[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体的说，涉及一种复合微生物菌剂及其在贝母提质中的应用。

[0002] 甘肃贝母是百合科贝母属多年生草本植物，为“国家二级重点保护野生植物”。作为名贵药材“川贝”基原植物之一，其鳞茎具有清热润肺、化痰止咳之功效。由于其具备较高的药用价值，因此，贝母的种植技术是目前研究的热点问题，由于传统人工种植模式从播种到形成商品药材需要4‑5年时间，周期长，成本高；并且，贝母的经济价值并不依赖于其产量，而主要依赖于药效品质，所以贝母商品药材以小为贵，价值最高的是松贝，形态为怀中抱月，直径一般0.5‑0.8厘米；其次为青贝，两瓣大小相同，相互抱合，直径一般为0.8‑1.5厘米。但是现有用于促生相关激素(生长素、细胞分裂素、赤霉素)、提高产量的相关产品应用于贝母时，反而会导致贝母药效品质的降低，影响贝母的商品价值。而关于贝母提质的研究中发现，现有种植的三年生甘肃贝母生物碱含量为0.044％，经纳米铁处理后为0.052％，虽然提高了18.2％，但绝对含量仅勉强达到药典标准；四年生贝母空白对照生物碱含量为0.163％，经纳米铁处理为0.128％，反倒降低了21.5％(杨涛等，纳米铁和褪黑素对驯化栽培条件下甘肃贝母产量和品质的影响)。因此，在贝母种植技术中，如何提升药效品质、实现快速优质生产、缩短成药期是贝母种植技术领域中的重点及难点问题。

[0003] 申请人于2021年12月21日申请了中国发明专利CN114196587A公开了一种复合微生物菌剂及在贝母提质中的应用，该复合微生物菌剂包括微杆菌、小叶微杆菌以及氧化微杆菌，由上述菌剂构成的复合微生物菌剂在对贝母进行叶面喷施，并检测其品质，结果表明：由上述菌种构成的复合微生物菌剂能够有效增加贝母中的总生物碱含量，为了进一步增强贝母中的总生物碱含量，上述的复合微生物菌剂还包括圆褐固氮菌，将圆褐固氮菌以及微杆菌、小叶微杆菌和氧化微杆菌共同构成的复合微生物菌剂应用在贝母中以后，能够进一步增强贝母中总生物碱的含量，有助于贝母中茉莉酸的积累。

[0004] 虽然，上述复合微生物菌剂能够增加贝母中的总生物碱含量，提高了茉莉酸的含量，但是，贝母中促生相关的激素含量并没有明显减少，因此，提供一种能够进一步增强贝母中总生物碱含量，并同时显著减少贝母中促生相关的激素含量的复合微生物菌剂，在贝母种植技术领域中尤为重要。

[0005] 针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种复合微生物菌剂，并将该菌剂对贝母进行叶面喷施后，进一步提升贝母品质。本发明还设置阳性对照组以及阴性对照组，结果显示该复合菌剂喷施贝母植物后与阳性对照组以及阴性对照组相比：胁迫相关激素茉莉酸含量显著升高，并且变化程度达到成倍或接近成倍的水平；胁迫相关激素水杨酸含量显著降低或不显著；生长相关激素生长素含量变化不显著，或虽显著但变化程度较小；生长相关激素细胞分裂素、赤霉素含量显著降低，并且变化程度达到成倍或接近成倍的水平；贝母中生物碱含量显著提高，实现了贝母药效品质的提升。具体的，本发明的技术方案具体包括以下内容：

[0006] 第一方面，本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括微杆菌以及氧化烃微杆菌。

[0007] 优选地，上述的复合微生物菌剂中，

[0008] 微杆菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.4所示；

[0009] 氧化烃微杆菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 第二方面，本发明还提供了一种复合微生物菌剂，包括微杆菌以及寡养单胞菌。

[0011] 优选地，上述的复合微生物菌剂中，

[0012] 微杆菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.4所示；

[0013] 寡养单胞菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

[0014] 第三方面，本发明还提供了一种复合微生物菌剂，包括微杆菌、氧化烃微杆菌和寡养单胞菌。

[0015] 优选地，上述的复合微生物菌剂中，

[0016] 微杆菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.4所示；

[0017] 氧化烃微杆菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；

[0018] 寡养单胞菌16SrDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

[0019] 第四方面，本发明还提供了上述的复合微生物菌剂在植物提质中的应用。

[0020] 第五方面，本发明还提供了上述的复合微生物菌剂在制备植物提质调节剂中的应用。

[0021] 第六方面，本发明还提供了上述的复合微生物菌剂在制备植物提质专用肥中的应用。

[0022] 优选地的，上述复合微生物菌剂在应用的过程中，使用的植物对象为贝母。

[0023] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：

[0024] 本发明中的复合微生物菌剂包括微杆菌，并且还包括氧化烃微杆菌和/或寡养单胞菌，该复合微生物菌剂在对贝母进行提质过程中，能够显著提升贝母药效成分生物碱的含量，促进贝母植株茉莉酸的积累，抑制贝母植株赤霉素、水杨酸以及细胞分裂素的积累，具有显著的提质功效，而且提高了贝母的商品价值，具有重大的经济意义。

[0025] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0026] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

[0027] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明提供了以下实施例。

[0028] 下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0029] 以下实施例中供试植株为甘肃贝母，试验地位于甘肃省兰州市榆中县马坡乡哈班岔村，海拔2600米。试验中用到的试剂、培养基均为化学纯。

[0030] 以下实施例所用微生物及其培养基来源：

[0031] 氧化烃微杆菌DG‑36，16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，NCBI号OR098484.1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号：CGMCCNO.28027)，保藏日期：2023年7月27日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议的分类命名：Microbacterium hydrocarbonoxydans。

[0032] 小叶微杆菌BM‑1，16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示，NCBI号MW981364，NCBI菌株编号AL2，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心(GSICC31307)。

[0033] 氧化微杆菌BM‑2，16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示，NCBI号MW981365，NCBI菌株编号AL4，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心(GSICC31306)。

[0034] 微杆菌DGWGJ‑1，16SrDNA序列如SEQ ID NO.4所示，NCBI号MW981366，NCBI菌株编号BR2，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号：CGMCC NO.18608)，保藏日期：2019年9月20日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议的分类命名：
Microbacterium sp.。

[0035] 寡养单胞菌DGGYDB‑1，16SrDNA序列如SEQ ID NO.5所示，NCBI号MW981357，NCBI菌株编号2R2，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号：CGMCC NO.18607)，保藏日期：2019年9月20日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议的分类命名：Stenotrophomonas sp.。

[0036] 贝莱斯芽孢杆菌GSICC32847、解淀粉芽孢杆菌GSICC32823、枯草芽孢杆菌GSICC32822、耐寒短杆菌32841、褐色球形固氮菌GSICC30112购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心。

[0037] 培养基成分：

[0038] PDB培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

[0039] LB培养基：胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH值调至7.0‑7.4。

[0040] 改良斯蒂芬逊培养基：硫酸铵2g/L、硫酸锰0.01g/L、磷酸二氢钠0.25g/L、硫酸镁0.03g/L、碳酸钙0.5g/L、磷酸氢二钾0.75g/L，pH值调至8.2。

[0041] 纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、过氧化物酶及亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量检测试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司。

[0042] 总生物碱含量检测按照2020年版《中国药典》所述方法进行(国家药典委员会中华人民共和国药典：一部)

[0043] 实施例1

[0044] 寡养单胞菌DGGYDB‑1、褐色球形固氮菌GSICC30112功能检测：

[0045] 1)硝化力测定：将寡养单胞菌DGGYDB‑1、褐色球形固氮菌GSICC30112分别接种到LB培养基中，在30℃、180r/min的条件下振荡培养2d，离心收集菌体，无菌水重悬至OD600为1.0，再接入灭菌的改良斯蒂芬逊培养基，在30℃、180r/min的条件下振荡培养2d，测定OD600值，按亚硝酸盐氮、硝酸盐氮试剂盒所述方法检测含量，以下列公式计算硝化力，计算结果除以相应菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液的硝化力。每个菌株重复3次，计算平均值。

[0046]

[0047] 结果表明：寡养单胞菌DGGYDB‑1消化力为1.563±0.003％、褐色球形固氮菌GSICC30112消化力为0.973±0.005％，寡养单胞菌DGGYDB‑1显著高于褐色球形固氮菌GSICC30112。

[0048] 2)激素含量测定：将寡养单胞菌DGGYDB‑1、褐色球形固氮菌GSICC30112分别接种到LB培养基中，在30℃，180r/min条件下振荡培养2d，4℃，5000r/min离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，超高效液相串联质谱法(UPLC‑MS)测定菌液水杨酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素(3、4、7)、生长素(吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、4‑氯吲哚乙酸)、细胞分裂素(顺反玉米素、玉米素核苷、利波腺苷、激动素、异戊烯基腺嘌呤)等激素含量。测定结果除以相应菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液的激素含量。

[0049] 结果表明，寡养单胞菌DGGYDB‑1只含有生长素(吲哚乙酸)和水杨酸，含量分别为11.048±0.054ng/mL，2.5±0.102ng/mL；褐色球形固氮菌GSICC30112含有生长素(吲哚乙酸、4‑氯吲哚乙酸)、细胞分裂素(激动素、异戊烯基腺嘌呤)、赤霉素(4，7)、水杨酸；含量分别为15.331±0.065ng/mL，0.049±0.021ng/mL，3.459±0.077ng/mL，1.063±0.049ng/mL。
由数据可知，褐色球形固氮菌GSICC30112促生的作用强于寡养单胞菌DGGYDB‑1。

[0050] 3)固氮酶活性定量检测：将寡养单胞菌DGGYDB‑1、褐色球形固氮菌GSICC30112分别接种到LB培养基中，在30℃，180r/min条件下振荡培养2d，得到相应菌液；移取上述菌液5mL转入20mL顶空瓶中，压盖封口，从瓶中抽出2mL气体，再注入等体积乙炔，继续培养24h，气相色谱仪检测生成的乙烯含量。气相色谱条件：PLOT/Q填充毛细管色谱柱(30mm×0.53mm×40mm)，载气为氮气，流速为2.0mL/min；进样口温度200℃，分流比10:1；升温恒定温度60℃，保持6min。FID检测器：温度250℃，氢气40mL/min，空气450mL/min，尾吹氦气30mL/min。
固氮酶活性按如下公式计算，计算结果除以菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液固氮酶活性。每个菌株重复3次，计算平均值。

[0051]

[0052] 结果表明，寡养单胞菌DGGYDB‑1的固氮酶活性为4.324±0.034nmoL/mL‑2·h‑1；褐‑2 ‑1色球形固氮菌GSICC30112的固氮酶活性为2.516±0.052nmoL/mL ·h 。寡养单胞菌DGGYDB‑1的固氮能力显著高于褐色球形固氮菌GSICC30112。

[0053] 4)菌株产酶活性测定：将寡养单胞菌DGGYDB‑1、褐色球形固氮菌GSICC30112分别接种于灭菌的50mLLB培养基中，在30℃、180r/min条件下振荡培养2d，过滤，收集菌体，无菌水溶解至浊度OD600为1。按待测菌液：酶提取液1:10的比例，冰浴超声破碎细胞，4℃、8000r/min离心10min，上清液置冰上待测。按照中性木聚糖酶、纤维素酶、漆酶和过氧化物酶酶活性试剂盒说明书所述分光光度法进行测定，重复3次。测定结果除以相应菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液的酶活。

[0054] 结果表明，寡养单胞菌DGGYDB‑1木聚糖酶、纤维素酶、漆酶、过氧化物酶活性分别为：0.064±0.025、11.141±0.232、0.030±0.009、24.381±0.627U/ml。褐色球形固氮菌GSICC30112木聚糖酶、纤维素酶、漆酶、过氧化物酶活性分别为0、10.192±0.442、19.511±0.891、93.392±0.884U/ml。褐色球形固氮菌GSICC30112清除活性氧、酚类物质的能力强于寡养单胞菌DGGYDB‑1；寡养单胞菌DGGYDB‑1降解植物细胞壁的能力强于褐色球形固氮菌GSICC30112。

[0055] 综上所述，褐色球形固氮菌GSICC30112促生增产的作用可能更强，寡养单胞菌DGGYDB‑1主要表现为固氮作用。

[0056] 实施例2

[0057] 复合微生物菌剂处理4年生贝母后对贝母品质和产量的影响：

[0058] 设置实验组并配置阳性对照组以及阴性对照组分别处理4年生贝母，将实验组中的菌剂用于制备植物提质调节剂，对植物进行叶面喷施，另外，值得注意的是，本实施例中的实验组中的菌剂包括但不限于制备植物提质调节剂，还可以用于制备植物提质专用肥，本实施例中的植物为贝母，本实施例中实验组以及阳性对照组和阴性对照组的微生物菌株如下：

[0059] 实验组微杆菌属复合菌剂(T1)：以中国发明专利CN114196587A公开的复合菌剂作为实验组T1，具体为：用PDB培养基培养的微杆菌DGWGJ‑1、小叶微杆菌BM‑1、氧化微杆菌BM‑7 ‑1
2等比例混合；调至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0060] 实验组微杆菌属复合菌剂(T2)：分别用PDB培养基培养的微杆菌DGWGJ‑1、氧化烃7 ‑1
微杆菌DG‑36等比例混合；调至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0061] 实验组单菌菌剂(T3)：用PDB培养基培养褐色球形固氮菌GSICC30112，调至菌浓度7 ‑1
为1‑4×10CFU·mL ；

[0062] 实验组单菌菌剂(T4)：用PDB培养基培养寡养单胞菌DGGYDB‑1，调至菌浓度为1‑47 ‑1
×10CFU·mL ；

[0063] 实验组复合菌剂(T5)：以中国发明专利CN114196587A公开的复合菌剂作为实验组T5，具体为：用PDB培养基培养的微杆菌DGWGJ‑1、小叶微杆菌BM‑1、氧化微杆菌BM‑2、褐色球7 ‑1
形固氮菌GSICC30112等比例混合；调至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0064] 实验组复合菌剂(T6)分别用PDB培养基培养的微杆菌DGWGJ‑1、寡养单胞菌7 ‑1
DGGYDB‑1等比例混合；调至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0065] 阳性对照组复合菌剂(T7)：分别用PDB培养基培养的贝莱斯芽孢杆菌GSICC32847、解淀粉芽孢杆菌GSICC32823、枯草芽孢杆菌GSICC32822、耐寒短杆菌32841等比例混合，调7 ‑1
至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0066] 阴性对照组(CK)：PDB培养基不加菌。

[0067] 试验采用单因素完全随机设计，设T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7及CK共8个处理，不同菌‑1株在28℃，200r·min 条件下用PDB培养基震荡培养2d，调至相同OD值，等比例复配，用无菌
7 ‑1 2
水调至1‑4×10CFU·mL ，不同处理施用量体积相等。每处理3次重复，小区面积5m。4月上旬出苗后，不同处理叶面喷施，每3周叶面喷施一次，共4次，7月中旬地上部分枯萎后，每小区採挖30株，流水冲洗，除去根和表面的泥土，阴干后称重；检测总生物碱含量。总生物碱及产量(平均百粒重)检测结果如表1所示。

[0068] 表1不同处理后4年生贝母总生物碱含量及产量测定结果(x±se，n＝3)[0069]

[0070] 注：每列大写字母分别表示极显著差异(P<0.01)水平下多重比较

[0071] 结果表明，实验组T2、T5、T6较阴性对照CK，总生物碱含量分别是对照的2.22倍、1.91倍和2.07倍；而阳性对照组T7较阴性对照CK，总生物碱含量是其0.61倍。表明，以微杆菌DGWGJ‑1为基础，分别增加氧化烃微杆菌DG‑36、褐色球形固氮菌GSICC30112、寡养单胞菌DGGYDB‑1都能显著提高4年生贝母药效成分生物碱的含量，具有显著的提质功效。

[0072] 实验组T5较阴性对照CK，百粒重增加；实验组T2、T6较阴性对照CK，百粒重降低，考虑到贝母以小为贵的商品价格属性，T2、T6处理不仅从品质方面，而且从大小方面都为最优处理。

[0073] 第3次处理后4天，采摘4年生贝母同样位置的叶片1片，每小区采摘10株，混样，液氮速冻，测定激素茉莉酸、水杨酸、赤霉素(3、4、7)、细胞分裂素(顺反玉米素、玉米素核苷、利波腺苷、激动素、异戊烯基腺嘌呤)和生长素(吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、4‑氯吲哚乙酸)的含量，激素检测结果如表2所示。

[0074] 表2不同处理后4年生贝母激素含量检测结果(ng/g)(x±se，n＝3)

[0075]

[0076] 注：每列大写字母分别表示极显著差异(P<0.01)水平下多重比较

[0077] 结果表明，实验组T1较阴性对照CK，水杨酸、细胞分裂素含量差异不显著,茉莉酸、赤霉素、生长素分别是对照的1.96、0.84、1.17倍。实验组T2较阴性对照CK，细胞分裂素、生长素含量差异不显著，茉莉酸、水杨酸、赤霉素、分别是对照的2.21、0.68、0.46倍。实验组T5较阴性对照CK，水杨酸含量差异不显著，茉莉酸、赤霉素、细胞分裂素、生长素含量分别是对照的1.67、0.81、2.20、1.50倍。实验组T6较阴性对照CK，水杨酸、细胞分裂素含量差异不显著,茉莉酸、赤霉素、生长素分别是对照的1.8、0.78、1.27倍。阳性对照T7较阴性对照CK，水杨酸含量差异不显著，茉莉酸、赤霉素、细胞分裂素、生长素含量分别是对照的0.52、4.28、3.33、1.94倍。由此可知，氧化烃微杆菌DG‑36的添加对贝母植株内源激素的影响主要表现为：接近成倍的显著的降低了水杨酸含量、成倍的显著的降低了赤霉素含量。褐色球形固氮菌GSICC30112的添加对贝母植株内源激素的影响主要表现为：成倍的显著的提高了细胞分裂素含量。寡养单胞菌DGGYDB‑1与褐色球形固氮菌GSICC30112的添加对贝母植株内源激素的影响主要区别是没有上调细胞分裂素含量。综上所述，原复合菌剂(CN114196587A)组成为微杆菌DGWGJ‑1，小叶微杆菌BM‑1，氧化微杆菌BM‑2，褐色球形固氮菌GSICC30112，本实施例中的复合微生物菌剂通过微杆菌DGWGJ‑1与氧化烃微杆菌DG‑36和/或寡养单胞菌DGGYDB‑1进行组合，改进后的复合菌剂较改进前显著的降低了贝母内源水杨酸、赤霉素、细胞分裂素含量，提质效果更好。

[0078] 实施例3

[0079] 复合微生物菌剂处理3年生贝母后对贝母的品质和产量的影响

[0080] 设置实验组并配置阴性对照组处理3年生贝母，将实验组中的菌剂用于制备植物提质调节剂，对植物进行叶面喷施，另外，值得注意的是，本实施例中的实验组中的菌剂包括但不限于制备植物提质调节剂，还可以用于制备植物提质专用肥，本实施例中的植物为贝母，本实施例中实验组以及阴性对照组的微生物菌剂如下：

[0081] 实验组复合菌剂(T1)分别用PDB培养基培养的微杆菌DGWGJ‑1、氧化烃微杆菌DG‑7 ‑1
36、寡养单胞菌DGGYDB‑1等比例混合；调至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0082] 实验组复合菌剂(T2)分别用PDB培养基培养的微杆菌DGWGJ‑1、氧化烃微杆菌DG‑7 ‑1
36、褐色球形固氮菌GSICC30112等比例混合；调至总菌浓度为1‑4×10CFU·mL ；

[0083] 阴性对照组(CK)：PDB培养基不加菌。

[0084] 试验设T1、T2及CK共3个处理，不同菌株在28℃，200r·min‑1条件下用PDB培养基震7 ‑1
荡培养2d，调至相同OD值，等比例复配，用无菌水调至1‑4×10 CFU·mL ，不同处理施用量
2
体积相等。每处理3次重复，小区面积5m。4月上旬出苗后，不同处理叶面喷施，每3周叶面喷施一次，共4次，7月中旬地上部分枯萎后，每小区採挖30株，流水冲洗，除去根和表面的泥土，阴干后称重，检测总生物碱含量。产量(平均百粒重)和总生物碱含量检测结果如表3所示。

[0085] 表3不同处理后3年生贝母产量和总生物碱含量测定结果(x±se,n＝3)

[0086]

[0087] 注：大写字母表示极显著差异(P<0.01)水平下多重比较

[0088] 结果表明，实验组T1、T2较阴性对照CK，总生物碱含量分别是对照的2.64、1.61倍；T1百粒重显著低于T2和CK。由此可见，本发明改进的复合微生物菌剂微杆菌DGWGJ‑1、氧化烃微杆菌DG‑36、寡养单胞菌DGGYDB‑1等比例混合，具有显著的提质功效。

[0089] 以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。