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一种酶组合、基因工程菌及其在生产D-阿洛糖中的应用

申请号 CN202310885692.1 申请日 2023-07-19 公开(公告)号 CN116855487A 公开(公告)日 2023-10-10
申请人 河南中大恒源生物科技股份有限公司; 发明人 王三营; 金子恒; 文雁君; 李林正; 文晨辉; 解蓉蓉; 潘天义;
摘要 本 发明 涉及 生物 工程 技术领域,尤其涉及一种酶组合、基因工程菌及其在生产D‑阿洛 酮 糖中的应用。本发明将特定来源的 葡萄糖 异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶共表达枯草芽孢杆菌,所得工程菌 发酵 后,获得粗酶液,以高浓度葡萄糖为底物进行异构反应,经分离纯化和浓缩获得果葡糖浆和D‑阿洛酮糖糖浆。本发明提供的酶组合对底物的催化速率较高,能够明显提高D‑阿洛酮糖的转化速率。同时,本发明以使用廉价的葡萄糖为原料,大大降低D‑阿洛酮糖的生产成本;而且在生产D‑阿洛酮糖的同时,同步生产果葡糖浆,节省了一套果葡糖浆的生产线投入,大大提高了经济效益。
权利要求

1.酶组合,其特征在于,包括Thermus  thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D‑阿洛糖3‑差向异构酶。
2.根据权利要求1所述的酶组合,其特征在于,所述葡萄糖异构酶的基酸序列选自如下任意一项;
1)如SEQ ID NO:1所示;
2)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列;或
3)与SEQ ID NO:1所示序列至少有90%同源性且蛋白活性与SEQ ID NO:1相同或相似的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的酶组合,其特征在于,所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列选自如下任意一项:
a)如SEQ ID NO:2所示;
b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列;或
c)与SEQ ID NO:2所示序列至少有90%同源性且与SEQ ID NO:2所示序列的蛋白活性相同或相似的氨基酸序列。
4.编码权利要求1~3任一项所述酶组合的核酸组合。
5.根据权利要求4所述的核酸组合,其特征在于,
所述葡萄糖异构酶基因为依照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化后的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因为依照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化后的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.表达载体,包括骨架载体和权利要求4或5所述的核酸组合。
7.包含权利要求6所述表达载体的工程菌。
8.根据权利要求7所述的工程菌,其特征在于,其出发菌为枯草芽孢杆菌。
9.权利要求7或8所述工程菌的构建方法,其特征在于,将葡萄糖异构酶基因和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因连接至骨架载体,获得重组载体;将所述重组载体转入枯草芽孢杆菌中,获得工程菌。
10.权利要求1~3任一项所述的酶组合、权利要求4或5所述的核酸组合、权利要求6所述的表达载体或权利要求7或8所述的工程菌,在生产D‑阿洛酮糖中的应用,或在制备降糖降脂产品中的应用。
11.D‑阿洛酮糖的制备方法,其特征在于,以权利要求7或8所述工程菌的发酵培养物、提取物或提取分离的酶液为催化剂,催化底物葡萄糖反应生成D‑阿洛酮糖。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,包括:
发酵培养权利要求7或8所述的工程菌,经破菌处理获得含葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖
3‑差向异构酶的粗酶液;
向所述粗酶液中加入底物葡萄糖,获得转化糖浆;
将所述转化糖浆依次进行过滤、纯化、色谱分离、浓缩,分别获得D‑阿洛酮糖和果葡糖。

说明书全文

一种酶组合、基因工程菌及其在生产D‑阿洛糖中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种酶组合、基因工程菌及其在生产D‑阿洛酮糖中的应用。

背景技术

[0002] D‑阿洛酮糖是一种稀有糖,具有蔗糖70%的甜度,但热量很低,是蔗糖良好的替代品。而且,D‑阿洛酮糖的吸收率低于其他甜味剂,可降低机体对果糖和葡萄糖吸收的作用,降低脂肪的堆积量,从而降低Ⅱ型糖尿病和过度肥胖等病症的患病险。目前还有研究发现D‑阿洛酮糖还具有降低血脂和血糖的功能。美国食品与药物管理局(FDA)已将D‑阿洛酮糖认证为GRAS(Generally recognized as safe),可作为食品添加剂的组成成分。D‑阿洛酮糖在食品、保健品中具有广泛的应用前景。
[0003] 目前,阿洛酮糖主要以果糖为原料,通过D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的酶催化,生成阿洛酮糖。但果糖的市场高价格势必造成阿洛酮糖的生产成本居高不下。而果糖可通过葡萄糖异构酶催化葡萄糖发生差向异构反应生成。通过利用葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的双基因共表达工程菌的发酵应用可实现从葡萄糖一步生成D‑阿洛酮糖。此方法以葡萄糖为原料,降低原料成本;还可节省一条由葡萄糖生产果糖的生产线,降低设备投资;具有重要的工业应用价值。

发明内容

[0004] 有鉴于此,本发明提供了一种酶组合、基因工程菌及其在生产D‑阿洛酮糖中的应用。本发明将特定来源的特定来源的葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶用于催化底物葡萄糖转化为D‑阿洛酮糖,明显提高了D‑阿洛酮糖转化效率,缩短了生产时间,适于工业化生产。
[0005] 为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0006] 本发明提供了酶组合,包括Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶。
[0007] 所述葡萄糖异构酶的基酸序列选自如下任意一项;
[0008] 1)如SEQ ID NO:1所示;
[0009] 2)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的功能不发生改变的氨基酸序列;或
[0010] 3)与SEQ ID NO:1所示序列至少有90%同源性且蛋白活性与SEQ ID NO:1相同或相似的氨基酸序列。
[0011] 所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列选自如下任意一项:
[0012] a)如SEQ ID NO:2所示;
[0013] b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列;或
[0014] c)与SEQ ID NO:2所示序列至少有90%同源性且与SEQ ID NO:2所示序列的蛋白活性相同或相似的氨基酸序列。
[0015] 具体实施例中,本发明所述的葡萄糖异构酶GI来源于Thermus thermophilus,登录号为WP_244348257.1,氨基酸序列为SEQ ID NO:1。所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶DPE来源于Ruminococcus sp.,登录号为MBS6425357.1,氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0016] 本发明经长期研究,发现不同来源的酶组合催化底物葡萄糖转化为阿洛酮糖的速率不同,最终获得了转化速率明显高于其他组合的最佳组合,即Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的组合,具体地,所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,所述D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0017] 本发明还提供了编码所述酶组合的核酸组合,包括GI基因和DPE基因。本发明依照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性对GI基因和DPE基因进行了优化,优化后的GI基因的序列为SEQ ID NO:3,优化后的DPE基因的序列为SEQ ID NO:4。
[0018] 本发明还提供了一种基因表达框,包括启动子、所述核酸组合中的一种基因、终止子。所述核酸组合中的GI基因和DPE基因分别由组成型启动子启动,一些实施例中,所述组成型启动子为p43启动子。
[0019] 本发明还提供了一种表达载体,包括骨架载体和所述的核酸组合。其中,编码葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的位于同一个骨架载体中,每个基因分别由启动子启动,启动子可以相同(如p43启动子),也可以不同。
[0020] 本发明所述的表达载体中,骨架载体为pWB980、pP43NMK、pYH‑P43等,本领域常见的其他载体种类均可,包括但不仅限于此。
[0021] 本发明还提供了转染或转化所述表达载体的工程菌。
[0022] 本发明所述工程菌的出发菌为枯草芽孢杆菌,具体实施例中为枯草芽孢杆菌WB600。
[0023] 本发明还提供了所述工程菌的构建方法,将葡萄糖异构酶基因和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因连接至骨架载体,获得重组载体;将所述重组载体转入枯草芽孢杆菌中,获得工程菌。其中,所述葡萄糖异构酶基因的序列如SEQ ID NO:3所示,D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因的序列如SEQ ID NO:4所示。
[0024] 一些具体实施例中,所述工程菌的构建方法如下:
[0025] 1)选取Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶蛋白序列(GI,SEQ ID NO:1)和Ruminococcus sp.的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶蛋白序列(DPE,SEQ ID NO:2),对其编码基因进行密码子优化,优化后的GI基因序列为,SEQ ID NO:3),DPE基因序列为SEQ ID NO:4,由金斯瑞生物科技全基因合成。将两基因通过同源重组连接到载体pWB980上,得到重组质粒pWB980‑GI和pWB980‑DPE。
[0026] 2)再以pWB980‑DPE质粒为模板PCR扩增出p43‑RBS‑DPE片段,通过同源重组把上述片段连接到载体pWB980‑GI上,进一步得到重组质粒pWB980‑GI‑DPE。其中,GI和DPE基因分别由P43启动子控制为组成型胞内表达。
[0027] 3)将重组质粒pWB980‑GI‑DPE转化至枯草芽孢杆菌WB600中,获得重组枯草芽孢杆菌WB600/GI‑DPE。
[0028] 实验表明,该菌株可直接发酵用于催化葡萄糖生产果葡糖浆和D‑阿洛酮糖,对葡萄糖的催化速率较高,明显缩短了反应时间,有利于阿洛酮糖的产业化生产,经济效益较高。
[0029] 本发明还提供了的酶组合、所述的核酸组合、所述的表达载体或所述的工程菌,在生产D‑阿洛酮糖中的应用,或在制备降糖降脂产品中的应用。
[0030] 本发明还提供了阿洛酮糖的制备方法,以本发明共表达葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌的发酵培养物、提取物或提取分离的酶液为催化剂,催化底物葡萄糖反应生成阿阿洛酮糖。具体包括如下步骤:
[0031] 发酵培养所述的工程菌,经破菌处理获得含葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的粗酶液;
[0032] 向所述粗酶液中加入底物葡萄糖,获得转化糖浆;
[0033] 将所述转化糖浆依次进行过滤、纯化、色谱分离、浓缩,分别获得D‑阿洛酮糖和果葡糖。
[0034] 具体实施例中,所述D‑阿洛酮糖的制备方法包括:
[0035] (1)将上述重组菌株接入LB种子培养基中,37℃,200rpm过夜培养进行富集,获得OD600值为3‑6的种子液;
[0036] (2)将步骤(1)获得的重组菌株的种子液按照0.1%(v/v)的比例接入发酵培养基(蛋白胨10g,酵母粉5g,磷酸二氢2.5g,磷酸氢二钾15g,四氯化锰0.1g,七水硫酸镁0.1g,葡萄糖6g,加水定容至1L)中进行发酵,发酵温度37℃,200rpm培养48h,获得发酵液。
[0037] (3)向步骤(2)获得的发酵液中按照0.1‰(w/v)加入溶菌酶,37℃,200rpm反应1h,以破菌释放胞内酶,获得粗酶液。
[0038] (4)向步骤(3)获得的粗酶液中,按终浓度600g/L加入葡萄糖,60℃反应24h,获得转化糖浆。
[0039] (5)将步骤(4)获得的转化糖浆用孔径8‑10nm的陶瓷膜过滤除杂,通量50L/㎡/h,获得透过液。
[0040] (6)将步骤(5)获得的透过液用截留分子量100‑300道尔顿的纳滤膜过滤除杂脱色,通量10L/㎡/h,获得透过液。
[0041] (7)将步骤(6)获得透过液先经过阳离子树脂,再经过阴离子树脂,去除阴阳离子;获得脱盐后糖液。其中,阳离子树脂型号为D001‑FD,阴离子树脂型号为D354‑FD;
[0042] (8)再将步骤(7)脱盐后糖液进行色谱分离,获得AD液为阿洛酮糖糖液,BD液为葡萄糖、果糖混合糖液。色谱分离过程中控制糖液浓:15‑25%,温度50‑60℃,压0.2‑0.3MPa,水料质量比为1:2,处理量2.2kg/kg/d;
[0043] (9)将步骤(8)获得的AD液和BD浓缩至固形物质含量为75%,获得D‑阿洛酮糖糖浆和果葡糖浆。
[0044] 相比于现有技术,本发明具有以下有益效果:
[0045] (1)本发明利用特定来源的酶组合将葡萄糖在较短时间内转化成D‑阿洛酮糖,明显缩短了生产时间,大大提高了经济效益,有利于产业化生产。
[0046] (2)本发明使用廉价的原料葡萄糖作为底物,大大降低了D‑阿洛酮糖的生产成本。
[0047] (3)本发明在生产D‑阿洛酮糖的同时,可同步生产果葡糖浆,可节省一套果葡糖浆的生产线投入。附图说明
[0048] 图1为重组质粒pWB980‑GI‑DPE的图谱;
[0049] 图2为SDS‑PAGE电泳图片,其中泳道1~2分别代表:1:WB600/pWB980,2:WB600/pWB980‑GI‑DPE;
[0050] 图3为液相检测图谱。

具体实施方式

[0051] 本发明提供了一种酶组合、基因工程菌及其在生产D‑阿洛酮糖中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
[0052] 本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
[0053] 下面结合实施例,进一步阐述本发明:
[0054] 实施例1本发明葡萄糖异构酶(GI)和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPE)共表达工程菌的构建和功能验证
[0055] 选取Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶蛋白序列(GI,SEQ ID NO:1)和Ruminococcus sp.的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶蛋白序列(DPE,SEQ ID NO:2),编码基因经密码子优化后,GI基因序列为SEQ ID NO:3,DPE基因序列为SEQ ID NO:4,由金斯瑞生物科技全基因合成,合成好的基因连接到pUC57载体上,分别命名为pUC57‑GI和pUC57‑DPE。
[0056] 以合成的重组质粒pUC57‑GI为模板,以GI‑F和GI‑R为引物进行PCR扩增,胶回收纯化获得GI片段;以合成的重组质粒pUC57‑DPE为模板,以DPE‑F和DPE‑R为引物进行PCR扩增,胶回收纯化获得DPE片段。
[0057] 以质粒载体pWB980为模板,以pWB980‑F1和pWB980‑R1为引物进行PCR扩增,胶回收纯化获得线性化质粒基因片段P1;以质粒载体pWB980为模板,以pWB980‑F2和pWB980‑R2为引物进行PCR扩增,胶回收纯化获得线性化质粒基因片段P2。
[0058] 将GI片段和pWB980线性化基因片段P1按同源重组试剂说明书进行连接,连接产物电转至枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞,得到重组枯草芽孢杆菌命名为WB600/GI,重组质粒命名为pWB980‑GI。通过转化子菌落PCR和测序分析验证是否正确。
[0059] 表1本发明引物序列
[0060]
[0061]
[0062] 将DPE片段和pWB980线性化基因片段P2按同源重组试剂盒说明书进行连接,连接产物电转至枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞,得到重组枯草芽孢杆菌命名为WB600/DPE,重组质粒命名为pWB980‑DPE。通过转化子菌落PCR和测序分析验证是否正确。
[0063] 以重组质粒pWB980‑DPE为模板,以p43‑RBS‑DPE‑F和p43‑RBS‑DPE‑R为引物进行PCR扩增,胶回收纯化获得p43‑RBS‑DPE片段。再以重组质粒pWB980‑GI为模板,以pWB980‑GI‑F和pWB980‑GI‑R为引物进行PCR扩增,胶回收纯化获得线性化质粒基因片段P3。
[0064] 将p43‑RBS‑DPE片段和pWB980‑GI线性化基因片段P3按同源重组试剂盒说明书进行连接,连接产物电转至枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞,得到重组枯草芽孢杆菌命名为WB600/GI‑DPE,重组质粒命名为pWB980‑GI‑DPE(质粒图谱如图1所示)。通过转化子菌落PCR和测序分析验证是否正确。
[0065] 挑取上述菌落PCR和测序正确的阳性转化子,接种于5ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基,37℃,200rpm过夜培养;以0.1%接种量接入1L以上含有50mg/L卡那霉素的发酵培养基中,37℃,200rpm培养48h。按0.1‰加入溶菌酶粉末,37℃,200rpm继续反应1h,即获得GI‑DPE粗酶液(SDS‑PAGE电泳结果如图2所示)。
[0066] 向上述获得的粗酶液中,按终浓度700g/L加入葡萄糖,60℃反应24h。取0.02ml反应液用纯水稀释50倍后,100℃水浴处理10min灭酶,再10000rpm离心10min后,0.22μm微孔滤膜过滤处理,滤液做高效液相色谱分析。
[0067] 使用带有空质粒pWB980的枯草芽孢杆菌WB600作为空白对照,其他操作条件相同。
[0068] 高效液相色谱按如下条件进行:安捷伦高效液相色谱仪1200;分析柱:waters sugarpak I色谱柱;流动相:纯水;流速:0.3ml/min,柱温:80℃;检测器:示差折光检测器。以sigma公司生产的葡萄糖、果糖、D‑阿洛酮糖纯品为标准品,将上述样品进行分析,进样量为10μl。
[0069] 液相色谱分析结果(图3)表明,葡萄糖、果糖和D‑阿洛酮糖的出峰时间分别为14.1min、17.9min和26.9min。
[0070] 空白对照(枯草芽孢杆菌WB600/pWB980)的液相图谱中只有葡萄糖;实验组(枯草芽孢杆菌WB600/pWB980‑GI‑DPE)的液相图谱中有葡萄糖、果糖和D‑阿洛酮糖。该结果表明,上述方法制作的GI‑DPE粗酶液能将葡萄糖转化为果糖,再将果糖转化为D‑阿洛酮糖。
[0071] 通过峰面积计算,反应24h,转化后糖液中含有284g/L的葡萄糖、209g/L的果糖和107g/L的D‑阿洛酮糖,所占比例为47.33:34.83:17.83。实施例2:本发明共表达工程菌发酵生产果葡糖浆和D‑阿洛酮糖的方法具体步骤如下:
[0072] (1)将上述实施例1共表达工程菌接入含有50mg/L卡那霉素的LB液体种子培养基中,37℃,200rpm过夜培养,获得共表达工程菌种子液;
[0073] (2)将上述获得的工程菌种子液按照0.1%(v/v)的比例接入1L以上含有50mg/L卡那霉素的发酵培养基中(蛋白胨10g,酵母粉5g,磷酸二氢钾2.5g,磷酸氢二钾15g,四水氯化锰0.1g,七水硫酸镁0.1g,葡萄糖6g,加水定容至1L)进行发酵,发酵温度37℃,200rpm培养48h,获得发酵液。
[0074] (3)向步骤(2)获得的发酵液中按照0.1‰(w/v)加入溶菌酶,37℃,200rpm反应1h,以破菌释放胞内酶,获得GI‑DPE粗酶液。
[0075] (4)向步骤(3)获得的粗酶液中,按终浓度600g/L加入葡萄糖,60℃反应2‑24h,获得转化糖浆。
[0076] (5)将步骤(4)获得的转化糖浆用孔径8‑10nm的陶瓷膜过滤除杂,通量50L/㎡/h,获得透过液。
[0077] (6)将步骤(5)获得的透过液用截留分子量100‑300道尔顿的纳滤膜过滤除杂脱色,通量10L/㎡/h,获得透过液。
[0078] (7)将步骤(6)获得透过液先经过阳离子树脂,再经过阴离子树脂,去除阴阳离子;阳离子树脂型号为D001‑FD,阴离子树脂型号为D354‑FD;获得脱盐后糖液。
[0079] (8)再将步骤(7)脱盐后糖液进行色谱分离,获得AD液为阿洛酮糖糖液,BD液为葡萄糖、果糖混合糖液。色谱分离过程中控制糖液浓:15‑25%,温度50‑60℃,压力0.2‑0.3MPa,水料质量比为1:2,处理量2.2kg/kg/d;
[0080] (9)将步骤(8)获得的AD液和BD浓缩至固形物质含量为75%,获得D‑阿洛酮糖糖浆和果葡糖浆。
[0081] 对比例1
[0082] 选取CN113980880专利中葡萄糖异构酶(GI,核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:1)和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPE,核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:3),按照本发明实施例1的方法构构建共表达葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的枯草芽孢杆菌,按照本发明实施例2的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
[0083] 对比例2(GI不同属(与本发明GI同源性56%),DPE相同)
[0084] 选取CN113980880专利中葡萄糖异构酶(GI,核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:1)和本申请Ruminococcus sp.来源的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPE,核酸序列为SEQ ID NO:4),按照本发明实施例1的方法构建共表达GI和DPE的枯草芽孢杆菌。按照本发明实施例2的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
[0085] 对比例3(GI不同属(同源性97%),DPE相同)
[0086] 选取水管致黑栖热菌(ThermusScotoductus)来源的葡萄糖异构酶(GI,登录号WP_126200404.1,核酸序列经密码子优化后为SEQ ID NO:5)和本发明Ruminococcus sp.来源的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPE,核酸序列
[0087] SEQ ID NO:4),按照本发明实施例1的方法构建共表达GI和DPE的枯草芽孢杆菌。按照本发明实施例2的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
[0088] 对比例4(GI相同,DPE不同(与本发明DPE同源性40%))
[0089] 选取本发明Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶(GI,核酸序列为SEQ ID NO:3)和CN113980880专利中D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPE,核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:3),按照本发明实施例1的方法构建共表达GI和DPE的枯草芽孢杆菌。按照本发明实施例2的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
[0090] 对比例5(GI相同,DPE不同(与本发明DPE同源性69%))
[0091] 选取本发明Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶(GI,核酸序列为SEQ ID NO:3)和窦口杆菌Oribacterium sinus)来源的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPE,WP_183684385.1,核酸序列为SEQ ID NO:6),按照实施例1的方法构建共表达GI和DPE的枯草芽孢杆菌。按照本发明实施例2的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
[0092] 试验例
[0093] 按照实施例2、对比例1~5的方法制备转化糖浆,分别取反应2h、4h、6h、12h、24h的样品,HPLC检测葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量,计算阿洛酮糖的生产速率。结果见表2。
[0094] 表2
[0095]
[0096]
[0097] 由以上结果可知,虽然对比例1~5和本发明工程菌株生产的酶催化葡萄糖生产阿洛酮糖的转化率相当,均在14‑18%之间,但达到平衡转化率所需的时间有明显差异,分别为6h、6h、12h、4h、12h和2h,由此可计算阿洛酮糖的最大生产速率分别为21.5g/L/h、25g/L/h、16g/L/h、25g/L/h、11.5g/L/h和53.5g/L/h。其中,本发明酶组合的平衡催化时间最短,明显低于其他对比例,且本发明酶组合的阿洛酮糖生产速率也最大,明显高于其他对比例。因此,可以确定本发明提供的Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的组合对葡萄糖的催化速率最高,在转化反应中阿洛酮糖的生产速率最高,为最佳组合。
[0098] 以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。