[0001] 本发明涉及从含有胶原蛋白的材料中提取高质量明胶的酶法。

[0002] 序列表的引用

[0003] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。

[0004] 明胶是通过溶解胶原蛋白得到的肽和蛋白的混合物。胶原蛋白主要是通过碱性或酸性预处理从各种动物副产品(例如骨骼和皮肤)中提取的。

[0005] 已描述了从胶原蛋白中提取明胶的酶方法。这些酶通常用于改善或替代明胶工艺中预处理步骤，例如浸灰，或在较低温度下的热水提取过程中提高明胶产量。

[0006] CN 102051130比较了酸性蛋白酶、胃蛋白酶、以及几种中性蛋白酶用于从脱脂脱矿物质的骨中提取明胶的用途。CN 102329843披露了来自黑曲霉(A.niger)的酸性蛋白酶
用于从骨胶原蛋白中提取明胶的用途。

[0007] 在所披露的酶提取方法中，高质量明胶产量相对较低，这影响了所获得明胶的平均勃鲁姆(bloom)。因此，仍希望提供改善的酶促提取明胶方法，其中以高产量获得高质量
明胶。

[0008] 本发明涉及提取明胶的方法，该方法包括(a)在有效量的蛋白酶存在下孵育含有胶原蛋白的材料，以及(b)准备从该含有胶原蛋白的材料中提取明胶，其中该蛋白酶是属于
家族M35的金属蛋白酶。

[0009] 在优选实施例中，其中该蛋白酶选自由以下组成的组：

[0010] (i)多肽，该多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177具有至少85％，优选地至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，
并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序
列，或由其组成；

[0011] (ii)多肽，该多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸1‑177中一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。

[0012] 出人意料地发现，使含有胶原蛋白的材料与如本文披露的酸性蛋白酶一起孵育，获得的高质量明胶的产量、获得的总明胶的总产量和/或平均勃鲁姆强度高于使用本领域
已知的酶方法获得的明胶，这种方式也可确保总明胶产物的高平均勃鲁姆强度。

[0013] 在优选实施例中，该方法包括以下步骤：提供含有胶原蛋白的材料，使该含有胶原蛋白的材料脱矿物质以产生骨胶原，并使所述蛋白酶与该骨胶原接触。

[0014] 在优选实施例中，该蛋白酶衍生自嗜热子囊菌属(Thermoascus)，优选地衍生自橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)，最优选地衍生自橙色嗜热子囊菌CGMCC编号
0670。

[0015] 在优选实施例中，该方法包括孵育后提高温度使蛋白酶失活的步骤，优选地，加热及温度保持的总时间为至少10分钟，在失活步骤后提取并收集一定量的明胶。

[0016] 在优选实施例中，该方法包括孵育后提高温度，以通过保持该温度持续优选地至少5分钟来使该蛋白酶失活的步骤，然后提取并收集一定量的明胶。

[0017] 在优选实施例中，该方法包括多阶段提取的步骤，优选地，包括在逐步加热过程中提取明胶的步骤，优选地，提取的温度是在50℃和100℃之间进行。

[0018] 在优选实施例中，其中将酸添加到含有胶原蛋白的材料中以脱矿物质。

[0019] 在优选实施例中，其中在孵育前将骨胶原研磨成可以通过10目筛，优选地可以通过20目筛的颗粒。

[0020] 在优选实施例中，其中孵育在温度20℃至40℃之间、和/或在pH 4至6之间进行。

[0021] 本发明也涉及可通过上述方法获得的明胶。

[0022] 本发明涉及制备明胶的方法，该方法包括(a)在有效量的蛋白酶存在下孵育含有胶原蛋白的材料，以及(b)从该含有胶原蛋白的材料中提取明胶，其中该蛋白酶是属于家族
M35的金属蛋白酶。

[0023] 术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一个)。EC编号是指来自NC‑IUBMB,Academic Press[学术出版社],
圣地亚哥,加利福尼亚的Enzyme Nomenclature 1992[酶命名法1992]，包括分别在
Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1994,223,1‑5；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]
1995,232,1‑6；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1996,237,1‑5；Eur.J.Biochem.[欧洲
生物化学杂志]1997,250,1‑6；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]1999,264,610‑
650中公开的增刊1‑5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://
www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。蛋白酶也称为，例如肽酶、蛋白酶、肽水
解酶、或蛋白水解酶。

[0024] 根据本发明使用的蛋白酶属于内部作用于多肽链的内切型(肽链内切酶)。对于根据本发明使用的蛋白酶的起源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括自然或野生型的蛋白
酶，还包括它们的展示出蛋白酶活性的任一突变体、变体、片段等等，以及合成的蛋白酶，例
如改组蛋白酶以及共有蛋白酶。可以例如通过定点诱变、PCR(在PCR反应中使用含有所希望
突变的PCR片段作为引物之一)、或随机诱变来制备此类经基因工程改造的蛋白酶，其是本
领域通常已知的。共有蛋白质的制备描述于例如EP 897985中。用于本上下文中的蛋白酶变
体的实例是其中一个或多个氨基酸已经缺失、插入或被其他氨基酸取代的蛋白酶。

[0025] 蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook of 
Proteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编
辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。

[0026] 在一些优选的实施例中，在上述手册的第1492‑1495页定义了属于家族M35的金属蛋白酶。

[0027] 在一些优选的实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由水分子(被二价金属阳离子活化的水分子)介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基
酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在具体实施
例中，数目是二或三，优选是三。

[0028] 为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述手册以及其中指示的原则。可对所有种类的蛋白酶进行上述确定，无论其为天然存在的或野生型蛋白酶，或者经基因
工程改造的或合成的蛋白酶。

[0029] 本发明涉及制备明胶的方法，该方法包括(a)将含有胶原蛋白的材料和蛋白酶一起孵育，以及(b)从该含有胶原蛋白的材料中提取明胶，其中该蛋白酶是属于家族M35的金
属蛋白酶。

[0030] 在一些优选实施例中，其中该蛋白酶选自由以下组成的组：

[0031] (i)多肽，该多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177具有至少85％，优选地至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，
并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序
列，或由其组成；

[0032] (ii)多肽，该多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸1‑177中一个或多个(例如，几个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。

[0033] 两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

[0034] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,
Trends Genet.[遗传学趋势]16:276‑277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程
序中所实施的尼德尔曼‑翁施(Needleman‑Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,
J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443‑453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所
使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取
代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比
并且如下计算：

[0035] (相同的残基x 100)/(比对长度‑比对中的空位总数)

[0036] 当两个序列在重叠的相同位置上具有相同的氨基酸残基时，发生完全匹配。序列的长度是所述序列中氨基酸残基的数目(例如，本文中的SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177的长
度是177)。

[0037] 术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替
代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸
之后添加氨基酸。在描述变体时，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字
母或三字母氨基酸缩写。

[0038] 在优选实施例中，同源多肽具有相差四十、三十五、三十、二十五、二十或十五个氨基酸的氨基酸序列。在另一个实施例中，同源多肽具有相差十、九、八、七、六或五个氨基酸
的氨基酸序列。在另一个特定实施例中，同源多肽与本文中的SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177
相差四个、三个、两个氨基酸或一个氨基酸。

[0039] 等位基因变体表示占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可
以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位
基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

[0040] 所述变体多肽的氨基酸序列与本文中的SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177的差别可能在于一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残
基取代。优选地，氨基酸改变的性质较小，即不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨
基酸取代；典型地为1个至约30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基
末端的甲硫氨酸残基；多至约20‑25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，例
如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。

[0041] 保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸
和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨
酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由
H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社]，纽
约描述的。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、
Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/
Glu和Asp/Gly，以及反向的这些。

[0042] 在一个实施例中，根据本发明使用的蛋白酶是真菌蛋白酶，该术语真菌是指该蛋白酶衍生自或源自真菌，或是衍生自真菌的类似物、片段、变体、突变体或合成的蛋白酶。该
蛋白酶可在原始野生型真菌菌株、另一种微生物菌株或植物中产生或表达；即，该术语涵盖
野生型、天然存在的蛋白酶的表达，以及重组、经基因工程改造的或合成蛋白酶在任何宿主
中的表达。

[0043] 在一个实施例中，根据本发明使用的蛋白酶可能衍生自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“衍生自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是
由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来
源的多肽被分泌到细胞外。

[0044] 在一个实施例中，该蛋白酶衍生自酵母菌，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属
(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或更优选地衍生自真菌，例如枝
顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球菌属
(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属
(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新
美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属
(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属
(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属
(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)。在另一个实施例中，该蛋白酶衍生自棘孢曲霉
(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus 
foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲
霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰刀菌(Fusarium 
bactridioides)、谷类镰刀菌(Fusarium  cerealis)、克地镰刀菌(Fusarium 
crookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium  culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium 
graminearum)、禾赤镰刀菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、
合欢木镰刀菌(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰刀菌
(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium 
sambucinum)、肤色镰刀菌(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium 
sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、圆镰刀菌(Fusarium 
torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰刀菌(Fusarium 
venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米
黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌
(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、橙色嗜热子囊菌
(Thermoascus aurantiacus)、哈茨木霉(Trichoderma  harzianum)、康宁木霉
(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉
(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。

[0045] 在优选实施例中，该蛋白酶衍生自嗜热子囊菌属的真菌，例如物种橙色嗜热子囊菌，例如菌株橙色嗜热子囊菌CGMCC编号0670。

[0046] 在优选实施例中，衍生自橙色嗜热子囊菌的蛋白酶包含本文中的SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177，或由其组成。

[0047] 在优选实施例中，本发明的蛋白酶是SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177的蛋白酶的变体。该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至177不相同，因为与SEQ ID NO:1的氨基酸1至177相
比，该变体包含至少一个修饰。

[0048] 在优选实施例中，本文中的SEQ ID NO:1的氨基酸1至177的蛋白酶变体(其由以下修饰组成：A27K/D79L/Y82F/S87G/D104P/A112P/A126V/D142L)是本发明的第二蛋白酶的另
一个实例。位置编号是指SEQ ID NO:1的氨基酸1至177的位置编号。

[0049] 应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的物
种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

[0050] 这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，这些培养物保藏中心如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche 
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心
(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏
中心北方地区研究中心(NRRL)。

[0051] 在本发明的方法中，可以纯化所述蛋白酶。如本文使用的术语“纯化的”涵盖基本上不含来自其所衍生的生物体的组分的酶蛋白。术语“纯化的”还涵盖不含来自天然生物体
(酶蛋白从其获得)的组分的酶蛋白，这也被称为“基本上纯的”酶，并且可能对于天然存在
的并未被基因修饰(例如通过缺失、取代或插入一个或多个氨基酸残基)的酶来说是尤其相
关的。

[0052] 因此，蛋白酶可以是纯化的，即仅存在少量的其他蛋白质。表述“其他蛋白”特别涉及其他的酶。如本文使用的术语“纯化的”还指去除其他组分，特别是存在于蛋白酶的来源
细胞中的其他蛋白质并且最特别是其他酶。蛋白酶可为“基本上纯的”，即，基本上不含来自
产生其的生物体(例如，针对重组产生的酶的宿主生物体)的其他组分。优选地，蛋白酶是至
少75％(w/w)纯的，更优选至少80％、85％、90％或者甚至至少95％纯的。在仍更优选的实施
例中，该蛋白酶是至少98％纯的酶蛋白制剂。

[0053] 然而，对于根据本发明的用途，该蛋白酶不必那么纯。它可以例如包括其他酶，甚至其他蛋白酶，这种情况下可将其称为蛋白酶制剂。

[0054] 在一些优选实施例中，本发明的方法包括以下步骤：提供含有胶原蛋白的材料；将含有胶原蛋白的材料脱矿物质以生产骨胶原；以及将所述蛋白酶添加到骨胶原中。

[0055] 典型的含有胶原蛋白的材料包括动物体的皮肤、骨骼、兽皮和结缔组织。动物体的来源包括牛、猪、鱼和羊。用于生产高质量明胶的最优选的胶原蛋白来源是牛骨骼。

[0056] 在一些优选实施例中，首先将骨骼原料粉碎成8mm至50mm大小的颗粒，然后为了脱脂，通过在80℃至95℃下煮沸2‑8小时来将骨骼进行脱脂。可以收集油脂用于作为食用香精
的相关应用，而脱脂的骨骼将经脱矿物质过程用于生产明胶。脱脂骨骼可现场生产或从市
场购买。

[0057] 在一些优选实施例中，其中将酸添加到含有胶原蛋白的材料中用于脱矿物质。通常，将脱脂骨骼进行脱矿物质得到富含胶原蛋白的材料，骨胶原。例如，将脱脂骨骼用0.5％
至6％的盐酸溶液浸泡。初期盐酸浓度通常为4.0％至6.0％。随着浸泡进行，盐酸浓度会降
低。当盐酸浓度变得稳定时，收集盐酸。脱矿物质的骨骼(命名为骨胶原且含有>70％的胶原
蛋白肽含量)是用于明胶提取的主要底物。

[0058] 在一些优选实施例中，其中在孵育前将骨胶原研磨成可以通过10目筛，优选地可以通过20目筛的颗粒。

[0059] 在一些优选实施例中，其中含有胶原蛋白的材料与蛋白酶的孵育在温度20℃至40℃之间、和/或在pH 4至6之间进行。

[0060] 在一些优选实施例中，该方法包括孵育后提高温度使蛋白酶失活的步骤，在失活步骤后提取并收集一定量的明胶。

[0061] 在一些优选实施例中，孵育后提高温度以通过保持该温度持续优选地至少5分钟来使蛋白酶失活，例如，提高温度至约95℃并保持约5‑15分钟以使蛋白酶失活。

[0062] 在一些优选实施例中，加热及温度保持的总时间为至少10分钟，优选地约10‑20分钟，例如约15分钟，并且优选地不超过30分钟。

[0063] 在温度升高期间内，也会释放一定量的明胶，在一些优选的实施例中，在失活步骤后提取并收集一定量的明胶。例如，通过以10000rpm离心15分钟来分离液相和固相，并收集
沉淀物中的骨胶原和进行下一提取过程，收集上清液，以10000rpm再次离心15分钟并且经
由100目纱布过滤。保留滤液并进行随后的浓缩(如果需要)和测定过程。

[0064] 在一些优选实施例中，该方法包括多阶段提取的步骤，优选地，包括在逐步加热过程中提取明胶的步骤，优选地，提取过程的温度在50℃和100℃之间进行。

[0065] 在一些优选实施例中，可以用热水经由多阶段提取来获得明胶。例如，可以将热水温度设置为数个间隔：(1)50℃至55℃；(2)60℃至65℃；(3)70℃至75℃；(4)80℃至85℃；
(5)90℃至100℃。根据不同的温度，明胶的质量和产量彼此之间可能会有所不同。方法通常
如下：

[0066] (1)将来自失活过程的骨胶原放入50℃至55℃的水中，水的重量是脱脂骨骼重量的0.8至1.2倍。保持该温度4‑8小时。通过以10000rpm离心15分钟来分离液相和固相。收集
沉淀物中骨胶原并进行下一提取过程。收集上清液，以10000rpm再次离心15分钟并经由100
目纱布过滤。保留滤液并进行随后的浓缩(如果需要)和测定过程。

[0067] (2)将来自步骤(1)的骨胶原放入60℃至65℃的水中，水的重量是脱脂骨骼重量的0.6至1.0倍。保持该温度4‑8小时。通过以10000rpm离心15分钟来分离液相和固相。收集沉
淀物中骨胶原并进行下一提取过程。收集上清液，以10000rpm再次离心15分钟并经由100目
纱布过滤。保留滤液并进行随后的浓缩(如果需要)和测定过程。

[0068] (3)将来自步骤(2)的骨胶原放入70℃至75℃的水中，水的重量是脱脂骨骼重量的0.5至0.8倍。保持该温度3‑6小时。通过以10000rpm离心15分钟来分离液相和固相。收集沉
淀物中骨胶原并进行下一提取过程。收集上清液，以10000rpm再次离心15分钟并经由100目
纱布过滤。保留滤液并进行随后的浓缩(如果需要)和测定过程。

[0069] (4)将来自步骤(3)的骨胶原放入80℃至85℃的水中，水的重量是脱脂骨骼重量的0.5至0.8倍。保持该温度2‑6小时。通过以10000rpm离心15分钟来分离液相和固相。收集沉
淀物中骨胶原并进行下一提取过程。收集上清液，以10000rpm再次离心15分钟并经由100目
纱布过滤。保留滤液并进行随后的浓缩(如果需要)和测定过程。

[0070] (5)将来自步骤(4)的骨胶原放入90℃至100℃的水中，水的重量是脱脂骨骼重量的0.8至1.2倍。保持该温度2‑6小时。通过以10000rpm离心15分钟来分离液相和固相。弃掉
沉淀物。收集上清液，以10000rpm再次离心15分钟并经由100目纱布过滤。保留滤液并进行
随后的浓缩(如果需要)和测定过程。

[0071] 可以改变酶提取明胶的纯化以达到所希望的微量成分水平。可以将过滤与去离子化、氧化或澄清过程结合。该明胶可以通过絮凝进一步澄清，絮凝可以去除非明胶蛋白质和
脂质。纯化后，可以将连续的酶产生的明胶提取物在浓缩前以液体形式混合。浓缩是通过蒸
发过程实现的。浓缩的明胶可以以液态形式使用、可以被冷冻或干燥。

[0072] 在另一方面，本披露还涉及可通过如本文披露的方法获得的明胶。

[0073] 明胶是肽和蛋白质的混合物，提取自胶原蛋白，并且也可以表示为胶原蛋白肽的胶原水解物。

[0074] 胶原蛋白底物是由三条α链组成的螺旋结构，每条α链都具有规则的Gly‑Xaa‑Yaa(Xaa通常是Pro，Yaa通常是Hyp或Hyl)序列重复。在胶原蛋白分子N/C前肽的三螺旋区域和
无螺旋区域，存在一些主要由Lys和少量His形成的交联。这些交互与氢键一起有助于稳定
三螺旋结构。

[0075] 发现如本文披露的蛋白酶可以对赖氨酸位置表现出一定的特异性，从而可以有效地破坏链中赖氨酸的交联。同时，如本文披露的蛋白酶还对由除赖氨酸以外的其他氨基酸
组成的肽键具有一定的攻击性。从底物结构考虑，N/C前肽的非螺旋区域内的肽键与三螺旋
区域的肽键相比，通常具有更好的酶可及性，因为结构更松散。因此，如本文披露的蛋白酶
可以水解N‑前肽和C‑前肽，从而在降解三螺旋链之前帮助完全解开三螺旋结构。通常，蛋白
酶对由赖氨酸组成的肽键的特异性可以提供高明胶质量，而对N/C前肽的某些作用可以有
助于得到高产量。因此，在如本文披露的使包含胶原蛋白的材料与蛋白酶一起孵育的步骤
期间，高质量明胶的产量高于用本领域已知的酶方法获得的明胶。

[0076] 通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

[0077] 材料与方法

[0078] 蛋白酶A，是属于家族M35的金属蛋白酶，衍生自橙色嗜热子囊菌并披露为本文所列的SEQ ID NO:1的氨基酸1‑177；

[0079] AP 5110，酸性蛋白酶，可从Doinghiger公司商购

[0080] 胃蛋白酶，可从西格玛公司(Sigma)商购

[0081] 蛋白酶B，曲霉胃蛋白酶(Aspergillopepsin)II，在WO 2014/044626披露为SEQ ID NO:1

[0082] 蛋白酶测定：酶蛋白(EP)含量的测定：

[0083] 通过Pierce BCA蛋白分析试剂盒(可从赛默科技公司(Thermo Scientific)商购)来测定酶蛋白含量。如下列出了本文所用的三种蛋白酶的蛋白含量：

[0084] 酶 EP含量％(w/w)蛋白酶A 2.7％
AP5110 7.2％
胃蛋白酶 27.0％
蛋白酶B 2.3％

[0085] 实例1由蛋白酶A、蛋白酶B、AP5110和胃蛋白酶产生的明胶

[0086] 将脱脂牛骨用4％至6％(w/w)的盐酸浸泡以去除矿物质，随着继续进行浸泡，盐酸浓度逐渐下降。当盐酸浓度趋于稳定时停止浸泡。弃掉盐酸溶液并得到脱矿物质骨骼，即骨
胶原。然后将骨胶原自然干燥以达到约10％的水分。然后将干燥的骨胶原磨成可以通过20
目筛的颗粒。

[0087] 干燥的骨胶原颗粒在孵育之前用水浸泡(水:脱脂骨＝3:4，w/w)过夜，并且将pH调整至5.0左右。将0.1％蛋白酶A(基于干燥骨胶原的w/w，等于27μg EP/g干燥骨胶原)或
0.1％酸性蛋白酶AP5110(基于干燥骨胶原的w/w，等于72μg EP/g干燥骨胶原)或0.1％胃蛋
白酶(基于干燥骨胶原的w/w，等于270μg EP/g干燥骨胶原)或0.117％蛋白酶B(基于干燥骨
胶原的w/w，等于27μg EP/g干燥骨胶原)添加到骨胶原和水的混合物中。

[0088] 将混合物与蛋白酶在约28℃的水浴中孵育约2小时。通过过滤分离固相并用水洗涤3次，洗掉大部分蛋白酶。将新水添加到经洗涤的固相中，其中脱脂骨:水的量＝3:5(w/
w)，将混合物的pH调至约6.0，然后通过在约7分钟内将混合物加热约95℃并保持约8分钟使
酶失活，加热及温度保持的总时间为约15分钟。收集沉淀物中骨胶原颗粒并进行下一提取
过程。保留上清液A用于收集明胶。

[0089] 如下表3所示，在逐步加热过程中提取骨胶原。每次提取过程后，重复上述分离过程，并分别收集上清液。

[0090] 表3.提取阶段的条件

[0091]

[0092] 测量上清液A至F的重量。使用折射计测量上清液的折射，其中折射可以反映上清液的固体含量。可以通过将重量与固体含量相乘来计算总干物质，从而分别计算出各阶段
的明胶产量，参见表4。

[0093] 以10000rpm将上清液A至F离心15分钟，弃掉沉淀物。然后将新的上清液分别经由100目纱布过滤。保留过滤明胶溶液，测定并记录白利度值。根据白利度值计算干物质含量，
然后计算明胶产量。

[0094] 然后，分别将明胶溶液的白利度值调整至2％。然后根据中国国家标准GB6783‑2013中的勃鲁姆法，用质地分析仪(TA Plus，可从稳定微系统公司(Stable Micro Systems 
Ltd)商购)分别测量凝胶溶液的勃鲁姆强度值。还测量了可从罗赛洛公司(Rousselot)商购
并具有240g勃鲁姆值的商业明胶作为参考来计算酶促明胶样品的勃鲁姆。分别计算每一过
程的明胶勃鲁姆，参见表5。

[0095] 下表4和表5示出了通过酶促提取方法获得的明胶的产量和勃鲁姆强度。根据这些结果，该蛋白酶A在非常低的酶蛋白用量下表现出了高效率。并且在这四种蛋白酶中，蛋白
酶A产生了最高产量的高质量明胶(高质量明胶意指明胶的强度在200勃鲁姆以上),尤其是
在温度较低的提取阶段初期，蛋白酶A也实现了获得的总明胶的最高总产量和最高平均勃
鲁姆强度。

[0096] 表4：各阶段的明胶产量

[0097]

[0098] 表5：各阶段的明胶勃鲁姆

[0099]