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首页 / 专利分类库 / 医学或兽医学；卫生学 / 医用、牙科用或梳妆用的配制品（专门适用于将药品制成特殊的物理或服用形式的装置或方法A61J3/00；空气除臭，消毒或灭菌，或者绷带、敷料、吸收垫或外科用品的化学方面，或材料的使用入A61L；肥皂组合物入C11D） / 含肽的医药配制品（含β内酰胺环的肽入A61K31/00；其分子中除形成其环的肽键外没有其他任何肽键的环状二肽，如哌嗪2，5二酮入A61K31/00；基于麦角林的肽入A61K31/48；含有按统计学分布氨基酸单元的大分子化合物的肽入A61K31/74；含有抗原或抗体的医药配制品入A61K39/00；特征在于非有效成分的医药配制品，如作为药物载体的肽入A61K47/00） / .含有20个以上氨基酸的肽；胃泌激素；生长素抑制素；促黑激素；其衍生物 / ..来源于动物；来源于人类 / ...来源于阿黑皮素原、脑啡肽原或强啡肽原 / 用于胃肠道特异性递送的黑皮质素受体特异性肽配制品和方法

用于胃肠道特异性递送的黑皮质素受体特异性肽配制品和方法
申请号 CN201980034318.2 申请日 2019-03-22 公开(公告)号 CN112188888A 公开(公告)日 2021-01-05
申请人 帕拉丁科技公司; 发明人 约翰·哈罗德·多德; 斯蒂芬·夸库·多度诺;
摘要 本文披露了用于将黑皮质素受体特异性肽、特别是对黑皮质素‑1受体具有选择性和特异性的环状肽递送至胃肠道内腔，以 治疗 黑皮质素受体介导性或 反应性 胃肠道 疾病 、适应症、病症和综合征的配制品、组合物和方法。
权利要求

1.一种下胃肠(GI)道释放药物配制品，其包含
置于包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的配制品，其中该迟释聚合物为pH依赖性释放聚合物。
3.如权利要求2所述的配制品，其中将该肽或其药学上可接受的盐混合在该颗粒基质内，从而形成该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物。
4.如权利要求3所述的配制品，其中将该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的该混合物置于水溶性胶囊内。
5.如权利要求4所述的配制品，其中该水溶性胶囊为明胶胶囊。
6.如权利要求3所述的配制品，其中将该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的该混合物制成片剂。
7.如权利要求4或6所述的配制品，其中该胶囊或片剂进一步包含密封包衣和肠溶包衣中的至少一种。
8.如权利要求7所述的配制品，其中该密封包衣和肠溶包衣中的至少一种包含pH依赖性释放聚合物肠溶包衣。
9.如权利要求2所述的配制品，其中该pH依赖性释放聚合物包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物。
10.如权利要求9所述的配制品，其中该pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物选自由 L100-55、 S100和 FS30D组成的组。
11.如权利要求10所述的配制品，其中该 L100-55、 S100和
FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:
1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
12.如权利要求1所述的配制品，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为黑皮质素-1受体(MC1r)特异性肽或其药学上可接受的盐。
13.如权利要求12所述的配制品，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r的功能EC50值小于约1nM。
14.如权利要求13所述的配制品，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对黑皮质素-4受体(MC4r)的功能EC50值为对MC1r的功能EC50值的至少一百倍。
15.如权利要求14所述的配制品，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC4r的功能EC50值为至少约500nM。
16.如权利要求12所述的配制品，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对黑皮质素-2受体(MC2r)、黑皮质素-3受体(MC3r)和黑皮质素-5受体(MC5r)无功能活性。
17.如权利要求12所述的配制品，其中该迟释聚合物在结肠内释放至少一部分该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐。
18.如权利要求12所述的配制品，其中该迟释聚合物在结肠内释放治疗有效量的该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐。
19.如权利要求1所述的配制品，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐。
20.如权利要求19所述的配制品，其中该包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质为包含L100-55、 S100和 FS30D的混合物，该 L100-55、
S100和 FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重
量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
21.如权利要求20所述的配制品，其中该 L100-55、 S100和
FS30D为具有直径不超过1000μm的最大粒度的颗粒。
22.如权利要求20所述的配制品，其中这些颗粒具有直径不超过约600μm的最大粒度以及直径至少约250μm的最小粒度。
23.如权利要求19所述的配制品，其中迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比基于重量-重量计不超过约
2％。
24.如权利要求23所述的配制品，其中迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比基于重量-重量计不超过约
1％。
25.如权利要求19所述的配制品，其中迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比基于重量-重量计不超过约
10％。
26.如权利要求20所述的配制品，其进一步包含至少一种赋形剂，该赋形剂选自由表面活性剂、崩解剂、滑润剂、和粘合剂组成的组。
27.如权利要求1所述的配制品，其中当向人类患者施用时，该至少一种迟释聚合物使该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐在结肠内最大释放。
28.如权利要求27所述的配制品，其中该至少一种迟释聚合物为pH依赖性释放聚合物。
29.如权利要求28所述的配制品，其中该至少一种迟释聚合物为包含 L100-
55、 S100和 FS30D的混合物，该 L100-55、 S100
和 FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:
6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
30.如权利要求1所述的配制品，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r和至少一种另外的黑皮质素受体具有功能活性，该至少一种另外的黑皮质素受体选自由MC3r、MC4r和MC5r组成的组。
31.一种下GI道释放药物配制品，该下GI道释放药物配制品由包括以下步骤的方法制备：
a.提供 L100-55、 S100和 FS30D的溶液混合物，该
L100-55、 S100和 FS30D处于选自由以下组成的组的L100-
55:S100:FS30D重量-重量比：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75；
b.向该溶液混合物中添加Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:
6)或其药学上可接受的盐；
c.将包含Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的该溶液混合物干燥；以及
d.将干燥的混合物转化为颗粒，其中所得粒度为直径不超过约1000μm且不小于约25。
32.如权利要求31所述的方法，其中将基于重量-重量计不超过约2％的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐添加到该L100-55、 S100和 FS30D的溶液混合物中。
33.如权利要求31所述的方法，其中干燥包括真空干燥。
34.如权利要求31所述的方法，其中转化包括将该干燥的混合物粉碎并通过筛进行筛分。
35.如权利要求31所述的方法，其中所得粒度为直径在约250μm至600μm之间。
36.一种改良释放的配制品，其包含
MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐作为单一活性药物成分，以及至少一种控释聚合物，该控释聚合物选自由pH依赖性聚合物和非pH依赖性聚合物组成的组；
其中在向人类患者口服施用时，该MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐基本上完整地递送至该人类患者的结肠内腔。
37.一种适合口服施用以治疗炎症性肠病的药物组合物，该药物组合物包含：
片剂芯，该片剂芯包含活性化合物和药学上可接受的赋形剂，该活性化合物选择MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐作为单一活性药物成分；以及
肠溶包衣。
38.一种适合口服施用以治疗炎症性肠病的药物组合物，该药物组合物包含：
置于包含至少一种迟释聚合物的包封颗粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐；以及
覆盖该胶囊的肠溶包衣。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐。
40.如权利要求38或39所述的药物组合物，其中该至少一种迟释聚合物包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物。
41.一种治疗患有炎症性肠病(IBD)的人类患者的IBD的方法，该方法包括：
施用置于包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐。
42.如权利要求41所述的方法，其中该迟释聚合物为pH依赖性释放聚合物。
43.如权利要求41所述的方法，其中将该肽或其药学上可接受的盐混合在该颗粒基质内，从而形成该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物。
44.如权利要求42所述的方法，其中将该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的该混合物置于水溶性胶囊内。
45.如权利要求44所述的方法，其中该水溶性胶囊为明胶胶囊。
46.如权利要求43所述的方法，其中将该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的该混合物制成片剂。
47.如权利要求46所述的方法，其中该片剂进一步包含肠溶包衣。
48.如权利要求46所述的方法，其中该肠溶包衣包含pH依赖性释放聚合物。
49.如权利要求42所述的方法，其中该pH依赖性释放聚合物包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物。
50.如权利要求49所述的方法，其中该pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物选自由 L100-55、 S100和 FS30D组成的组。
51.如权利要求50所述的方法，其中该 L100-55、 S100和
FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:
1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
52.如权利要求41所述的方法，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐。
53.如权利要求52所述的方法，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r的功能EC50值小于约1nM。
54.如权利要求53所述的方法，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC4r的功能EC50值为对MC1r的功能EC50值的至少一百倍。
55.如权利要求53所述的方法，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC4r的功能EC50值为至少约500nM。
56.如权利要求52所述的方法，其中该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC2r、MC3r和MC5r无功能活性。
57.如权利要求41所述的方法，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐。
58.如权利要求57所述的方法，其中该包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质为包含L100-55、 S100和 FS30D的混合物，该 L100-55、
S100和 FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-
重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
59.如权利要求58所述的方法，其中该 L100-55、 S100和
FS30D为具有直径不超过1000μm的最大粒度的颗粒。
60.如权利要求58所述的方法，其中这些颗粒具有直径不超过约600μm的最大粒度以及直径至少约250μm的最小粒度。
61.如权利要求57所述的方法，其中迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比基于重量-重量计不超过约
2％。
62.如权利要求57所述的方法，其中迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比基于重量-重量计不超过约
1％。
63.如权利要求57所述的方法，其中迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比基于重量-重量计不超过约
10％。
64.如权利要求41所述的方法，其中当向该患有IBD的人类患者施用时，该至少一种迟释聚合物使该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐在结肠内最大释放。
65.如权利要求64所述的方法，其中该至少一种迟释聚合物为pH依赖性释放聚合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中该至少一种迟释聚合物为包含 L100-55、S100和 FS30D的混合物，该 L100-55、 S100和
FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:
1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
67.如权利要求41所述的方法，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r和至少一种另外的黑皮质素受体具有功能活性，该至少一种另外的黑皮质素受体选自由MC3r、MC4r和MC5r组成的组。
说明书全文

用于胃肠道特异性递送的黑皮质素受体特异性肽配制品和

方法

[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求于2018年3月23日提交的题为“Melanocortin Receptor-Specific Peptide Formulations and Methods for Gastrointestinal Tract-Specific Delivery[用于胃肠道特异性递送的黑皮质素受体特异性肽配制品和方法]”的美国临时专利申请序列号62/647,000的申请权益，并且其说明书和权利要求通过引用并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此将其通过引用以其全文并入。创建于2019年3月18日的所述ASCII副本名称为1903-187-Sequence_ST25.txt并且大小是40KB。

背景技术

[0005] 本发明的领域(技术领域)：
[0006] 本发明涉及黑皮质素受体特异性肽(特别是对黑皮质素-1受体具有选择性和特异性的环状肽)以及包含此类肽的方法、组合物和配制品用于胃肠道特异性递送(包括结肠特异性递送)以治疗黑皮质素受体介导性或反应性疾病、适应症、病症和综合征(包括黑皮质素-1受体介导性或反应性疾病、适应症、病症和综合征)的用途。
[0007] 相关技术说明：
[0008] 已经鉴定了黑皮质素受体类型和亚型的家族。受体类型包括黑皮质素-1受体(MC1r)，其通常已知在正常人黑素细胞和黑色素瘤细胞中表达，但据报道也可在多种其他细胞(包括参与免疫应答的那些细胞，例如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞和内皮细胞)中表达。通常参见Kang,L.等人,“A selective small 
molecule agonist of melanocortin-1receptor inhibits lipopolysaccharide-
induced cytokine accumulation and leukocyte infiltration in mice[黑皮质素-1受体的选择性小分子激动剂抑制小鼠脂多糖诱导的细胞因子蓄积和白细胞浸润]”
J.Leuk.Biol.[白细胞生物学杂志]80:897-904(2006)，以及其中引用的参考文献。已知多种人MC1r亚型和变体，包括在美国专利号6,693,184和7,115,393中披露的那些。除MC1r外，其他黑皮质素受体类型包括在肾上腺细胞中表达的针对ACTH(促肾上腺皮质激素)的黑皮
质素-2受体(MC2r)，主要在下丘脑、中脑和脑干以及周围组织的细胞中表达的黑皮质素-3受体(MC3r)和黑皮质素-4受体(MC4r)，以及在广泛分布的周围组织中表达的黑皮质素-5受体(MC5r)。
[0009] 高度选择性和特异性的MC1r激动肽是已知的，包括在美国专利号9,447,148、8,877,890和8,492,517中披露的环状肽以及在美国专利号9,580,466和8,933,194中披露的
直链肽。
[0010] 有许多已知的炎症性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病。两种疾病均为胃肠(GI)道慢性和复发型/缓解型IBD。最常受克罗恩病影响的GI区域是小肠和大肠(也称为结肠，并且包括直肠)，但已知克罗恩病可影响从口到肛门的整个GI道。UC通常影响包括结肠在内的大肠。这些疾病的常见症状包括腹泻、腹痛、直肠出血和体重减轻。另外，克罗恩病可能包括肠脓肿、瘘管、从肠的一个部位到另一部位并允许液体或分泌物通过的异常通道、以及肠梗阻。
[0011] 已知MC1r在某些实验性结肠炎动物模型中上调，并在肠上皮细胞表面表达。Maaser C.等人Crucial role of the melanocortin receptor MC1R in experimental 
colitis[黑皮质素受体MC1R在实验性结肠炎中的关键作用].Gut[肠病学].2006；55(10):
1415-1422。然而，迄今为止，MC1r特异性化合物用于治疗UC、克罗恩病或IBD的用途仅限于全身施用途径，例如国际公开号WO 2016/066702、PCT/EP 2015/075019中披露的。
[0012] 尽管对黑皮质素受体特异性肽有强烈的科学和药学兴趣，仍需要用于药物应用的高选择性和特异性MC1r激动肽，以及将MC1r激动肽递送至靶位点(例如结肠内腔)的配制品和方法。针对这种背景而作出本发明。

发明内容

[0013] 在一个方面，本发明提供了下胃肠(GI)道释放药物配制品，其包含置于包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质(例如微粒基质)内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐。在该配制品中，该迟释聚合物可为pH依赖性释放聚合物。可将该肽或其药学上可接受的盐混合在该颗粒基质内，从而形成该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合
物。该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物可置于水溶性胶囊内，该水溶性胶囊可为明胶胶囊，该明胶胶囊可进一步包含密封包衣和肠溶包衣中的至少一种。可替代地，可将该颗粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物制成片剂，并且该片剂可进一步包含密封包衣和肠溶包衣中的至少一种。
[0014] 该至少一种迟释聚合物可包括pH依赖性释放聚合物，其任选地包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物，例如选自由 L100-55、 S100和FS30D组成的组的共聚物。 L100-55、 S100和
FS30D共聚物能以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
[0015] 该配制品中的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐可为MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐。该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r的功能EC50值可小于约1nM，并且对MC4r的功能EC50值可进一步为对MC1r的功能EC50值的至少一百倍。在一个方面，该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC4r的功能EC50值为至少约500nM。在另一个方面，该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC2r、MC3r和MC5r可能无功能活性。
[0016] 在一个方面，该迟释聚合物在结肠内释放至少一部分MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐，并且优选地在结肠内释放治疗有效量的MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐。
[0017] 在另一个方面，该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐。在包括Ac-
Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的配制
品中，该颗粒基质(可以是微粒基质)可包括迟释聚合物混合物，该迟释聚合物混合物包含L100-55、 S100和 FS30D，其以选自由以下组成的组的
L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。该L100-55、 S100和 FS30D可以是微粒，这些微粒具有直径不
超过1000μm、优选地直径不超过约600μm的最大粒度以及直径至少约250μm的最小粒度。迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比可以是基于重量-重量计不超过约2％、或可替代地基于重量-重量计不超过约1％、或可替代地基于重量-重量计不超过约10％。该配制品可进一步包括至少一种赋形剂，该赋形剂选自由表面活性剂、崩解剂、滑润剂、和粘合剂组成的组。
[0018] 在另一个方面，当向人类患者施用时，包含置于包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐的配制品使该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐在结肠内最大释放。在这方面，该至少一种迟释聚合物可为pH依赖性释放聚合物，包括包含 L100-55、 S100和 FS30D的混
合物，该 L100-55、 S100和 FS30D以选自由以下组成的组的
L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
[0019] 在本发明的另一个方面，在包含置于包含至少一种迟释聚合物的颗粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐的配制品中，该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r和至少一种另外的黑皮质素受体具有功能活性，该至少一种另外的黑皮质素受体选自由MC3r、MC4r和MC5r组成的组。
[0020] 在另一个方面，本发明提供了下GI道释放药物配制品，该下GI道释放药物配制品由包括以下步骤的方法制备：
[0021] a.提供 L100-55、 S100和 FS30D的溶液混合物，该L100-55、 S100和 FS30D处于选自由以下组成的组的L100-
55:S100:FS30D重量-重量比：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75；
[0022] b.向该溶液混合物中添加Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐；
[0023] c.将包含Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的该溶液混合物干燥；以及
[0024] d.将干燥的混合物转化为微粒，其中所得粒度为直径不超过约1000μm，并且优选地其中所得粒度为直径在约250μm至约600μm之间。
[0025] 在前述方法中，在一个方面，将基于重量-重量计不超过约2％的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐添加到L100-55、 S100和 FS30D的溶液混合物中。在该方法中，干燥可包括真
空干燥。在该方法中，转化可包括将干燥的混合物粉碎并通过筛进行筛分。
[0026] 在另一个方面，本发明提供了改良释放的配制品，其包含
[0027] MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐作为单一活性药物成分，以及
[0028] 至少一种控释聚合物，该控释聚合物选自由pH依赖性聚合物和非pH依赖性聚合物组成的组；
[0029] 其中在向人类患者口服施用时，该MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐基本上完整地递送至该人类患者的结肠内腔。
[0030] 在另一个方面，本发明提供了适合口服施用以治疗炎症性肠病的药物组合物，该药物组合物包含：
[0031] 片剂芯，该片剂芯包含活性化合物和药学上可接受的赋形剂，该活性化合物选择MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐作为单一活性药物成分；以及
[0032] 肠溶包衣。
[0033] 在另一个方面，本发明提供了适合口服施用以治疗炎症性肠病的药物组合物，该药物组合物包含：
[0034] 置于包含至少一种迟释聚合物的包封微粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐；以及
[0035] 覆盖该胶囊的肠溶包衣。
[0036] 在该药物组合物中，该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐可为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐，并且该至少一种迟释聚合物可包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物。
[0037] 在又另一个方面，本发明提供了治疗患有IBD的人类患者的IBD的方法，该方法包括施用置于包含至少一种迟释聚合物的微粒基质内的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐。在该方法中，该迟释聚合物可为pH依赖性释放聚合物。可将该肽或其药学上可接受的盐混合在该微粒基质内，从而形成该微粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物。该微粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物可置于水溶性胶囊内，该水溶性胶囊包括明胶胶囊，该明胶胶囊可进一步包含肠溶包衣，该肠溶包衣包含pH依赖性释放聚合物。可替代地，可将该微粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物制成片剂，并且该片剂可进一步包含肠溶包衣，该肠溶包衣包含pH依赖性释放聚合物。
[0038] 在治疗人类患者IBD的方法中，该pH依赖性释放聚合物可包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物，包括选自由 L100-55、 S100和
FS30D组成的组的共聚物。 L100-55、 S100和 FS30D能以选自
由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约
23.25:23:3.75。
[0039] 在治疗患者IBD的方法中，黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐可为MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐。该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r的功能EC50值可小于约1nM。该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC4r的功能EC50值可比对MC1r的功能EC50值少至少一百倍。在一个方面，在该方法中，该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC4r的功能EC50值为至少约500nM。在另一个方面，该MC1r特异性肽或其药学上可接受的盐对MC2r、MC3r和MC5r可能无功能活性。
[0040] 在治疗患有IBD人类患者的IBD的方法的一个方面，该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐可为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐。在该方面，该微粒基质可进一步为包含 L100-55、S100和 FS30D的混合物，该 L100-55、 S100和
FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:1、或约6.2:
6.2:1或约23.25:23:3.75。该 L100-55、 S100和 FS30D可以
是微粒，这些微粒具有直径不超过1000μm且可替代地直径不超过约600μm的最大粒度。迟释聚合物的Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的百分比是基于重量-重量计不超过约2％、或可替代地基于重量-重量计不超过约
1％、或可替代地基于重量-重量计不超过约10％。
[0041] 在治疗患有IBD的人类患者的IBD的方法的一个方面，当向该患有IBD的人类患者施用时，该至少一种迟释聚合物使该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐在结肠内最大释放。该至少一种迟释聚合物可为pH依赖性释放聚合物，任选地包含
L100-55、 S100和 FS30D的混合物，该 L100-55、
S100和 FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：
约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
[0042] 在治疗患有IBD的人类患者的IBD的方法的另一个方面，该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐对MC1r和至少一种另外的黑皮质素受体具有功能活性，该至少一种另外的黑皮质素受体选自由MC3r、MC4r和MC5r组成的组。
[0043] 在另一个方面，本发明提供了基于黑皮质素受体特异性肽的药物组合物，用于在治疗GI道黑皮质素受体介导性疾病、适应症、病症和综合征中使用。
[0044] 在另一个方面，本发明提供了基于肽的黑皮质素受体特异性药物，用于在治疗MC1r相关的IBD障碍、疾病、适应症、病症和/或综合征中使用，其中该肽是置于pH依赖性聚合微粒基质内的选择性MC1r配体。
[0045] 在另一个方面，本发明提供了肽黑皮质素受体特异性药物，用于在治疗中使用，其中该治疗的施用是经由口服施用聚合基质，从而使该肽在GI道(包括结肠)内释放。
[0046] 在另一个方面，本发明提供了用于使用特异性MC1r环状肽的配制品和方法，这些MC1r环状肽可用于利用pH依赖性聚合控制释放基质靶向递送至下GI道(包括结肠)的内腔。
[0047] 在另一个方面，本发明提供了用于将特异性MC1r环状肽施用至下GI道内腔内受体的配制品和方法，其中这些肽在没有任何或基本上没有任何全身递送此类肽的情况下(包括在基本上没有任何全身递送此类肽至心血管循环的情况下)被递送。
[0048] 本发明的又另一个方面提供了通过口服施用置于pH依赖性聚合微粒基质中的肽的手段，将特异性MC1r环状肽位点特异性递送至患有IBD的患者的下GI道(包括结肠)内腔内的受体，其中该肽在没有任何或基本上没有任何导致该肽存在于患者的循环中的情况下被递送至下GI道(包括结肠)内并在其中释放。
[0049] 本发明的其他方面和新颖特征以及实用性的另外范围将部分地在下文详细的说明书中阐明，并且当本领域普通技术人员进行以下检测时将部分地显而易见的，或可以通过本发明的实践来学习。本发明的这些方面可以借助于在所附权利要求中特别指出的手段以及组合来实现和获得。
附图说明
[0050] 附图并入本说明书中并形成本说明书的一部分，说明了本发明的一个或多个实施例，并且与说明书一起用来解释本发明的原理。这些附图仅为了说明本发明的一个或多个优选的实施例的目的，并且不应被解释为限制本发明。
[0051] 图1A和图1B是经由结肠插管施用的实例9.3的肽和口服施用的柳氮磺胺吡啶对DNBS诱导的肠炎症大鼠的炎症评分(图1A)和结肠重量(图1B)的影响的图，其中“*”指示p值小于0.05，IC为结肠内，PO为口服。
[0052] 图2是通过大鼠肠道经由本发明的口服胶囊施用的、置于批次(Lot)41的微粒基质内的实例9.3的肽的进程的图，其中“结肠”包含直肠和远端结肠，“大肠”包含远端肠，并且“小肠”包含近端肠。
[0053] 图3A和图3B是经由本发明的口服胶囊施用的实例9.3的肽和口服施用的柳氮磺胺吡啶对DNBS诱导的肠炎症大鼠的基线校正的宏观损伤评分(图3A)和基线校正的炎症评分
的影响的图，其中“*”指示p值小于0.05，“**”指示p值小于0.01，并且“***”指示p值小于
0.001。
[0054] 图4是来自 微粒批次23、24和27的实例9.3的肽溶解到pH 6.8的磷酸盐缓冲液中的图。
[0055] 图5是来自各个 微粒批次的实例9.3的肽在pH 1.2至pH 7.4的pH范围内随时间溶解的图。
[0056] 图6是实例9.3的肽(肽浓度为1％或2％)在pH 1.2至pH 7.4的pH范围内随时间从微粒批次23、24、27和31溶出的溶解的图。
[0057] 图7是批次35(包含40％的批次29(60％ L-100-55/40％FS)和60％的批次31R( S100))随时间的溶出曲线的图。
[0058] 图8是来自批次40的实例9.3的肽溶解到缓冲液中的图，其中随时间调整缓冲液的pH，从pH 4.5-5.5和pH 4.5-7.5。
[0059] 图9是对于批次29、34和38，实例9.3的肽随时间和pH增加(pH 4.5至7.5)的累积释放的图。
[0060] 图10是对于批次38和41，实例9.3的肽随时间和pH增加(pH 4.5至7.5)的累积释放的图。
[0061] 图11是对于两轮批次41，实例9.3的肽随时间和pH增加(pH 4.5至7.5)的累积释放的图。

具体实施方式

[0062] 1.0定义。
[0063] 在进行本发明的描述之前，某些术语是如本文所阐明的来定义。
[0064] 在针对根据本发明的肽给出的序列中，氨基酸残基具有其常规含义，如Manual of Patent Examining Procedure[专利审查程序手册]第9版于第2400章中给出的。因此，“Nle”是正亮氨酸，“Asp”是天冬氨酸，“His”是组氨酸，“Phe”是苯丙氨酸，“Arg”是精氨酸，“Trp”是色氨酸，并且“Lys”是赖氨酸等。应当理解，D-异构体由“D-”后接三字母代码或氨基酸名称指定，使得例如D-Phe是D-苯丙氨酸。前述未涵盖的氨基酸残基包括以下氨基酸或氨基酸侧链，应当理解，此类氨基酸残基可以是L-异构体或D-异构体：
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] 术语“α氨基酸”包括具有通用结构 的任何氨基酸(以其非电离形式描绘)，其中R是任何侧链基团或氢，包括但不限于上表和段落中描述的氨基酸残基或侧链基团。
[0069] “N-取代的氨基酸”意指其中氨基酸侧链部分共价键合到主链氨基基团的任何氨基酸，包括任选地其中在α-碳位置没有除H以外的取代基的任何氨基酸。肌氨酸是N-取代的氨基酸的实例。举例来说，肌氨酸可称为Ala的N-取代的氨基酸衍生物，因为肌氨酸和Ala的氨基酸侧链部分是相同的，即甲基。每当本文中的权利要求或说明书提及“氨基酸”时，此类指定包括但不限于“N-取代的氨基酸”。
[0070] 术语“L-或D-异构体氨基酸”意指如本文定义的任何氨基酸残基，特别包括任何α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸或δ-氨基酸，包括但不限于由DNA直接编码的氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、由生物手段而不是直接由DNA表达的氨基酸、蛋白原或非蛋白原氨基酸、或任何合成或人造氨基酸。
[0071] 氨基酸，包括L-或D-异构体氨基酸，通过“酰胺键(amide bond)”或酰胺键联(amide linkages)连接在一起，以形成共价肽键，该共价肽键将一个氨基酸的主链羧酸基团与另一个氨基酸的主链氨基基团连接起来，从而形成肽键(-C(＝O)-NH-)。
[0072] 在某些情况下，基团可被氨基酸取代，例如特别是用二羧酸代替氨基酸。本文使用的一种特定的二羧酸是琥珀酸，缩写为“Suc”，其具有结构式
[0073] 术语“烷烃”包括直链或支链饱和烃。直链烷烃基团的实例包括甲烷、乙烷、丙烷等。支链或经取代的烷烃基团的实例包括甲基丁烷或二甲基丁烷、甲基戊烷、二甲基戊烷或三甲基戊烷等。通常，任何烷基基团都可以是烷烃的取代基。
[0074] 术语“烯烃”包括含有一个或多个双碳-碳键的不饱和烃。此类烯烃基团的实例包括乙烯、丙烯等。
[0075] 术语“烯基”包括含有至少一个双键的具有二至六个碳原子的直链单价烃自由基或具有三至六个碳原子的支链单价烃自由基；其实例包括乙烯基、2-丙烯基等。
[0076] 本文特定的“烷基”基团包括那些具有指定长度的烷基自由基，这些烷基自由基为直链或支链饱和脂肪族烃基团。此类烷基自由基的非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
[0077] 术语“炔烃”包括含有至少一个三键的具有二至六个碳原子的直链单价烃基或具有三至六个碳原子的支链单价烃自由基；其实例包括乙炔、丙炔、丁炔等。
[0078] 术语“芳基”包括具有6至12个环原子并且任选地被选自由以下组成的组的一个或多个取代基独立取代的单环或双环芳香族烃自由基：烷基、卤代烷基、环烷基、烷氧基、烷硫基、卤代、硝基、酰基、氰基、氨基、单取代的氨基、双取代的氨基、羟基、羧基、或烷氧基-羰基。芳基基团的实例包括苯基、联苯、萘基、1-萘基和2-萘基及其衍生物等。
[0079] 术语“芳烷基”包括自由基-RaRb，其中Ra是亚烷基(二价烷基)基团，而Rb是如上定义的芳基基团。芳烷基基团的实例包括苄基、苯乙基、3-(3-氯苯基)-2-甲基戊基等。
[0080] 术语“脂肪族”包括具有烃链的化合物，例如像烷烃、烯烃、炔烃及其衍生物。
[0081] 术语“酰基”包括基团R(C＝O)-，其中R是有机基团，例如烷基、芳基、杂芳基、碳环基或杂环基。非限制性实例为乙酰基基团CH3-C(＝O)-，本文称为“Ac”。如本文所用，R可包含C1至C17直链或支链烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基或烷基芳基。
[0082] 当如上所定义的烷基或经取代的烷基基团通过一个或多个羰基{-(C＝O)-}基团键合时，肽或脂肪族部分被“酰化”。肽最通常在N-末端被酰化。
[0083] 术语“杂芳基”包括含有选自氮、氧和硫的1至4个杂原子的单环和双环芳香族环。5元或6元杂芳基为单环杂芳香族环；其实例包括噻唑、噁唑、噻吩、呋喃、吡咯、咪唑、异噁唑、吡唑、三唑、噻二唑、四唑、噁二唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪等。双环杂香族环包括但不限于苯并噻二唑、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、喹啉、苯并三唑、苯并噁唑、异喹啉、嘌呤、呋喃吡啶和噻吩并吡啶。
[0084] 如本文所用，术语“酰胺”包括具有附接到羰基基团的三价氮的化合物，即-C(＝O)-NH2(即一级酰胺)、-C(＝O)-NHRc和-C(＝O)-NRcRd，其中Rc和Rd中的每一个独立地代表有机基团。当本文提及经取代的酰胺基团时，意指所述有机基团(Rc和Rd)中的至少一个被取代。酰胺的实例包括甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺等。
[0085] “酰亚胺”包括含有亚胺基基团(-C(＝O)-NH-C(＝O)-)的化合物。
[0086] “胺”包括含有氨基基团(-NH2)、-NHRa和-NRaRb的化合物，其中Ra和Rb中的每一个独立地代表有机基团。当本文提及经取代的胺基团时，意指所述有机基团(Ra和Rb)中的至少一个被取代。
[0087] “腈”包括作为羧酸衍生物并含有与有机基团结合的(-CN)基团的化合物。
[0088] 术语“卤素”包括卤素原子氟、氯、溴和碘，以及包括一个或多个卤素原子的基团，例如-CF3等。
[0089] 如在药物组合物中的术语“组合物”涵盖包含一种或多种活性成分以及组成载体的一种或多种惰性成分的产品；以及由任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，药物组合物涵盖通过将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合而制成的任何组合物。
[0090] 对于黑皮质素受体，“激动剂”是指可与黑皮质素受体相互作用并引发药理学应答(包括但不限于受体的激活，包括启动信号转导，例如腺苷酸环化酶激活，黑皮质素受体表征)的内源性物质、药物物质或化合物(包括本文披露的某些肽化合物)。黑皮质素受体激动剂可以是MC1r、MC2r、MC3r、MC4r和MC5r中的一个或多个的激动剂。对于本发明，优选的黑皮质素受体激动剂是MC1r的激动剂。
[0091] “α-MSH”是指肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2(SEQ ID NO:2)及其类似物和同系物，包括但不限于NDP-α-MSH。
[0092] “NDP-α-MSH”是指肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2(SEQ ID NO:3)及其类似物和同系物。
[0093] “EC50”是指激动剂(包括部分激动剂)的摩尔浓度，其产生对该激动剂50％最大可能应答。举例来说，测试化合物在浓度为72nM时产生50％最大可能应答，如在MC1r细胞表达系统中的cAMP测定所确定的，则该化合物的EC50为72nM。除非另有说明，否则与EC50测定相关的摩尔浓度以纳摩尔/升(nM)计。
[0094] “Ki(nM)”是指平衡抑制剂解离常数，其表示竞争性化合物在没有竞争者的情况下在平衡下与受体的一半结合位点结合的摩尔浓度。通常，Ki的数值与化合物对受体的亲和力成反比，因此如果Ki低，则亲和力高。Ki可使用Cheng和Prusoff的方程式确定(Cheng Y.,Prusoff W.H.,Biochem.Pharmacol.[生物化学与药理学]22:3099-3108,1973)：
[0095]
[0096] 其中“配体”是竞争者的浓度，而KD是竞争者产生50％受体占有率时竞争者的受体亲和力的反向量度。除非另有说明，否则与Ki测定相关的摩尔浓度以nM计。Ki可根据特定受体(例如MC1r、MC3r、MC4r或MC5r)、特定物种(例如人类或鼠类)和特定配体(例如α-MSH或NDP-α-MSH)来表达。
[0097] “抑制”是指与已知标准相比，在竞争性抑制测定中受体结合的百分比减弱或减少。因此，“1μM处的抑制(NDP-α-MSH)”是指(例如在下文所述的测定条件下)通过添加确定量的待测化合物(例如1μM的测试化合物)，NDP-α-MSH结合的减少百分比。举例来说，不抑制NDP-α-MSH结合的测试化合物具有0％抑制，而完全抑制NDP-α-MSH结合的测试化合物具有100％抑制。典型地，如下文所述，可检测标记的测定用于竞争性抑制测试(例如用I125标记的NDP-α-MSH)或镧系螯合荧光测定(例如用Eu-NDP-α-MSH)。然而，已知测试竞争性抑制的其他方法，包括使用不同的标记或标签系统，并且通常本领域已知的用于测试竞争性抑制的任何方法可用于本发明。因此可以看出，“抑制”是确定测试化合物是否减弱α-MSH与黑皮质素受体结合的一种量度。
[0098] “结合亲和力”是指化合物或药物与其生物靶标结合的能力，在本文中以Ki(nM)表示。
[0099] “Emax”是指化合物在特定的黑皮质素受体表达细胞系统中所能达到的最大功能活性，例如腺苷酸环化酶的最大刺激。NDP-α-MSH达到的最大刺激被指定为100％的Emax，而能够刺激NDP-α-MSH的一半最大活性的化合物被指定为具有50％的Emax。在本文所述的测定条件下Emax为70％或更高的本发明化合物可被分类为激动剂，Emax在10％和70％之间的化合物可被分类为部分激动剂，而Emax低于10％的化合物可被分类为非活性化合物。
[0100] 通常，“功能活性”是在化合物激活受体后，受体信号传导的量度，或受体(如黑皮质素受体)相关信号传导变化的量度。黑皮质素受体通过激活异源三聚体G蛋白启动信号转导。在一个方面，黑皮质素受体通过GαS发出信号，GαS通过腺苷酸环化酶催化产生cAMP。因此，确定腺苷酸环化酶的刺激(例如确定腺苷酸环化酶的最大刺激)是功能活性的一种测量，也是本文例举的主要测量。然而，应当理解，功能活性的替代性测量可以用于本发明的实践中，并且具体地考虑和包括在本发明的范围内。因此，在一个实例中，可使用由以下报道的结合到钙的特定荧光分子(如Fura2)和以下披露的方法来测量细胞内游离钙：
Mountjoy  K.G.等人,Melanocortin receptor-medicated  mobilization of 
intracellular free calcium in HEK293 cells.[HEK293细胞中细胞内游离钙黑皮质素
受体介导的动员]Physiol Genomics[生理学基因组学]5:11-19,2001，或Newman等人,
Activation of the melanocortin-4 receptor mobilizes intracellular free 
calcium in immortalized hypothalamic neurons.[黑皮质素-4受体的激活动员永生化
下丘脑神经元细胞内游离钙]J Surg Res[外科研究杂志]:132:201-207,2006。Fluo-4是常用的替代性钙结合染料(Nohr等人,The orphan G protein-coupled receptor GPR139 is activated by the peptides:Adrenocorticotropic hormone(ACTH),α-,and β-
melanocyte stimulating hormone(α-MSH,and β-MSH),and the conserved core motif HFRW[孤儿G蛋白偶联受体GPR139被促肾上腺皮质激素(ACTH)、α-和β-黑素细胞刺激激素(α-MSH和β-MSH)以及保守的核心基序HFRW等肽激活].Neurochem Int[国际神经化学]102:
105-113,2017)。在Ca2+释放事件的更上游，以及在相同途径中，也可以通过测量磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯生成的三磷酸肌醇或二酰甘油来测量激活，例如可商购的HTRF测定(Liu等人,Comparison on functional assays for Gq-coupled GPCRs by measuring inositol monophospate-1 and intracellular calcium in 1536-well plate format[通过在1536孔板格式中测量肌醇单磷酸-1和细胞内钙来比较Gq偶联GPCR的功能测定].Curr Chem 
Genomics[现代化学与基因组学]1:70-77,2008)。功能活性的又另一个量度是由调控途径的激活而导致的受体内化，例如使用以下披露的方法：Nickolls S.A等人,Functional 
selectivity of melanocortin 4 receptor peptide and nonpeptide agonists:
evidence for ligand specific conformational states[黑皮质素4受体肽和非肽激动
剂的功能选择性：配体特异性构象状态的证据].J Pharm Exper Therapeutics[药学实验治疗学杂志]313:1281-1288,2005。功能活性的又另一个量度是与G蛋白受体激活相关的核苷酸的交换和交换率，例如G蛋白α亚基上的GDP(鸟苷二磷酸)与GTP(鸟苷三磷酸)的交换，其可以用任何手段测量，包括使用鸟苷5′-(γ-[35S]硫代)-三磷酸酯的放射分析，如在以下中披露的：Manning D.R.,Measures of efficacy using G proteins as endpoints:
differential engagement of G proteins through single receptors[使用G蛋白作为
终点的功效测量：G蛋白通过单个受体的差异结合].Mol Pharmacol[分子药理学]62:451-
452,2002。设计了相对新的测定平台来测量属于Gi、Gq、Gs、Gi2/i3亚家族的14个不同的Gα物种的活性/结合，因为其与受体相关，该测定平台使用基于BRET(生物发光共振能量转移)的生物传感器来测量配体结合时Gα和Gγ亚基的脱离(Zhao等人,Biased signaling of 
protease-activated receptors[蛋白酶激活受体的偏向性信号传导].Front Endocrinol[内分泌学前沿]5:67,2014，vander Westhuizen等人,Quantification of ligand bias for clinically relevant β2-adrenergic receptor ligands:Implications for drug taxonomy[临床相关β2-肾上腺素能受体配体的配体偏倚量化：药物分类学的意义]
.Molecular Pharm[分子药理学]85:492-509,2014)。已经开发了各种基于基因的测定来测量G偶联蛋白的激活，例如以下中披露的方法：Chen W.等人,A colorimetric assay from measuring activation of Gs-and Gq-coupled signaling pathways[通过测量Gs-和Gq-偶联信号传导通路的活性的比色法].Anal Biochem[分析生物化学]226:349-354,1995；
Kent T.C.等人,Development of a generic dual-reporter gene assay for screening G-protein-coupled receptors[用于筛选G蛋白偶联受体的通用双报告基因测定的开发]
.Biomol Screening[生物分子筛选杂志],5:437-446,2005；或Kotarsky K.等人,Improved receptor gene assays used to identify ligands acting on orphan seven-
transmembrane receptors[用于识别作用于孤儿七跨膜受体的配体的改善的受体基因测
定].Pharmacology&Toxicology[药理学与毒理学]93:249-258,2003。Chen等人的比色测定已适于用于测量黑皮质素受体激活，如以下披露的：Hruby V.J.等人,Cyclic lactamα-
4 5 7 10]
melanocortin analogues of Ac-Nle -cyclo[Asp ,D-Phe ,Lys α-melanocyte-
stimulating hormone-(4-10)-NH2 with bulky aromatic amino acids at position 7 shows high antagonist potency and selectivity at specific melanocortin 
receptors[在7位有大量芳香族氨基酸的Ac-Nle4-cyclo[Asp5,D-Phe7,Lys10]α-黑素细胞刺激性激素-(4-10)-NH2的环状内酰胺α-黑皮质素类似物在特定的黑皮质素受体处显示出高的拮抗剂效力和选择性].J Med Chem[医物化学杂志]38:3454-3461,1995。通常，功能活性可通过任何方法来测量，这些方法包括确定G偶联受体的激活和/或信号传导的方法，以及进一步包括之后可能开发或报道的方法。前述各条款及其中披露的方法各自如同完全阐明一样通过引用并入本文。
[0101] 当肽的EC50值(如果可以确定)大于约1,000nM时，该肽“无功能活性”。
[0102] 缩写“μm”是国际单位制(SI)度量单位的符号，称为微米(micrometer或micrometre)，通常也称为微米(micron)。
[0103] 本文所用的术语“颗粒”包括(在不限制其性质和尺寸的情况下)任何颗粒、微粒、球体、珠、粒子、球粒、微粒子(particulates)或可被掺入到口服剂型中的任何结构单元，并且包括“微粒(microparticle)”，其如本文所用包括直径小于约1000μm的颗粒。
[0104] 如本文所用的术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指在患者患有特定疾病或障碍时发生的行为，其降低该疾病或障碍的严重性。
[0105] 如本文所用，术语“药理学有效量”(包括“治疗有效量”)意指根据本发明施用的足以诱导期望的治疗效果或生物效应的肽量。
[0106] 如本文所用，术语“预防上有效的”或“具有预防性”意指包括本发明的肽的化合物的量，该量可使具有如下医疗状况的哺乳动物的痛苦得到预防或抑制、或减轻该痛苦，该医疗状况是医师或其他临床医生在患者开始患有特定疾病或障碍之前试图预防、抑制或缓解的医疗状况。
[0107] 2.0配制品和用途。
[0108] 2.1在一个优选的实施例中，黑皮质素受体特异性肽，优选MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐，以pH依赖性释放形式配制，其中该黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐被置于包含至少一种迟释聚合物的颗粒或微粒基质中。可将该肽或其药学上可接受的盐混合在该微粒基质内，从而形成该微粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物。可将该微粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物置于水溶性胶囊内，该胶囊可为明胶胶囊。可替代地，可将该微粒基质与该肽或其药学上可接受的盐的混合物制成片剂，并且该片剂可进一步包含密封包衣和肠溶包衣中的至少一种。该至少一种迟释聚合物可包括pH依赖性释放聚合物，其任选地包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物，例如选自由 L100-55、 S100和 FS30D组成的组的共聚物。L100-55、 S100和 FS30D共聚物能以选自由以下组成的组
的L100-55:S100:FS30D重量-重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。
[0109] 在另一个实施例中，黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐为Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐。在包括Ac-
Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)或其药学上可接受的盐的配制
品中，该颗粒或微粒基质可包括pH依赖性迟释聚合物混合物，该混合物包含
L100-55、 S100和 FS30D，该 L100-55、 S100和
FS30D处于选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-重量比：约6:6:1、
或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。 L100-55、 S100和
FS30D可以是颗粒(例如微粒)，这些颗粒具有直径不超过1000μm、优选地直径不超过约600μm、以及进一步优选地直径至少约250μm的最大粒度。在一个方面，最大粒度可包含直径至少约1500μm、1400μm、1300μm、1200μm、1100μm、1000μm、900μm、800μm、700μm、600μm、或500μm。
在另一个方面，最大粒度可不小于直径约2.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、50μm、75μm、
100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、300μm、350μm、或400μm。在又另一个方面中，最小和最大直径选自前述组中，并且最小粒径与最大粒径之间的差不超过约100μm、125μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、或600μm。在某种程度上，最大粒径、最小粒径、和最小粒径与最大粒径之间的差可被优化以获得黑皮质素受体特异性肽向期望治疗的GI道区域的最大递送。
[0110] 在一些实施例中，黑皮质素受体特异性肽，优选MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐以pH依赖性释放形式调配。可替代地，此类肽以在GI道的特定区域(例如十二指肠、空肠、回肠、回肠末端、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠或直肠)释放肽的形式配制。在一个方面，配制品可含有包覆有MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐的惰性载体以及在特定pH(例如ρΗ5或ρΗ7)下释放该肽的肠溶包衣。在一个方面，十二指肠或空肠释放的优选pH为pH 4.5-5.5或pH 5.5-6.5。在另一个方面，回肠、回肠末端或结肠释放的优选pH为pH 5.5-6.5或pH 6.5-7.5。如果使用惰性载体，则其可包括但不限于甘露醇、乳糖、微晶纤维素、或淀粉。
[0111] 对于某些实施例和IBD适应症(例如UC)，期望利用如下口服组合：在多于两小时但小于七小时的时间段内，优选地在约四至约七小时的时间段内，在pH约5.5处开始释放活性药物(例如MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐)，但在pH 5.5处释放至多少于20％的该活性药物，并且在pH大于约6.0或可替代地约6.5处释放不少于80％的该活性药物。
[0112] 在另一个实施例中，将MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐配制在颗粒或微粒基质中，例如置于胶囊中的迟释聚合物混合物或pH依赖性释放聚合物混合物，该胶囊可进一步包含密封包衣或肠溶包衣、或包含两者。pH依赖性释放聚合物可包括包含L100-55、 S100和 FS30D的聚合物混合物，该 L100-55、
S100和 FS30D以选自由以下组成的组的L100-55:S100:FS30D重量-
重量比存在：约6:6:1、或约6.2:6.2:1或约23.25:23:3.75。 L100-55、
S100和 FS30D可以是微粒，这些微粒具有直径不超过1000μm、优选地直径不超过
约600μm、并且进一步直径至少约25μm、或直径至少约250μm的最大粒度。
[0113] 在另一个实施例中，MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐以颗粒或片剂形式配制，该颗粒或片剂形式包括片剂芯、密封包衣和肠溶包衣，其中该片芯包含一种或多种药学上可接受的赋形剂以及该MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐。通过举例而非限制，片剂芯的配制品可包括糖醇，例如阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、甘油、异麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇或木糖醇、或具有任何期望的平均粒度(例如约50μm、约100μm、约
250μm、或优选小于约1,000μm的任何期望的平均粒度)的微晶纤维素。片剂或其他配制品可进一步包括药学上可接受的赋形剂，例如聚维酮、十二烷基硫酸钠、淀粉乙醇酸钠、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)或硬脂酸镁。此类赋形剂包含可作为表面活性剂、崩解剂、润滑剂、或粘合剂的药剂。因此，可使用通常药学上的粘合剂(例如聚维酮)、稀释剂、助流剂、填料(例如微晶纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸镁)、崩解剂(例如交联羧甲基纤维素钠)、防腐剂、着色剂等。
[0114] 2.2本文披露的组合物、配制品和方法可以用于医疗应用以及畜牧业或兽医应用。典型地，方法用于人类，但还可以用于其他哺乳动物。术语“患者”表示哺乳动物个体，并且因此贯穿本说明书和在权利要求中使用。本发明的主要应用涉及人类患者，但本发明可以应用于实验动物、家畜、动物园动物、野生动物、宠物、竞技动物或其他动物。临床适应症和特定用途包括以下：
[0115] 本发明的肽、组合物、配制品和方法旨在治疗受试者的IBD，包括但不限于UC和克罗恩病。在另一个方面，炎性疾病包括IBD的形式，例如克罗恩病、UC、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、贝赫切特综合征、感染性结肠炎和未定型结肠炎。
[0116] 各种细胞因子的表达在炎性过程(包括继发于或伴随某些IBD形式的炎性过程)期间增加。TNF-α是一种多效性细胞因子，主要由巨噬细胞产生，也可由其他类型的细胞产生。
在炎性过程期间增加的其他细胞因子包括IL-1和IL-6。虽然TNF-α等细胞因子在许多情况下都有有益的作用，但水平显著增加、或水平增加持续长时间段都可能产生病理学作用。
[0117] 在一个实施例中，本发明涉及使用本发明的一种或多种肽来减少促炎性细胞因子的产生和表达(包括降低继发于IBD的促炎性细胞因子的产生和表达)的方法。降低促炎性细胞因子的产生和表达(包括但不限于TNF-α、IL-1和IL-6中的一种或多种)优选地发生于肽在疾病(例如IBD)部位处从组合物释放后的短时间内。
[0118] 在相关实施例中，本发明涉及使用本发明的一种或多种肽来增加抗炎性细胞因子的产生和表达的方法。抗炎性细胞因子的产生和表达的增加(包括但不限于IL-10)优选地发生于肽在疾病(例如IBD)部位处从组合物释放后的短时间内。
[0119] 通常，向患者施用的MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐的实际量将在相当广泛范围内变化，这取决于施用模式、所使用的配制品以及期望的应答。治疗剂量是通过前述任何手段或本领域已知的任何其他手段施用的、足以产生期望治疗效果的量。因此，治疗有效量包括本发明的肽或药物组合物的量，该量足以在治疗上缓解患者的IBD，或预防或延迟IBD(包括UC和克罗恩病)的发作或复发，或在预防或限制IBD(包括UC和克罗恩病)恶化的复发方面是预防上有效的或具有预防性。
[0120] 通常，在本发明的实施例中使用的MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐具有高度活性。例如，可将环状肽以约0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、50、100、500、1000或5000μg/kg体重(取决于所选的特定肽、递送配制品、期望的治疗应答、以及本领域技术人员已知的其他因素)向GI道内腔(例如结肠或大肠的内腔，优选地在IBD或其他疾病部位的近端)施用。
[0121] 3.0某些适应症的组合疗法。
[0122] 本发明的肽、组合物和方法可用于通过与一种或多种其他药学上有活性的化合物组合施用来治疗IBD、UC或克罗恩病，或任何MC1r介导性或反应性GI道疾病、适应症、病症或综合征。这种组合施用可通过包含本发明的肽和一种以上其他药学上有活性的化合物两者的单一剂型的手段进行，该单一剂型包括片剂或胶囊。可替代地，组合施用可通过施用两种不同剂型的手段进行，其中一种剂型含有本发明的肽，而另一种剂型包含另一种药学上有活性的化合物。在这种情况下，剂型可以相同或不同。术语“共同施用”指示在组合疗法中的至少两种化合物中的每一种在相应生物活性或效应时间段重叠的时间范围内施用。因此，该术语包括连续施用和同时施用化合物，其中一种化合物是本发明的肽中的一种或多种。如果共同施用一种以上的化合物，则两种或多种化合物的施用途径不必相同。无意限制组合疗法，以下举例说明可以使用的某些组合疗法。
[0123] 对于与炎症相关的GI道疾病、适应症、病症和综合征的治疗，本发明的肽可用于组合疗法，包括通过与一种或多种抗炎剂共同施用的手段。一类抗炎剂为糖皮质激素类，包括但不限于可的松，包括醋酸可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、泼尼松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮和醛固酮。另一类抗炎剂为氨基水杨酸盐，包括但不限于5-氨基水杨酸，例如氨基水杨酸、巴柳氮和奥沙拉嗪。
[0124] 可用于组合疗法(包括通过共同施用的手段)的其他抗炎剂包括阿司匹林、非类固醇抗炎药(NSAID)(如布洛芬和萘普生)、TNF-α抑制剂(如替尼达普和雷帕霉素或其衍生物)或TNF-α拮抗剂(例如，英夫利昔单抗、OR1384)、环氧合酶抑制剂(即COX-1和/或COX-2抑制剂)、CTLA4-lg激动剂/拮抗剂、CD40配体拮抗剂、IMPDH抑制剂(如霉酚酸酯)、整合蛋白拮抗剂、α-4β-7整合蛋白拮抗剂、细胞粘附抑制剂、干扰素γ拮抗剂、ICAM-1、前列腺素合成抑制剂、布地奈德、氯法齐明、p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂、蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、IKK抑制剂、治疗肠易激综合征的其他疗法(例如，像美国专利号6,184,231中披露的那些)、或其他NF-κB抑制剂，如皮质类固醇、卡弗他丁(calphostin)、CSAID、4-取代的咪唑并[1,2-A]喹喔啉(如美国专利号4,200,750披露的)；白细胞介素-10、水杨酸盐、一氧化氮和其他免疫抑制剂；以及核易位抑制剂，如脱氧精胍素。可共同施用的免疫抑制剂药物包括硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢霉素和甲氨蝶呤。共同施用也可与肿瘤坏死因子(TNF)-α抑制剂(如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗)一起使用。其他可使用的生物疗法包括那他珠单抗、维多珠单抗和优特克单抗。共同施用也可与质子泵抑制剂(如奥美拉唑、泮托拉唑、埃索美拉唑(esomeprazole)、兰索拉唑、雷贝拉唑、右兰索拉唑、雷贝拉唑钠、奥美拉唑镁、泮托拉唑钠、萘普生/埃索美拉唑、埃索美拉唑镁、埃索美拉唑钠或奥美拉唑/vi碳酸盐离子)，或与控制小肠细菌过度生长的抗生素(如利福昔明或新霉素)一起使用。
[0125] 4.0多颗粒递送配制品的制备方法。
[0126] 在一个方面，将本发明中使用的肽(包括MC1r特异性肽)配制成用于将完整肽口服递送至GI道内腔，优选GI道下部区域的内腔，并且进一步优选在GI道中的疾病(例如IBD)的任何部位之前(包括之前紧邻处)。许多药物分子，特别是包含蛋白质或肽的蛋白质类药物，期望绕过胃和GI道的上部区域(如小肠)将药物递送至GI的下部区域。口和胃中包括各种可以破坏氨基酸链的酶。小肠产生多种肽酶，这些肽酶可以将氨基酸链(包括肽)还原为小单位，包括可以被吸收和消化的二肽和单个氨基酸残基。因此，为了将完整的肽递送到下GI道(包括结肠)内腔，必须使用可以在不降解肽的情况下穿过胃和GI道上部区域的方法和配制品。如果肽在胃酸性环境中由于pH或酶活性而不稳定，也可使用该方法。
[0127] 有几种方法可以概念上用于实现下GI道靶向，包括使用前药、包覆pH敏感性聚合物、设计延时释放剂型或利用可生物降解聚合物，如仅由结肠细菌降解的偶氮聚合物和多糖。每个系统既有优点也有缺点。
[0128] 单一单位剂型进行结肠递送可能会具有配制品过早崩解(原因是在受试者间和受试者内生存能力高以及重现性差)的缺点，从而导致结肠局部治疗作用丧失。多颗粒递送系统具有如生物利用度好、降低局部刺激风险和可预测胃排空等优点。
[0129] 因此，在一个方面，本发明提供了含有黑皮质素受体特异性肽(例如MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐)的颗粒剂型，该颗粒形式在胃酸性环境中保护黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐，并预防或限制小肠或上GI道中蛋白酶降解，但在下GI道(例如大肠或结肠)中释放完整的黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐。通过该手段，黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐结合并激动存在于下GI道(包括大肠或结肠)内腔上或内腔内、或下GI道(包括大肠或结肠)内腔附近的一个或多个MC受体(优选MC1r)，从而影响治疗应答。
[0130] 该方法可通过使用pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物利用迟释(肠溶)微粒来使用。可使用的pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物的一种形式是赢创工业集团(Evonik Industries)生产的 聚合物，应当理解使用其他和不同的pH敏
感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物，并且其他和不同的pH敏感性聚合物或共聚物可用于本发明。
[0131] 黑皮质素受体特异性肽基于重量-重量计可占pH敏感性迟释颗粒的从约0.1％至约30％。优选地，黑皮质素受体特异性肽基于重量-重量计占pH敏感性迟释颗粒的约1％至约10％、或约2％至约5％。
[0132] 颗粒或微粒可填充到胶囊(如硬明胶胶囊)中，或可配制成片剂、珠、粒子、粉末、囊片、糖锭(troch)、袋剂(sachet)、扁囊剂(cachet)、小袋、胶剂(gum)、粉(sprinkle)和混悬剂等。在一个方面，如果包含黑皮质素受体特异性肽、优选MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐的颗粒以及pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物被配制成固体形式，例如胶囊或片剂，则该胶囊或片剂可包覆有密封包衣或肠溶包衣、或两者。通常，任何固体药物递送形式(包括片剂、珠、粒子、囊片等)可包覆有密封包衣或肠溶包衣、或两者。肠溶包衣可包含pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物。
[0133] 在一个方面，本发明提供了配制品、剂型及方法，其中少于10％的活性药物(例如黑皮质素受体特异性肽、MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐)在两小时的时间段内、在约1至约3的酸性pH下释放，少于另外10％的活性药物在一小时的时间段内、在从约4.5至5.5的酸性pH下释放，并且不少于80％的活性药物在四至七小时的时间段内、在pH大于约6下释放。
[0134] 本发明的特定用途是pH依赖性聚甲基丙烯酸酯，例如 L100-55、L100、 S100和 FS30D。这些聚甲基丙烯酸酯包含：
[0135] L100-55：固体物质。该产品含有固体物质中0.7％十二烷基硫酸钠Ph.Eur./NF和2.3％聚山梨酯80Ph.Eur./NF。 L100-55含有基于甲基丙烯酸和丙
烯酸乙酯的阴离子共聚物。游离羧基基团与酯基的比为约1:1。单体沿着共聚物链随机分布。基于SEC方法， L100-55的重量平均摩尔质量(Mw)为约320,000g/mol。
[0136] L100：固体物质。该产品含有固体物质中0.3％月桂硫酸钠Ph.Eur./NF。L100为基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子共聚物。 L100中
游离羧基基团与酯基的比为约1:1。基于SEC方法， L100的重量平均摩尔质量
(Mw)为约125,000g/mol。
[0137] S100：固体物质。该产品含有固体物质中0.3％月桂硫酸钠Ph.Eur./NF。 S100为基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子共聚物。 S100
中游离羧基基团与酯基的比为约1:2。基于SEC方法， S100的重量平均摩尔质量
(Mw)为约125,000g/mol。
[0138] FS30D：以含30％干物质的水分散体形式提供。将水根据Ph.Eur.“Purified Water in bulk[散装纯化水]”规范以及根据USP“Purified Water[纯净水]”的电导率规范进行测试。分散体含有固体物质中0.3％十二烷基硫酸钠Ph.Eur./NF和1.2％聚山梨酯80Ph.Eur./NF，作为乳化剂。 FS30D是基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯
和甲基丙烯酸的阴离子共聚物的水分散体。游离羧基基团与酯基的比为约1:10。单体沿着共聚物链随机分布。基于SEC方法， FS30D的重量平均摩尔质量(Mw)为约280,
000g/mol。
[0139] 1g的 L100、 L100-55或 S100溶解于7g甲醇、乙醇、水性异丙醇和丙酮(含有约3％的水)以及1N氢氧化钠中，以获得清澈至浑浊的溶液。这些特定的 制剂几乎不溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚和水。 L100-55在
高于pH 5.5时溶解； L100在高于pH 6.0时溶解； S100在高于pH 7.0
时溶解，并且 FS30D在高于pH 7.0时溶解。
[0140] 多种技术可用于药物包封。在一个方面，可利用通过固体分散然后进行微粉化以形成微粒，这是简单的且提供高包封效率及高产率。
[0141] 为了制备药物产品，黑皮质素受体特异性肽、MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐可分散于合适溶剂中，例如丙酮、甲醇或水，或前述部分或全部的组合。 共聚物可溶解于甲醇或丙酮中。伴随搅拌将包含肽的药物分散体添加到共聚物溶液中。然后将所得混合物真空干燥、粉碎并通过合适的筛进行筛分。在一个方面，使用30目至60目筛，其中在60目筛上收集的所得粒度为直径在250μm至600μm之间。在另一个方面，将在60目筛上收集的颗粒悬浮或用pH 1.2的0.1M盐酸溶液冲洗，以去除表面MC1r肽药物分子，随后干燥。所得微粒可被包封或压片。填充的胶囊或片剂也可进行肠溶包衣，以进一步降低上胃肠道释放的药物量，从而允许更多的药物到达结肠。
[0142] 可替代地，甲醇、甲醇-水(例如2:1的混合物)和水可用作黑皮质素受体特异性肽或其药学上可接受的盐的溶剂/分散剂。可替代地，丙酮或丙酮-水可用作溶剂/分散剂。在一个方面，如果使用水，则其使用量可不大于溶解一种或多种共聚物所用的丙酮量的约3％。
[0143] 在一个实施例中，本发明中所用的配制品可掺入 聚合物，例如像可溶其在较低pH下释放相关肽的L100-55，其与可溶且在较高pH下释放相关肽的聚合物(例如
S100或FS30D，或两者)组合。此共混物确保在更大的pH范围内释放。更宽的pH范
围释放优于现有技术配制品在单一特定pH下的结肠释放，因为它允许在GI道(一些患者可能在此处具有疾病)较高处的部分释放，并且还因为它使得在pH GI道比正常受试者低的患者GI道部分(其中较低pH值是由IBD疾病状态引起)释放，。如果期望，如在某些IBD疾病状态下的GI道pH较低的情况下，可部分中和不同的 聚合物(例如， L100-
55)和/或添加其他添加剂，如海藻酸、山梨酸或琥珀酸或其添加的盐，以增加药物在较低pH(如4.5至5.5)下的释放。利用广泛范围的pH释放曲线结合黑皮质素受体特异性肽(该黑皮质素受体特异性肽与GI道内腔表面上或其中的受体结合而不是通过全身吸收提供治疗益
处)，提供适合治疗多种多样患者的治疗剂。因此，由于黑皮质素受体特异性肽几乎没有或完全没有发生全身吸收，并且可能发生的任何全身吸收几乎没有或完全没有治疗益处，因此配制品优选旨在通过存在或可能存在疾病的GI道范围而提供益处，并在该范围内提供足够剂量以缓解或治愈IBD。特别需要注意的是，由于黑皮质素受体特异性肽几乎没有或完全没有发生全身吸收，几乎没有或全身毒性或全身副作用或有害作用限制可递送至胃肠道内腔的黑皮质素受体特异性肽的量。
[0144] 在一些实施例中，使用配制成迟释(肠溶)颗粒或微粒的不同pH敏感性甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸共聚物的组合。在一些实施例中，颗粒或微粒包含 L100-55和S100，其中L100-55与S-100的重量-重量比为约1:1、或约2:3、或约1:2、或约3:
2、或约2:1。在其他实施例中，颗粒或微粒包含 L100-55、 L100和
S100，其中L100-55:L100:S-100的重量-重量比为约1:1:1、或约4:3:3、或约3:4:
3、或约1:1:1、或约1:2:1、或约1:2:2、或约2:1:1、或约2:2:1、或约2:1:2。在其他实施例中，颗粒或微粒包含 L100-55、 S100和 FS30D，其中L100-55:
S100:FS30D的重量-重量比为约6:6:1、或约23.35:23:3.75、或约5:5:1、或约4:4:1、或约6:
5:1、或约5:6:1、或约3:3:1、或约6:5:2、或约5:6:2。特别优选的是L100-55:S100:FS30D的重量-重量比为约6:6:1或约23.25:23:3.75。
[0145] pH敏感性迟释聚合物中黑皮质素受体特异性肽的量基于重量-重量计可占约0.1％至约30％。优选地，黑皮质素受体特异性肽基于重量-重量计占pH敏感性迟释聚合物的约1％至约10％、或约2％至约5％。
[0146] 通常，由本文所述方法或由包括但不限于加热、冷却、冷冻干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、快速溶剂蒸发、溶剂重结晶、微波诱导沉淀、超声诱导沉淀等技术制备置于pH依赖性释放聚合物基质内的黑皮质素受体特异性肽的固体形式。所得固体形式的粒度(可以例如从直径约25μm或更大的最小尺寸变化到直径约1000μm或更小的最大尺寸)可以例如通过粒度缩分技术(包括研磨、碾磨、微粉化或超声处理，结合或不结合通过合适的筛进行筛分)或本领域已知的其他方法来控制，从而从设定的最小值到设定的最大值选择期望粒度范围。在一个方面，粒度为直径小于约1000μm，或直径小于约600μm，且损伤大于约25μm，或直径大于约250μm。
[0147] 5.0肠溶包衣。
[0148] 在一个方面，配制黑皮质素受体特异性肽、MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐以供口服递送，例如以胶囊或片剂形式。肽可被配制成使该肽以胶囊或片剂形式包裹在肠溶保护剂中，优选地使该肽在片剂或胶囊穿过胃之后再释放，并且任选地进一步穿过全部或部分小肠后再释放。在本申请的上下文中，应当理解，术语肠溶包衣或材料是指基本上完整地穿过胃、但会在肠(优选但不限于大肠)中快速崩解以释放活性肽药物物质的包衣或材料。可以使用的肠溶包衣溶液包括邻苯二甲酸乙酸纤维素，以及任选的其他成分，例如氢氧化铵、乙酸甘油酯、乙醇、亚甲基蓝和纯化水。邻苯二甲酸乙酸纤维素是一种聚合物，可用于肠溶包衣的单个剂型，如片剂和胶囊，并且不溶于pH低于约5.5至约6.0的水中。肠溶包衣(包括邻苯二甲酸乙酸纤维素)提供保护，以抵御胃的酸性环境，但在十二指肠环境(pH约为6-6.5)中开始溶解，并在剂型到达回肠(pH约为7-8)时完全溶解。除邻苯二甲酸乙酸纤维素外，其他肠溶包衣材料是已知的并可与本发明一起使用，包括但不限于羟丙基甲基乙基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、和甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物。所使用的肠溶包衣主要在胃以外的部位促进剂型的溶解，并且可选择使肠溶包衣在约至少6.0的pH下溶解，更优选在约6.0至约8.0的pH下溶解。在一个优选方面，肠溶包衣在回肠附近溶解和分解。
[0149] 在一些实施例中，黑皮质素受体特异性肽、MC1r特异性环状肽或其药学上可接受的盐被配制成颗粒填充胶囊或带有外包衣的片剂形式，这种包衣可任选地包含在低pH(例如pH≤6.0)下稳定但在pH大于约6.0下溶解的聚合物或由其组成。外包衣可进一步包含在酸性条件下(包括在胃中)稳定、但可在较高pH(例如结肠内腔的pH)下溶解的聚合物，或由其组成。包衣的溶解速率可根据期望的释放参数而变化，这也是有利的和可以考虑的。
[0150] 通过举例而非限制，外包衣可由以下组成或包括以下：对特定pH范围有反应且在该范围下可溶的聚合物，包括例如聚(甲基)丙烯酸酯的聚合物。在一个方面，外包衣可由以下组成或包括以下：一个或多个聚合物或共聚物，这些聚合物或共聚物带有阴离子基团或可转化为阴离子基团的基团。在另一个方面，外包衣可由以下组成或包括以下：多于一种(甲基)丙烯酸酯共聚物(带有阳离子基团或可转化为阳离子基团的基团)，以及一种或多种聚合物或共聚物(带有阴离子基团或可转化为阴离子基团的基团)。某些此类聚合物、共聚物和(甲基)丙烯酸酯共聚物教授于美国专利9237760中，其如同完全阐明一样通过引用并入本文。因此，肠溶包衣可以是丙烯酸酯聚合物，例如 S100或 L100。S100在约pH 7.0时溶解，而 L100在约pH 6.0时溶解。前述任何肠溶
包衣均可与前述配制品一起使用，这些配制品包括但不限于包含 多颗粒配制品
的配制品。
[0151] 在一些实施例中，包括胶囊或片剂的药物组合物可进一步包含封闭包衣或密封包衣。该包衣可防止水分渗入片剂。因此，密封包衣可包括提供药学上可接受的湿气屏障的聚合物或其他材料。此类密封包衣可包括聚乙烯醇以及聚合物和增塑剂的各种组合，任选地具有期望的色素。
[0152] 可用作肠溶包衣的其他pH依赖性聚合物包括但不限于肠溶纤维素衍生物，例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素；天然树脂，例如虫胶和玉米醇溶蛋白；肠溶乙酸酯衍生物，例如聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙醛二甲基纤维素乙酸酯；以及除上述披露的那些之外的各种聚甲基丙烯酸酯基聚合物。pH依赖性肠溶包衣还可包含两种或多种pH依赖性聚合物的组合，包括前述任何一种。
[0153] 6.0本发明中使用的肽。
[0154] 在一个方面，本发明使用环状肽，该环状肽含有从环状部分内的His-Phe-Arg、但不包括核心部分内的Trp衍生的核心序列，并且其中Trp或其衍生物或模拟物(定义为具有侧链(包括至少一个芳基或杂芳基)的氨基酸残基，包括但不限于Nal 1或Nal 2)是紧靠在C-末端侧的环状部分之外的氨基酸残基。在一个方面，使用序列His-Phe-Arg-Xaa6-Trp(SEQ ID NO:1)，其中Xaa6是氨基酸，其中其侧链与肽的另一个氨基酸的侧链形成环状桥。
[0155] 衍生自His-Phe-Arg-Xaa6-Trp(SEQ ID NO:1)的核心序列可以包括许多取代。His位置可以是His，也可以是经取代或未经取代的Pro或具有如下侧链的氨基酸，该侧链包括至少一个伯胺、仲胺、烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、醇、醚、硫化物、砜、亚砜、羰基或羧基。经取代的Pro包括但不限于氨基酸，例如Hyp、Hyp(Bzl)、Pro(4R-Bzl)或Pro(4R-NH2)。Phe位置可以是Phe，但最典型的是经取代或未经取代的D-Phe、D-Nal 1、D-Nal 2或具有包括吡啶基的侧链的氨基酸。Arg位置可以是Arg、Lys、Orn、Dab或Dap、或经取代或未经取代的Pro或Cit、或可以是具有如下侧链的氨基酸，该侧链包括至少一个伯胺、仲胺、胍、脲、烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基或醚。Xaa6可以是具有包括伯胺的侧链的氨基酸(例如Lys、Orn、Dab、Dap)、具有羧基基团的氨基酸(例如Asp、Glu或hGlu)、或具有二硫化物基团的氨基酸(例如Cys或Pen)，所有这些都取决于环状桥的性质。Trp位置可以是具有如下侧链的氨基酸，该侧链包括至少一个经取代或未经取代的芳基或杂芳基，例如Trp、Nal 1或Nal 2。
[0156] 在一个方面，本发明利用包含具有式(I)的环状肽的配制品：
[0157]
[0158] 包括所有其对映异构体、立体异构体或非对映异构体，或前述任何的药学上可接受的盐，
[0159] 其中：
[0160] R1为-H、-NH-R10、-NH-R10-R11或-NH-R11；
[0161] R2为-CH-或-N-；
[0162] R3为-H、-CH3或-CH2-，并且如果其为-CH2-则与R4形成具有通用结构的环；
[0163] R4为-H、-(CH2)z-(如果R3为-CH2-)，并且如果其为-(CH2)z-则与R3形成环，其中-(CH2)z-中任何H任选地被R12取代，或R4为-(CH2)w-R13-(CH2)w-R14，其中任一(CH2)w中的任何H任选地被-(CH2)w-CH3取代；
[0164] R5为-(CH2)w-R15；
[0165] R6为-H、-CH3或-CH2-，并且如果其为-CH2-则与R7形成具有通用结构的环；
[0166] R7为-(CH2)z-(如果R6为-CH2-)，并且如果其为-(CH2)z-则与R6形成环，或R7为-(CH2)w-R16；
[0167] R8为-R17-R18或-R18；
[0168] R9为
[0169] -(CH2)x-C(＝O)-NH-(CH2)y-、
[0170] -(CH2)x-NH-C(＝O)-(CH2)y-、
[0171] -(CH2)x-C(＝O)-(CH2)z-C(＝O)-(CH2)y-、
[0172] -(CH2)x-C(＝O)-NH-C(＝O)-(CH2)y-、
[0173] -(CH2)x-NH-C(＝O)-NH-(CH2)y-、
[0174] -(CH2)x-NH-C(＝O)-(CH2)z-C(＝O)-NH-(CH2)y-、或
[0175] -(CH2)x-S-S-(CH2)y-；
[0176] R10为一至三个氨基酸残基；
[0177] R11为H或C1至C17酰基基团，其中该C1至C17包含直链或支链烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基或烷基芳基；
[0178] R12任选地存在，并且如果存在则在每种情况中独立地为-R13-(CH2)w-R14；
[0179] R13任选地存在，并且如果存在则在每种情况中独立地为
[0180] -O-、
[0181] -S-、
[0182] -NH-、
[0183] -S(＝O)2-、
[0184] -S(＝O)-、
[0185] -S(＝O)2-NH-、
[0186] -NH-S(＝O)2-、
[0187] -C(＝O)-、
[0188] -C(＝O)-O-、
[0189] -O-C(＝O)-、
[0190] -NH-C(＝O)-O-、
[0191] -O-C(＝O)-NH-、
[0192] -NH-C(＝O)-、或
[0193] -C(＝O)-NH-；
[0194] R14在每种情况中独立地为-H、-CH3、-N(R19a)(R19b)、-NH-(CH2)z-N(R19a)(R19b)、-NH-CH(＝NH)-N(R19a)(R19b)、-NH-CH(＝O)-N(R19a)(R19b)、-O(R19a)、-(R19a)(R19b)、-S(＝O)2(R19a)、-C(＝O)-O(R19a)，
[0195]
[0196] 其中R14中任何环任选地被一个或多个环取代基取代，并且当存在一个或多个取代基时，是相同或不同的且独立地为羟基、卤代、磺酰胺、烷基、-O-烷基、芳基、-O-芳基、C(＝O)-OH、或C(＝O)-N(R19a)(R19b)；
[0197] R15为任选地被一个或多个取代基取代的苯基、萘基或吡啶基，该一个或多个取代基独立地选自卤代、(C1-C10)烷基-卤代、(C1-C10)烷基、(C1-C10)烷氧基、(C1-C10)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈、磺酰胺、氨基、单取代的氨基、双取代的氨基、羟基、羧基和烷氧基-羰基；
[0198] R16为-H、-N(R19a)(R19b)、-NH-(CH2)z-N(R19a)(R19b)、-NH-CH(＝NH)-N(R19a)(R19b)、-NH-CH(＝O)-N(R19a)(R19b)、-O(R19a)、直链或支链C1至C17烷基链、-C(＝O)-N(R19a)(R19b)、-S(＝O)2(R19a)，
[0199]
[0200] 其中任何环任选地被一个或多个任选的环取代基取代，并且当存在一个或多个取代基时，是相同或不同的且独立地为羟基、卤素、磺酰胺、烷基、-O-烷基、芳基、芳烷基、O-芳烷基、或-O-芳基；
[0201] R17为一至三个氨基酸残基；
[0202] R18为-OH、-N(R19a)(R19b)、-N(R19a)(CH2)w-(C1-C7)环烷基、或
[0203] -O-(CH2)w-(C1-C7)环烷基；
[0204] R19a和R19b各自独立地为H或C1至C4直链或支链烷基链；
[0205] w在每种情况中独立地为0至5；
[0206] x为1至5；
[0207] y为1至5；以及
[0208] z在每种情况中独立地为1至5。
[0209] 在具有式(I)的环状肽中，R17可为具有下式的单个氨基酸残基
[0210]
[0211] 其中R20是
[0212] 任选地被一个或多个环取代基取代，并且当存在一个或多个时，是相同或不同的且独立地为羟基、卤素、磺酰胺、烷基、-O-烷基、芳基、或-O-芳基。
[0213] 在另一个方面，本发明利用具有式(II)的环状肽：
[0214]
[0215] 其中变量如式(I)所指示的。
[0216] 在另一个方面，本发明利用具有式(III)的环状肽：
[0217]
[0218] 其中R21a、R21b和R21c在每种情况中独立地为氢、卤代、(C1-C10)烷基-卤代、(C1-C10)烷基、(C1-C10)烷氧基、(C1-C10)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈、磺酰胺、氨基、单取代的氨基、双取代的氨基、羟基、羧基或烷氧基-羰基，并且所有其他变量如式(I)所指示的。
[0219] 在另一个方面，本发明利用具有式(IV)的环状肽：
[0220]
[0221] 其中R22为H或C1至C9直链或支链烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基或烷基芳基；
[0222] R21a、R21b和R21c如针对式(III)所定义的；以及
[0223] 所有其他变量如式(I)所指示的。
[0224] 在另一个方面，本发明利用具有式(V)的环状肽：
[0225]
[0226] 其中变量如具有式(IV)的环状肽所指示的。
[0227] 在另一个方面，本发明利用具有式(VI)的环状肽：
[0228]
[0229] 其中变量如具有式(III)的环状肽所指示的。
[0230] 在具有式(I)的环状肽中，R9可为-(CH2)x-C(＝O)-NH-(CH2)y-，其中x为4且y为3，其中x为3且y为2，或其中x为2且y为1。可替代地，R9可为-(CH2)x-NH-C(＝O)-(CH2)y-，其中x为1且y为2，其中x为2且y为3，或其中x为3且y为4。
[0231] 在具有式(I)的环状肽中，R3可与R4形成具有通用结构 的环，其中z为3。
[0232] 在具有式(I)的环状肽中，R17可为具有下式的单个氨基酸残基
[0233]
[0234] 因此，本发明在一个方面可利用具有式(VII)的环状肽：
[0235] Z-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Y(VII)
[0236] 或其药学上可接受的盐，其中：
[0237] Z为H或N-末端基团；
[0238] Xaa1任选地存在，并且如果存在，则为一至三个L-或D-异构体氨基酸残基；
[0239] Xaa2和Xaa6为L-或D-异构体氨基酸，其中其侧链包含环状桥；
[0240] Xaa3为L-或D-Pro，其任选地被羟基、卤素、磺酰胺、烷基、-O-烷基、芳基、烷基-芳基、烷基-O-芳基、烷基-O-烷基-芳基、或-O-芳基取代，或Xaa3为具有如下侧链的氨基酸的L-或D-异构体，该侧链包括至少一个伯胺、仲胺、烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、醚、硫化物或羧基；
[0241] Xaa4为具有如下侧链的L-或D-异构体氨基酸，该侧链包括苯基、萘基或吡啶基，任选地其中环被一个或多个取代基取代，该一个或多个取代基独立地选自卤代、(C1-C10)烷基-卤代、(C1-C10)烷基、(C1-C10)烷氧基、(C1-C10)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈、磺酰胺、氨基、单取代的氨基、双取代的氨基、羟基、羧基和烷氧基-羰基；
[0242] Xaa5为L-或D-Pro，或Xaa5是具有如下侧链的L-或D-异构体氨基酸，该侧链包括至少一个伯胺、仲胺、胍、脲、烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基或醚；
[0243] Xaa7任选地存在，并且如果存在，则为一至三个L-或D-异构体氨基酸残基；以及[0244] Y为C-末端基团。
[0245] 在一个方面，Xaa4可为任选地被一个或多个取代基取代的D-Phe，该一个或多个取代基独立地选自卤代、(C1-C10)烷基-卤代、(C1-C10)烷基、(C1-C10)烷氧基、(C1-C10)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈、磺酰胺、氨基、单取代的氨基、双取代的氨基、羟基、羧基和烷氧基-羰基。
[0246] 在另一个方面，Xaa2和Xaa6中的一个可为Asp、hGlu或Glu的L-或D-异构体，且Xaa2和Xaa6中的另一个为Lys、Orn、Dab或Dap的L-或D-异构体。在替代性方面，Xaa2和Xaa6中的每一个可为Cys、D-Cys、Pen或D-Pen。
[0247] 在另一个方面，Xaa1可为具有如下侧链的氨基酸，该侧链包括直链或支链烷基、环烷基、环杂烷基、芳基或杂芳基。
[0248] 在另一个方面，Xaa7可为具有包括至少一个芳基或杂芳基的侧链的氨基酸(其任选地被一个或多个环取代基取代)，并且当存在一个或多个取代基时，是相同或不同的且独立地为羟基、卤素、磺酰胺、烷基、-O-烷基、芳基或-O-芳基。
[0249] 在另一个方面，N-末端基团可为C1至C17酰基基团，其中该C1至C17包含直链或支链烷基、环烷基、烷基环烷基、芳基或烷基芳基，直链或支链C1至C17烷基、芳基、杂芳基、烯烃、烯基、或芳烷基链，或N-酰化的直链或支链C1至C17烷基、芳基、杂芳基、烯烃、烯基或芳烷基链。
[0250] 在另一个方面，Y可以为羟基、酰胺或被以下取代的酰胺：一个或两个直链或支链C1至C17烷基、环烷基、芳基、烷基环烷基、芳烷基、杂芳基、烯烃、烯基或芳烷基链。
[0251] 因此，本发明在另一个方面中提供如上所定义的具有式(VII)的环状肽，但其中Xaa4为任选地被一个或多个取代基取代的D-Phe，该一个或多个取代基独立地选自卤代、(C1-C10)烷基-卤代、(C1-C10)烷基、(C1-C10)烷氧基、(C1-C10)烷硫基、芳基、芳氧基、硝基、腈、磺酰胺、氨基、单取代的氨基、双取代的氨基、羟基、羧基和烷氧基-羰基；
[0252] Xaa5为Arg、Lys、Orn、Dab或Dap的L-或D-异构体；以及
[0253] Xaa7为Trp、Nal 1或Nal 2的L-或D-异构体。
[0254] 在前述中，在一个方面Xaa3为His的L-或D-异构体，且在另一个方面Z可为C1至C17酰基且Xaa1可为Nle的L-或D-异构体。
[0255] 在前述和式(I)中，经取代的Pro可以是例如Hyp、Hyp(Bzl)、Pro(4-Bzl)、和Pro(4-NH2)。
[0256] 式(I)至(VII)涵盖的肽含有一个或多个不对称元素，例如立体异构中心、立体异构轴等，因此式(I)涵盖的肽能以不同的立体异构形式存在。对于特定和一般性描述的肽，包括式(I)至(VII)涵盖的肽，所有手性或其他异构体中心的所有异构体形式(包括对映异构体和非对映异构体)都将涵盖于本文中。本发明的肽各自包括多个手性中心，并且除了在对映纯的制剂中使用本发明的肽之外，还可以用作外消旋混合物或对映异构体富集的混合物。典型地，使用手性纯的试剂(例如指定的L-或D-氨基酸)，使用能保持对映异构体纯度试剂、条件和方法来合成本发明的肽，但可能并且预期可以制备外消旋混合物。此类外消旋混合物可任选地使用熟知技术分离，且单个对映异构体可单独使用。在其中肽能以互变异构形式存在的温度、溶剂和pH的情况和特定条件下，每种互变异构形式都被认为包括在本发明中，无论是平衡存在还是主要以一种形式存在。因此，具有式(I)的肽的单一对映异构体(任选地呈活性形式)可通过不对称合成、从光学纯前体合成、或外消旋体拆分获得。
[0257] 本发明进一步旨在包括本发明的肽的前药，其施用时通过代谢过程进行化学转化，然后成为活性药理学肽。通常，此类前药将是本方面的肽的功能性衍生物，在体内可轻易转化为具有式(I)至(VII)的肽。前药是任何共价键合的化合物，在体内释放具有式(I)至(VII)的活性亲本肽药物。选择和制备合适的前药衍生物的常规程序描述于例如：“Design of Prodrugs[前药设计]”,H.Bundgaard编辑,Elsevier[爱思唯尔],1985。前药的典型实例在功能部分上具有生物不稳定的保护基团，例如像通过羟基、羧基或氨基官能团的酯化。因此，通过举例而非限制，前药包括具有式(I)的肽，其中使用酯前药形式，例如像具有式(I)的R基团的低级烷基酯，例如其中R是-OH，这些低级烷基酯可包括烷基自由基中的1-8个碳或在芳烷基自由基中具有6-12个碳的芳烷基酯。广义地说，前药包括可被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基、水解、脱水、烷基化、脱烷基、酰化、脱酰基、磷酸化或去磷酸化以在体内产生具有式(I)的活性亲本肽药物的化合物。
[0258] 本主题发明也包括与式(I)至(VI)叙述的那些相同的肽，但事实上，式(I)至(VI)描绘的一个或多个原子被原子质量或质量数与通常见于自然界中的原子质量或质量数不同的原子替代。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和氧的同位素，分别例如2H、3H、13C、14C、15N、18O和17O。本发明的肽以及含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的所述化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物在本发明的范围内。本发明的某些同位素标记的化合物，例如放射性同位素(例如3H和14C)掺入其中的化合物，可用于各种测
2
定中，例如在药物和/或底物组织分布测定中。用较重同位素取代，例如用氘(H)取代一个或多个氢原子，在某些情况下可提供药理学优势，包括提高代谢稳定性。具有式(I)至(VI)的同位素标记的肽通常可通过用同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备。
[0259] 7.0本发明中所用肽的制备方法。
[0260] 通常，本发明的肽可通过固相合成进行合成并且根据本领域已知的方法进行纯化。可以使用多个熟知的程序中任一项，利用多种树脂和试剂来制备本发明的肽。
[0261] 本发明的环状肽可通过用于在氨基酸之间形成肽键联的已知常规程序来容易地合成。此类常规程序包括例如任何溶液相程序，其允许在氨基酸或其残基(其羧基基团和其他反应性基团受保护)的游离α氨基基团与另一个氨基酸或其残基(其氨基基团或其他反应性基团受保护)的游离初级羧基基团之间进行缩合。在优选的常规程序中，本发明的环状肽可通过固相合成进行合成并且根据本领域已知的方法进行纯化。可以使用多个熟知的程序中任一项，利用多种树脂和试剂来制备本发明的肽。
[0262] 用于合成环状肽的方法可通过以下程序来进行：通过该程序，期望序列中的每个氨基酸按一次一个连续添加到另一个氨基酸或其残基中，或者首先按常规合成具有期望氨基酸序列的肽片段、然后将其浓缩以提供期望的肽。然后将所得肽环化以产生本发明的环状肽。
[0263] 固相肽合成方法是本领域熟知和实践的方法。在此类方法中，本发明的肽的合成可通过以下来进行：根据固相方法的一般原理，依次将期望的氨基酸残基一次一个地掺入生长肽链。这些方法披露于许多参考文献中，包括Merrifield,R.B.,“Solid phase synthesis(Nobel lecture)[固相合成(诺贝尔讲座)],”Angew Chem[应用化学]24:799-
810(1985)和Barany等人,The Peptides,Analysis,Synthesis and Biology[肽/分析/合
成和生物学],第2卷,Gross,E.和Meienhofer,J.,编辑.Academic Press[学术出版社]1-
284(1980)。
[0264] 在肽的化学合成中，各种氨基酸残基的反应性侧链基团被合适的保护基团保护，以在该保护基团被去除之前防止化学反应在该位点发生。同样常见的是当氨基酸残基或片段的实体在羧基基团处反应时对该氨基酸残基或片段的α氨基基团进行保护，然后选择性地去除α氨基保护基团以允许在该位点发生随后的反应。特定的保护基团已经被披露并且在于固相合成方法和液相合成方法中是已知的。
[0265] α氨基基团可由合适的保护基团保护，包括氨基甲酸乙酯型保护基团(例如苄氧基羰基(Z)和经取代的苄氧基羰基，例如对氯苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对联苯-异丙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和对甲氧基苄氧基羰基(Moz))和脂肪族氨基甲酸乙酯型保护基团(例如叔丁氧基羰基(Boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧羰基、和烯丙氧基羰基(Alloc))。Fmoc优选地用于α氨基保护。
[0266] 胍基团可由合适的保护基团(例如硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、Z、五甲基色满磺酰基(Pmc)、金刚烷基氧基羰基、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)和Boc)保护。Pbf和Pmc是Arg优选的保护基团。
[0267] 本文所述的本发明的肽是使用固相合成进行制备的，例如通过Symphony Multiplex Peptide Synthesizer(瑞宁仪器公司(Rainin Instrument Company))自动化
肽合成仪，使用制造商提供的编程模块并遵循制造商手册中阐明的方案进行制备。
[0268] 通过将受保护的α氨基酸偶联到合适的树脂，从肽的C-末端开始固相合成。通过如下来制备这种起始材料：将α氨基保护的氨基酸经由酰胺键联附接到9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基-梅里菲尔德(Merrifield)树脂(Sieber酰胺树脂)或4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基树脂(Rink酰胺树脂)，经由酯键联附接到对苄氧基苯甲醇(Wang)树脂、2-氯三苯甲基氯树脂或肟树脂，或通过本领域熟知的其他方法。必要时，将树脂进行重复循环，以顺序添加氨基酸。α氨基Fmoc保护基团在基本条件下被去除。为此目的，可使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶、哌嗪、二乙胺或吗啉(20％-40％v/v)。
[0269] 在去除α氨基保护基团之后，随后受保护的氨基酸按期望顺序逐步偶联以获得中间体，即受保护的肽树脂。在肽的固相合成中用于氨基酸偶联的激活剂是本领域熟知的。在合成肽之后，如果期望，可以使用本领域熟知的方法去除正交保护的侧链保护基团，以进一步衍生化该肽。
[0270] 典型地，适当地使用正交保护基团。例如，本发明的肽含有具有含氨基基团的侧链的多种氨基酸。在一个方面，使用烯丙基-Alloc保护方案，其中氨基酸通过其侧链形成内酰胺桥，而在不同反应条件下可裂解的正交保护基团用于具有含氨基基团的侧链的其他氨基酸。因此，例如，Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Orn(Alloc)-OH、Fmoc-Dap(Alloc)-OH、Fmoc-Dab(Alloc)-OH、Fmoc-Asp(OAll)-OH或Fmoc-Glu(OAll)-OH氨基酸可用于在环化时形成内酰胺桥的位置，而具有含氨基基团的侧链的其他氨基酸具有不同且正交的保护基团，例如用Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH等。可以使用其他类似的保护基团；通过举例而非限制，Mtt/OPp(4-甲基三苯甲基/2-苯基异丙基)可与环化时形成内酰胺桥的侧链一起使用，其中使用适合于Mtt/OPp裂解的条件将正交保护基团用于其他不可裂解的位置。
[0271] 肽中的反应性基团可在固相合成期间或从树脂中去除后进行选择性修饰。例如，当在树脂上时，肽可经修饰以获得N-末端修饰(例如乙酰化)，或者可以通过使用裂解试剂从树脂中移除然后进行修饰。类似地，用于修饰氨基酸侧链的方法为肽合成领域的技术人员所熟知。对肽上存在的反应性基团所作的修饰的选择将部分取决于该肽中期望的特征。
[0272] 在本发明的肽中，在一个实施例中，通过引入N-乙酰基基团来修饰N-末端基团。在一个方面，使用如下方法，其中在移除N-末端的保护基团后，树脂结合肽在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中、在有机碱(例如吡啶)存在下与乙酸酐反应。N-末端乙酰化的其他方法是本领域已知的，包括溶液相乙酰化，并且可以使用。
[0273] 在一个实施例中，肽可在从肽树脂裂解之前被环化。对于通过反应性侧链部分的环化，将期望的侧链进行脱保护，并且将肽悬浮在合适的溶剂中并添加环状偶联剂。合适的溶剂包括，例如DMF、二氯甲烷(DCM)或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。合适的环状偶联试剂包括，例如，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)膦六氟磷酸酯(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(吡咯烷代)六氟磷酸膦(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TATU)、2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1,1,3,
3-四甲基脲四氟硼酸酯(TPTU)或N,N'-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCCI/HOBt)。
常规上，偶联是通过使用合适的碱(例如N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、sym-三甲吡啶或N-甲基吗啉(NMM))来启动。
[0274] 对于具有非内酰胺环状桥的肽，如含有如下桥的肽：
[0275] -(CH2)x-NH-C(＝O)-(CH2)z-C(＝O)-NH-(CH2)y-，
[0276] 其中x、y和z各自独立地为1至5，这些肽可使用固相合成进行制备，该固相合成使用侧链保护的二胺氨基酸以用于待环化的位置。在此类位置中特别优选的是Dap、Dab或Lys，优选具有胺保护基团，例如Alloc、Mtt、Mmt(甲氧基三苯甲基)、Dde(1-(4,4-二甲基-2,
6-二氧代环己-1-亚基))乙基)、ivDde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基)或任何其他正交可裂解的保护基团。典型地，首先去除一个侧链保护基团，例如在二氯甲烷中使用2％TFA去除Mtt。在树脂洗涤之后，所得树脂结合的无保护胺被酰化，例如用在二氯甲烷/吡啶1:1中的环酐(例如琥珀酐或戊二酸酐)的0.5M溶液。在另外的洗涤步骤之后，第二二氨基氨基酸的正交可裂解保护基团被裂解，例如使用二氯甲烷中的四(三苯基膦)钯(0)和苯基硅烷去除Alloc。在用二氯甲烷和DMF洗涤后，使用标准偶联试剂(例如，TBTU和碱基)使树脂结合肽环化。可替代地，可使用DMF中5％的肼溶液对ivDde保护的树脂结合二氨基氨基酸进行脱保护，并且在用DMF洗涤后，所得树脂结合胺可以用环酐进行酰化或用树脂结合羧酸进行环化。
[0277] 然后可使用任何合适的试剂(例如DCM中的乙胺、或药剂(例如三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、二甲氧基苯(DMB)、水等)的各种组合)从固相裂解。将所得粗肽干燥，并使用任何合适的试剂(例如在水存在下的(TFA)、TIS、2-巯基乙烷(ME)和/或1,2-乙二硫醇(EDT))裂解剩余的氨基酸侧链保护基团(如果有)。将最终产物通过添加冷乙醚沉淀，并通过过滤收集。最终纯化是通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、使用合适的柱(如C18柱)进行，或也可使用其他分离或纯化方法，例如基于肽的尺寸或电荷的方法。一旦纯化，肽可以用许多方法来表征，这些方法例如高效液相色谱(HPLC)、氨基酸分析、质谱等。
[0278] 对于具有C-末端取代的酰胺衍生物或N-烷基基团的本发明的肽，可通过将受保护的α氨基酸偶联到合适的树脂而从肽的C-末端开始固相合成以进行合成。本领域描述了用于在固相上制备经取代的酰胺衍生物的此类方法。参见，例如，Barn,D.R.等人,“Synthesis of an array of amides by aluminum chloride assisted cleavage on resin bound esters[通过在树脂结合酯上的氯化铝辅助裂解而合成酰胺阵列],”Tetrahedron Letters[四面体快报],37:3213-3216(1996)；DeGrado,W.F.和Kaiser E.T.,“Solid-phase 
synthesis of protected peptides on a polymer bound oxime:Preparation of 
segments comprising the sequences of a cytotoxic 26-peptide analogue[聚合物结合肟上保护肽的固相合成：制备包含细胞毒性26-肽类似物序列的片段],”J.Org.Chem.[有机化学杂志]47:3258-3261(1982)。可以通过熟知手段，将α氨基保护的氨基酸通过酯键联附接到对苄氧基苯甲醇(Wang)树脂或肟树脂上以制备这种起始材料。用适当的胺(如甲胺、二甲胺、乙胺等)的溶液处理的氨基酸、环化肽和肽树脂的期望序列来生长肽链。使用对苄氧基苯甲醇(Wang)树脂的肽可通过DCM中的氯化铝从树脂裂解，而使用肟树脂的肽可被DCM裂解。制备具有C-末端取代胺的肽的另一种方法为通过还原胺化将烷基胺附接到甲酰树
脂，例如4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基)丁酰基-AM树脂(FMPB AM树脂)，然后利用固相合成的一般原理依次掺入期望的氨基酸残基。
[0279] 虽然已主要参考固相Fmoc化学来描述合成，但应当理解，可使用其他化学和合成方法来制备本发明的环状肽，例如通过举例而非限制，使用Boc化学、溶液化学的方法，以及其他化学和合成方法。
[0280] 8.0用于评估本发明中使用肽的测试和测定。
[0281] 本发明中使用的黑皮质素受体特异性肽可通过各种测定系统和动物模型进行测试，以确定结合、功能状态和功效。
[0282] 8.1使用[I125]-NDP-α-MSH的竞争性抑制测定。
[0283] 使用从表达重组hMC1r或hMC4r(在h前缀指人的每种情况中)的HEK-293细胞制备的膜匀浆或可替代地从含有内源性鼠类MC1r的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞制备的膜匀浆进行竞争性抑制结合测定。在下面的实例中，除非另有说明，否则所有MC1r和MC4r值都是针对人类重组受体的。在96孔聚丙烯圆底板(VWR目录号12777-030)中进行测定。将膜匀浆与
0.1nM[I125]-NDP-α-MSH(珀金埃尔默(Perkin Elmer))和增加浓度的本发明的测试肽在含有25mM HEPES缓冲液(pH 7.5)的缓冲液中孵育，该缓冲液含有100mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、0.3mM 1,10-菲咯啉和0.2％牛血清白蛋白。在37℃下孵育90分钟后，将测定混合物过滤到GF/B Unifilter板(珀金埃尔默目录号6005177)上，并以每孔3mL的冰冷缓冲液进行洗涤。将过滤器风干，并向每个孔中添加35μL闪烁混合物。对于结合放射性，将板在
Microbeta计数器中计数。通过在1μM NDP-α-MSH存在下抑制[I125]-NDP-α-MSH结合来测量非特异性结合。最大特异性结合(100％)定义为在1μM NDP-α-MSH存在和不存在的情况下与细胞膜结合的放射性(cpm)差异。每项测定一式两份进行，并描述实际平均值，其中小于0％的结果报告为0％。使用Graph Pad 曲线拟合软件确定本发明的肽的Ki值。
[0284] 8.2激动剂活性测定。
[0285] 以本发明的肽在表达hMC1r的人类黑色素瘤细胞系HBL(参见Kang,L.等人,“A selective small molecule agonist of MC1r inhibits lipopolysaccharide-induced cytokine accumulation and leukocyte infiltration in mice[MC1r选择性小分子激动剂抑制脂多糖诱导的小鼠细胞因子积累和白细胞浸润],”J.Leuk.Biol[白细胞生物学杂
志]80:897-904(2006))或表达hMC4r的HEK-293细胞中引起功能反应的能力的量度来检查
细胞内cAMP的累积。将表达hMC1r的融合HBL细胞或表达重组hMC4r的HEK-293细胞通过在无酶细胞分离缓冲液中孵育而从培养板分离出来。将分散的细胞悬浮在含有10mM HEPES(pH 
7.5)、1mM MgCl2、1mM谷氨酰胺、0.5％白蛋白和0.3mM 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(IBMX)(磷酸二酯酶抑制剂)的Earle平衡盐溶液中。将细胞以每孔0.4x 105个细胞(对于HBL细胞)和每孔0.5x 105个细胞(对于HEK-293细胞)的密度铺板于96孔板中，并预孵育10分钟。在37℃下将细胞暴露于本发明的肽中15分钟，该肽溶解于DMSO(最终DMSO浓度为1％)中，浓度范围为0.05-5000nM，总测定体积为200μL。使用NDP-α-MSH作为参考激动剂。cAMP水平由Cisbio Bioassays公司的 cAMP细胞基测定系统确定，该系统使用穴状化合物标记的抗cAMP
和d2标记的cAMP，其中板在Perkin Elmer Victor读板仪上在665和620nM处读取。通过用Graph Pad 软件进行非线性回归分析来分析数据。确定本发明的每个测试肽的最大
功效(Emax)值，与参考黑皮质素激动剂NDP-α-MSH所获得的进行比较。
[0286] 9.0本发明中使用的肽的实例。
[0287] 合成了以下结构的肽，并按指示确定了平均MC1r和MC4r Ki值。Ki值用[I125]-NDP-α-MSH确定。除Emax值(其为百分比值)外，所有结果均以nM表达。如上文第7部分所述，合成并纯化具有标题项一级序列的肽，其中所得肽具有所描绘的结构。在合成和纯化后，如上文第8部分所述对肽进行测试，结果如下所示。
[0288] 9.1 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Lys)-Trp-NH2(SEQ ID NO:4)
[0289]
[0290]
[0291]
[0292] 9.2 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:5)
[0293]
[0294]
[0295] 9.3 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:6)
[0296]
[0297]
[0298] 9.4 Ac-Nle-环(Asp-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:7)
[0299]
[0300]
[0301] 9.5 Ac-Nle-环(Cys-His-D-Phe-Arg-Cys)-Trp-NH2(SEQ ID NO:8)
[0302]
[0303]
[0304] 9.6 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Orn)-Trp-NH2(SEQ ID NO:9)
[0305]
[0306]
[0307]
[0308] 9.7 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-D-Trp-NH2(SEQ ID NO:10)
[0309]
[0310]
[0311] 9.8 Ac-Nle-环(Glu-His-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:11)
[0312]
[0313]
[0314] 9.9 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-D-Nal 1-NH2(SEQ ID NO:12)
[0315]
[0316]
[0317] 9.10 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Nal 2-NH2(SEQ ID NO:13)
[0318]
[0319]
[0320] 9.11 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-D-Nal 2-NH2(SEQ ID NO:14)
[0321]
[0322]
[0323]
[0324] 9.12 Ac-D-Phe-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:15)
[0325]
[0326]
[0327] 9.13 Ac-Phe-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:16)
[0328]
[0329]
[0330]
[0331] 9.14环(Suc-His-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:17)
[0332]
[0333]
[0334] 9.15 CH3-(CH2)2-C(＝O)-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:18)[0335]
[0336]
[0337]
[0338] 9.16 CH3-(CH2)3-C(＝O)-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:19)[0339]
[0340]
[0341] 9.17 CH3-(CH2)4-C(＝O)-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:20)[0342]
[0343]
[0344] 9.18 CH3-(CH2)5-C(＝O)-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:21)[0345]
[0346]
[0347]
[0348] 9.19环丙酰基-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:22)
[0349]
[0350]
[0351] 9.20环己酰基-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:23)
[0352]
[0353]
[0354]
[0355] 9.21环戊基乙酰基-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:24)
[0356]
[0357]
[0358] 9.22环己基乙酰基-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:25)
[0359]
[0360]
[0361]
[0362] 9.23苯基乙酰基-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:26)
[0363]
[0364]
[0365] 9.24苯基丙酰基-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:27)
[0366]
[0367]
[0368] 9.25 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Ala-NH2(SEQ ID NO:28)
[0369]
[0370]
[0371] 9.26 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-OH(SEQ ID NO:29)
[0372]
[0373]
[0374] 9.27 Ac-Nle-环(Dab-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:30)
[0375] └C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)┘
[0376]
[0377]
[0378]
[0379] 9.28 Ac-Nle-环(Dap-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:31)
[0380] └C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)┘
[0381]
[0382]
[0383] 9.29 Ac-Nle-环(Dab-His-D-Phe-Arg-Dap)-Trp-NH2(SEQ ID NO:32)
[0384] └C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)┘
[0385]
[0386]
[0387] 9.30 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Nal 1-NH2(SEQ ID NO:33)
[0388]
[0389]
[0390] 9.31 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-OH(SEQ ID NO:34)
[0391]
[0392]
[0393] 9.32 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:35)
[0394]
[0395]
[0396]
[0397] 9.33 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Ala-Dab)-NH2(SEQ ID NO:36)
[0398]
[0399]
[0400] 9.34 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Gly-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:37)
[0401]
[0402]
[0403]
[0404] 9.35 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Ala-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:38)
[0405]
[0406]
[0407] 9.36 Ac-Nle-环(Glu-Ala-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:39)
[0408]
[0409]
[0410] 9.37 Ac-Nle-环(Glu-Arg-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:40)
[0411]
[0412]
[0413]
[0414] 9.38 Ac-Nle-环(Glu-Cit-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:41)
[0415]
[0416]
[0417] 9.39 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Lys-NH2(SEQ ID NO:42)
[0418]
[0419]
[0420] 9.40 Ac-Nle-环(Glu-Lys-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:43)
[0421]
[0422]
[0423] 9.41 Ac-Nle-环(Glu-Dab-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:44)
[0424]
[0425]
[0426] 9.42 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:45)
[0427]
[0428]
[0429]
[0430] 9.43 Ac-Nle-环(Dap-His-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:46)
[0431] └C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)┘
[0432]
[0433]
[0434] 9.44 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:47)
[0435]
[0436]
[0437]
[0438] 9.45 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Ala-Dab)-NH2(SEQ ID NO:48)
[0439]
[0440]
[0441] 9.46 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Dab)-NH2(SEQ ID NO:49)
[0442]
[0443]
[0444]
[0445] 9.47 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Gly-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:50)
[0446]
[0447]
[0448] 9.48 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Ala-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:51)
[0449]
[0450]
[0451] 9.49 Ac-Nle-环(Glu-Ala-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:52)
[0452]
[0453]
[0454] 9.50 Ac-Nle-环(Glu-Arg-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:53)
[0455]
[0456]
[0457] 9.51 Ac-Nle-环(Glu-Cit-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:54)
[0458]
[0459]
[0460]
[0461] 9.52 Ac-Nle-环(Glu-His-D-Phe-Arg-Dab)-Lys-NH2(SEQ ID NO:55)
[0462]
[0463]
[0464] 9.53 Ac-Nle-环(Glu-Lys-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:56)
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[0470]
[0471] 9.55 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:58)
[0472]
[0473]
[0474] 9.56 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:59)
[0475]
[0476]
[0477]
[0478] 9.57 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe(2-Cl)-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:60)
[0479]
[0480]
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[0482]
[0483]
[0484] 9.59 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe(4-Cl)-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:62)
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[0488]
[0489]
[0490] 9.61 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe(4-F)-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:64)
[0491]
[0492]
[0493]
[0494] 9.62 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe(3,4-F)-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:65)
[0495]
[0496]
[0497] 9.63 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe(4-Me)-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:66)
[0498]
[0499]
[0500]
[0501] 9.64 Ac-Nle-环(Glu-Orn-D-Phe(4-OMe)-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:67)
[0502]
[0503]
[0504] 9.65 Ac-Nle-环(Glu-Pro-D-Phe-Arg-Dab)-NH2(SEQ ID NO:68)
[0505]
[0506]
[0507] 9.66 Ac-Nle-环(Glu-Pro-D-Phe-Arg-Dab)-Trp-NH2(SEQ ID NO:69)
[0508]
[0509]
[0510]
[0511] 10.本发明中使用的多颗粒配制品的实例。
[0512] 制备了以下所述批次的配制品：
[0513]
[0514] 各批次装载有约1％至2％(肽/聚合物的w/w)之间的实例9.3的环状肽。使用HPLC方法(使用C-18柱)进行测定，包括研究不同酸和pH范围内的环状肽释放。在制造过程后确定了微粒的载药量和包封效率。用体外释放法对微粒的性能进行了表征。
[0515] 通过将已知重量的微粒溶解于适当体积的pH 7.5-8.0的磷酸盐缓冲液(1L缓冲液，含有0.5mL磷酸，用氢氧化钠调节pH至7.5)确定载药量。使用HPLC对所得溶液中的药物进行分析。对于包封效率(EE)，将微粒用0.1M HCl冲洗、干燥和使用(如针对载药量所述的)。基于药物和聚合物起始重量计算载药量和EE值。载药量大于99％并且所有制备的样品的包封效率大于95％。
[0516]
[0517]
[0518] 使用USP仪器(Apparatus)2，从500mL酸(0.1M HCl pH 1.2)或乙酸盐缓冲液(pH 4.5)开始，溶解含有实例9.3的环状肽的 微粒。精确称量约1 g微粒，并在37℃的
酸中悬浮2小时。然后将培养基的pH依次调整至pH 5.5持续1小时，调整至pH 6.8持续另一小时，并且最后调整至pH 7.4持续7小时。
[0519] 图4-11为实例9.3的环状肽从使用各种 聚合物及其共混物制备的微粒中的代表性释放曲线。一般而言，药物的释放是pH依赖性的，并且速率取决于所用聚合物的类型。
[0520] 图4-8示出实例9.3的环状肽从使用特定 聚合物及其共混物制备的微粒中的释放曲线。如图8所示，肽释放是pH依赖性的，在pH 4.5-5.5时不释放，在pH4.5-7.5时几乎完全释放。
[0521] 一个产物靶曲线是在整个GI道中的药物释放，在pH 5.5时起始约为20％。对使用不同聚合物制备的微粒共混物进行了测试。图9示出了从共混的微粒中获得的释放曲线。选择包含40％的批次29、30％的批次27和30％的批次31的批次38进行进一步研究。为了简化制备过程并确保共混物均匀性，通过以与共混的微粒批次38相同的比率共溶解聚合物类型来制备微粒批次(批次41)，并用于制备微粒，使得配制品包含约46.5％ L100-55、46％ S100和7.5％ FS30D(按重量计)。图10示出了由预共混的聚合
物制备的并且与批次38微粒共混物的比率相同的批次41的释放曲线。选择该批次以评估临床前药代动力学和功效研究。图11示出了批次41的重复溶解曲线(n＝3)。
[0522] 制备含有如批次41中的 聚合物共混物的安慰剂微粒(批次49)，并用作活性批次41的稀释剂，并填充到临床前大鼠9号胶囊中。称量安慰剂和活性微粒并通过几何稀释法共混。进行共混物均匀性测试，并将微粒填充到临床前胶囊中，使其含有17mg填充重量。制备含有100、50、20或10μg实例9.3的环状肽强度的胶囊以供在动物模型中测试。所有填充的胶囊均单独称量，并记录重量。
[0523] 11.实验模型。
[0524] 11.1法国的西海珀公司(Cerep)对实例9.3的环状肽相比内源性MC1r激动剂ACTH(促肾上腺皮质激素)和α-MSH(α-黑皮质素刺激激素)的体外选择性进行了评估。结果如下：
[0525]
[0526] 11.2进行了体外活性和安全性研究。实例9.3的环状肽显示脂多糖诱导的TNF-α抑制与α-MSH及ACTH相当。另外，在欧陆集团(Eurofins)铅谱中，在10μM处的72个体外测定中均未检测到活性。
[0527] 11.3实例9.3的环状肽在插管大鼠肠炎症模型中评估，其中二硝基苯磺酸(DNBS)作为溶液直肠施用于雄性200g维斯塔(wistar)大鼠，以诱导肠内腔炎症。在大鼠升结肠的近端部分植入导管，该导管从颈背伸出以便给药。在10组中，按照如下对大鼠进行给药：0.5μg和5.0μg的实例9.3的环状肽和媒介物(无菌水)，在DNBS激发前24h、12h和2h以及激发后
6h经由结肠内注射，随后每天两次给药，连续持续5天至第7天。向未插管的对照大鼠施用柳氮磺胺吡啶(阳性对照)和媒介物(未治疗的对照)。如图1A和图1B所示，在DNBS大鼠肠道炎症模型中，在降低肠道炎症参数(结肠重量和炎症评分)方面，递送至肠内腔的实例9.3的环状肽与柳氮磺胺吡啶(护理标准)具有相同活性，并且优于未治疗的对照。
[0528] 11.4在大鼠中评估含有实例9.3的环状肽的上述第10部分批次41的口服胶囊配制品用于结肠释放的药代动力学和药效动力学。使用总共24只体重在250-350克之间、7-9周大的斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠，禁食过夜，之后口服给药含有0.1mg实例9.3的环状肽的单粒胶囊，可随意进食和饮水。在特定时间点(n＝20)和测试后(n＝4)，收集肠和结肠内容物。如图2所示，批次41的实例9.3的环状肽的口服配制品在结肠中释放并于9小时内穿过大鼠肠道。
[0529] 11.5在大鼠结肠炎DNBS模型中，与批次49的安慰剂媒介物和柳氮磺胺吡啶治疗相比，评估每天两次(bid)施用的、含有10μg、20μg和50μg实例9.3的环状肽的批次41的口服胶囊配制品。如图3A和图3B所示，与安慰剂媒介物相比，含有50μg实例9.3的环状肽的胶囊的基线校正的炎症评分和宏观损伤评分均显著降低(改善)，其程度与柳氮磺胺吡啶相似。血浆测定未检测到任何全身性的实例9.3的环状肽。
[0530] 12.人类临床试验研究。
[0531] 按照批次41，配制实例9.3的C14标记的环状肽的口服配制品。C14标记用于评估单一口服量后实例9.3的肽在远端GI道中的释放和吸收。以23.25:23.0:12.5的重量比选择并使用 L100-55、 S-100和 FS30D聚甲基丙烯酸酯的组合，其中L100-55和S-100的重量为固体材料的干重，且FS30D的重量为商业制备的水性配制品重量，其中12.5克液体FS30D含有3.75克聚合物，使得聚合物的重量比为23.25:23:3.75。将聚甲基丙烯酸酯组合置于丙酮中并长时间搅拌。将适量的实例9.3的C14标记的肽溶解于水中并与制备的丙酮-聚甲基丙烯酸酯溶液混合、长时间搅拌、并在真空下干燥。将干燥的材料回收，用不含肽的另外干燥的聚甲基丙烯酸酯混合物稀释以获得预定量的材料中期望的靶浓度，并碾磨至期望的直径，并筛分。将过筛的材料置于2号明胶胶囊中，以提供口服配制品。
[0532] 以微剂量水平向24名受试者(分为6组，每组4名受试者)施用口服配制品。组1到组5的受试者在给药后5、8、11、14和17小时服用缓泻药，而组6的受试者不服用缓泻药。对所有组中的受试者的血液、尿液和粪便样品进行药代动力学分析，包括分析是否存在实例9.3的肽和实例9.3的肽的代谢物、实例9.26的肽(带有N-末端游离酸)。
[0533] 实例9.26的肽的存在提供了实例9.3的肽从聚合物基质中释放的证据，因为实例9.3的C-末端的胺转化为实例9.26的酸仅可在该肽从聚合物基质中释放后发生。在所分析的粪便样品中，发现实例9.3和实例9.26的肽水平显著且大致相等。此外，在血浆或尿液中未发现完整的实例9.3或实例9.26的肽。尿液中唯一的放射性物质是C14标记的苯丙氨酸。这些结果表明，药物产品穿过上GI时得到显著保护，并且在随后药物产品释放中递送至结肠。
此外，在血浆或尿液样品中没有任何可检测的实例9.3或实例9.26的肽，这证明了药物产品没有吸收到体循环中。
[0534] 虽然本发明已经具体参考这些优选的实施例进行了详细描述，但其他实施例可以实现相同的结果。本发明的变化和修改对本领域的普通技术人员将是显而易见的，并且旨在涵盖所有此类修改和等效物。以上所引用的所有参考文献、申请、专利以及公开的全部披露内容特此通过引用并入。

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