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首页 / 专利分类库 / 天然或化学的线或纤维；纺纱或纺丝 / 制作人造长丝，线，纤维，鬃或带子的化学特征； 专用于生产碳纤维的设备 / 单组分合成聚合物人造长丝及类似物； 其制造 / .均缩聚产物 / ..用聚氨基酸或多肽 / 重组蛋白的纯化方法

重组蛋白的纯化方法
申请号 CN201780061276.2 申请日 2017-10-03 公开(公告)号 CN109843905A 公开(公告)日 2019-06-04
申请人 丝芭博株式会社; 发明人 本间俊将;
摘要 本 发明 公开了一种重组蛋白的纯化方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中纯化所述重组蛋白的方法，其特征在于，在添加或未添加无机盐的第一非质子性极性 溶剂 中在来源于宿主细胞的 蛋白质 溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下对所述重组细胞进行处理，除去第一可溶性级分后，将所得到的第一不溶性级分在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在所述重组蛋白溶解的条件下进行处理。
权利要求

1.一种重组蛋白的纯化方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中纯化所述重组蛋白的方法，其特征在于，
在添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂中在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下对所述重组细胞进行处理，除去第一可溶性级分后，将所得到的第一不溶性级分在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在所述重组蛋白溶解的条件下进行处理。
2.如权利要求1所述的重组蛋白的纯化方法，其中，进一步包括如下步骤：在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在所述重组蛋白溶解的条件下进行处理之后除去第二不溶性级分，得到包含重组蛋白的第二可溶性级分。
3.如权利要求2所述的重组蛋白的纯化方法，其中，进一步包括如下步骤：使用所述重组蛋白的不良溶剂对除去第二不溶性级分后得到的第二可溶性级分进行处理，使所述重组蛋白凝集，以凝集体的形式得到纯化后的重组蛋白。
4.一种重组蛋白的纯化方法，其包括以下(A)～(D)的步骤：
(A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
(B)除去第一可溶性级分，回收包含所述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
(C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在所述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
(D)除去第二不溶性级分，得到包含所述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤。
5.如权利要求4所述的重组蛋白的纯化方法，其中，进一步包括：
(E)使用所述重组蛋白的不良溶剂对第二可溶性级分进行处理，使所述重组蛋白凝集，以凝集体的形式回收纯化后的重组蛋白的步骤。
6.如权利要求1～5中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述条件为温度条件。
7.如权利要求1～6中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其中，所述第一非质子性极性溶剂或第二非质子性极性溶剂的偶极矩为3.0D以上。
8.如权利要求1～7中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其中，所述无机盐选自由碱金属卤化物、碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐和硫氰酸盐组成的组。
9.如权利要求1～8中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其中，所述重组蛋白为结构蛋白质。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其中，所述结构蛋白质来源于选自由胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝和蛛丝组成的组中的蛋白质。
11.一种人造多肽纤维的制造方法，其包括以下(A)～(D)和(F)的步骤：
(A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
(B)除去第一可溶性级分，回收包含所述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
(C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在所述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
(D)除去第二不溶性级分，得到包含所述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤；
(F)将第二可溶性级分以丝状液体的形式施加至凝固液中，使所述重组蛋白凝固成丝状并回收，由此得到未拉伸丝的步骤。
12.一种多肽膜的制造方法，其包括以下(A)～(D)和(G)的步骤：
(A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
(B)除去第一可溶性级分，回收包含所述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
(C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在所述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
(D)除去第二不溶性级分，得到包含所述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤；
(G)使用第二可溶性级分在对第二非质子性极性溶剂具有耐性的平板上形成规定厚度的涂膜，从所述涂膜中除去第二非质子性极性溶剂，由此得到多肽膜的步骤。
说明书全文

重组蛋白的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及从表达重组蛋白的重组细胞中纯化该重组蛋白的方法。

背景技术

[0002] 利用基因重组宿主细胞能够以工业规模生产目标蛋白质。也报道了很多对利用重组细胞生产的重组蛋白进行单离、纯化的方法。
[0003] 作为单离不溶性的目标蛋白质的方法，报道了从重组细胞的悬浮液中利用氢氧化钠等金属氢氧化物的方法(专利文献1)、以及利用甲酸、丙酸等有机酸的方法(专利文献2)等。但是，在利用这些方法单离不溶性的目标蛋白质的情况下，难以除去与目标蛋白质一同存在的杂质，因此存在单离出的目标蛋白质的纯度不高的问题。另外，在使用有机酸的方法的情况下，对酸不具有耐性的蛋白质容易被分解，因此存在能够单离的蛋白质有限的问题。
[0004] 作为能够除去与目标蛋白质一同存在的杂质、不使用有机酸的方法，报道了下述方法等：溶解于二甲亚砜等非质子性极性溶剂中，使用水等溶剂将杂质除去，对目标蛋白质进行纯化(专利文献3)。利用该方法，能够将目标蛋白质纯化至约70％，但存在目标蛋白质限定于亲水指数(HI)为0以下的亲水性重组蛋白的问题。另外，根据蛋白质的不同，还有可能由于为了除去杂质而添加的水等水系溶剂的影响而发生凝胶化。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1：日本特表2013-523665号公报
[0008] 专利文献2：日本特表2004-503204号公报
[0009] 专利文献3：国际公开第2014/103847号

发明内容

[0010] 发明所要解决的问题
[0011] 在工业规模的生产中，依然期望简便地高纯度地对目标重组蛋白进行纯化的方法。因此，本发明的目的在于提供从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中简便地高纯度地纯化该重组蛋白的方法。
[0012] 用于解决问题的方法
[0013] 本发明人进行了深入研究，结果发现，通过使用非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但目标重组蛋白不溶解的条件下对重组细胞进行处理，在使目标重组蛋白溶解之前将来源于宿主细胞的蛋白质除去，由此能够在不添加水等水系溶剂的情况下简便地高纯度地纯化目标重组蛋白，从而完成了本发明。
[0014] 即，本发明涉及例如以下的各发明。
[0015] [1]一种重组蛋白的纯化方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中纯化上述重组蛋白的方法，其特征在于，
[0016] 在添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂中在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下对上述重组细胞进行处理，除去第一可溶性级分后，将所得到的第一不溶性级分在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在上述重组蛋白溶解的条件下进行处理。
[0017] [2]如[1]所述的重组蛋白的纯化方法，其中，进一步包括如下步骤：在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在上述重组蛋白溶解的条件下进行处理之后除去第二不溶性级分，得到包含重组蛋白的第二可溶性级分。
[0018] [3]如[2]所述的重组蛋白的纯化方法，其中，进一步包括如下步骤：使用上述重组蛋白的不良溶剂对除去第二不溶性级分后得到的第二可溶性级分进行处理，使上述重组蛋白凝集，以凝集体的形式得到纯化后的重组蛋白。
[0019] [4]一种重组蛋白的纯化方法，其包括以下(A)～(D)的步骤：
[0020] (A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
[0021] (B)除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
[0022] (C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
[0023] (D)除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤。
[0024] [5]如[4]所述的重组蛋白的纯化方法，其中，进一步包括：(E)使用上述重组蛋白的不良溶剂对第二可溶性级分进行处理，使上述重组蛋白凝集，以凝集体的形式回收纯化后的重组蛋白的步骤。
[0025] [6]如[1]～[5]中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其特征在于，上述条件为温度条件。
[0026] [7]如[1]～[6]中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其中，上述第一非质子性极性溶剂或第二非质子性极性溶剂的偶极矩为3.0D以上。
[0027] [8]如[1]～[7]中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其中，上述无机盐选自由碱金属卤化物、碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐和硫氰酸盐组成的组。
[0028] [9]如[1]～[8]中任一项所述的重组蛋白的纯化方法，其中，上述重组蛋白为结构蛋白质。
[0029] [10]如[9]所述的纯化方法，其中，上述结构蛋白质来源于选自由胶原蛋白、弹性蛋白、节肢弹性蛋白、蚕丝和蛛丝组成的组中的蛋白质。
[0030] [11]一种人造多肽纤维的制造方法，其包括以下(A)～(D)和(F)的步骤：
[0031] (A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
[0032] (B)除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
[0033] (C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
[0034] (D)除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤；
[0035] (F)将第二可溶性级分以丝状液体的形式施加至凝固液中，使上述重组蛋白凝固成丝状并回收，由此得到未拉伸丝的步骤。
[0036] [12]一种多肽膜的制造方法，其包括以下(A)～(D)和(G)的步骤：
[0037] (A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
[0038] (B)除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
[0039] (C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
[0040] (D)除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤；
[0041] (G)使用第二可溶性级分在对第二非质子性极性溶剂具有耐性的平板上形成规定厚度的涂膜，从上述涂膜中除去第二非质子性极性溶剂，由此得到多肽膜的步骤。
[0042] 发明效果
[0043] 本发明的重组蛋白的纯化方法虽然是不包括复杂的步骤、步骤数也少的简便方法，但所得到的纯化后的重组蛋白的纯度高，在不经过进一步的纯化步骤的情况下也能够直接用于例如纺丝、膜的形成等制造。
[0044] 另外，本发明的重组蛋白的纯化方法无需添加酸的步骤。因此，作为纯化对象的重组蛋白并不限定于对酸具有耐性的蛋白质。
[0045] 此外，本发明的重组蛋白的纯化方法无需将包含重组蛋白的非质子性极性溶剂置换为水等水系溶剂的纯化步骤。因此，作为纯化对象的重组蛋白并不限定于亲水指数为0以下的亲水性重组蛋白。另外，也不存在由于水系溶剂的影响而导致该重组蛋白凝胶化的担忧。另外，由于不向非质子性极性溶剂中添加水等水系溶剂，因此还能够回收该非质子性极性溶剂进行再利用。附图说明
[0046] 图1是示出在实施例1中研究的、涉及来源于宿主细胞的蛋白质的除去的、利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行的分析的结果的照片。
[0047] 图2是示出在实施例2中研究的、涉及来源于宿主细胞的蛋白质的除去的、通过离心分离得到的上清级分的利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0048] 图3是示出在实施例2中研究的、涉及来源于宿主细胞的蛋白质的除去的、通过离心分离得到的沉淀级分的利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0049] 图4是示出在实施例3中研究的、涉及来源于宿主细胞的蛋白质的除去的、通过离心分离得到的上清级分的利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0050] 图5是示出在实施例3中研究的、涉及来源于宿主细胞的蛋白质的除去的、通过离心分离得到的沉淀级分的利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0051] 图6是示出在实施例4中研究的、涉及目标蛋白质的纯化的、利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0052] 图7是示出在实施例5中研究的、涉及目标蛋白质的纯化的、利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0053] 图8是示出在实施例6中研究的、涉及目标蛋白质的纯化的、利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0054] 图9是示出在实施例7中研究的、涉及目标蛋白质的纯化的、利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。
[0055] 图10是在实施例8中研究的、使用纯化蛋白质溶液作为纺丝用的纺丝液而形成丝时的照片。
[0056] 图11是示出在实施例9中研究的、目标蛋白质的凝胶化的状态的照片。
[0057] 图12是示出在实施例9中研究的、涉及利用现有方法与本实施例的方法进行的目标蛋白质的纯化的、利用SDS-PAGE进行分析的结果的照片。

具体实施方式

[0058] 以下，详细对本发明的具体实施方式进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
[0059] 一个实施方式的重组蛋白的纯化方法为从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中纯化上述重组蛋白的方法，其特征在于，在添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂中在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下对上述重组细胞进行处理，除去第一可溶性级分后，在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在上述重组蛋白溶解的条件下对所得到的第一不溶性级分进行处理。优选进一步包括如下步骤：在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在上述重组蛋白溶解的条件下进行处理之后除去第二不溶性级分，得到包含重组蛋白的第二可溶性级分。优选进一步包括如下步骤：使用上述重组蛋白的不良溶剂对除去第二不溶性级分后得到的第二可溶性级分进行处理，使上述重组蛋白凝集，以凝集体的形式得到纯化后的重组蛋白。
[0060] 具体而言，一个实施方式的重组蛋白的纯化方法的特征在于，包括以下(A)～(D)的步骤：
[0061] (A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
[0062] (B)除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
[0063] (C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
[0064] (D)除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤。
[0065] (重组蛋白)
[0066] 作为本实施方式的目标重组蛋白(以下也有时称为“重组蛋白”或“目标蛋白质”)，可以列举适合以工业规模制造的任意的蛋白质，可以列举例如能够用于工业用途的蛋白质、能够用于医疗用途的蛋白质、结构蛋白质等。作为能够用于工业用途或医疗用途的蛋白质的具体例，可以列举酶、调控蛋白质、受体、肽激素、细胞因子、膜蛋白质或转运蛋白质、预防接种中使用的抗原、疫苗、抗原结合蛋白质、免疫刺激蛋白质、变应原、全长抗体或抗体片段或者衍生物。作为结构蛋白质的具体例，可以列举蛛丝、蚕丝、胶原蛋白、弹性蛋白和节肢弹性蛋白、以及来源于这些蛋白质的蛋白质等。
[0067] 作为丝心蛋白样蛋白质的来源于蛛丝或蚕丝的蛋白质可以列举例如包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为
80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示8～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号1(PRT468)～序列号4所表示的氨基酸序列的蛋白质等。PRT468(序列号
1)的亲水指数为-0.59，PRT698(序列号4)的亲水指数为0.43。亲水指数的值为按照国际公开第2014/103846号中记载的方法算出的值。
[0068] 作为来源于胶原蛋白的蛋白质，可以列举例如包含式2：[REP2]o所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式2中，o表示5～300的整数。REP2表示由Gly-X-Y构成的氨基酸序列，X和Y表示Gly以外的任意的氨基酸残基。两个以上存在的REP2彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号5所表示的氨基酸序列的蛋白质(IV型胶原蛋白-Kai)。序列号5所表示的氨基酸序列是在从NCBI数据库获得的人的IV型胶原蛋白的部分序列(NCBI的Genbank的登记号：CAA56335.1、GI：3702452)的相当于重复部分和基序的第301位残基至第540位残基的氨基酸序列的N末端附加序列号8所表示的氨基酸序列(His标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。IV型胶原蛋白-Kai的亲水指数为-0.75。
[0069] 作为来源于节肢弹性蛋白的蛋白质，可以列举例如包含式3：[REP3]p所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式3中，p表示4～300的整数。REP3表示由Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro构成的氨基酸序列。J表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由Asp、Ser和Thr组成的组中的氨基酸残基。U表示任意的氨基酸残基，特别优选为选自由Pro、Ala、Thr和Ser组成的组中的氨基酸残基。两个以上存在的REP3彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)。具体而言，可以列举包含序列号6所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号6所表示的氨基酸序列是在节肢弹性蛋白(NCBI的Genbank的登记号NP_611157.1、Gl：24654243)的氨基酸序列中将第87位残基Thr置换成Ser并且将第95位残基Asn置换成Asp的置换后的序列的第19位残基至第321位残基的氨基酸序列的N末端附加序列号8所表示的氨基酸序列(His标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。节肢弹性蛋白-Kai(序列号6)的亲水指数为-1.22。
[0070] 作为来源于弹性蛋白的蛋白质，可以列举例如具有NCBI的Genbank的登记号AAC98395(人)、I47076(绵羊)、NP786966(牛)等氨基酸序列的蛋白质。具体而言，可以列举包含序列号7所表示的氨基酸序列的蛋白质。序列号7所表示的氨基酸序列是在NCBI的Genbank的登记号AAC98395的氨基酸序列的第121位残基至第390位残基的氨基酸序列的N末端附加序列号8所表示的氨基酸序列(His标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列。人弹性蛋白(elastin Homo sapiens)(序列号7)的亲水指数为0.42。
[0071] (重组细胞)
[0072] 本实施方式的重组细胞是以不溶体的形式在细胞内表达重组蛋白的重组细胞，可以使用利用基因工程方法的一般的方法来获得。
[0073] 重组细胞例如可以通过利用具有编码目标蛋白质的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列的表达载体对宿主(宿主细胞)进行转化而得到。
[0074] 调节序列是对宿主中的重组蛋白的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人工染色体载体等。
[0075] 作为宿主，原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物均可以优选使用。例如，作为原核生物的优选例，可以列举大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、棒杆菌、乳球菌等细菌，更优选可以列举大肠杆菌细胞。
[0076] 作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够整合到宿主的染色体中、且在能够对编码目标蛋白质的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。
[0077] 在使用细菌等原核生物作为宿主的情况下，本发明的表达载体优选为在原核生物细胞中能够自主复制的同时包含启动子、核糖体结合序列、本发明的核酸序列和转录终止序列的载体。也可以包含对启动子进行调控的基因序列。
[0078] 作为启动子，可以使用在宿主细胞中发挥功能、能够对目标蛋白质进行表达诱导的诱导型启动子。诱导型启动子是能够根据存在诱导物质(表达诱导剂)、不存在阻遏物分子、或者温度、渗透压或pH值的上升或降低等物理因素对转录进行调控的启动子。
[0079] 作为细菌等原核生物的宿主，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属属和假单胞菌属等的微生物。
[0080] 作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠杆菌BL21(Novagen公司)、大肠杆菌BL21(DE3)(Life Technologies公司)、大肠杆菌BLR(DE3)(默克密理博公司)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌GI698、大肠杆菌HB101、大肠杆菌JM109、大肠杆菌K5(ATCC 23506)、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)、大肠杆菌No.49、大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌TB1、大肠杆菌Tuner(Novagen公司)、大肠杆菌Tuner(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue等。
[0081] 作为属于短芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如土壤短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、沼泽短芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊氏短芽孢杆菌、热红短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌47(FERM BP-1223)、短短芽孢杆菌47K(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5(FERM BP-1664)、短短芽孢杆菌47-5Q(JCM8975)、桥石短芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)、桥石短芽孢杆菌HPD31-S(FERM BP-6623)、桥石短芽孢杆菌HPD31-OK(FERM BP-4573)、桥石短芽孢杆菌SP3株(Takara公司制)等。
[0082] 作为属于沙雷氏菌属的微生物，可以列举例如液化沙雷氏菌(Serratia liquefacience)ATCC14460、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)、变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)等。
[0083] 作为属于芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。
[0084] 作为属于微杆菌属的微生物，可以列举例如嗜氨微杆菌ATCC15354等。
[0085] 作为属于短杆菌属的微生物，可以列举例如叉开短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020、黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC14067)ATCC13826、ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)ATCC13665、ATCC13869、玫瑰色短杆菌ATCC13825、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、生硫短杆菌ATCC19240、白色短杆菌ATCC15111、蜡状短杆菌ATCC15112等。
[0086] 作为属于棒杆菌属的微生物，可以列举例如产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC6871、ATCC6872、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、醋谷棒杆菌ATCC15806、解烷棒杆菌ATCC21511、帚石南棒杆菌ATCC15991、谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060、百合棒杆菌ATCC15990、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERMBP-1539)、力士棒杆菌ATCC13868等。
[0087] 作为属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物，可以列举例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)和假单胞菌属菌(Pseudomonas sp.)D-0110等。
[0088] 作为向上述宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394)、或Gene,17,107(1982)、Molecular&General Genetics,168,111(1979)中记载的方法等。
[0089] 属于短芽孢杆菌属的微生物的转化可以利用例如Takahashi等的方法(J.Bacteriol.,1983,156:1130-1134)、Takagi等的方法(Agric.Biol.Chem.,1989,53:
3099-3100)、或Okamoto等的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:202-203)来实施。
[0090] 作为导入编码目标蛋白质的核酸的载体(以下简称为“载体”)，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司销售)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM B-400)制备、日本特开昭60-221091]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-
6798)制备、日本特开昭60-221091]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET系统(Novagen公司制)等。
[0091] 在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可以列举pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold等作为优选的载体。
[0092] 作为属于短芽孢杆菌属的微生物的优选载体的具体例，可以列举作为枯草杆菌载体公知的pUB110、或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pHY4831(J.Bacteriol.,1987,1239-1245)、pNU200(鹈高重三、日本农艺化学会志1987,61:669-676)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,30:75-80)、pNU211(J.Biochem.,1992,112:488-491)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pNH301(Appl.Environ.Microbiol.,1992,58:525-531)、pNH326、pNH400(J.Bacteriol.,1995,
177:745-749)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)、pHT110R2L5
(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42:358-363)、或大肠杆菌与属于短芽孢杆菌属的微生物的穿梭载体pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
[0093] 作为以原核生物作为宿主的情况下的启动子，只要在宿主细胞中发挥功能则没有限制。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个Ptrp串联而成的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子这样人为地进行了设计改造的启动子等。优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。上述表达载体中，上述核酸的表达不一定需要转录终止序列，但优选紧挨在结构基因的下游配置转录终止序列。
[0094] 作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母、丝状真菌(霉菌等)和昆虫细胞。
[0095] 作为酵母，可以列举例如属于酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、许旺酵母(Schwanniomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、耶氏酵母属和汉逊酵母属等的酵母。更具体而言，可以列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、多形毕赤酵母(Pichia polymorpha)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等。
[0096] 使用酵母作为宿主细胞的情况下的表达载体通常优选包含复制起点(需要在宿主中扩增的情况)和用于大肠杆菌中的载体的增殖的筛选标志物、用于酵母中的重组蛋白表达的启动子和终止子、以及用于酵母的筛选标志物。
[0097] 在表达载体为非整合载体的情况下，优选进一步包含自主复制序列(ARS)。由此，能够提高表达载体在细胞内的稳定性(Myers、A.M.、et al.(1986)Gene 45:299-310)。
[0098] 作为使用酵母作为宿主的情况下的载体，可以列举例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、YIp、pHS19、pHS15、pA0804、pHIL3Ol、pHIL-S1、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα、pPICZ B等。
[0099] 作为以酵母作为宿主细胞的情况下的启动子的具体例，只要能够在酵母中表达则没有限制。可以列举例如己糖激酶等糖酵解系统的基因的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子、pGAP启动子、pGCW14启动子、AOX1启动子、MOX启动子等。
[0100] 作为向酵母中导入表达载体的方法，只要是将DNA导入酵母中的方法则均可以使用，可以列举例如电穿孔法(Methods Enzymol.,194,182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984))、乙酸锂法(J.Bacteriol.,153,163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)记载的方法等。
[0101] 作为丝状真菌，可以列举例如属于顶孢霉(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、黑粉菌(Ustilago)属、木霉(Trichoderma)属、链孢霉(Neurospora)属、镰孢霉(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、青霉(Penicillium)属、毁丝霉(Myceliophtora)属、灰霉(Botryts)属、稻瘟霉(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、绿僵菌(Metarhizium)属、红曲霉(Monascus)属、根霉(Rhizopus)属和根毛霉属的菌等。
[0102] 作为丝状真菌的具体例，可以列举阿拉巴马顶孢霉(Acremonium alabamense)、解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、清酒曲霉(Aspergillus sake)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、海枣曲霉(Aspergillus phoeicus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reseei)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、孢子丝菌(Sporotrichum)、嗜纤维素侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、篮状菌(Talaromyces)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、梭孢壳霉(Thielavia)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、尖孢镰孢霉(Fusarium oxysporus)、禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)、镶片镰孢霉(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、卡门培尔青霉(Penicillium camemberti)、灰白青霉(Penicillium canescens)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)、嗜热毁丝霉(Myceliophtaora thermophilum)、不明毛霉(Mucor ambiguus)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、易脆毛霉(Mucor fragilis)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)、不等孢毛霉(Mucor inaequisporus)、Mucor oblongiellipticus、总状毛霉(Mucor racemosus)、反屈毛霉(Mucor recurvus)、土星状毛霉(Mocor saturninus)、Mocor subtilissmus、多形欧加铁菌(Ogataea polymorpha)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)等。
[0103] 作为以丝状真菌作为宿主的情况下的启动子的具体例，可以为参与糖酵解系统的基因、参与构成性表达的基因、参与水解的酶基因等的任意一种，具体而言，可以列举amyB、glaA、agdA、glaB、TEF1、xynF1tannasegene、No.8AN、gpdA、pgkA、enoA、melO、sodM、catA、catB等。
[0104] 表达载体向丝状真菌中的导入可以使用现有公知的方法进行。可以列举例如Cohen等的方法(氯化钙法)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)]、原生质体法[Mol.Gen.Genet.,168:111(1979)]、感受态细胞法[J.Mol.Biol.,56:209(1971)]、电穿孔法等。
[0105] 作为昆虫细胞，可以列举例如鳞翅类的昆虫细胞，更具体而言，可以列举Sf9和Sf21等草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)来源的昆虫细胞、以及High 5等粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的昆虫细胞等。
[0106] 作为使用昆虫细胞作为宿主的情况下的载体，可以列举例如作为感染夜蛾科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa  californica  nuclear polyhedrosis virus)等杆状病毒(Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual(杆状病毒表达载体实验室手册),W.H.Freeman and Company,纽约(1992))。
[0107] 在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以利用例如Current protocols in molecular biology(分子生物学现行规范)；Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual(杆状病毒表达载体实验室手册),W.H.Freeman and Company,纽约(1992)；Bio/Technology,6,47(1988)等中记载的方法对多肽进行表达。即，可以将重组基因导入载体和杆状病毒共导入昆虫细胞中，在昆虫细胞培养上清中得到重组病毒(表达载体)后，进一步使重组病毒感染昆虫细胞，使多肽进行表达。作为该方法中使用的基因导入载体，可以列举例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均为Invitorogen公司制)等。
[0108] 作为用于制备重组病毒的、重组基因导入载体和杆状病毒向昆虫细胞中的共导入方法，可以列举例如磷酸钙法(日本特开平2-227075)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987))等。
[0109] 上述重组载体优选进一步含有用于转化体选择的选择标志物基因。例如，在大肠杆菌中，作为选择标志物基因，可以使用针对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等各种药剂的抗性基因。也可以使用能够与营养需求性相关的基因变异互补的劣性的选择标志物。在酵母中，作为选择标志物基因，可以使用针对遗传霉素的抗性基因，也可以使用与营养需求性相关的基因变异互补的基因、LEU2、URA3、TRP1、HIS3等选择标志物。在丝状真菌中，作为选择标志物基因，可以列举选自由niaD(Biosci.Biotechnol.Biochem.,59,1795-1797(1995))、argB(Enzyme Microbiol Technol,6,386-389,(1984))、sC(Gene,84,329-334,(1989))、ptrA(BiosciBiotechnol  Biochem,64,1416-1421,(2000))、pyrG(BiochemBiophys Res Commun,112,284-289,(1983))，amdS(Gene,26,205-221,(1983))、金担子素抗性基因(Mol Gen Genet,261,290-296,(1999))、苯菌灵抗性基因(Proc Natl Acad Sci USA,83,4869-4873,(1986))和潮霉素抗性基因(Gene,57,21-26,(1987))组成的组中的标志物基因、亮氨酸需求性互补基因等。另外，在宿主为营养需求性变异株的情况下，也可以使用与该营养需求性互补的野生型基因作为选择标志物基因。
[0110] 利用上述表达载体进行了转化的宿主的选择可以通过使用选择性地与上述核酸结合的探针的噬菌斑杂交和菌落杂交等来进行。作为该探针，可以使用将基于上述核酸的序列信息利用PCR法扩增出的部分DNA片段用放射性同位素或地高辛进行修饰而得到的探针。
[0111] (重组蛋白的生产)
[0112] 重组蛋白可以通过将利用上述表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养来生产。将上述宿主在培养用培养基中进行培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法来进行。
[0113] 在上述宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为培养用培养基，只要是含有该宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行该宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。
[0114] 作为碳源，只要是该宿主可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。
[0115] 作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。
[0116] 作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
[0117] 大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的pH优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的pH的调节可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。
[0118] 另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导型启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
[0119] 作为昆虫细胞的培养用培养基，可以使用通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制)、Sf-900II SFM培养基(Life Technologies公司制)、ExCell400、ExCell405(均为JRH Biosciences公司制)、Grace昆虫培养基(Nature,195,788(1962))等。
[0120] 昆虫细胞的培养例如可以在培养用培养基的pH为6～7、培养温度为25～30℃等条件下使培养时间为1～5天来进行。另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加庆大霉素等抗生素。
[0121] 在宿主为植物细胞的情况下，转化后的植物细胞可以直接进行培养，另外也可以分化为植物的器官来进行培养。作为培养该植物细胞的培养基，可以使用通常使用的Murashige&Skoog(MS)培养基、怀特(White)培养基、或者在这些培养基中添加生长素、细胞分裂素等植物激素而得到的培养基等。
[0122] 动物细胞的培养例如可以在培养用培养基的pH为5～9、培养温度为20～40℃等条件下使培养时间为3～60天来进行。另外，培养中，可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。
[0123] 利用上述方法，能够使目标蛋白质以不溶体的形式在宿主细胞内中进行表达。
[0124] [步骤(A)]
[0125] 步骤(A)是对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤。
[0126] 以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中所含的、来源于宿主细胞的蛋白质的一部分能够有效地溶解于未添加无机盐的非质子性极性溶剂或添加有无机盐的非质子性极性溶剂中。第一非质子性极性溶剂可以添加至干燥菌体等干燥后的重组细胞中，也可以添加至重组细胞的悬浮液等中。此外，通过在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但重组蛋白不溶解的条件下进行处理，来源于宿主细胞的蛋白质溶解而包含在可溶性级分(第一可溶性级分)中，重组蛋白包含在不溶性级分(第一不溶性级分)中。在后续的步骤(B)中将第一可溶性级分除去，由此能够从来源于宿主细胞的蛋白质中分离重组蛋白。
[0127] 将来源于宿主细胞的蛋白质除去时的重组细胞可以为无损伤的细胞，也可以为进行破坏处理等处理后的细胞。另外，本发明的方法也可以应用于使用已进行了简单纯化处理的细胞，将残留的来源于宿主细胞的蛋白质除去。
[0128] (第一非质子性极性溶剂)
[0129] 作为第一非质子性极性溶剂，可以列举例如二甲亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈、丙酮、异丙醇、碳酸亚丙酯、六甲基磷酰胺、N-乙基吡咯烷酮、硝基苯、糠醛、γ-丁内酯、亚硫酸亚乙酯、环丁砜、琥珀腈、碳酸亚乙酯等，但并不限定于这些。这些非质子性极性溶剂中，优选偶极矩为3.0D以上的非质子性极性溶剂，例如优选DMSO、NMP、DMI、DMF、DMA和乙腈，更优选DMSO、NMP、DMF和DMA。
[0130] 非质子性极性溶剂的纯度没有特别限定，在本步骤中无需为高纯度，但优选纯度为80％以上。
[0131] 作为第一非质子性极性溶剂，可以单独使用一种非质子性极性溶剂，也可以将两种以上的非质子性极性溶剂适当混合使用。
[0132] 在溶解蛋白质等具有极性的化合物的情况下，极性大的溶剂是有效的，认为偶极矩为3.0D以上的分子的极性强。将基于溶剂手册(讲谈社科学出版社、2007年)的有机化合物(有机溶剂)的偶极矩记载于表1中。
[0133] [表1]
[0134]有机溶剂 偶极矩(D) 有机溶剂 偶极矩(D)
DMSO 4.30 NMP(环状) 4.09
DMI 4.05 DMF 3.86
DMA 3.72 乙腈 3.44
丙酮 2.69 异丙醇 1.68
[0135] 添加至重组细胞中的第一非质子性极性溶剂的添加容量只要是能够溶解宿主细胞的量即可，例如，相对于重组细胞干燥重量(重量)，以非质子性极性溶剂(体积)/重组细胞干燥重量(重量)之比计，可以为10～100倍，可以为12～50倍，也可以为20～35倍。在此，重组细胞干燥重量例如在宿主为细菌的情况下是指干燥后的细菌的菌体的重量。
[0136] (无机盐)
[0137] 通过在第一非质子性极性溶剂中添加无机盐，来源于宿主细胞的蛋白质变得更容易溶解。
[0138] 作为添加至第一非质子性极性溶剂中的无机盐，可以列举碱金属卤化物、碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐、硫氰酸盐、高氯酸盐等。
[0139] 作为碱金属卤化物，可以列举例如溴化钾、溴化钠、溴化锂、氯化钾、氯化钠、氯化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铯、碘化钾、碘化钠、碘化锂等。
[0140] 作为碱土金属卤化物，可以列举例如氯化钙、氯化镁、溴化镁、溴化钙、碘化镁、碘化钙等。
[0141] 作为碱土金属硝酸盐，可以列举例如硝酸钙、硝酸镁、硝酸锶、硝酸钡等。
[0142] 作为硫氰酸盐，可以列举例如硫氰酸钠、硫氰酸铵、(硫氰酸胍)等。
[0143] 作为高氯酸盐，可以列举例如高氯酸铵、高氯酸钾、高氯酸钙、高氯酸银、高氯酸钠、高氯酸镁等。
[0144] 这些无机盐可以单独使用一种，也可以将两种以上组合使用。
[0145] 作为优选的无机盐，可以列举碱金属卤化物、碱土金属卤化物，作为优选的无机盐的具体例，可以列举氯化锂、氯化钙等。
[0146] 作为无机盐的添加量，根据所使用的第一非质子性极性溶剂决定最佳量即可，例如，相对于第一非质子性极性溶剂，可以添加0～1.0M的无机盐。例如，无机盐的添加量的上限值可以为0.7M、0.6M或0.5M，无机盐的添加量的下限值可以为0.05M、0.1M或0.2M。
[0147] 在使用DMSO作为第一非质子性极性溶剂的情况下，无机盐的添加量优选为0～0.7M，更优选为0～0.3M，进一步优选为0～0.1M。
[0148] 在使用DMF、DMA、DMI、NMP作为第一非质子性极性溶剂的情况下，无机盐的添加量优选为0～0.7M，更优选为0～0.6M，进一步优选为0～0.5M。
[0149] 第一非质子性极性溶剂可以进一步包含抑制目标蛋白质的溶解的溶剂。通过在第一非质子性极性溶剂中添加无机盐，来源于宿主细胞的蛋白质变得更容易溶解，但同时具有目标蛋白质也变得更容易溶解的倾向。因此，通过在第一非质子性极性溶剂中添加抑制目标蛋白质的溶解的溶剂，能够防止目标蛋白质的溶解，同时高效地使来源于宿主细胞的蛋白质溶解。作为抑制目标蛋白质的溶解的溶剂，优选为具有环状结构的非质子性极性溶剂，具体而言，可以列举环状酮类、含氮杂环式化合物类、含氧杂环式化合物类、含硫杂环式化合物类、以及具有氮、氧和硫中的两种以上原子的杂环式化合物类等溶剂。
[0150] 作为环状酮类的溶剂，可以列举例如环己酮、环己烯酮、异佛尔酮、环戊酮和环戊烯酮等，优选环己酮和异佛尔酮等，更优选环己酮。
[0151] 作为含氮杂环式化合物类的溶剂，可以列举例如吡啶、哌啶、吡咯烷、甲基吡啶、喹啉、NMP、2-吡咯烷酮、N-乙基-2-吡咯烷酮和DMI等，优选吡啶、NMP、2-吡咯烷酮和DMI，更优选NMP。
[0152] 作为含氧杂环式化合物类的溶剂，可以列举例如二氧杂环己烷、四氢呋喃、糠醛、二氧杂环戊烷、碳酸亚乙酯、碳酸亚丙酯、δ-戊内酯和γ-丁内酯等，优选四氢呋喃、碳酸亚乙酯、碳酸亚丙酯、δ-戊内酯和γ-丁内酯，更优选四氢呋喃。
[0153] 作为含硫杂环式化合物类的溶剂，可以列举例如环丁砜和四氢噻吩等。
[0154] 作为具有氮、氧和硫中的两种以上原子的杂环式化合物类的溶剂，可以列举吗啉、N-甲基吗啉、噻唑、异噻唑、 唑和苯并 唑等。
[0155] 作为抑制上述目标蛋白质的溶解的溶剂向第一非质子性极性溶剂中的添加量，根据所添加的无机盐的量决定最佳量即可，例如，相对于第一非质子性极性溶剂，可以为10～75％(体积/体积)，也可以为10～50％。
[0156] 来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但重组蛋白不溶解的条件可以根据添加至第一非质子性极性溶剂中的无机盐的浓度和目标重组蛋白等进行适当设定，优选为温度条件。优选加热至来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但目标重组蛋白不溶解的温度，并维持规定时间。
[0157] 用于使来源于宿主细胞的蛋白质溶解的温度根据添加至第一非质子性极性溶剂中的无机盐的浓度和目标重组蛋白来决定即可，可以列举例如10～60℃和10～40℃的温度。例如，用于使来源于宿主细胞的蛋白质溶解的温度的上限值可以为70℃、60℃、50℃或40℃，用于使来源于宿主细胞的蛋白质溶解的温度的下限值可以为10℃、20℃、25℃或30℃。
[0158] 用于使来源于宿主细胞的蛋白质溶解的时间只要是来源于宿主细胞的蛋白质充分溶解且目标重组蛋白的溶解少的时间，则无需特别限定，若考虑工业性生产，则优选为10～100分钟，更优选为10～60分钟，进一步优选为10～30分钟。
[0159] 在目标重组蛋白为蛛丝、蚕丝、胶原蛋白、弹性蛋白和节肢弹性蛋白等结构蛋白质的情况下，可以列举例如以下的条件。
[0160] 关于添加至表达上述结构蛋白质的宿主中的第一非质子性极性溶剂的添加量，相对于重组细胞每干燥重量(重量)，以非质子性极性溶剂(体积)/重组细胞干燥重量(重量)之比计，优选为10～100倍，更优选为12～50倍，进一步优选为20～35倍。作为添加至第一非质子性极性溶剂中的无机盐，优选氯化锂和氯化钙，更优选氯化锂。另外，添加无机盐的浓度相对于第一非质子性极性溶剂优选为0～1.0M以下，更优选为0～0.6M以下，进一步优选为0～0.5M以下。通过使用上述第一非质子性极性溶剂，在例如10～50℃、优选10～40℃下进行处理，能够将构成宿主细胞的蛋白质溶解。作为用于溶解的时间，例如可以为20～60分钟，优选为20～40分钟，更优选为20～30分钟。
[0161] 更具体而言，在目标重组蛋白为如序列号1～4那样包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质(在此，式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示8～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。)的情况下，可以列举例如以下的条件。
[0162] 关于添加至表达上述蛋白质的宿主中的第一非质子性极性溶剂的添加量，相对于重组细胞每干燥重量(重量)，以非质子性极性溶剂(体积)/重组细胞干燥重量(重量)之比计，优选为10～100倍，更优选为12～50倍，进一步优选为20～35倍。作为添加至第一非质子性极性溶剂中的无机盐，优选氯化锂和氯化钙，更优选氯化锂。另外，添加无机盐的浓度相对于第一非质子性极性溶剂优选为0～1.0M以下，更优选为0～0.6M以下，进一步优选为0～0.5M以下。通过使用上述第一非质子性极性溶剂，在例如10～50℃、优选10～40℃下进行处理，能够将构成宿主细胞的蛋白质溶解。作为用于溶解的时间，例如可以为20～60分钟，优选为20～40分钟，更优选为20～30分钟。
[0163] [步骤(B)]
[0164] 步骤(B)是除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤。
[0165] 通过从步骤(A)中得到的溶液中除去溶解有来源于宿主细胞的蛋白质的第一可溶性级分，能够将来源于宿主细胞的蛋白质除去。作为将第一可溶性级分与第一不溶性级分分离、除去溶解有来源于宿主细胞的蛋白质的第一可溶性级分、回收包含目标重组蛋白的第一不溶性级分的方法，可以列举离心分离、鼓式过滤器或压滤器等过滤器过滤等一般的方法。在利用过滤器过滤的情况下，通过组合使用硅藻土(Celite)、硅藻土等助滤剂和预涂剂等，能够更高效地回收包含目标重组蛋白的第一不溶性级分。
[0166] 利用该方法，能够在不添加水等水系溶剂的情况下通过利用简便的方法将可溶性级分与不溶性级分分离，除去来源于宿主细胞的蛋白质。由于不添加水系溶剂，因此使用后的第一非质子性极性溶剂可以经纯化而再次用于步骤(A)，较为经济。
[0167] [步骤(C)]
[0168] 步骤(C)是使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤。
[0169] 步骤(B)中回收的第一不溶性级分中所含的目标重组蛋白可以使用添加有无机盐的非质子性极性溶剂(第二非质子性极性溶剂)有效地进行溶解。通过将第二非质子性极性溶剂添加至第一不溶性级分中，在该重组蛋白溶解的条件下进行处理，该重组蛋白溶解而包含在可溶性级分(第二可溶性级分)中，不溶性的夹杂物包含在不溶性级分(第二不溶性级分)中。通过在后续的步骤(D)中除去第二不溶性级分，能够除去夹杂物。
[0170] 作为第二非质子性极性溶剂，可以使用上述步骤(A)中记载的非质子性极性溶剂，但优选为不具有环状结构的非质子性极性溶剂，更优选为不具有环状结构且偶极矩为3.5D以上的非质子性极性溶剂。
[0171] 作为第二非质子性极性溶剂，可以使用与步骤(A)中使用的第一非质子性极性溶剂相同的非质子性极性溶剂，也可以使用与第一非质子性极性溶剂不同的非质子性极性溶剂。
[0172] 作为第二非质子性极性溶剂的优选的具体例，可以列举DMSO、DMF、DMA、DM1和NMP，作为更优选的具体例，可以列举DMSO、DMF和DMA。
[0173] 第二非质子性极性溶剂的纯度没有特别限定，从降低夹杂物的观点出发，优选为90％以上，更优选为95％以上。
[0174] 作为第二非质子性极性溶剂，可以单独使用一种非质子性极性溶剂，也可以将两种以上的非质子性极性溶剂适当混合使用。
[0175] 关于添加至包含目标重组蛋白的第一不溶性级分中的第二非质子性极性溶剂的添加容量，以非质子性极性溶剂(体积)/重组细胞干燥重量(重量)之比计，优选为5～50倍，更优选为6～25倍，进一步优选为8～16倍。
[0176] 作为添加至第二非质子性极性溶剂中的无机盐，可以使用上述步骤(A)中记载的无机盐。在使用步骤(A)中添加无机盐的第一非质子性极性溶剂的情况下，可以使用与该无机盐相同种类的无机盐作为添加至第二非质子性极性溶剂中的无机盐，也可以使用与该无机盐不同的无机盐。
[0177] 作为添加至第二非质子性极性溶剂中的无机盐，可以单独使用一种无机盐，也可以组合使用两种以上的无机盐。
[0178] 作为添加至第二非质子性极性溶剂中的无机盐，优选可以列举碱金属卤化物和碱土金属卤化物，作为具体的优选例，可以列举氯化锂和氯化钙等。
[0179] 作为添加至第二非质子性极性溶剂中的无机盐的添加量，根据所使用的第二非质子性极性溶剂决定最佳量即可，例如，相对于第二非质子性极性溶剂，可以添加0.01～2.0M的无机盐。
[0180] 在使用DMSO作为第二非质子性极性溶剂的情况下，无机盐的添加量优选为0.01～1.5M，更优选为0.5～1.5M，进一步优选为1～1.5M。
[0181] 在使用DMF、DMA、DMI、NMP作为第二非质子性极性溶剂的情况下，无机盐的添加量优选为0.01～2.0M，更优选为0.5～2.0M，进一步优选为1.0～2.0M。
[0182] 重组蛋白溶解的条件可以根据添加至第二非质子性极性溶剂中的无机盐的浓度和目标重组蛋白等进行适当设定，优选为温度条件。优选加热至重组蛋白溶解的温度，并维持规定时间。通过进行加热，能够高效地使目标重组蛋白溶解。
[0183] 用于使目标重组蛋白溶解的温度根据添加的无机盐的浓度和目标重组蛋白来决定即可，可以列举例如10～90℃，优选列举30～85℃，更优选列举40～80℃。例如，用于使目标重组蛋白溶解的温度的上限值可以为100℃、90℃、85℃或80℃，用于使目标重组蛋白溶解的温度的下限值可以为50℃、60℃、65℃或70℃。
[0184] 用于使目标重组蛋白溶解的的时间只要是目标重组蛋白充分溶解的时间，则无需特别限定，若考虑工业生产率和收率，则优选为20～80分钟，更优选为20～70分钟，进一步优选为20～60分钟。
[0185] [步骤(D)]
[0186] 步骤(D)是除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤。
[0187] 通过从步骤(C)中得到的溶液中除去包含不溶性夹杂物的第二不溶性级分，能够将夹杂物除去。作为将第二可溶性级分与第二不溶性级分分离、除去包含不溶性夹杂物的第二不溶性级分，回收包含目标重组蛋白的第二可溶性级分的方法，可以列举离心分离、鼓式过滤器或压滤器等过滤器过滤等一般的方法。在利用过滤器过滤的情况下，通过组合使用硅藻土(Celite)、硅藻土等助滤剂和预涂剂等，能够更高效地回收溶解有目标重组蛋白的第二可溶性级分。
[0188] [步骤(E)]
[0189] 本纯化方法可以进一步包括使用上述重组蛋白的不良溶剂对第二可溶性级分进行处理，使上述重组蛋白凝集，以凝集体的形式回收纯化后的重组蛋白的步骤(E)。
[0190] 在上述步骤(D)中得到的溶解有目标重组蛋白的第二可溶性级分中添加难以溶解该重组蛋白的溶剂(不良溶剂)，使该重组蛋白凝集(添加不良溶剂所致的凝集)，以凝集体的形式回收，由此能够得到纯化纯度更高的重组蛋白。
[0191] 作为不良溶剂，优选使目标重组蛋白难以溶解于第二非质子性极性溶剂中的溶剂。可以列举例如酯类、酮类、醇类、腈类、醚类和芳香族烃类的不良溶剂。
[0192] 作为酯类的不良溶剂，可以列举例如乙酸乙酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸辛酯、甲酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸2-乙氧基乙酯、丁酸甲酯和水杨酸甲酯等，优选乙酸乙酯、甲酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸2-乙氧基乙酯，更优选乙酸乙酯和乙酸2-乙氧基乙酯。
[0193] 作为酮类的不良溶剂，可以列举例如丙酮、甲基乙基酮、甲基丁基酮和甲基异丁基酮等，优选丙酮和甲基乙基酮，更优选丙酮。
[0194] 作为醇类的不良溶剂，优选饱和醇，更优选碳原子数1～5的一价醇、碳原子数2～5的二价醇和碳原子数3的三价醇。
[0195] 具体而言，作为一价醇，可以列举甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1-戊醇、2-戊醇和3-戊醇等。作为二价醇，可以列举1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇和1,5-戊二醇等。作为三价醇，可以列举甘油等。
[0196] 作为腈类的不良溶剂，优选饱和腈，更优选碳原子数2～8、特别是碳原子数2～6的腈，进一步优选碳原子数2～4的腈。具体而言，可以列举乙腈、丙腈、琥珀腈、丁腈和异丁腈等。
[0197] 作为醚类的不良溶剂，优选使用饱和醚。具体而言，可以列举乙醚、甲基叔丁基醚、苯甲醚、二氧杂环己烷和四氢呋喃等。
[0198] 作为芳香族烃类的不良溶剂，可以列举苯和甲苯等，优选甲苯。
[0199] 作为添加至第二可溶性级分中的不良溶剂的添加量，根据目标重组蛋白适当决定即可，通常添加与溶解有该蛋白质的第二可溶性级分相同的量即可。根据该蛋白质的凝集状况和来源于宿主细胞的蛋白质的混入存在等适当调节添加量即可。
[0200] 作为以凝集体的形式回收凝集的目标重组蛋白的方法，可以列举离心分离、鼓式过滤器或压滤器等过滤器过滤等一般的方法。在利用过滤器过滤的情况下，通过组合使用硅藻土(Celite)、硅藻土等助滤剂和预涂剂等，能够更高效地以凝集体的形式回收目标重组蛋白。
[0201] 利用该方法，能够在不添加水等水系溶剂的情况下纯化目标重组蛋白。因此，在以凝集体的形式回收该重组蛋白后，可以将使用后的第二非质子性极性溶剂纯化而再次利用，较为经济。
[0202] [人造多肽纤维的制造方法]
[0203] 在目标重组蛋白为来源于以多肽纤维的制造为目的而生产的结构蛋白质、例如蛛丝、蚕丝等的蛋白质的情况下，可以将步骤(D)中得到的包含重组蛋白的第二可溶性级分直接使用于多肽纤维的制造。在此，直接使用是指无需进一步的纯化步骤。这表示步骤(D)中得到的第二可溶性级分中所含的纯化后的重组蛋白的纯度足够高至用于纺丝。在步骤(A)～(D)后，进行纺丝步骤，由此能够通过湿式纺丝而制造人造多肽纤维。
[0204] 即，一个实施方式的人造多肽纤维的制造方法的特征在于，包括以下(A)～(D)和(F)的步骤：
[0205] (A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
[0206] (B)除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
[0207] (C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
[0208] (D)除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤；
[0209] (F)将第二可溶性级分以丝状液体的形式施加至凝固液中，使上述重组蛋白凝固成丝状并回收，由此得到未拉伸丝的步骤。
[0210] 关于步骤(A)～(D)，如上所述。步骤(F)是将第二可溶性级分以丝状液体的形式施加至凝固液中，使上述重组蛋白凝固成丝状并回收，由此得到未拉伸丝的步骤。
[0211] 将步骤(D)中得到的包含重组蛋白的第二可溶性级分施加至凝固液中时，重组蛋白凝固。此时，通过将第二可溶性级分以丝状液体的形式施加至凝固液中，重组蛋白凝固成丝状，能够形成丝(未拉伸丝)。未拉伸丝的形成例如可以依照日本专利第5584932号中记载的方法进行。
[0212] (1)多肽的溶液(纺丝液)的制备如上所述，步骤(D)中得到的溶解有重组蛋白的第二可溶性级分无需进一步的纯化步骤，能够作为所谓的纺丝液用于步骤(E)的纺丝。适于纺丝的粘度通常为10～10000cP(厘泊)，粘度可以使用例如京都电子工业公司制造的商品名“EMS粘度计”进行测定。在步骤(D)中得到的第二可溶性级分的粘度不在10～10000cP(厘泊)的范围内的情况下，可以将第二可溶性级分的粘度调节至能够纺丝的粘度。粘度的调节可以使用步骤(A)的说明中作为优选溶剂所例示的非质子性极性溶剂。非质子性极性溶剂可以包含步骤(A)的说明中所例示的优选的无机盐。
[0213] 为了用作纺丝液而对粘度进行调节时添加至非质子性极性溶剂中的无机盐的浓度可以高于以纯化为目的的情况下的浓度。例如，可以按照相对于纺丝液使无机盐为0.5～2.0M的方式添加。
[0214] 关于第二可溶性级分实际能否作为纺丝液直接用于步骤(E)中的纺丝，例如可以利用以下的简易方法来确认。即，在具有内径0.1mm的针的注射器中装入适当量的该第二可溶性级分，将针的尖端按入300mL烧杯中的甲醇(相当于凝固液)中并挤出。在重组蛋白在甲醇中凝固为丝、能够用镊子以丝的形式从甲醇中取出的情况下，该第二可溶性级分能够作为纺丝液用于纺丝。在不形成丝的情况下，调整粘度和无机盐浓度等，进行微调节，由此能够作为纺丝液使用。
[0215] (2)使用多肽溶液的多肽的聚合
[0216] 将上述(1)中制备的多肽的溶液(纺丝液)加热至100℃以上。通过该加热，多肽彼此发生脱水缩合而聚合。还可以通过组合使用公知的脱水缩合催化剂而飞跃性地提高聚合效率。进行该聚合反应后的纺丝液可以根据需要添加乙醇、甲醇或水等进行稀释，用于湿式纺丝的制作。
[0217] (3)湿式纺丝-拉伸
[0218] (a)湿式纺丝
[0219] 将加热后的第二可溶性级分(纺丝液)以丝状流体的形式施加至凝固液中。湿式纺丝中使用的凝固液只要是能够脱溶剂的溶液，则可以是任何凝固液。用于将溶剂脱离而形成纤维的凝固液优选使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子数1～5的低级醇或丙酮。也可以适当添加水。从纺丝的稳定性的观点出发，凝固液的温度优选为5～30℃。
[0220] 将第二可溶性级分(纺丝液)以丝状流体的形式施加的方法没有特别限制，可以列举例如从纺丝用的喷头挤出至脱溶剂槽的凝固液中的方法。通过重组蛋白凝固，得到未拉伸丝。将第二可溶性级分挤出至凝固液中的情况下的挤出速度可以根据喷头的直径和第二可溶性级分的粘度等适当设定，例如，在具有直径0.1～0.6mm的喷嘴的注射泵的情况下，从纺丝的稳定性的观点出发，挤出速度优选为每孔0.2～6.0mL/小时，更优选为每孔1.4～4.0mL/小时。加入凝固液的脱溶剂槽(凝固液槽)的长度没有特别限定，例如长度可以为200～500mm。通过重组蛋白的凝固而形成的未拉伸丝的引离速度例如可以为1～14m/分钟，停留时间例如可以为0.01～0.15分钟。从脱溶剂的效率的观点出发，未拉伸丝的引离速度优选为1～3m/分钟。通过重组蛋白的凝固而形成的未拉伸丝可以进一步在凝固液中进行拉伸(预拉伸)，但从抑制凝固液中使用的低级醇的蒸发的观点出发，优选将凝固液维持于低温，在未拉伸丝的状态下从凝固液中引离。
[0221] (b)拉伸
[0222] 本实施方式的人造多肽纤维的制造方法也可以包括将步骤(E)中得到的未拉伸丝进一步拉伸的步骤。拉伸可以为一步拉伸，也可以为两步以上的多步拉伸。以多步进行拉伸时，能够使分子在多步中进行取向，总拉伸倍率也提高，因此适合于强韧性高的纤维的制造。
[0223] [多肽膜的制造方法]
[0224] 在目标重组蛋白为来源于以多肽膜的制造为目的而生产的结构蛋白质、例如蛛丝、蚕丝等的蛋白质的情况下，可以将步骤(D)中得到的包含重组蛋白的第二可溶性级分直接使用于多肽膜的制造。在此，直接使用是指无需进一步的纯化步骤。这表示步骤(D)中得到的第二可溶性级分中所含的纯化后的重组蛋白的纯度足够高至用于多肽膜的形成。在步骤(A)～(D)后，进行膜形成步骤，由于能够制造多肽膜。
[0225] 即，一个实施方式的多肽膜的制造方法的特征在于，包括以下(A)～(D)和(G)的步骤：
[0226] (A)对于以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞，使用添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂，在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但上述重组蛋白不溶解的条件下进行处理的步骤；
[0227] (B)除去第一可溶性级分，回收包含上述重组蛋白的第一不溶性级分的步骤；
[0228] (C)使用添加无机盐的第二非质子性极性溶剂，在上述重组蛋白溶解的条件下对回收的第一不溶性级分进行处理的步骤；
[0229] (D)除去第二不溶性级分，得到包含上述重组蛋白的第二可溶性级分的步骤；
[0230] (G)使用第二可溶性级分在对第二非质子性极性溶剂具有耐性的平板上形成规定厚度的涂膜，从上述涂膜中除去第二非质子性极性溶剂，由此得到多肽膜的步骤。
[0231] 关于步骤(A)～(D)，如上所述。步骤(G)是使用第二可溶性级分在对第二非质子性极性溶剂具有耐性的平板上形成规定厚度的涂膜，从上述涂膜中除去第二非质子性极性溶剂，由此得到多肽膜的步骤。
[0232] 使用步骤(D)中得到的包含目标重组蛋白的第二可溶性级分形成涂膜，除去第二可溶性级分中所含的第二非质子性极性溶剂时，形成重组蛋白的多肽膜。
[0233] 作为形成涂膜的平板，使用玻璃板等对第二非质子性极性溶剂具有耐性的平板。涂膜的厚度没有特别限定，例如可以为1～1000μm。
[0234] 作为形成规定厚度的多肽膜的方法，可以列举例如流延法。在利用流延法形成多肽膜的情况下，使用气刀涂布机、刮刀涂布机等工具将包含目标重组蛋白的第二可溶性级分以几微米以上的厚度流延至平板上，形成流延膜，然后通过减压干燥或在脱溶剂槽中浸渍而将溶剂脱离，由此能够得到多肽膜。
[0235] 实施例
[0236] 以下，基于实施例更具体地说明本发明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
[0237] (1)目标蛋白质表达株(重组细胞)的制作
[0238] 分别合成编码具有序列号1(PRT468)、序列号2(PRT647)、序列号3(PRT699)和序列号4(PRT698)所表示的氨基酸序列的具有来源于蛛丝的序列)的丝心蛋白的核酸、GEN514、GEN740、GEN797和GEN796。该核酸中，在5’末端附加有NdeI位点、并且在终止密码子下游附加有EcoRI位点。各蛋白质的亲水指数和分子量如表2中所示。
[0239] [表2]
[0240]序列号 蛋白质名 核酸名 亲水指数 分子量
1 PRT468 GEN514 -0.59 50.1
2 PRT647 GEN740 0.04 54.1
3 PRT699 GEN797 0.17 48.8
4 PRT698 GEN796 0.43 48.5
[0241] 将这四种核酸分别克隆至克隆载体(pUC118)中。然后，利用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制酶处理并将其切出后，重组到蛋白质表达载体pET-22b(+)中得到表达载体。利用分别重组有该四种核酸的pET-22b(+)表达载体分别对大肠杆菌BLR(DE3)进行转化，得到表达目标蛋白质的转化大肠杆菌(重组细胞)。
[0242] (2)目标蛋白质的表达
[0243] 将上述转化大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄青霉素的100mL的种子培养用培养基(表3)中，使OD600达到0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至OD600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。
[0244] [表3]
[0245] 种子培养用培养基
[0246]
[0247] 将该种子培养液添加到添加有500ml的生产培养基(表4)的发酵罐中，使OD600达到0.05。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。
[0248] [表4]
[0249] 生产培养基
[0250]
[0251] 在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1L、酵母提取物120g/1L)。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％，进行20小时培养。然后，向培养液中添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以使终浓度达到1mM，诱导表达目标蛋白质。在添加IPTG后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液制备的菌体进行SDS-PAGE，根据依赖于IPTG添加的目标蛋白质大小的条带的出现，确认到目标蛋白质以不溶体的形式进行了表达。
[0252] [实施例1来源于宿主细胞蛋白质的溶解步骤中的无机盐和温度的影响][0253] 对于将来源于宿主细胞的蛋白质溶解的步骤中的、无机盐向第一非质子性极性溶剂中的添加和添加浓度以及温度的影响进行了考察。在PRT468表达大肠杆菌的干燥菌体50mg中添加含有0M、0.1M、0.25M和0.5M氯化锂的DMSO 1mL，在40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的温度下进行30分钟处理。冷却至室温后，在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离。利用SDS-PAGE对通过离心分离得到的上清(第一可溶性级分)进行分析。将结果示于图1。40～60的数字表示温度，0～0.5M的标记表示DMSO中所含的氯化锂的浓度。泳道XL是对分子量标志蛋白质进行电泳的结果，泳道C是将纯化完毕的PRT468作为阳性对照进行电泳的结果。
[0254] 图1A和C利用能够将全部蛋白质染色的Oriole(商标)荧光凝胶染色剂(Bio-Rad公司制)进行了染色，图1B和D利用与PRT468的His标签区域反应的InVision(商标)带His标签的凝胶内染色试剂(Thermo Fisher Scientific公司制)进行了染色。
[0255] 在任意一种条件下均确认到来源于宿主细胞的蛋白质的条带，表明来源于宿主细胞的蛋白质溶解于第一非质子性极性溶剂中而包含在第一可溶性级分中。但是，在使用含有浓度高达0.25M～0.5M的氯化锂的DMSO的样品中，目标蛋白质PRT468也溶解而包含在第一可溶性级分中(图1D)。来源于宿主细胞的蛋白质溶解、且PRT468的溶解最少的条件为在DMSO中添加0.1M氯化锂、且在40℃下进行处理的条件。
[0256] [实施例2来源于宿主细胞的蛋白质的溶解步骤中的环己酮添加的效果之一][0257] 在实施例1中，在使用含有高浓度氯化锂的DMSO作为第一非质子性极性溶剂的情况下，不仅确认到来源于宿主细胞的蛋白质的溶解，还确认到目标蛋白质PRT468的溶解。因此，对于通过向含有高浓度氯化锂的DMSO中添加环己酮而带来的PRT468的溶解防止效果进行了研究。
[0258] 制备DMSO:环己酮＝100:0、50:50、25:75这三种混合比率的溶剂，在这些溶剂中以达到0.1M或0.5M的方式添加氯化锂，制备总计六种第一非质子性极性溶剂(参考表5)。
[0259] [表5]
[0260]泳道No. 氯化锂(M) DMSO(％) 环己酮(％)
1 0.1 100 0
2 0.1 50 50
3 0.1 25 75
4 0.5 100 0
5 0.5 50 50
6 0.5 25 75
[0261] 在PRT468表达大肠杆菌的干燥菌体50mg中添加表5的第一非质子性极性溶剂1mL，在60℃下进行30分钟处理。冷却至室温后，在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离。在通过离心分离得到的沉淀中分别添加所使用的处理溶剂0.5mL，悬浮后再次离心分离，进行沉淀级分的清洗。利用SDS-PAGE对所得到的上清级分(第一可溶性级分)和沉淀级分(第一不溶性级分)进行分析。将上清级分的结果示于图2，将沉淀级分的结果示于图3。1～6的数字对应于表5的泳道No.。泳道XL是对分子量标志蛋白质进行电泳的结果，泳道C是将纯化完毕的PRT468作为阳性对照进行电泳的结果。
[0262] 图2A和图3A利用能够将全部蛋白质染色的Oriole(商标)荧光凝胶染色剂进行了染色，图2B和图3B利用与PRT468的His标签区域反应的InVision(商标)带His标签的凝胶内染色试剂进行了染色。
[0263] 在将未添加环己酮的含有0.5M氯化锂的DMSO作为第一非质子性极性溶剂的情况下，在与阳性对照相同的位置确认到条带，确认到PRT468的溶解(图2A和B的泳道4)。另一方面，在将添加有环己酮的含有0.5M氯化锂的DMSO作为第一非质子性极性溶剂的情况下，未确认到PRT468的条带(图2A和B的泳道5和6)。
[0264] 在使用含有0.5M氯化锂的DMSO的情况下，与使用含有0.1M氯化锂的DMSO的情况(图3A和B的泳道1)相比，确认到沉淀级分中所含的PRT468的减少(图3A和B的泳道4)。但是，在添加有环己酮的情况下，未确认到沉淀级分中的PRT468含量的降低(图3A和B的泳道5和6)。但是，在使用DMSO:环己酮为25:75的第一非质子性极性溶剂的情况下，上清级分中所含的PRT468减少，但上清级分中所含的来源于宿主细胞的蛋白质也减少，因此得到了来源于宿主细胞的蛋白质与PRT468一同大量残留于沉淀级分中的结果(图3A的泳道6)，并不是适合于PRT468的纯化的条件。
[0265] 由这些结果，在确认了目标蛋白质在第一非质子性极性溶剂中的溶解性的基础上，可以确认：通过根据该蛋白质以适当的浓度添加环己酮，能够通过添加高浓度的盐而使来源于宿主细胞的蛋白质容易溶解于第一非质子性极性溶剂中，同时能够防止目标蛋白质在第一非质子性极性溶剂中的溶解。因此，能够高效地将来源于宿主细胞的蛋白质分离在第一可溶性级分中、将目标蛋白质分离在第一不溶性级分中。
[0266] [实施例3来源于宿主细胞的蛋白质的溶解步骤中的非质子性极性溶剂的种类的影响]
[0267] 对于在第一非质子性极性溶剂使用DMF的情况下是否也能高效地将来源于宿主细胞的蛋白质与目标蛋白质分离进行了研究。在PRT468表达大肠杆菌的干燥菌体50mg中添加含有0M、0.1M、0.25M和0.5M的氯化锂的DMF(第一非质子性极性溶剂)1mL，在60℃的温度下进行30分钟处理。冷却至室温后，以11000×g离心分离5分钟。在通过离心分离得到的沉淀级分中分别添加所使用的上述第一非质子性极性溶剂0.5mL，悬浮后再次离心分离，进行沉淀级分的清洗。利用SDS-PAGE对所得到的上清级分(第一可溶性级分)和沉淀级分(第一不溶性级分)进行分析。将上清级分的结果示于图4，将沉淀级分的结果示于图5。泳道1～4表示DMF中所含的氯化锂的浓度为0M(泳道1)、0.1M(泳道2)、0.25M(泳道3)和0.5M(泳道4)的结果。泳道XL是对分子量标志蛋白质进行电泳的结果，泳道C是将纯化完毕的PRT468作为阳性对照进行电泳的结果。
[0268] 图4A和图5A利用能够将全部蛋白质染色的Oriole(商标)荧光凝胶染色剂进行了染色，图4B和图5B利用与PRT468的His标签区域反应的InVision(商标)带His标签的凝胶内染色试剂进行了染色。
[0269] 与使用未添加氯化锂的DMF作为第一非质子性极性溶剂的情况相比，在使用添加有氯化锂的DMF作为第一非质子性极性溶剂的情况下，上清级分中较多地含有来源于宿主细胞的蛋白质。特别表明在使用含有0.25M以上的氯化锂的DMF的情况下，能够有效地将来源于宿主细胞的蛋白质溶解(图4A)。在任意一种情况下，上清级分中均几乎不含有PRT468(图4B)。
[0270] 在使用含有0.25M以上的氯化锂的DMF作为第一非质子性极性溶剂的情况下，与使用含有0～0.1M的氯化锂的DMF的情况相比，沉淀级分中所含的PRT468以外的蛋白质显著减少，表明能够有效地将来源于宿主细胞的蛋白质除去(图5A)。另外，PRT468的溶解也少，还表明能够无损失地进行回收(图5B)。由此可以确认，与DMSO同样，通过对氯化锂的浓度进行优化，DMF也能够用作用于除去来源于宿主细胞的蛋白质的第一非质子性极性溶剂。
[0271] [实施例4来源于宿主细胞的蛋白质的除去和目标蛋白质的纯化]
[0272] 从分别表达PRT468(序列号1：分子量50.1、HI：-0.59)、PRT647(序列号2：分子量54.1、HI：0.04)、PRT699(序列号3：分子量48.8、HI：0.17)和PRT698(序列号4：分子量48.5、HI：0.43)的转化大肠杆菌中除去来源于该宿主细胞的蛋白质，进行目标重组蛋白的纯化。
[0273] 在分别表达上述四种目标蛋白质的转化大肠杆菌的干燥菌体50mg中添加含有0.1M氯化锂的DMSO(第一非质子性极性溶剂)1mL，在40℃的温度下进行30分钟处理。冷却至室温后，在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离，分离为沉淀级分(第一不溶性级分)和上清级分(上清I：第一可溶性级分)。对于沉淀级分，再次添加含有0.1M氯化锂的DMSO 
0.5mL使其悬浮，通过离心分离进行沉淀级分的清洗。在该清洗后的沉淀级分中添加含有
0.5M氯化锂的DMSO(第二非质子性极性溶剂)0.5mL，在80℃下进行30分钟处理。自然冷却至室温后，在20000×g、5分钟的条件下进行离心分离，回收含有目标蛋白质的上清级分(上清II：第二可溶性级分)。利用SDS-PAGE对上清I和上清II进行分析。将结果示于图6。泳道1～4分别以蛋白质浓度为1.5μg的方式施加有上清I和上清II，表示PRT468(泳道1)、PRT647(泳道2)、PRT698(泳道3)和PRT699(泳道4)的结果。泳道XL是将分子量标志蛋白质进行泳动的结果。
[0274] 图6的A利用能够将全部蛋白质染色的Oriole(商标)荧光凝胶染色剂进行了染色，图6的B利用与附加在目标蛋白质的N末端的序列号8所表示的氨基酸序列(His标签序列和铰链序列)的His标签区域反应的InVision(商标)带His标签的凝胶内染色试剂进行了染色。
[0275] 对于四种蛋白质的任意一种均能够高效地除去来源于宿主细胞的蛋白质(图6A)，能够将目标蛋白质纯化(图6B)。
[0276] [实施例5来源于宿主细胞的蛋白质的溶解步骤中的环己酮添加的效果之二][0277] 对于在升高用于使来源于宿主细胞的蛋白质溶解的温度的情况下是否也能通过向DMSO中添加环己酮而得到目标蛋白质的溶解防止效果进行了研究。将来源于宿主细胞的蛋白质的溶解步骤中的温度设定为40℃至60℃，作为第一非质子性极性溶剂，使用含有与DMSO相同容量的环己酮和0.5M氯化锂的溶剂，除此以外利用与实施例4相同的方法将来源于宿主细胞的蛋白质溶解，分离为沉淀级分(第一不溶性级分)和上清级分(上清I：第一可溶性级分)。进一步，利用与实施例4相同的方法进行沉淀级分的清洗，接着将目标蛋白质溶解，得到包含目标蛋白质的上清级分(上清II：第二可溶性级分)。将结果示于图7。泳道1～4分别以蛋白质浓度为1.5μg的方式施加有上清I或上清II，表示PRT468(泳道1)、PRT647(泳道2)、PRT698(泳道3)和PRT699(泳道4)的结果。泳道XL是将分子量标志蛋白质进行泳动的结果。
[0278] 即使将用于使来源于宿主细胞的蛋白质溶解的温度从40℃升高至60℃，通过添加环己酮，也能够抑制四种目标蛋白质的溶解，能够高效地除去来源于宿主细胞的蛋白质(图7A和B的上清I)。另外，与实施例4的结果相比，目标蛋白质以外的条带少或浅，因此表明能够比实施例4更高纯度地对目标蛋白质进行纯化(图7A的上清II)。
[0279] [实施例6使用不良溶剂的纯化的效果之一]
[0280] 对得到包含目标蛋白质的第二可溶性级分后进一步使用不良溶剂进行纯化的情况下的纯化效果进行了研究。在表达PRT468的转化大肠杆菌的干燥菌体10g中添加含有0.1M氯化锂的DMSO(第一非质子性极性溶剂)200mL，在40℃的温度下进行1小时处理。在进行处理后的溶液中添加2g助滤剂ラヂオライト#900，搅拌后，使用设置有玻璃纤维过滤器DP-7(ADVANTEC公司制)的布氏漏斗进行减压过滤，得到滤液I(第一可溶性级分)。利用含有
0.1M氯化锂的DMSO 40mL对滤出的残渣(第一不溶性级分)进行清洗。在该清洗残渣中添加含有0.5M氯化锂的DMSO(第二非质子性极性溶剂)200mL，在80℃的温度下进行1小时处理，将PRT468溶解。自然冷却至室温后，在与上述相同的条件下减压过滤，得到包含PRT468的滤液II(第二可溶性级分)。使用不良溶剂如下对该滤液II进行进一步纯化。
[0281] 在113mL滤液II中添加等量的乙酸乙酯(不良溶剂)，使PRT468凝集。在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离，分离为上清级分(离心分离后的上清)和沉淀级分(凝集体)。回收沉淀级分，用RO水200mL清洗3次后，冷冻干燥，得到2.5g的粉末(纯化粉末)。利用SDS-PAGE对各步骤中的纯化状况进行分析。将结果示于图8。泳道1施加有最终得到的纯化粉末，泳道2施加有滤液I，泳道3施加有滤液II，泳道4施加有离心分离后的上清，分别以蛋白质浓度为1.5μg的方式施加。泳道XL是对分子量标志蛋白质进行电泳的结果，泳道C是将纯化完毕的PRT468作为阳性对照进行电泳的结果。
[0282] 确认到：在将来源于宿主细胞的蛋白质溶解后的滤液I中大量溶解有来源于宿主细胞的蛋白质，能够高效地从包含该蛋白质的滤出的残渣中分离(图8A的泳道2)。另外，在通过添加乙酸乙酯进行纯化之前的滤液II和进行纯化后的纯化粉末中未观察到PRT468量的差异，因此确认到：通过添加乙酸乙酯进行纯化，能够在几乎无损失的情况下有效地纯化目标蛋白质PRT468(图8B的泳道1和3)。
[0283] [实施例7使用不良溶剂的纯化的效果之二]
[0284] 对于从分别表达PRT468(序列号1)、PRT647(序列号2)、PRT699(序列号3)和PRT698(序列号4)的转化大肠杆菌中纯化目标蛋白质的方法中的、来源于宿主细胞蛋白质的溶解条件与使用不良溶剂的纯化的组合的效果进行了研究。
[0285] 使用分别表达上述四种目标蛋白质的转化大肠杆菌，利用与上述
[0286] 实施例4(40℃)同样的方法或与实施例5(60℃-环己酮添加)同样的方法进行来源于宿主细胞的蛋白质的溶解处理。然后，与实施例4同样地在通过离心分离得到的沉淀级分(第一不溶性级分)中添加含有0.1M氯化锂的DMSO 0.5mL使其悬浮，通过离心分离进行沉淀级分的清洗。在清洗后的沉淀级分中添加含有0.5M氯化锂的DMSO(第二非质子性极性溶剂)0.5mL，在80℃下进行30分钟处理，使四种目标蛋白质溶解。自然冷却至室温后，在20000×g、5分钟的条件下进行离心分离，得到包含目标蛋白质的上清级分(第二可溶性级分)。
[0287] 在该上清级分300μL中添加异丙醇(不良溶剂)600μL，颠倒混合30分钟，使目标蛋白质凝集。在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离，分离为上清级分(上清I)和沉淀级分(凝集体)。在沉淀级分中添加RO水1mL，进行清洗。在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离，除去上清级分(上清II)后，将沉淀级分冷冻干燥。在干燥后的沉淀级分中添加含有0.5M氯化锂的DMSO 500μL，在80℃的温度下进行30分钟处理，得到包含四种目标纯化蛋白质的溶液(纯化蛋白质溶液)。
[0288] 利用SDS-PAGE对四种目标纯化蛋白质溶液、上清I和上清II进行分析。图9A和B示出与实施例4(40℃)同样地进行来源于宿主细胞的蛋白质的溶解处理的结果，图9C和D示出与实施例5(60℃-环己酮添加)同样地进行来源于宿主细胞的蛋白质的溶解处理的结果。泳道1～4分别以蛋白质浓度为1.5μg的方式施加有纯化蛋白质溶液，表示上清I或上清II、PRT468(泳道1)、PRT647(泳道2)、PRT698(泳道3)和PRT699(泳道4)的结果。
[0289] 图9的A和C利用能够将全部蛋白质染色的Oriole(商标)荧光凝胶染色剂进行了染色，图9的B和D利用与附加在目标蛋白质的N末端的序列号8所表示的氨基酸序列(His标签序列和铰链序列)的His标签区域反应的InVision(商标)带His标签的凝胶内染色试剂进行了染色。
[0290] 与将40℃的温度条件下的来源于宿主细胞的蛋白质的溶解和由不良溶剂异丙醇的添加所致的凝集化进行组合的情况相比，在将60℃-环己酮添加条件下的来源于宿主细胞的蛋白质的溶解和由不良溶剂异丙醇的添加所致的凝集化进行组合的情况下，对于任意一种目标蛋白质而言，在纯化后的蛋白质中目标蛋白质以外的条带均减少，均确认到纯度的进一步提高(图9A和C“纯化蛋白质”)。另一方面，纯化损失在40℃的温度条件下的处理和60℃-环己酮添加条件下基本同等(图9B和D)。
[0291] [实施例8第二可溶性级分作为纺丝液形式的利用]
[0292] 对于能否使用通过本纯化方法得到的纯化蛋白质溶液来纺丝进行了研究。
[0293] 依据实施例2中记载的方法，如下除去来源于宿主细胞蛋白质。在表达PRT468的大肠杆菌的干燥菌体10g中添加第一非质子性极性溶剂200mL，该第一非质子性极性溶剂是在按照DMSO:环己酮＝1:1的比率混合而成的溶剂中以达到0.5M的方式添加氯化锂而得到的，在60℃的温度下进行30分钟处理。接着在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离。除去上清级分(第一可溶性级分)，用上述第一非质子性极性溶剂100mL对沉淀级分(第一不溶性级分)进行清洗。
[0294] 在湿润状态的沉淀级分500mg中添加含有1.0M氯化锂的DMSO(第二非质子性极性溶剂)500μL，在80℃的温度下进行30分钟处理，将目标蛋白质溶解。自然冷却至室温后，在20000×g、60分钟的条件下进行离心分离，除去沉淀级分(第二不溶性级分)，以纯化蛋白质溶液的形式得到包含PRT468的上清级分(第二可溶性级分)。利用以下的方法对该纯化蛋白质溶液作为纺丝用的纺丝液的利用可能性进行确认。
[0295] 将上述包含PRT468的纯化蛋白质溶液80μL装入具有内径0.1mm的针的注射器中。将该注射器的针的尖端按入300mL烧杯中的甲醇(凝固液)中，将上述纯化蛋白质溶液挤出，确认到在凝固液中形成丝状物(图10A)。用镊子将形成的丝状物从凝固液中取出，自然干燥(图10A和B)。
[0296] 由以上的结果可以确认，目标蛋白质的纯度高至如下程度：利用本纯化方法得到的纯化蛋白质溶液无需进一步的纯化步骤，能够直接用作纺丝用的纺丝液。即，可知：与现有的使用重组蛋白的纺丝用的纺丝液的制备步骤(凝集、清洗、干燥和再溶解等)相比，能够以极少的步骤制备纺丝用的纺丝液。
[0297] [实施例9利用本纯化方法得到的凝胶化消除效果]
[0298] 国际公开第2014/103847号中记载的方法(以下称为现有方法)是在DMSO等非质子性极性溶剂中溶解目标蛋白质、添加水等溶剂将杂质除去而进行纯化的方法。该现有方法虽为优良的方法，但目标蛋白质限定于亲水指数为0以下的亲水性重组蛋白，根据蛋白质的不同有可能发生凝胶化。
[0299] 对于利用该现有方法发生凝胶化的蛋白质(PRT468(序列号1)、HI：-0.59)，利用现有方法和本纯化方法进行纯化，并进行比较。
[0300] (现有方法)
[0301] 按照现有方法，在表达PRT468的大肠杆菌的干燥菌体50mg中添加含有0.5M氯化锂的DMSO 500μL，在80℃的温度下加热30分钟，将PRT468溶解。自然冷却至室温后，添加RO水500μL并进行搅拌。将该溶液的一部分分装至微量离心管中，在分装后立即、1小时后、3小时后和24小时后倒置并观察的凝胶化的状况。将结果示于图11(左为“现有”)。现有方法中，纯化PRT468在1小时后发生凝胶化。将利用SDS-PAGE对凝胶化前的含有PRT468的溶液进行分析的结果示于图12的泳道1。泳道XL是对分子量标志蛋白质进行电泳的结果。
[0302] (本纯化方法)
[0303] 依据实施例2中记载的方法，如下除去来源于宿主细胞蛋白质。在表达PRT468的转化大肠杆菌的干燥菌体50mg中添加第一非质子性极性溶剂1mL，该添加第一非质子性极性溶剂是在按照DMSO:环己酮＝1:1的比率混合而成的溶剂中以达到0.5M的方式添加氯化锂而得到的，在60℃的温度下进行30分钟处理。在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离。除去上清级分(第一可溶性级分)，用60℃的上述第一非质子性极性溶剂对沉淀级分(第一不溶性级分)进行清洗。
[0304] 在清洗后的沉淀级分中添加含有0.5M氯化锂的DMSO溶剂(第二非质子性极性溶剂)500μL，在80℃下进行30分钟处理，将PRT468溶解。将该溶液的一部分分装至微量离心管中，在分装后立即、1小时后、3小时后和24小时后倒置并观察凝胶化的状况。将结果示于图11(右为“本实施例”)。利用本纯化方法，即使在24小时后也未发生凝胶化。
[0305] 将上述溶液在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离，除去沉淀级分(第二不溶性级分)。在上清级分(第二水溶性级分)350μL中添加异丙醇(不良溶剂)700μL，颠倒混合1小时，使PRT468凝集。在11000×g、5分钟的条件下进行离心分离，用RO水清洗沉淀级分(凝集体)。将清洗后的凝集体冷冻干燥，利用SDS-PAGE对所得到的粉体进行分析。将结果示于图12的泳道2。
[0306] 本纯化方法和现有方法的共同点在于均使用非质子性极性溶剂。但是，可知：利用本纯化方法，即使是在利用现有方法时发生凝胶化的重组蛋白，也没有发生凝胶化，能够以与现有方法基本同等的纯度获得重组蛋白。

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