产生治疗疼痛的止痛化合物的细胞系

产生治疗疼痛的止痛化合物的细胞系

本发明涉及对治疗疼痛有用的细胞系。更具体地讲，本发明的细胞系已被基因改造可产生选自内啡肽、脑啡肽和儿茶酚胺的至少一种止痛化合物。

疼痛是疾病的一种常见的症状。脊髓的浅层后角，传输感受伤害信息的初级传入神经纤维在此终止，它包含脑啡肽能中间神经元和高密度的阿片受体。除此之外，在脊髓浅层中还有高密度的去甲肾上腺素能神经纤维。

急性疼痛是由对急性有害刺激的反应引起的。慢性疼痛主要是由于中枢和外周起源的神经病。这种神经病痛是躯体传感过程紊乱的结果，可导致对疼痛刺激的敏感性的增加(痛觉过敏)以及与通常不能引起疼痛的刺激相关的疼痛(allodynia)。

将吗啡鞘内注射到脊柱的蛛网膜下腔可有效地止痛。类似地，去甲肾上腺素和去甲肾上腺素能激动剂的鞘内给药也可止痛。参见，例如，Sagen等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第83卷，7522-26页(1986)。

亚效剂量鸦片类药物如脑啡肽和儿茶酚胺(例如去甲肾上腺素)的联合服用，可协同作用产生止痛作用。同上。肾上腺髓质的嗜铬细胞产生和释放几种神经活性物质，包括去甲肾上腺素、肾上腺素、蛋氨酸-脑啡肽、亮氨酸-脑啡肽、神经肽Y、血管活性肠多肽、促生长素抑制素、神经降压素、缩胆囊肽和降钙素基因的相关多肽。参见，例如，Sagen等，美国科学院院报，第83卷，7522-26页(1986)；Sagen等，神经化学杂志(Jour.Neurochem.)，第S6卷，623-27页(1991)。

因为嗜铬细胞产生阿片样肽和儿茶酚胺，一种减少伤害感受反应或疼痛敏感性的方法已经研究了将肾上腺髓质组织还有分离的肾上腺嗜铬细胞直接移植到中枢神经系统疼痛调节区域，试图产生止痛。参见，例如，Sagen等，脑研究(Brain Research)，第384卷，189-94页(1986)；Vaguero等，神经报告(Neuroreport)，第2卷，149-51页(1991)；Ginzeberg和Seltzer，脑研究，第523卷，147-50页(1990)；Sagen等，疼痛(Pain)，第42卷，69-79(1990)。

已经尝试使用同种异体的和异种的嗜铬组织或细胞移植来产生止痛。同种异体移植组织来源有限，并且不容易进行，尤其对人类疼痛的治疗过程。除此之外，同种异体的人类组织带有病原体污染的危险。参见，例如Hama和Sagen，脑研究，第651卷，183-93页(1994)。

异种供体可提供大量的容易获得的材料。因此，已经使用了牛的肾上腺组织。参见，例如，Hama和Sagen，脑研究，第651卷，183-93页(1994)。

然而，潜在的严重的宿主结果以及最终的移植排斥是在迥然不同的种类之间移植所固有的问题。完整的或解离的组织完全的移植排斥甚至可发生在中枢神经系统，后者正常被认为是免疫特区，这是由于异体移植物中尤其是在上皮细胞中强抗原细胞的存在。除此之外，必须仔细筛选供体组织以避免病毒污染或其它的病原体传入宿主。为了克服移植排斥，需要免疫抑制，典型的是使用环孢菌素A。

已经报道了由于这些移植减轻了一些疼痛敏感性，尤其是低强度慢性疼痛的减轻。在大多数的报道中，仅仅当服用尼古丁刺激产生阿片样多肽之后，对照和移植动物才显示显著差异。然而，还有一些报道在大鼠慢性疼痛模型中从嗜铬组织同种异体移植的基本水平活性观察到了痛觉缺失。参见，例如，Vaquero等，神经报告第2卷，149-51页，(1991)和Hama和Sagen，脑研究，第651卷，183-93页(1994)。

牛的肾上腺嗜铬细胞已经被包囊化制成生物人造器官植入大鼠来治疗急性和慢性疼痛。参见，例如，Sagen等，神经科学杂志(J.Neutosci.)，第13卷，2415-23页(1993)和Hama等，第七届世界疼痛大会(7thWorld Congress Pain)，摘要986，法国巴黎(1993)。在人类患者中已使用包囊化的牛嗜铬细胞进行了最初的尝试。参见，例如，Aebischer等，移植(Transplantation)，第58卷，1275-77页(1994)。

也已使用其它细胞例如AtT-20细胞进行了诱导抗感受伤害的尝试。AtT-20细胞最初是从小鼠的垂体前叶癌中衍生的。这些细胞合成和分泌β-内啡肽。参见，例如，u，神经移植和可塑性杂志(J.Neural Transpl.& Plasticity)，第5卷，15-26页(1993)。AtT-20/hENK细胞为已经被基因改造携带了具有200个碱基的5’-旁侧序列和2660个碱基的3’-旁侧序列的完整的人类脑啡肽原A基因(即，含有6个蛋氨酸-脑啡肽序列和一个亮氨酸-脑啡肽序列)的AtF-20细胞。参见，Wu等，(同上)，Comb等EMBO J.，第4卷，3115-22页(1985)。

Wu等，神经移植可塑性杂志，第5卷，15-26页(1993)涉及到用AtT-20或AtT-20/hENK细胞移植的大鼠宿主。没有刺激的AtT-20/hENK细胞比AtT-20植入细胞产生更强的抗感受伤害(尾部轻拍试验)。相反，异丙基肾上腺素刺激后tT-20细胞比AtT-20/hENK细胞产生更强的抗感受伤害。同上。

在小鼠宿主中，AtT-20细胞或AtT-20/hENK细胞的植入不影响对热感受伤害刺激的基础反应。植入AtT-20细胞的小鼠对β-内啡肽和μ-阿片样激动剂(DAMGO)的耐受有所提高。植入AtT-20/hENK细胞的小鼠对δ-阿片样激动剂(DPDPE)的耐受有所提高。对于μ阿片样激动剂的重复给药，植入AtT-20/hENK细胞的小鼠与植入AtT-20细胞的小鼠或对照小鼠相比耐受的提高较小。

在植入AtT-20细胞或AtT-20/hENK细胞的小鼠中，异丙基肾上腺素处理的抗感受伤害效果看起来是相等的。参见，Wu等，神经科学杂志，第14卷，4808-14页(1994)。Wu等推测在植入产生脑啡肽的AtT-20/hENK细胞的小鼠中额外的抗感受伤害缺失的一个原因是缺少行为试验的敏感性。另一个可能的原因是蛋氨酸-脑啡肽的对吗啡诱导的抗感受伤害的已知拮抗作用和单一亮氨酸-脑啡肽潜在的作用相抵消，尤其因为在脑啡肽原A中有6个蛋氨酸-脑啡肽序列对应一个亮氨酸-脑啡肽序列。

本发明提供了一种已被基因改造可产生选自内啡肽、脑啡肽和儿茶酚胺的至少一种止痛化合物的细胞系。这种细胞系可用于治疗疼痛。

使用细胞系比使用原代细胞有许多好处。对个个原代细胞分离物必须进行昂贵的和耗时的试验来确定细胞的安全性以及效能标准。而对细胞库则要求的试验较少。这样就没有必要分离原代细胞。由于原代细胞的效能可能依赖于供体动物的年龄、性别、健康或荷尔蒙的状况，使用细胞系时所需止痛剂的产生可能更加稳定。也有可能获得所需产品更高的产量，还可将特异修饰的多肽改造到细胞系中。这允许同时投送多种止痛剂。一种或多种止痛剂的表达可被调控(用驱动表达的可调控的启动子)。除此之外，为了安全，可在细胞系中插入“自杀基因”。进一步，为了包囊化的目的，增殖细胞还具有它们可分裂以取代将死的或已死细胞的好处。

图1是载体pBS-hPOMC-027，pBS-IgSP-hPOMC-028和pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029的质粒图谱。图2是载体pCEP4-hPOMC-030，pCEP4-hPOMC-031，pcDNA3-hPOMC-034和pcDNA3-hPOMC-035的质粒图谱。图3是载体pCEP4-hPOMC-ΔACTH-032，pCEP4-hPOMC-ΔACTH-033，pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-036和pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-037的质粒图谱。

图4是载体pcDNA3-rTH-044，pcDNA3-rTHΔ-045和pcDNA3-rTHDKS-075(也表示成pcDNA3-rTHΔKS-075)的质粒图谱。图5是载体pcDNA3-rTHΔ-IRES-bDBH-088和pcDNA3-rTHΔKS-IRES-bDBH-076的质粒图谱。

图6是载体pZeo-Pcmv-rTHΔKS-IRES-bDBH-088的质粒图谱。

图7是载体pBS-Pcmv-rTHΔIRES-bDBH-067的质粒图谱。

图8是载体pBS-hPOMC-ΔACTH-IRES-rTHΔIRES-bDBH-068的质粒图谱。

图9是载体pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-069的质粒图谱。

图10是载体pcDNA3-IRES-Zeocin-072的质粒图谱。

图11是载体pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-IRES-Zeocin-073的质粒图谱。

图12是载体pcDNA3-hPROA+KS-091的质粒图谱。

为了可以更加深入地了解本发明，列出以下详细描述。

任何合适的细胞都可以用本发明的重组DNA分子转化。本发明所关注的细胞中有嗜铬细胞，包括条件无限增殖化嗜铬细胞如在WO96/02646中所描述的那些，Neuro-2A、PC12、PC12a、SK-N-MC、AtT-20、和包括RINa和RINb的RIN细胞。该细胞优选含有内源性激素原转化酶和/或多巴脱羧酶。

SK-N-MC细胞，一种神经上皮瘤细胞系，同时表达几种神经肽，包括脑啡肽、儿茶酚胺和胃泌素释放肽。参见，例如，Verbeeck等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，第265卷，18087-090页(1990)。脑啡肽原A的基因已经在SK-N-MC细胞中表达。参见，例如，Folkrsson等，分子脑研究(Mol.Brain Res.)，第3卷，147-54页(1988)。我们优选AtT-20细胞和RIH细胞，尤其最优选RIH细胞。

RIH细胞是来自大鼠的胰内分泌细胞系。参见，例如，Horellou等，生理学杂志(J.Phvsiol.)，第85卷，158-70页(1991)。已知RIN细胞产生内源性γ-氨基丁酸和(GABA)β-内啡肽。

本发明关注的各种细胞的一些特征如表1所示。

表1细胞             止痛物质                        其它组份嗜铬细胞         去甲肾上腺素，蛋氨酸-脑啡肽     TH、DDC，DβH，PCPC12，PCl2a      低去甲肾上腺素，蛋氨酸-脑啡肽   DDC，DβH，PCAtT-20           β-内啡肽                       DDC，PCRINa             β-内啡肽，γ-氨基丁酸          DDC，PCRINO             β-内啡肽                       DDC，PCNeuro 2A                                         DDC，DβH，PCTH＝酪氨酸羟化酶转化酪氨酸-1-多巴DDC＝多巴胺羧化酶转化1-多巴-多巴胺(DA)

DβH＝多巴胺β-羟化酶转化多巴胺-去甲肾上腺素(NE)PC＝激素原转化酶加工阿黑皮素原成为β-内啡肽，脑啡肽原A(ProA)成为蛋氨酸-脑啡肽。

AtT20＝通过阿黑皮素原(POMC)的表达内源分泌β-内啡肽的小鼠脑垂体促肾上腺皮质细胞系。

RIN＝大鼠胰岛瘤Neuro2A＝小鼠成神经细胞瘤最初释放的产物包括内啡肽、脑啡肽和儿茶酚胺的至少一种。

脑啡肽和内啡肽是人体中内源性的阿片样肽。这些阿片样肽包括大约从5到31个氨基酸的15种化合物。这些化合物与吗啡的同一种μ阿片受体结合以及至少部分作用于该受体，但它们化学上与吗啡无关。除此之外，这些化合物还刺激其它的阿片受体。Yaksh和Malmberg，Textbook ofPain，第三版(P.Wall和R.Melzack编)“感受伤害传导的中枢药理学”(“Central Pharmacology of Nociceptive Transmission”)165-200页，1994(纽约)。

阿片样肽具有共同的化学性质，但是以不同的路线合成。

β-内啡肽(最丰富的内啡肽)是作为大的前体分子阿黑皮素原(“POMC”)的一部分合成的。阿黑皮素原分子含有促肾上腺皮质激素(“ACTH”)、α-促黑素细胞激素(“α-MSH”)，β-促黑素细胞激素和β促脂解素。阿黑皮素原前体分子还具有产生其它内啡肽的潜能，包括α-内啡肽和γ-内啡肽。根据裂解酶例如激素酶原转化酶在这些组织的定位，在各种组织中阿黑皮素原前体分子的加工不同。

在脑垂体中，阿黑皮素原被裂解成促肾上腺皮质激素和β-内啡肽，促肾上腺皮质激素不再被加工。相反地，在下丘脑中，促肾上腺皮质激素被加工成β-促黑素细胞激素。虽然不同的细胞类型可合成相同的最初基因产物，但最终激素分泌的分布却可迥然不同。

本发明包括使用编码具有止痛活性的任何合适内啡肽的DNA序列。除此之外，还包括具有止痛活性的这些内啡肽的类似物或片断。那么本发明的细胞系产生的内啡肽可具有在所指定的天然内啡肽的氨基酸序列中一个或多个位点上发生氨基酸插入、缺失、置换和修饰的特点。我们优先选择保守的置换和修饰(例如，对内啡肽的二级和三级结构以及内啡肽的止痛性质具有最小影响的置换和修饰)。这些保守的置换包括Dayhoff的《蛋白序列和结构集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，5，(1978)和Argos，EMBO J.，第3卷，779-85(1989)中所描述的那些。

产生这些天然内啡肽的这些突变体的技术是众所周知的。例如，编码野生型内啡肽的DNA序列密码子可通过专一性的点突变而发生变化。

本发明包括使用编码完整的阿黑皮素原前体分子的DNA序列。这个实施方案利用宿主细胞的裂解酶(例如，激素原转化酶2)来产生一套内啡肽，它们中的一些或全部可具有止痛性质。

本发明还包括使用编码特殊的指定内啡肽的阿黑皮素原基因的DNA片段。

阿黑皮素原的DNA和氨基酸序列是已知的。Cochet等，自然(Nature)，第297卷，335-9页(1982)；Takahashi等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，第11卷，6847-58页(1983)。

我们优先选择其中缺失促肾上腺皮质激素编码区的编码阿黑皮素原的DNA序列。这种结构所编码的优选的内啡肽是β-内啡肽。

一些脑啡肽是在肾上腺内作为大分子脑啡肽原A的一部分被合成的，其中包含六个重复的蛋氨酸-脑啡肽序列和一个亮氨酸-脑啡肽序列。蛋氨酸-脑啡肽以及蛋氨酸-脑啡肽-精氨酸-苯丙氨酸和蛋氨酸-脑啡肽-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸都具有重要的抗感受伤害活性。参见，例如，Sagen等，脑研究，第502卷，1-10页(1989)。

其它的脑啡肽，例如，强啡肽和新内啡肽是由另一分子脑啡肽原B衍生的。附加的“隐蔽的”多肽也被编码在这些前体蛋白的结构之中，它们可被“激素酶原型”裂解而释放。参见，例如，Harrison的“内科医学原理”(“Principle of Internal Medicine”)，第12版，1668-69页(1991)。

本发明包括使用编码具有止痛活性的任何合适脑啡肽的DNA序列。还包括具有止痛活性的类似物或片断。这些类似物和片段可在天然的氨基酸序列中一个或多个位点上发生氨基酸插入、缺失、置换。这些突变体可按照以上所描述的方法得到。

本发明包括使用编码所指定的脑啡肽的成熟形式的DNA序列。除此之外，本发明还包括使用编码完整的脑啡肽原A前体或完整的脑啡肽原B前体的DNA序列。更进一步，本发明还包括使用编码融合蛋白的DNA序列，或这些序列的片段，它们的表达可产生一种或多种具有止痛性质的脑啡肽类的分子。

我们优先选择使用编码完整的脑啡肽原A前体分子的DNA序列。脑啡肽原A的DNA和氨基酸序列是已知的。Folkesson，同上。这个实施方案是利用宿主细胞的裂解酶如激素原转化酶来产生一套脑啡肽，它们中的一些或全部具有止痛性质。这种结构所编码的优选的脑啡肽是蛋氨酸-脑啡肽。

在中枢神经系统中有三种具有神经递质作用的天然儿茶酚胺：去甲肾上腺素(“NE”)，肾上腺素(“E”)和多巴胺。去甲肾上腺素与节后神经元交感神经末端相关。去甲肾上腺素在紧靠它释放的附近局部地发挥作用。

儿茶酚胺是由酪氨酸经过连续羟基化形成多巴，再脱羧形成多巴胺合成而来的，然后在多巴胺β羟化酶催化下在侧链的β位上羟化形成去甲肾上腺素。Harrison同上，380页。去甲肾上腺素经苯基乙醇胺-N-甲基转移酶(“PNMT”)N-甲基化形成肾上腺素。

酪氨酸羟化酶(“TH”)催化的酪氨酸的羟基化是去甲肾上腺素合成的限速步骤。在肾上腺髓质中多巴和去甲肾上腺素合成的调节可通过酪氨酸羟化酶的酶量和活性的变化来完成。

除此之外，从去甲肾上腺素到肾上腺素合成的调节可通过苯基乙醇胺-N-甲基转移酶(“PNMT”)的酶量和活性的变化而进行。苯基乙醇胺-N-甲基转移酶是在肾上腺皮质中由糖皮质激素诱导产生的。同上。

与肾上腺素非常类似，儿茶酚胺在肾上腺髓质嗜铬组织中保持高的浓度。阿片样肽也贮存在肾上腺中。

去甲肾上腺素和肾上腺素对α2受体具有相似的亲和力，因此都具有潜在的止痛作用。Bylund，FASEB J.第6卷，832-39页(1992)。脑啡肽类多肽主要包括蛋氨酸-脑啡肽，选择性激活δ阿片受体。Reisine和Bell，神经科学进展(Trends Neurosci.)，第16卷，506-10页(1993)。脊髓中α2肾上腺能和δ阿片受体的激活均导致抗感受伤害并具有潜在的协同作用。Yaksh和Malmberg，疼痛研究和控制的进展(Progress inPain Research and Management)，第1卷，Fields和LisbesKind编，IASP出版，西亚图，141-71页(1994)。δ和(μ)阿片受体在试验动物中的激活导致包括便秘和成瘾性的轻微副作用。Lee等，实验治疗药理学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，第267卷，883-87页(1993)。不同种阿片样能和肾上腺素能制剂的联合给药可降低对单一制剂的耐受力大小从而产生持续的疼痛缓解。Yaksh和Reddy，麻醉学(Anesthsiol.)，第54卷，451-67页(1981)。

本发明包括编码用于获得具有止痛性质的儿茶酚胺的儿茶酚胺生物合成酶或其类似物或片段的DNA序列。在本发明中优选的儿茶酚胺是去甲肾上腺素和肾上腺素。

在一个实施方案中，宿主细胞用必要的基因转化以完成所需的去甲肾上腺素或肾上腺素的生产。所需异源基因序列的选择依赖于在宿主细胞中天然儿茶酚胺合成酶的补充。例如，RIN细胞和AtT-20细胞缺乏酪氨酸羟化酶(“TH”)和多巴β羟化酶(“DβH”)。但RIN细胞和AtT-20细胞中含有内源性的多巴脱羧酶(“DDC”)。如果所指定的儿茶酚胺是肾上腺素，那么编码PNMT的基因也是必须的。编码PNMT的基因是已知的。Baetge等，美国科学院院报，第83卷，5455-58页(1986)。

编码酪氨酸羟化酶的基因是已知的。参见，例如，美国专利5,300,436，作为参考引用于文中。修饰的酪氨酸羟化酶的突变体也是已知的。美国专利5,300,436。除此之外，含有必须的C-末端催化区的酪氨酸羟化酶的截短的形式也是已知的。参见，例如，Daubner等，蛋白科学(Protein Science)，第2卷，1452-60页(1993)。

AtT-20细胞已用野生型的酪氨酸羟化酶以及各种酪氨酸羟化酶突变蛋白转化。参见，例如，Wu等，生物化学杂志，第267卷，25754-758页(1992)。

多巴β羟化酶的基因也是已知的。参见，例如，Lamoroux等，EMBOJ.，第6卷，3931-37页(1987)。

应认识到除了在此所描述的优选的DNA序列，还将有许多编码所指定止痛剂的简并DNA序列。

本发明的细胞系还可产生具有潜在止痛作用的次要的化合物，这些化合物包括高良姜素(galanin)和抑生长素。除此之外，本发明的转化细胞还可产生神经肽Y、神经降压肽和缩胆囊肽。本发明的细胞可正常产生一些或全部这些化合物，或者用标准技术进行基因改造来使之产生。

标准方法可用于制备或合成编码本发明细胞产生的止痛化合物的基因。

例如，所指定化合物的全部的氨基酸序列可用于构建一个后期翻译基因。含有编码所指定止痛化合物的核苷酸序列的DNA寡聚体可以被合成。例如，可合成编码任何指定多肽的一部分的几个小的寡核苷酸链然后连接。为了组装，每一个寡核苷酸都含有典型的突出端。

编码每一种所指定的止痛化合物的DNA序列，可以包括也可不包括编码信号序列的DNA序列。这种信号序列，如果存在的话，应该被选择表达止痛化合物的细胞所识别。它可能是原核的、真核的或是二者的联合。它也可是天然化合物的信号序列。一般地优选编码的信号序列，更加优选的是使用天然信号序列。

一旦组装，编码所指定化合物的DNA序列将被插入到一个或多个表达载体上，并且有效地与适于在所指定的转化细胞中表达的表达控制序列相连接。

正常的组装可用核苷酸测序、限制性内切酶酶切图谱、和转化细胞中生物学活性多肽的表达来确证。正如本领域所熟悉的，为了在宿主中得到转染基因的高水平的表达，基因必须有效地与在所选择的表达细胞中起作用的转录和翻译表达调控序列相连接。

表达调控序列和表达载体的选择依赖于细胞的选择。可以使用很多种表达宿主/载体的联合。对真核宿主有用的表达载体，例如含有SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。

我们优先选择pcDNA3、pCEP4、pZeoSV(InVitrogen，SanDiego)和pNUT。

各种表达调控序列中的任何一种都可在这些载体中使用。这些有用的表达调控序列包括与上述的表达载体的结构基因相连的表达调控序列。有用的表达调控序列的举例包括，例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、3’-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶启动子、酸性磷酸酶启动子如Pho5、酵母α-交配系统的启动子以及已知的控制真核细胞或它们的病毒基因表达的其它序列，和它们的各种组合。

当然应该清楚，并不是所有的载体和表达调控序列对这里所描述的DNA序列的表达具有相同的作用。也不是同一种表达系统对所有的细胞都有相同的作用。然而，本领域技术人员可在这些载体、表达调控序列和细胞中不用过多实验作一选择。例如，选择一个载体时，因为载体必须要在其中复制，所以宿主细胞必须被考虑。载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和这个载体所编码的任何其它蛋白的表达如抗生素标记也应该考虑。

选择表达调控序列时，各种因素都应该考虑。这些包括，例如，这些序列的相对强度，它的控制能力以及它与编码所指定止痛化合物的实际DNA序列的相容性，尤其在潜在的二级结构方面。宿主细胞应该通过它们与所选择的载体间的相容性、DNA序列所编码的产品的毒性、它们的分泌特性、它们正确折叠多肽的能力、和它们培养的需求的考虑而进行选择。如果宿主细胞要被包囊化，还应该考虑当包囊化和植入受体时细胞的生存力。

在这些参数中，本领域技术人员可以选择各种在培养物中表达所指定DNA序列的载体/表达调控序列/宿主的组合。

在一个实施方案中，细胞(例如，RIN细胞)连续用含有阿黑皮素原基因，脑啡肽原A基因、酪氨酸羟化酶基因和多巴β羟化酶基因的四个独立的表达载体转化。在这样一个转化的宿主细胞中，获得异源基因拷贝数的扩增比较困难。那么优选较少的表达载体。最为优选的是，使用含有四个异源基因的单一的表达载体。

在特殊的实施方案中，RIN细胞连续用三个表达载体转化。第一个载体含有和巨细胞病毒启动子相连的阿黑皮素原基因。优选使用一个促肾上腺皮质激素编码区缺失的截短的阿黑皮素原基因。第二个载体含有和巨细胞病毒启动子相连的脑啡肽原A基因。优选proA结构含有处在起始密码子紧邻上游区的Kozak序列。第三个载体含有酪氨酸羟化酶基因(优选截短的和在起始密码子紧邻上游区含有Kozak共有序列的)和多巴β羟化酶基因。在这个实施方案中，酪氨酸羟化酶基因和巨细胞病毒启动子有效地相连。多巴β羟化酶基因和内部核糖体进入位点启动子序列有效地相连。然后根据已知的方案用每一种载体相继转化RIN细胞。

在另一个实施方案中，构建一个含有脑啡肽原A基因、阿黑皮素原基因、酪氨酸羟化酶基因、和多巴β羟化酶基因的表达载体。优先缺失POMC基因的促肾上腺皮质激素区。优选截短的酪氨酸羟化酶基因。

单一转录产物的基因多基因表达比多个转录单位的表达更优选。从单一的真核转录产物获得多个基因表达的方法是利用称作内部核糖体进入位点(“IRES”)的细小RNA病毒mRNA的序列。这些位点对于mRNA的第一个AUG下游的序列的翻译有促进作用。

Macejak和Sarnow报道在哺乳动物细胞中免疫球蛋白重链结合蛋白的5’-非翻译序列(Bip，也称作CRP78，分子量78,000的葡萄糖-调节蛋白)的mRNA可直接使内部核糖体和mRNA以5’-帽的独立形式结合，表明这个细胞内mRNA使用内部核糖体结合机制来启动翻译。自然，第353卷，90-94页(1991)。

WO94/24870涉及使用两种以上的IRES从一条转录产物启动翻译，并且还使用一个结构中同一IRES的多个拷贝。

本发明还包括在转化细胞中使用“自杀”基因。最为优选的是，细胞携带TK(胸腺嘧啶激酶)作为安全措施，允许在体内用GCV(9-〔1，3-二羟-2-丙氧甲基〕鸟嘌呤)处理杀死宿主细胞。

在本领域使用“自杀”基因是已知的。参见，例如，Anderson的PCT申请WO93/10218；Hamre的PCT申请WO93/02556。接者受自身的免疫系统对植入的细胞的副反应提供了最先水平的保护。如果被包囊化，聚合物胶囊本身可为免疫隔离的。在表达构建中存在TK基因(或其它的自杀基因)可增加植入细胞的接受者的安全性。

在本发明中优先使用的载体包括那些允许编码止痛化合物的DNA的拷贝数可被扩增的载体。这些可扩增的载体在本领域是已知的。它们包括，例如，用DHFR扩增法可扩增的载体(参见，例如，Kaufman，美国专利4,470,461，Kaufman和Sharp，“构建标准的二氢叶酸还原酶的cDNA基因：用于有效表达的信号的分析”，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，第二卷，1304-19页(1982))或用谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增法可扩增的载体(参见，例如，美国专利5,122,464和欧洲公布申请338,841)。这些扩增可用于增加所指定的止痛化合物的产量。

还包括可增加所指定止痛化合物产量的其它技术。例如，包括存在于多克隆细胞系的亚克隆。细胞通过每一个加样孔中有限稀释成一个细胞而被克隆。培养细胞克隆，检测克隆并选择止痛物质产量最高的克隆。

另一种增加所指定止痛化合物产量的技术包括克隆具有比野生型的生物合成酶活性高的变异形式(即，截短的酪氨酸羟化酶1-155)。一些酪氨酸羟化酶截短的形式比野生型的酶活增加4-6倍。参见，例如，Daubner等，“大鼠酪氨酸羟化酶催化和调节区的表达和鉴定”，脑科学，第2卷，1452-60页(1993)。

除此之外，用无酪氨酸的培养基来选择增强的四氢生物喋呤辅因子水平可潜在地提高酪氨酸羟化酶的活性。参见，例如，Horellou等，“各种细胞系中人酪氨酸羟化酶cDNA的逆转录病毒转移；小鼠垂体前叶AtT-20细胞多巴胺的调节释放”，美国科学院院报，第86卷，7233-37页(1989)。

优选地，β-内啡肽的产量范围为从1到10,000pg/106细胞/小时。优选地，蛋氨酸-脑啡肽的产量为从1到10,000pg/106细胞/小时。优选地，儿茶酚胺的产量为从1到1,000pmol/106细胞/小时。

本发明的细胞可植入哺乳动物包括人体中，用以治疗疼痛。如果植入的细胞未包囊化，可以使用任一种合适的植入方案，包括Sagen等所概括的那些，见美国专利4,753,635，后者作为参考引用于文中。

在植入前本发明的遗传改造细胞可能需要包囊化。这些包囊化的细胞形成生物人造器官(“BAO”)。生物人造器官可设计成植入接受者体内或在体外发挥作用。本发明中有用的生物人造器官应至少具有在细胞核心周围有半透性外表面膜或夹套的典型特征。夹套允许养分、生物活性分子和其它的选择的产物透过生物人造器官的扩散。生物人造器官是生物相容性的。

在一些情况下，膜可以通过阻止免疫排斥的细胞和分子效应物而使细胞免疫隔离。免疫隔离膜的使用可使同种异型或异种基因的细胞在不使用免疫抑制的情况下植入个体。如果所隔离的细胞释放生物活性分子，这些分子通过周围的半透膜进入受者身体内。如果所隔离的细胞有代谢功能，要被代谢的物质将从受者的身体透过细胞待作用的膜而进入生物人造器官。

各种类型的膜已经用于构建生物人造器官。一般地，生物人造器官所用的膜都是微孔或超滤级的膜。各种膜材料已被建议用于生物人造器官，包括PAN/PVC、聚氨基甲酸乙酯、聚砜、聚偏乙烯、和聚苯乙烯。典型膜的几何形状包括平面片状，它可以组装成“三明治”形式的结构，即一层活细胞夹在两层必要的平面膜之间而周围被密封的装置。另外还可使用中空纤维装置，其中活细胞位于管式膜的内部。中空纤维生物人造器官可以通过将活细胞放入中空纤维的腔中再将纤维末端密封来分步制备。中空纤维生物人造器官也可通过共挤压过程形成，其中活性细胞与高分子溶液共挤压并在细胞周围形成膜。

生物人造器官已被描述，例如，美国专利Nos.4,892,538，5,106,627，5,156,844，5,158,881，和5,182,111，和PCT中请No.PCT/US/94/07015，WO92/19195，WO93/03901，和WO91/00119，所有这些将作为参考引用于文中。

生物人造器官可含有促进包囊化细胞长期存活的其它成分。例如，WO92/19195涉及含有能增强细胞生存力的水凝胶基质的可植入的免疫隔离的生物相容性载体。

生物人造器官的包囊膜可以使用与核心膜相同的材料，或使用不同的材料。在任一情形下，将形成选择通透性的或生物相容性的生物人造器官的周围或外周膜。如果需要的话，膜还可构建成免疫隔离性的。含有隔离细胞的核心可以悬浮在液体基质中也可固定在水凝胶基质中。

构建生物人造器官的材料的选择取决于一些因素，在Dionno WO92/19195中有详细描述。简要地说，各种聚合物和聚合物混合物可用来制造胶囊夹套。形成生物人造器官的高分子膜和其中的生长表面可包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸类共聚物)、聚偏乙烯化物、聚氯乙烯共聚物、聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚磷氮杂烯、聚丙烯腈、聚(丙烯腈/氯乙烯)，及其衍生物、共聚合物和它们的混合物。

生物人造器官可以用本领域已知的合适方法制备。一种这样的方法包括高分子铸型溶液和促凝剂的共挤压，其中可含有生物组织碎片、细胞器、或细胞悬浮液和/或其它的治疗制剂，如Dionno WO92/19195和美国专利5,158,881、5,283,187和5,284,761中所述，这些文献作为参考引用于文中。

夹套可含有一层或两层膜。一层膜的中空纤维可以通过当它被共挤压时猝灭高分子溶液的仅仅一个表面的方法得到。双层膜的中空纤维可以通过当它被共挤压时猝灭高分子溶液两个表面的方法而得到。

多种胶囊的构型都是可能的，例如圆柱形、圆盘形或球形。

生物人造器官的夹套具有决定选择通透性膜截留标称分子量(nMWCO)的孔径尺寸。大于截留标称分子量的分子不能透膜过而被截留。截留标称分子量定义为在对流条件下90％的排斥。在要求生物人造器官免疫隔离的情况下，选择膜的孔径尺寸允许细胞产生的特殊的因子扩散出载体，但不允许宿主免疫反应因子进入生物人造器官。典型的截留标称分子量为从50到200kD，优选为90到150kD。最合适的膜的组成也可将已知存在于选择的植入位点的宿主免疫效应分子和生物人造器官的外膜组份之间的反应性降到最低。

构建生物人造器官的核心为其中隔离的特殊细胞提供合适的局部环境。核心可以包含足以维持细胞生长的液体基质。液体核心尤其适于维持如PC12细胞的转化细胞系。可选择的，核心还可包含胶状基质。胶状基质可由水凝胶(藻酸盐，“VitrogenTM”等)或胞外基质成分组成。参见，例如，Dionne WO92/19195。

形成水凝胶的成分一般可分为三种类型。第一种带有净负电荷(例如，藻酸盐)。第二种带有净正电荷(例如，胶原和层粘连蛋白)。商业上可得的胞外基质成分包括例如MatrigelTM和VitrogenTM。第三种带有中性电荷(例如，高度交联的聚环氧乙烷，或聚乙烯醇)。

可采用任何合适的密封生物人造器官的方法，包括应用聚合物粘合剂和/或卷曲、打结和热密封。这些密封技术在本领域是已知的。除此之外，也可使用任何合适的“干燥”密封方法。在这些方法中，采用基本上无孔隙的接头，通过它注入包含细胞的溶液。填充以后，将生物人造器官密封。这种方法描述于共同未决的美国申请流水号08/082,407中，后者作为参考引用于文中。

在植入体内以前优先使用一个或多个体外实验来确定生物人造器官的功能。本领域已知的实验或诊断测试可以达到此目的。参见，例如，酶学方法，(Methods In Enzymology)Abelson(Ed)，Academic Press，1993。例如，可以使用ELISA(酶联免疫吸附试验)、层析或酶促试验、或分泌产物特异性的生物测定。如果要求，可以通过从受者体内收集适当的样品(例如，血清)监视植入物随时间的的分泌功能并测定它们。如果受者是灵长类，可用微量透析。

生物人造器官的数目和大小植入时应足以产生治疗效果，这由特殊用途所要求的生物活性的量而决定。在释放治疗物质的分泌细胞中，本领域已知的标准剂量因素和标准用于决定所要求的分泌物质的数量。应考虑的因素在Dionne的WO92/29295中讨论过。

生物人造器官的植入在无菌的条件下进行。一般地，生物人造器官植入在宿主某一位点，即允许分泌产物或对宿主作用和包囊化细胞或组织养分适当释放的位点，和有利于生物人造器官的收回和/或置换的位点。优选宿主是灵长类，最优选人类。

本发明包括一些不同的植入位点。这些植入位点包括中枢神经系统，包括脑、脊髓、和眼睛的眼房水和玻璃体液。脑中优选的位点包括纹状体、大脑皮质、丘脑下核和迈内特氏下橄榄核。其它优选的位点是脑脊液，最优选蛛网膜下腔和侧室。本发明还包括肾囊下的位点、和腹膜内的以及皮下的位点，或任何其它的在治疗上有利的植入位点。

为了更好地了解本发明，列出以下实施例。这些实施例仅为了举例说明，并不在任何意义上构成对本发明范围的限制。实施例多顺反子表达载体的构建IgSP-POMC融合基因的构建含有人的阿黑皮素原外显子3的Sma I-Sal I片段亚克隆到pBS载体(Stratagene)上。参见，Takahashi，同上；Cochet，同上。得到的质粒命名为pBS-hPOMC-027。参见图1。

使用两个寡聚核苷酸引物即oCNTF-003(SEQ ID NO：10和oIgSP-018(SEQ ID NO：2)和含有人睫状神经营养因子(CNTF)基因的pNUT质粒得到PCR片段。参见Baetge等，美国科学院院报，第83卷，5454-58页(1986)。oCNTF-003和oIgSP-018两条引物，分别在5’末端含有合成的BamH I和Sma I限制性内切酶酶切位点。

196个碱基对(bp)的PCR片段用限制性内切酶BamH I和Sma I-同切点酶Xma I消化，并用1％的SeaPlaque琼脂糖进行电泳。193bpHind III/Xma I DNA片段被切除并用FMC SpinBind DNA纯化试剂盒纯化(FMC BioProducts，Rockland，ME)。

pBS-hPOMC-027用BamH I h和Xma I消化并用FMC SpinBindDNA纯化试剂盒(FMC BioProducts，Rockland，ME)从1％的SeaPlaque琼脂糖中纯化。连接混合物转化到大肠杆菌DH5α(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。

阳性的亚克隆用裂解胶方法(Promega Protocols and ApplicationsGuide，1991)进行最初的鉴定。微裂解的DNA用FMC Spin Bind DNA纯化试剂盒纯化(FMC BioProducts，Rockland，ME)并用BamH I和SmaI限制性内切酶消化。阳性的亚克隆命名为pBS-IgSP-hPOM-028。参见图1。pBS-IgSP-hPOMC-028中融合接头的核苷酸序列通过用测序酶试剂盒(USBC，Cleveland)进行双脱氧核苷酸序列测定来确定。IgSP-hPOMC融合基因的序列如SEQ ID NO：3中所示。IgSP-hPOMC表达载体的构建pBS-IgSP-hPOMC-028中的IgSP-hPOMC DNA片段以有义和反义的取向亚克隆到pcDNA3(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)和pCEP4(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)中。

pBS-IgSP-hPOMC-028中的Not I-Sal I IgSP-hPOMC片段和NotI-Xho I消化的pCEP4相连形成命名为pCEP4-hPOMC-030的有义取向的克隆。图2.pBS-IgSP-hPOMC-028中的BamH I-Sal I IgSP-hPOMC片段和BamH I-Xol I消化的pCEP4相连形成命名为pCEP4-hPOMC-031的反义取向的克隆。图2。在pCEP4-hPOMC-030和-031中的插入方向由BamH I、Not I、Sal I和Not I/Sal I限制性内切酶酶切和测序酶试剂盒(USBC，Cleveland)的双脱氧核苷酸序列测定而决定。

pBS-IgSP-hPOMC-028中的BamH I-Sal I IgSP-hPOMC片段和BamH I-Xol I消化的pcDNA3相连形成命名为pcDNA3-hPOMC-034的有义取向的克隆。图2.pBS-IgSP-hPOMC-028中的Not I-Hind III IgSP-hPOMC片段和Not I-Hind III消化的pcDNA3相连形成命名为pcDNA-hPOMC-035的反义取向的克隆。图2。用Sma I、BamH I、EcoR I、BamH I/EcoR I进行限制性内切酶酶切消化确定pcDNA3-hPOM-034中的插入方向，而用Hind III Not I和Sal I确定pcDNA-hPOMC-035的插入方向。促肾上腺皮质激素(ACTH)缺失的IgSP-POMC的构建将pBS-IgSP-hPOMC-028的POMC基因中促肾上腺皮质激素编码区删除。pBS-IgSP-hPOMC-028首先用限制性内切酶Xma I消化并用pfuDNA聚合酶处理(Promega，Madison，WI.)。然后这个Xma I-pfu DNA聚合酶处理后的pBS-IgSP-hPOMC-028再用限制性内切酶Stu I消化并用FMC SpinBind DNA纯化试剂盒(FMC BioProducts，Rockland，ME)从1％的SeaPlaque琼脂糖中纯化。自身连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。阳性亚克隆用Bam I/Hind III限制性内切酶消化鉴定，并命名为pBS-IgSP-hPOMCΔACTH-029。参见图1。pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029中促肾上腺皮质激素缺失区的核苷酸序列用双脱氧核苷酸序列测定方法证实。IgSP-hPOMC-ΔACTH融合基因如SEQ ID NO：4所示。促肾上腺皮质激素缺失的IgSP-POMC表达载体的构建

pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029中的IgSP-hPOMC-ΔACTH DNA片段以有义和反义的取向亚克隆到pcDNA3(Invitrogen Corp.，SanDiego，CA)和pCEP4(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)中。pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029中的Not I-Sal I消化的IgSP-hPOMC-ΔACTHDNA片段和Not I-Xho I消化的pCEP4相连形成命名为pCEP4-hPOMC-ΔACTH-032的有义取向的克隆(图3)。pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029中的BamH I-Sal I消化的IgSP-hPOMC-ΔACTH DNA片段和BamH I-Xho I消化的pCEP4相连形成命名为pCEP4-hPOMC-ΔACTH-033的反义取向的克隆(图3)。pCEP4-hPOMC-ΔACTH-032和-033中的插入方向可用BamH I、EcoR I限制性内切酶消化并用测序酶试剂盒(USBC，Cleveland)通过双脱氧核苷酸序列测定方法来确定。

pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029中的BamH I-Sal I消化的IgSP-hPOMC-ΔACTH DNA片段和BamH I-Xho I消化的pcDNA3相连形成命名为pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-036的有义取向的克隆(图3)。pBS-IgSP-hPOMC-ΔACTH-029中的Not I-Hind III消化的IgSP-hPOMC-ΔACTH DNA片段和Not I-Hind III消化的pcDNA3相连形成命名为pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-037的反义取向的克隆(图3)。

用Pvu II和EcoR I的限制性内切酶消化确证pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-036的插入方向，用Sal I和EcoR I确证pcDNA3-hPOMC-ΔACTH-。037的插入方向。全长以及截短的酪氨酸羟化酶cDNA的克隆用以硫氰酸胍为基础的TRI试剂(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH)从PC12细胞中制备总RNA。500ng的PC12总RNA在含有10mM Tris.HCl(pH8.3)、50mMKCl、4mM各种dNTP、5mMMgCl2、1.25μMoligo(dT)15-mer、1.25μM随机六聚体、31单位的RNA酶Guard RNA酶抑制剂(Pharmacia，Sweden)和200单位的SuperScript II逆转录酶(Gibco BRL，Gaithersberg，MD)的20μl反应体系中42℃逆转录30分钟。两微升的上述逆转录cDNA加入到25μl含有10mM Tris.HCl(pH8.3)、50mM KCl、800nM各种dNTP、2mMMgCl2、400nM引物#1和#2和2.5单位的栖热水生菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，德国)的PCR反应混合物中。

为了获得全长的酪氨酸羟化酶cDNA，采用寡核苷酸引物orTH-052(SEQ ID NO：5)和寡核苷酸引物orTH-053(SEQ ID NO：6)。对于截短的酪氨酸羟化酶，采用寡核苷酸引物orTH-054(SEQ ID NO：7)和orTH-053(SEQ ID NO：6)。这些寡核苷酸的构建是基于Grima等，自然，第326卷，707-11页(1987)；美国专利5,300,436，和Daubner，同上中所公布的酪氨酸羟化酶序列的信息。

引物orTH-052(SEQ ID NO：5)和orTH-054(SEQ ID NO：7)在5’末端含有合成的Hind III的限制性内切酶酶切位点，而orTH-053在5’末端有BamH I的酶切位点。PCR反应混合物经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，50℃1分钟；和延伸，72℃3.5分钟(最后一个循环5分钟)的30个扩增循环。1537个碱基对的全长和1087个碱基对的截短的大鼠酪氨酸羟化酶的PCR片段用限制性内切酶BamH I和Hind III消化并用1％的Sea Plaque琼脂糖凝胶分离。1531个碱基对和1081个碱基对的Hind III/BamH I的DNA片段被切下并用FMCSpinBind DNA纯化试剂盒(FMC BioProducts，Rockland，ME)纯化。

pcDNA3表达载体也用BamH I和Hind III消化并用FMC SpinBindDNA纯化试剂盒(FMC BioProducts，Rockland，ME)从1％的SeaPlaque琼脂糖凝胶分离纯化。连接混合物转化到大肠杆菌DH5α(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。

裂化凝胶方法(Promega Protocols and APPlications Guide，1991)用于筛选阳性的亚克隆。正确克隆的形式进一步通过BamH I/Hind III的双酶切而证实。

pcDNA3中全长和截短的大鼠酪氨酸羟化酶的阳性亚克隆被分别命名为pcDNA3-rTH-044(图4)和pcDNA3-rTHΔ-045(图4)。全长和截短的大鼠酪氨酸羟化酶的核苷酸序列用测序酶试剂盒(USBC，Cleveland)通过双脱氧核苷酸序列测定方法测定。rTHΔ构建物的序列如SEQ ID NO：16所示。

为使截短的大鼠酪氨酸羟化酶的翻译效率最优化，设计寡核苷酸引物orTH-78(SEQ ID NO：8)以便使共有的Kozak序列处在起始密码子ATG紧上游。使用pcDNA3-rTHΔ-45作为PCR反应的模板，在50μl的PCR反应体系中，除了用orTH-078(SEQ ID NO：8)和orTH-053(SEQ IDNO：6)取代寡核苷酸引物以外，含有和上述体系一样的试剂组成。用以上所描述的相同的方法，将1097个碱基对的PCR产物克隆到pcDNA3中。最终的亚克隆命名为pcDNA3-rTHΔKS-75(图4)。rTHΔKS构建物的序列如SEQ ID NO：17所示。rTH-IRES-bDBH融合基因的构建重组PCR方法用于制备rTH-IRES-bDBH融合基因。寡核苷酸oIRES-057(SEQ ID NO：9)和obDBH-065(SEQ ID NO：10)分别对IRES和bDBH基因序列特异，并且分别在5’末端含有合成的BamH I和Not I的限制性内切酶酶切位点。寡核苷酸oIRES-bDBH-064(SEQ IDNO：11)和oIRES-bDBH-066(SEQ ID NO：12)是彼此互补的。而且，寡核苷酸引物oIRES-bDBH-064(SEQ ID NO：11)的5’末端的16个核苷酸与IRES序列一致，3’末端的18个核苷酸与bDBH序列一致；oIRES-bDBH-066(SEQ ID NO：12)则正好相反。

首先分别以pCTI-001(带有SEQ ID NO：30所示的IRES序列的插入片段)和pBE-bDBH-006(含有从牛肾上腺嗜铬细胞克隆的牛DBH基因，Lamoroux等，EMBO J.，第6卷，3931-37页(1987))质粒为模板用寡核苷酸对oIRES-057/oIRES-bDBH-066和oIRES-bDBH-064/obDBH-065作两次PCR反应。100ng的模板DNA加入到50μl含有10nM Tris.HCl(pH8.3)、50mM KCl、800nM各种dNTP、2mMMgCl2、400nM引物#1和#2、2.5单位的栖热水生菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，German)的PCR反应混合物中。

PCR反应混合物经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，50℃1分钟；和延伸，72℃30秒(最后一个循环5分钟)的30个扩增循环。PCR产物用1％TrivieGen 500(TrivieGen)分离。将各含有一种第一次PCR产物的两个琼脂糖段转移到含有50μL PCR反应混合物的管中，反应混合物和上面所描述的一致，但是使用寡核苷酸oIRES-057和obDBH-065。

第二个PCR反应经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，60℃30秒(第2到第4个循环，37℃2分钟)；和延伸，72℃30秒(最后一个循环2分钟)的30个扩增循环。2407个碱基对的IRES-bDBH融合基因的PCR产物和克隆载体pcDNA3-rTHΔ-45用限制性内切酶BmaH I和Not I消化，尔后用FMC SpinBind DNA纯化试剂盒(FMCBioProducts，Rockland，ME)从1％的SeaPlaque琼脂糖凝胶分离纯化。

IRES-bDBH/BmaH I/Not I和pcDNA3-rTHΔ-45/BmaH I/NotI的连接产生命名为pcDNA3-rTHΔ-IRES-bDBH-066(图5)的rTHΔ-IRES-bDBH表达载体，而IRES-bDBH/BmaH I/Not I和pcDNA3-rTHΔKS-075/BmaH I/Not I的连接产生命名为pcDNA3-rTHΔKS-IRES-bDBH-076(图5)的rTHΔKS-IRES-bDBH表达载体，其中rTHΔ中的起始密码子ATG前面有共有的Kozak序列。rTHΔ-IRES-bDBH构建物的序列如SEQ ID NO：18中所示。rTHΔKS-IRES-bDBH构建物的序列如SEQ ID NO：19中所示。连接混合物转化到大肠杆菌DH5α(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。阳性的亚克隆用裂化凝胶法(Promega Protocols and Applications Guide，1991)鉴定并用Hind III、BamH I Hind III/BamH I、Sma I、Not I进行限制性内切酶酶切。

从pcDNA3-rTHΔKS-IRES-bDBH-076中切下含有CMV启动子-rTHΔKS-IRES-bDBH的4114个碱基对的Nru I-Xho I片段并亚克隆到在多克隆位点上用Sca I和Xho I消化的pZeoSV克隆载体(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中。最终的表达载体称为pZeo-Pcmv-rTHΔKS-IRES-bDBH-088(图6)。IgSP-hPOMC ACTH-rTHD-IRES-bDBH融合基因的构建从pcDNA3-rTHD-IRES-bDBH-066切下含有CMV启动子，rTHD-IRES-bDBH融合基因和BGH聚腺苷酸化序列的4100个碱基对的Nru I-Xho I片段并亚克隆到pBS(Stratagene，La Jolla，CA)表达载体中。

得到的质粒pBS-Pcmv-rTHΔ-IRES-bDBH-067(图7)被用作将插入重组PCR IgSP-hPOMCDATCH-IRES片段的中间构建物。

含有一个合成的EcoRV的限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸oIgSP-068(SEQ ID NO：13)对IgSP序列是特异的。

寡核苷酸引物ohTHΔ-073(SEQ ID NO：14)对rTHΔ序列是特异的并且含有内源性的Sma I的限制性内切酶酶切位点。

寡核苷酸引物ohPOMC-IRES-069(SEQ ID NO：15)和ohPOM-IRES-070(SEQ ID NO：20)是彼此互补的。而且，寡核苷酸引物ohPOMC-IRES-069的5’末端的18个核苷酸与hPOMC序列一致，3’末端的12个核苷酸与IRES序列一致；ohPOMC-IRES-070则正好相反。

寡核苷酸引物oIRES-rTHΔ-071(SEQ ID NO：21)和oIRES-rTHΔ-072(SEQ IDNO：22)是彼此互补的。此外，寡核苷酸引物oIRES-rTHΔ-071的5’末端的15个核苷酸与rTHΔ序列一致，3’末端的18个核苷酸与IRES序列一致；oIRES-rTHΔ-072则正好相反。

三组第一步PCR反应如下进行。

PCR反应A：模板pBS-IgSP-hPOMCDACTH-029，寡核苷酸oTgSP-068/ohPOMC-IRES-069；PCR反应B：模板pCTI-001，寡核苷酸ohPOMC-IRES-070/oIRES-rTHΔ-071；和PCR反应C：模板pcDNA3-rTHΔ-045，寡核苷酸orIRES-rTHΔ-072/orTHΔ-073。

三组第一步的PCR反应在含有10mM Tris.HCl(pH8.3)、50mMKCl、800nM各种dNTP、2mM MgCl2、400nM引物#1和#2、2.5单位的栖热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，Germany)的50μL PCR反应混合物中进行。

PCR反应混合物经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，50℃1分钟；和延伸，72℃30秒(最后一个循环5分钟)的30个扩增循环。

PCR产物用1％TrivieGel 500(TrivieGel)分离。将各含有PCR反应B和C中任何一种PCR产物的两个琼脂糖段转移到含有50μl PCR反应混合物的管中，反应混合物和上面所描述的一致，但是使用寡核苷酸ohPOMC-IRES-070和orTHΔ-073。

第二次PCR反应混合物经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，60℃30秒(第2-4循环37℃2分钟)；和延伸，72℃30秒(最后一个循环2分钟)的30个扩增循环。

PCR产物用上述方法处理。将含有第二次PCR反应和PCR反应A的PCR产物混合并用oIgSP-068/orTHΔ-073做第三次PCR扩增。将1203个碱基对的IgSP-hPOMC-IRES-rTHΔ融合基因PCR产物和克隆载体pBS-Pcmv-rTHΔ-IRES-bDBH-067用限制性内切酶EcoRV和XmaI消化并用FMC SpinBind DNA纯化试剂盒(FMC BioProducts，Rockland，ME)从1％的SeaPlaque琼脂糖凝胶分离纯化。连接混合物转化到DH5α(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。

阳性的亚克隆用裂化凝胶方法(Promega Protocols andApplications Guide，1991)鉴定并用EcoRI、KpnI和NotI进行限制性内切酶酶切。最终的克隆称为pBS-IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-068(图8)。这个构建物的序列如SEQ ID NO：23所示。Igsp-hPOMC ACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH表达载体的构建从pBS-IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-068中切下含有IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH基因的4491个碱基对的NotI片段并亚克隆到pcDNA3(Invitrogen Corp.，SanDiego，CA)的多克隆位点的NotI位点上。使用NotI和SmaI的限制性内切酶酶切可确证IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH基因以有义取向插入，从而形成pcDNA3-IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-069。参见图9。IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-IRES-Zeocine表达载体的构建重组PCR方法用于制备IRES-Zeocin融合基因。寡核苷酸oIRES-074(SEQ ID NO：24)和oZeocine-077(SEQ ID NO：25)对IRES和Zeocin基因序列分别是特异的，并分别在5’末端含有合成的NotI和XhoI限制性内切酶酶切位点。寡核苷酸引物oIRES-Zeocin-075(SEQ ID NO：26)和oIRES-Zeocin-076(SEQ ID NO：27)是彼此互补的。而且，寡核苷酸oIRES-Zeocin-075的5’末端的15个核苷酸与Zeocin序列一致，3’末端的18个核苷酸与IRES序列一致；oIRES-Zeocin-076则正好相反。

首先分别以pCTI-001和pZeoSV(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)质粒为模板用寡核苷酸对oIRES-074/oIRES-Zeocin-075和oIRES-Zeocin-076/oZeocin-075作两次PCR反应。

将100ng模板DNA加入到含有10mM Tris.HCl(pH8.3)，50mMKCL、800nM各种dNTP、2mM MgCl2、400nM引物#1和#2和2.5单位的栖热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，Germany)的50μl的PCR反应混合物中。

PCR反应混合物经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，50℃1分钟；和延伸，72℃30秒(最后一个循环5分钟)的30个扩增循环。

PCR产物用1％TrivieGel 500(TrivieGel)分离。将各含有任一种第一次PCR产物的两个琼脂糖段转移到含有50μl PCR反应混合物的管中，反应混合物和上面所描述的一致，但是使用寡核苷酸oIRES-074和oZeocin-077。

第二次PCR反应混合物经过包括：变性，94℃30秒(第一个循环2分钟)；退火，50℃30秒(第二个至第四个循环37℃2分钟)；和延伸，72℃30秒(最后一个循环2分钟)的30个扩增循环。

将974个碱基对的IRES-Zeoein融合基因PCR产物和克隆载体pcDNA3用限制性内切酶NotI和XhoI消化，然后用FMC SpinBind DNA纯化试剂盒(FMC BioProducts，Roclland，ME)从1％的Sea Plaque琼脂糖凝胶分离纯化。

IRES-Zeocin/NotI/XhoI和pcDNA3/NotI/XhoI连接产生称为pcDNA-IRES-Zeocin-072的中间克隆载体。图10。

阳性克隆用裂解凝胶法(Promega Protocols and APPlicationsGuide，1991)鉴定并用HindIII、SmaI、XhoI、NotI和NotI/XhoI进行限制性内切酶酶切。

为了产生最终的IgSP-hPOMCDACTH-IRES-rTHD-IRES-bDBH-IRES-Zeocin表达载体，从pBS-IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-068(图8，SEQ ID NO：23)中切下含有IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH基因的4491个碱基对的NotI片段并克隆到pcDNA3-IRES-Zeocin-072(图10)的多克隆位点的NotI位点上。使用NotI和SmaI的限制性内切酶酶切确定IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH基因以有义取向插入，从而形成pcDNA3-IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-IRES-Zeocin-073。这个结构的序列如SEQ ID NO：28所示。图15。ProA+KS融合基因的构建该构建物含有人的脑啡肽原A基因编码区和起始密码子ATG紧上游的Kozak共有序列。该构建物的序列如SEQ ID NO：29所示。hProA+KS表达载体的构建用大体如上述的方法将含有hProA+KS融合基因的HindIII/BamHI片段连接到BamHI和HindIII消化的pcDNA3表达载体上。如上所述筛选后，得到命名为pcDNA3-hProA+KS-091的阳性亚克隆。图12。pBS-CMVProA载体的构建在Mothis，J.和Lindber2，I.，内分泌学(Endocrinology)，第131卷，2287-96页(1992)中有详细描述。细胞的转化RIN和AtT-20细胞用以下方法转化。

RINa和AtT-20细胞系在含10％胎牛血清和pen-strep-fungizon(Gibco)碱性培养基的DMEM中培养。将细胞种入P100培养皿(750,000个细胞/平皿)上10ml碱性培养基中。18-24小时后，将细胞用Stratagene(San Diego，CA)的试剂盒采用磷酸钙法转染。10μg量的质粒载体DNA在450μl的去离子无菌水中稀释。然后，向质粒DNA中加入50μl的10×缓冲液(溶液#1)。立即向含有溶液的DNA中加入500μl的溶液#2并温和地混匀。在室温孵育20分钟，然后在培养皿的细胞中加入1.0ml溶液。细胞孵育过夜，18-24小时后用无钙离子和镁离子的Hanks平衡盐溶液洗涤两次。然后细胞在碱性培养基+选择药物中培养。用600μg/ml遗传霉素(Gibco)或400μg/ml潮霉素(Boehringer Mannheim)或500μg/ml Zeocin(In Vitrogen，San Diego，CA)的任何一种筛选细胞。依次转染和筛选细胞得到最终的细胞系。

用含有POMC基因的质粒pCEP4-hPOMC-030转染RINa细胞。这是潮霉素抗性载体。细胞还用质粒pcDNA3-hProA+KS-091转化。这是遗传霉素抗性载体。最后，细胞再用提供Zeocin抗性的质粒pZeo-PCMV-rTHΔKS-IRES-bDBH-088转染。

AtT-20细胞分别用提供遗传霉素和潮霉素抗性的质粒pBS-CMV-ProA和pCEP4-POMC-ΔACTH-32转染。最后细胞再用质粒pZeo-Pcmv-rTHΔKS-IRES-bDBH-088转染。

我们测试了细胞在一些培养基中的生长。令人惊讶的是，我们发现在无血清的培养基中和有血清的培养基相比，上述的细胞系具有提高的神经递质的产量。我们优选CHO-Ultra(Biowhitaker)培养AtT-20细胞，优选Ultra-Culture(Biowhitaker)培养RINa细胞。

转化的RINa细胞系(RINa/ProA/P030/P088)的各种止痛剂的产量如表2所示。所有的值均代表没有刺激的细胞。β-内啡肽和蛋氨酸-脑啡肽的产量是以pg/106细胞/hr表示。β-内啡肽和蛋氨酸-脑啡肽用Incstar试剂盒(Stillwater，Minnesota)通过放射免疫分析而测定。儿茶酚胺的产量以pmol/106细胞/hr表示。括号中的数字代表用10μM四氢生物喋呤预孵育的细胞的数值。儿茶酚胺用高压液相层析测定，如Lavoie等在“封于空心纤维胶囊中的两种PC12嗜铬细胞体外紧张性释放1-多巴”，细胞移植，第2卷，163-73页(1993)中所述。这些RINa中的γ-氨基丁酸产量是28ng pg/106细胞/hr。

表2内源性    β-内    蛋氨酸-脑细胞系                                     多巴胺    肾上腺素止痛物质    啡肽      啡肽RINa/ProA/  β-内啡肽                         3          0POMC/TH-       GABA      22        17        (6)        (2)IRES-DβH有些编码的(encrypted)脑啡肽片段未从脑啡肽原前体分子完全加工。这些编码脑啡肽具有结合阿片受体的能力。我们消化这些编码脑啡肽以测定阿片样物质活性。胰蛋白酶消化方案如下所述。2μg/ml的胰蛋白酶(Worthington#34E470)溶液加入到冰上的培养基样品中。将样品涡旋混匀，在37℃水浴中孵育20分钟。消化20分钟后，将样品放回到冰中并加入100ng/ml羧肽酶B(Sigma#C-7011)。将样品涡旋混匀，放回到37℃水浴中15分钟。样品再次置于冰上并加入10μg/ml的胰蛋白酶抑制剂。在这个阶段，可以从样品中抽提蛋氨酸-脑啡肽或立即冷冻以便以后的抽提。这将导致完全的酶降解并从较长的编码片段中释放出所有的蛋氨酸-脑啡肽。消化样品的蛋氨酸-脑啡肽放射免疫测定给出上清中的总蛋氨酸-脑啡肽。与完全加工的蛋氨酸-脑啡肽相比，转化的RINa细胞似具有5倍以上的编码脑啡肽。纤维胶囊的形成和特性将12.5-13.5％的聚(丙烯腈/氯乙烯)溶液用湿纺技术纺成中空纤维。Cabasso，中空纤维膜，第12卷，Kirk-Otbmer化学技术百科全书，Wiley，纽约，第3版，492-517页(1980)，美国专利5,158,881，作为参考引用于文中。

形成的膜纤维可以是一层或两层的PAN/PVC纤维。为了制备可植入的胶囊，首先将纤维切成5cm长的片段并将每一个片段的远端用丙烯酸胶密封。按如下制备包囊冲头装配件：取上述长度的膜，用一滴LCM24(可光固化的丙烯酸胶，可从ICI得到)密封纤维的一端，用蓝光使胶固化，用第二滴胶重复以上步骤。另一端事先连在具有一个硅氧烷隔片的易碎的颈状冲头装置上，通过该隔片可以导入细胞溶液。经将LM22加在冲头装置的外径上并将纤维拉上，用蓝光固化，从而将纤维胶粘在冲头上。冲头/纤维配件放入灭菌袋中并进行ETO消毒。

用环氧乙烷消毒并除气后，首先用70％乙醇、然后用HEPES缓冲盐溶液在真空下通过纤维壁除去纤维的甘油。转化细胞的制备和包囊化转化细胞的制备和包囊化按照以下方法进行：用商品化的藻酸盐、胶原或其它合适的基质材料制备基质溶液。细胞溶液以两份基质溶液对一份含有上述转化细胞的细胞溶液的比例稀释。我们优先选择Vitrogen(Celtix，Santa Clara)作为AtT-20细胞的基质。

我们优先选择Organogen(Organogenesis，Canton，MA)作为RINa细胞的基质。RINa细胞按照以下方法准备以供包囊。增殖期细胞在加10％胎牛血清的DMEM碱性培养基中生长。这些细胞可通过两次无钙离子和镁离子的Hanks平衡盐溶液的洗涤从组织培养瓶中转移出来。然后细胞在0.25％胰蛋白酶+EDTA中孵育1分钟。除去胰蛋白酶+EDTA并用无钙离子和镁离子的Hanks平衡盐溶液将细胞从瓶中洗出。将细胞放入10ml的碱性培养基中100×g离心2分钟。细胞重新悬浮在10ml优选的不含牛血清的培养基(Ultra culture，Biowhitaker，Walkersville，MD)中。令人惊讶的是，与含有血清的培养基中的培养相比，在这种不含血清的培养基中RINa分泌更多的止痛物质。

在用优选的Organogen基质将细胞以1∶1的比例调节浓度以前，将细胞在优选的不含血清的培养基中100g离心两次。Organogen是1％牛腱胶原经过消毒而得到的溶液。8份这种溶液和1份10×DPBS混合。加入0.5N氢氧化钠直到达到生理pH(大约250μL。

最终用于包囊化的细胞+基质溶液的浓度可为20,000-50,000个细胞/μl。细胞用血细胞计以标准的方法计数。

将细胞/基质悬浮液放入1ml注射器。一个Hamiton1800系50微升注射器先吸入10微升气泡，插入到1ml含有细胞溶液的注射器中并抽出30微升。将细胞溶液通过冲头/纤维装置的硅氧烷密封注入到截留分子量大约为50,000-100,000道尔顿的中空改良丙烯酸纤维膜的腔中。应该沿着纤维的整个长度观察超滤情况。一分钟后，冲头折断成亚冲头，暴露新鲜的细胞溶液未湿的表面。加一滴LCM24并用蓝光固化粘附剂。首先将这个装置放入HEPES缓冲的氯化钠溶液中然后再放入氯化钙溶液中5分钟以便使藻酸盐交联。每一个植入物大约长5cm，直径1mm，含有大约2.5百万个细胞。

这个装置填充和密封后，将一硅氧烷系线(Speciality SilconeFabrication，Paso Robles，CA)(ID：0.69，OD：1.25)置于纤维的近末端上。将一不透射线的钛塞装入硅氧烷系线的腔中作为放射显影的标记。然后将这个装置放入100mm组织培养皿中的1.5mlPC-1培养基中，37℃在5％CO2孵箱中贮存以进行体外分析和植入前的贮存。

包囊化的细胞按照以下方法植入到人的蛛网膜下腔：外科手术过程建立静脉液路并给予预防性抗生素(头孢唑林钠，1克静脉滴注)之后，病人固定在手术台上，一般取腰椎向前弯曲的侧卧位或膝胸卧位。手术范围消毒处理并覆盖手术巾，暴露从S-1到L-1的中线腰部背侧，保证手术过程中用C-臂荧光镜能使腰椎成像。1.0％利多卡因局部浸润麻醉表皮及骨膜和包括黄韧带在内的其它深层结缔组织。

在中线的右或左侧1-2cm处皮肤做一3-5cm的矢状切口直到腰背侧筋膜，用电烙铁止血。应用传统的包括髂嵴和腰棘突在内的骨标记及荧光镜导向，斜向正中方向将18号Touhy针头在L-3和L-4间穿刺至蛛网膜下腔。针头导向使得它进入该腔较浅部，其在矢状面或横断面与脊髓所成上方角度不超过30-35°。抽出几毫升脑积液(CSF)作移植前儿茶酚胺、脑啡肽、葡萄糖和蛋白质水平测定和细胞计数来证实针头的适当位置。

重新检查Touhy针冲头以证实针头的开口朝向上方(开口方向由针冲头上活塞的标志痕迹来显示)，导线穿过针的空腔，向蛛网膜下腔延伸4-5cm(经预先测量来确定)。在线穿过时应十分注意，针外的线向前时应没有阻力并且病人没有抱怨明显的神经性症状，其任一现象可表明导线方向错误及可能即将发生的神经根或脊髓损伤。

导线置于蛛网膜下腔内合适位置后，将Touhy针抽出并从线上取下。然后用荧光镜证实导线在脊管中线、马尾的预期位置之前且没有打结和不可解释的弯曲。取出Touhy针之后，导线应该能自由进出空腔，仅由于导线的不光滑表面穿过质密的纤维性黄韧带而有轻微的阻力。

然后将7French扩张器套于导线上，当扩张器轻轻并肯定地推过筋膜、脊椎旁侧肌肉和黄韧带时，该线用作扩张器的向导。沿线推向蛛网膜下腔，一旦穿过黄韧带，发现阻力消失，立即停止7French扩张器的前进并从线上取下扩张器。这样做是为了避免相对较硬的扩张器在蛛网膜下腔中的任何显著程度的前行和操作。

当线路被7French扩张器“过分扩张”之后，将6French扩张器和套管鞘组装并套于导线上。仔细向前推6French扩张器和套管鞘，进入蛛网膜下腔，直到套管的开口位于腔内7cm。象7French扩张器一样，组装好6French扩张器和套管由扩张器的空腔中的导线引导。通过预先测量该装置来确定在蛛网膜下腔中的位置并由荧光镜大体证实。操作蛛网膜下腔中的扩张器和套管要十分小心避免方向错误和可能的神经损伤。

当确定套管的位置适当时，将导线和6French扩张器依次从套管腔中取出。根据手术台上病人的位置，此时流过套管的CSF应该可见而且非常浓，需要盖上套管或非常迅速地加上胶囊移植体以避免过多的CSF流失。

包囊(转化细胞)在灭菌的两套层容器中，浸泡在运输介质中，并完全组装好(包括一管状硅氧烷系线)。在植入物通过套管进入蛛网膜下腔之前，将胶囊转移到插入工具盘，在这里胶囊可定位在一定的位置，保证胶囊保持在运输介质中，此时大体检测其损伤和重要缺陷及调整硅氧烷系线，调整其相对于推进器的长度并去掉加在外侧末端上的hemaclipipTM。

当将该装置的膜部分仔细导入到套管中时，通过插入推进器的小径线部分，将胶囊的系线部分安置在不锈钢推进器上。推进胶囊直到膜的顶部到达距蛛网膜下腔中的套管顶部2-10mm处。通过预先测定套管和组装好的胶囊-系线-推进器，来实现这一安置，并保证胶囊的膜部分在其被推到位的整个时间里受到套管的保护。

当胶囊定位在套管中时，推进器用于在套管从胶囊和推进器上完全抽出时，将胶囊固定在蛛网膜下腔中一定位置上(没有向前或往后)。然后将推进器的线部分从硅氧烷系线上滑脱，取出推进器。应用这一方法，胶囊的最终定位使得该装置5cm长的膜部分完全处于含CSF的马尾前侧的蛛网膜下腔中。在系线穿过硬脑脊膜和黄韧带退出之前，它被约1-2cm长的在蛛网膜下腔中运动的硅氧烷系线在其尾部固定。系线由此继续向外穿过椎旁肌肉从腰背部筋膜中露出约10-12cm，以供收回此装置。

通过注射谷胶纤维蛋白(Tissel)到椎旁肌肉中系线所行的通路中，并用收缩纤维缝合以牢固地封闭通路的上方筋膜开口来减小CSF的流失。然后用不可吸收的缝线固定系线的游离端，并经皮肤和皮下组织两层覆盖而完全覆盖。

然后将病人转移到神经外科恢复区，手术后24小时保证严格的卧床休息。移植手术后24小时还继续抗生素预防。序列下面将序列表中所涉及的序列做一总结：SEQ ID NO：1--寡核苷酸oCNTF-003的DNA序列SEQ ID NO：2--寡核苷酸oIgSP-018的DNA序列SEQ ID NO：3--IgSP-hPOMC融合基因的DNA序列SEQ ID NO：4--IgSP-hPOMC-ΔACTH融合基因的DNA序列SEQ ID NO：5--寡核苷酸orTH-052的DNA序列SEQ ID NO：6--寡核苷酸orTH-053的DNA序列SEQ ID NO：7--寡核苷酸orTH-054的DNA序列SEQ ID NO：8--寡核苷酸orTH-078的DNA序列SEQ ID NO：9--寡核苷酸oIRES-057的DNA序列SEQ ID NO：10--寡核苷酸obDBH-065的DNA序列SEQ ID NO：11--寡核苷酸oIRES-bDBH-064的DNA序列SEQ ID NO：12--寡核苷酸oIRES-bDBH-066的DNA序列SEQ ID NO：13--寡核苷酸oIRE-068的DNA序列SEQ ID NO：14--寡核苷酸orTHΔ-073的DNA序列SEQ ID NO：15--寡核苷酸ohPOMC-IRES-069的DNA序列SEQ ID NO：16--rTHΔ1-155的DNA序列SEQ ID NO：17--rTHΔ+KS的DNA序列SEQ ID NO：18--rTHΔ-IRES-bDBH的DNA序列SEQ ID NO：19--rTHΔKS-IRES-bDBH的DNA序列SEQ ID NO：20--寡核苷酸ohPOMC-IRES-070的DNA序列SEQ ID NO：21--寡核苷酸IRES-rTHΔ-071的DNA序列SEQ ID NO：22--寡核苷酸orIRES-rTHΔ-072的DNA序列SEQ ID NO：23--IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-068融合基因的DNA序列SEQ ID NO：24--oIRES-074的DNA序列SEQ ID NO：25--寡核苷酸oZeocin-077的DNA序列SEQ ID NO：26--寡核苷酸oIRES-Zeocin-075的DNA序列SEQ ID NO：27--寡核苷酸oIRES-Zeocin-076的DNA序列SEQ ID NO：28--IgSP-hPOMCΔACTH-IRES-rTHΔ-IRES-bDBH-IRES-Zeocin-073的DNA序列SEQ ID NO：29--proA+KS的DNA序列SEQ ID NO：30--IRES片段的DNA序列保藏命名为RINa/ProA/P030/P088的RINa/ProA/POMC/TH-IRES-DBH细胞已被保藏，如以上实施例(和表2)所述，它已被转化产生儿茶酚胺、脑啡肽和内啡肽。保藏是根据布达佩斯条约进行的，它已于1995年6月7日被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland，U.S.A.)。它的保藏号为CRL11921。

以上的描述仅仅是为说明和描述而已。本说明书无意将本发明局限在上述实施例中的精确形式。本发明的范围可通过此文所附的权利要求来限定。序列表(1)一般信息：(i)申请人：CytoTherapeutics公司。(对于美国以外的所有指定国)Shou Wang(只对美国)Joel Saycboff(只对美国)(ii)发明名称：疼痛细胞系(iii)序列数：30(iv)通讯地址：(A)收信人：James F.Haley，Jr./Ivor.Elrifi  FISH & NEAVE(B)街道：1251 Ave.of the Americas(C)城市：纽约(D)州：纽约(E)国家：美国(F)ZIP：10020-1104(v)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容(C)操作系统：PC-DOC/MS-DOS(D)软件：PateneIn Release#1.0，#1.30版本(vi)本申请资料：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类：(vii)优先申请资料：(A)申请号：US08/481,917(B)申请日：1995，6，07(viii)律师/代理人资料：(A)姓名：Elrifi，Ivor R

(B)注册号：39,529(C)参考/卷号：CTI-29 CIP PCT(ix)电信资料：(A)电话：212596-9000(B)传真：212 596-9090(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：(A)长度：33bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：无(vii)直接来源：(B)克隆：cCNTF-003(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：                                 33CCCGGATCCG  CGTCACCCCT AGAGTCGAGC TGT(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：(A)长度：23bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：无

(vii)直接来源：(B)克隆：oIgSP-018(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：TTTCCCGGGA AAGCCGAATT CAC                                   23(3)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：(A)长度：849bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：无(iv)反义：无(vii)直接来源：(B)克隆：IgSP-hPOMC(ix)特征：(A)名称/关键：5’UTR(B)位置：1..43(ix)特征：(A)名称/关键：外显子(B)位置：44..89(ix)特征：(A)名称/关键：内含子(B)位置：90..168(ix)特征：

(A)名称/关键：3’UTR(B)位置：807..849(ix)特征：(A)名称/关键：混合特征(B)位置：43..186(C)其它资料：/产物＝“IgSP区”(ix)特征：(A)名称/关键：混合特征(B)位置：187..806(C)其它资料：/产物＝“hPOMC区”(xi)序列描述：  SEQ ID NO：3：GGATCCCCGT CACCCCTAGA GTCCACCTGT GACGGTCCTT ACAATGAAAT GCAGCTGGGT     60TATCTTCTTC CTGATGGCAG TGGTTACAGG TAAGGGGCTC CCAAGTCCCA AACTTGAGGG     120TCCATAAACT CTGTGACAGT GGCAATCACT TTCCCTTTCT TTCTACAGGG GTGAATTCGG     180CTTTCCCGGG AAATGGCGAC GAGCAGCCTC TGACCGAGAA CCCCCGGAAG TACGTCATGG     240GCCACTTCCG CTGGGACCGA TTCGGCCGCC GCAACAGCAG CAGCAGCGGC AGCAGCGGCG     300CAGGGCAGAA GCGCGAGGAC CTCTCAGCGG GCGAAGACTG CGGCCCGCTG CCTGAGGGCG     360GCCCCGAGCC CCGCAGCGAT GGTGCCAAGC CGGGCCCGCG CGAGGGCAAG CGCTCCTACT     420CCATGGAGCA CTTCCGCTGG GGCAAGCCGG TGGGCAAGAA GCGGCGCCGA GTGAAGGTGT     480ACCCTAACGG CGCCGAGGAC GAGTCGGCCG AGGCCTTCCC CCTGGAGTTC AAGAGGGAGC     540TGACTGGCCA GCGACTCCGG GAGGGAGATG GCCCCGACGG CCCTGCCGAT GACGGCGCAG     600GGGCCCAGGC CGACCTGGAG CACAGCCTGC TGGTGGCGGC CGAGAAGAAG GACGAGGGCC     660CCTACAGGAT GGAGCACTTC CGCTGGGGCA GCCCGCCCAA GGACAAGCGC TACGGCGGTT     720TCATGACCTC CGAGAAGAGC CAGACGCCCC TGGTGACGCT GTTCAAAAAC GCCATCATCA     780AGAACGCCTA CAAGAAGGGC GAGTGAGGGC ACAGCGGGCC CCAGGGCTAC CCTCCCCCAG     840GAGGTCGAC                                                             849(2)SEQ lD NO：4的资料：(i)序列特征：(A)长度：525bp

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(2)SEQ ID NO：19的资料：(i)序列特征：(A)长度：3432bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：无(iv)反义：无(vii)直接来源：(B)克隆：rTHDKS-IRES-bDBH(ix)特征：(A)名称/关键：5’UTR(B)位置：1..13(ix)特征：(A)名称/关键：外显子(B)位置：14..1024(ix)特征：(A)名称/关键：内含子(B)位置：1025..1624(ix)特征：(A)名称/关键：外显子(B)位置：1625..3418(ix)特征：(A)名称/关键：3’UTR(B)位置：3419..3432

(ix)特征：(A)名称/关键：混合特征(B)位置：1032..1624(C)其它资料：/产物＝“IRES序列”(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：AAGCTTCGCC ACCATGGTCC CCTGGTTCCC AAGAAAAGTG TCGGAATTGG ACAAGTGTCA     60CCACCTGGTC ACCAAGTTTG ACCCTGATCT GGACCTGGAC CACCCGGGCT TCTCTGACCA    120GGTGTATCGC CAGCGTCGGA AGCTGATTGC AGAGATTGCC TTCCAGTACA AGCACGGTGA    180ACCAATTCCC CATGTGGAAT ACACAGCGGA AGAGATTGCT ACCTGGAAGG AGGTATATGT    240CACGCTGAAG GGCCTCTATG CTACCCATGC CTGCCGGGAG CACCTGGAGG GTTTCCAGCT    300TCTGGAACGG TACTGTGGCT ACCGAGAGGA CACCATCCCA CAGCTGGAGG ACGTGTCCCG    360CTTCTTGAAG GAGCGGACTG GCTTCCAGCT GCGACCCGTG GCCGGTCTAC TGTCCGCCCG    420TGATTTTCTG GCCAGTCTGG CCTTCCGCGT GTTTCAATGC ACCCAGTATA TCCGCCATGC    480CTCCTCACCT ATGCATTCAC CTGAGCCGGA CTGCTGCCAT GAGCTGTTGG GACATGTACC    540CATGTTGGCT GACCGCACAT TTGCCCAGTT CTCCCAGGAC ATTGGACTTG CATCTCTGGG    600GGCCTCAGAT GAAGAAATTG AAAAACTCTC CACGGTGTAC TGGTTCACTG TGGAATTCGG    660GCTATGTAAA CAGAATGGGG AGCTGAAGGC TTATGGTGCA GGGCTGCTGT CTTCCTACGG    720AGAGCTCCTG CACTCCCTGT CAGAGGAGCC TGAGGTCCGA GCCTTTGACC CAGACACAGC    780AGCTGTGCAG CCCTACCAAG ATCAAACCTA CCAGCCTGTG TACTTTGTGT CCGAGAGCTT    840CAATGACGCC AAGGACAAGC TCAGGAACTA TGCCTCTCGT ATCCAGCGCC CATTCTCTGT    900GAAGTTTGAC CCGTACACAC TGGCCATTGA CGTACTGGAC AGCCCTCACA CCATCCAGCG    960CTCCTTGGAG GGGGTCCAGG ATGAGCTGCA CACCCTGGCC CACGCACTGA GTGCCATTAG   1020CTAAATGCAT AGGATCCGCC CCTCTCCCTC CCCCCCCCCT AACGTTACTG GCCGAAGCCG   1080CTTGGAATAA GGCCGGTGTG CGTTTGTCTA TATGTTATTT TCCACCATAT TGCCGTCTTT   1140TGGCAATGTG AGGGCCCGGA AACCTGGCCC TGTCTTCTTG ACGAGCATTC CTAGGGGTCT   1200TTCCCCTCTC GCCAAAGGAA TGCAAGGTCT GTTGAATGTC GTGAAGGAAG CAGTTCCTCT   1260GGAAGCTTCT TGAAGACAAA CAACGTCTGT AGCGACCCTT TGCAGGCAGC GGAACCCCCC   1320GGCACAACCC CAGTGCCACG TTGTGAGTTG GATAGTTGTG GAAAGAGTCA AATGGCTCTC   1440CTCAAGCGTA TTCAACAAGG GGCTGAAGGA TGCCCAGAAG GTACCCCATT GTATGGGATC    1500TGATCTGGGG CCTCGGTGCA CATGCTTTAC ATGTGTTTAG TCGAGGTTAA AAAACGTCTA    1560GGCCCCCCGA ACCACGGGGA CGTGGTTTTC CTTTGAAAAA CACGATGATA AGCTTGCCAC    1620AACCATGTAC GGCACCGCGG TGGCCGTCTT CCTGGTCATC CTCGTGGCTG CACTGCAGGG    1680CTCGGCTCCC GCCGAGAGCC CCTTCCCCTT CCACATCCCC CTGGACCCCG AGGGGACCCT    1740GGAGCTGTCC TGGAACATCA GCTATGCGCA GGAGACCATC TACTTCCAGC TCCTGGTGCG    1800GGAGCTCAAG GCTGGTGTCC TGTTTGGGAT GTCGGACCGA GGGGAGCTGG AGAATGCTGA    1860CTTGGTGGTG CTCTGGACTG ACAGGGACGG CGCCTACTTT GGGGATGCCT GGAGTGACCA    1920GAAGGGGCAG GTCCACCTGG ACTCCCAGCA GGATTACCAG CTTCTGCGGG CACAGAGGAC    1980TCCAGAAGGC CTGTACCTGC TCTTCAAGAG GCCTTTTGGC ACCTGTGACC CCAACGACTA    2040CCTCATCGAG GACGGCACCG TCCACCTGGT GTATGGATTC CTGGAGGAGC CGCTCCGGTC    2100GCTGGAGTCC ATCAACACAT CCGGCTTGCA CACGGGGCTG CAGAGGGTGC AGCTGCTGAA    2160GCCCAGCATC CCCAAGCCGG CCCTGCCCGC GGACACGCGC ACCATGGAGA TCCGCGCCCC    2220CGACGTCCTC ATCCCCGGCC AGCAGACCAC GTACTGGTGC TACGTGACCG AGCTCCCGGA    2880CGGCTTCCCC CGGCACCACA TCGTCATGTA CGAGCCCATC GTCACCGAGG GCAACGAGGC    2340GCTGGTGCAC CACATGGAGG TCTTCCAGTG CGCCGCCGAG TTCGAGACCA TCCCCCACTT    2400CAGCGGGCCC TGCGACTCCA AGATGAAGCC GCAGCGGCTC AACTTCTGCC GTCACGTGCT    2460GGCCGCCTGG GCCCTGGGCG CCAAGGCCTT TTACTACCCA GAGGAAGCAG GCCTGGCCTT    2520CGGGGGGCCC GGCTCCTCCA GATTTCTCCG CCTGGAAGTT CACTACCACA ACCCACTGGT    2580GATAACAGGC CGGCGCGACT CCTCGGGCAT CCGCCTGTAC TACACGGCTG CGCTGCGGCG    2640CTTCGACGCG GGCATCATGG AGCTGGGCCT GGCGTACACG CCCGTGATGG CCATCCCCCC    2700GCAGGAGACG GCCTTCGTCC TCACCGGCTA CTGCACGGAC AAGTGCACCC AGCTGGCCCT    2760GCCCGCCTCA GGGATTCACA TCTTCGCCTG TCAGCTCCAC ACGCACCTGA CCGGCCGGAA    2820GGTGGTCACA GTGCTGGCCA GGGACGGCCG GGAGACAGAG ATCGTGAACA GGGACAACCA    2880CTACAGCCCA CACTTCCAGG AGATCCGCAT GTTGAAGAAG GTCGTGTCTG TCCAGCCGGG    2940AGACGTGCTC ATCACCTCTT GCACATACAA CACGGAAGAC AGGAGGCTGG CCACCGTGGG    3000GGGCTTCGGG ATCCTGGAGG AGATGTGCGT CAACTATGTG CACTACTACC CCCAGACGCA    3060GCTGGAGCTC TGCAAGAGCG CCGTGGACCC TGGCTTCCTG CACAAGTACT TCCGCCTCGT    3120GAACAGGTTC AACAGCGAGG AAGTCTGCAC CTGCCCCCAG GCGTCTGTCC CTGAGCAGTT    3180TGCCTCCGTG CCCTGGAACT CCTTCAACCG CGAGGTGCTC AAGGCCCTGT ACGGCTTCGC    3240ACCCATCTCC ATGCACTGCA ACAGGTCCTC GGCCGTCCGC TTCCAGGGGG AGTGGAATCG    3300GCAGCCCCTG CCTGAGATCG TGTCCAGGTT GGAAGAGCCC ACCCCTCACT GCCCAGCCAG    3360CCAGGCTCAG AGCCCCGCCG GCCCCACCGT GCTGAACATC AGTGGGGGCA AAGGCTGAAC    3420GTGGGCGGCC GC                                                        3432(2)SEQ ID NO：20的资料：(i)序列特征：(A)长度：30bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：无(iv)反义：无(vii)直接来源：

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(vii)直接来源：(B)克隆：oIRES-rTHD-072(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：CTTGCCACAA CCATGGTCCC CTGGTTCCCA                            30(2)SEQ ID NO：23的资料：(i)序列特征：(A)长度：4499bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：无(iv)反义：无(vii)直接来源：(B)克隆：pomc-th-doh融合基因(ix)特征：(A)名称/关键：5’UTR(B)位置：1..43(ix)特征：(A)名称/关键：外显子(B)位置：44..89(ix)特征：(A)名称/关键：内含子(B)位置：90..168(ix)特征：

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(B)克隆：ProAKS(ix)特征：(A)名称/关键：5’UTR(B)位置：1..16(ix)特征：(A)名称/关键：外显子(B)位置：17..820(ix)特征：(A)名称/关键：3’UTR(B)位置：821..829(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：CCCAAGCTTC GCCACCATGG CGCGGTTCCT GACACTTTGC ACTTGGCTGC TGTTGCTCGG    60CCCCGGGCTC CTGGCGACCG TGCGGGCCGA ATGCAGCCAG GATTGCGCGA CGTGCAGCTA   120CCGCCTAGTG CGCCCGGCCG ACATCAACTT CCTGGCTTGC GTAATGGAAT GTGAAGGTAA   180ACTGCCTTCT CTGAAAATTT GGGAAACCTG CAAGGAGCTC CTGCAGCTGT CCAAACCAGA   240GCTTCCTCAA GATGGCACCA GCACCCTCAG AGAAAATAGC AAACCGGAAG AAAGCCATTT   300GCTAGCCAAA ACGTATGGGG GCTTCATGAA AAGGTATGGA GGCTTCATGA AGAAAATGGA   360TGAGCTTTAT CCCATGGAGC CAGAAGAAGA GGCCAATGGA AGTGAGATCC TCGCCAAGCG   420GTATGGGGGC TTCATGAAGA AGGATGCAGA GGAGGACGAC TCGCTGGGCA ATTCCTCAGA   480CCTGCTAAAA GAGCTTCTGG AAACAGGGGA CAACCGAGAG CGTAGCCACC ACCAGGATGG   540CAGTGATAAT GAGGAAGAAG TGAGCAAGAG ATATGGGGGC TTCATGAGAG GCTTAAAGAG   600AAGCCCCCAA CTGGAAGATG AAGCCAAAGA GCTGCAGAAG CGATATGGGG GCTTCATGAG   660AAGAGTAGGT CGCCCAGAGT GGTGGATGGA CTACCAGAAA CGGTATGGAG GTTTCCTGAA   720CGCGTTTGCC GAGGCTCTGC CCTCCGACGA AGAAGGCGAA AGTTACTCCA AAGAAGTTCC   780TGAAATGGAA AAAAGATACG GAGGATTTAT GAGATTTTAA GGATCCGGG               829

(2)SEQ ID NO：30的资料：(i)序列特征：(A)长度：598bp(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：无(iv)反义：无(vii)直接来源：(B)克隆：IRES序列(ix)特征：(A)名称/关键：内含子(B)位置：1..598(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GAATTCCGCC CCTCTCCCTC CCCCCCCCCT AACGTTACTG GCCGAAGCCG CTTGGAATAA    60GGCCGGTGTG CGTTTGTCTA TATGTTATTT TCCACCATAT TGCCGTCTTT TGGCAATGTG   120AGGGCCCGGA AACCTGGCCC TGTCTTCTTG ACGAGCATTC CTAGGGGTCT TTCCCCTCTC   180GCCAAAGGAA TGCAAGGTCT GTTGAATGTC GTGAAGGAAG CAGTTCCTCT GGAAGCTTCT   240TGAAGACAAA CAACGTCTGT AGCGACCCTT TGCAGGCAGC GGAACCCCCC ACCTGGCGAC   300AGGTGCCTCT GCGGCCAAAA GCCACGTGTA TAAGATACAC CTGCAAAGGC GGCACAACCC   360CAGTGCCACG TTGTGAGTTG GATAGTTGTG GAAAGAGTCA AATGGCTCTC CTCAAGCGTA   420TCAACAAGGG GCTGAAGAAG TGCCCAGAAG GTACCCCATT GTATGGGATC TGATCTGGGG   480CCTCGGTGCA CATGCTTTAC ATGTGTTTAG TCGAGGTTAA AAAACGTCTA GGCCCCCCCA   540ACCACGGGGA CGTGGTTTTC CTTTGAAAAA CACGATGATA AGCTTGCCAC AACCATGG     598

lNDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)

INDICATIONS RELATTNG To A DEPOSITED MICROORCANlSM（PCT Rule 13bis)

INDICATTONS RELATTNG T0 A DEPOSITED MICR00RGANlSM（PCT RuIe 13bis)