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首页 / 专利分类库 / 天然或化学的线或纤维；纺纱或纺丝 / 制作人造长丝，线，纤维，鬃或带子的化学特征； 专用于生产碳纤维的设备 / 单组分合成聚合物人造长丝及类似物； 其制造 / .均缩聚产物 / ..用聚氨基酸或多肽 / 重组丝固体及膜

重组丝固体及膜
申请号 CN202180027614.7 申请日 2021-02-12 公开(公告)号 CN115427435A 公开(公告)日 2022-12-02
申请人 保尔特纺织品公司; 发明人 A·A·B·达维贾尼; W·J·安德鲁斯三世;
摘要 本公开涉及一种用于成型体的组合物，其包含重组蜘蛛丝蛋白和 增塑剂 。此外，本公开涉及一种包含重组蜘蛛丝蛋白和增塑剂的成型体，以及一种用于制备该成型体的方法。
权利要求

1.一种制备成型体的方法，其包括：
a.提供包含重组丝和增塑剂的组合物，其中所述组合物处于可流动状态；
b.将所述组合物置于模具中；
c.对所述模具中的所述组合物施加热和压力；以及
d.冷却所述组合物以形成包含所述重组丝的成型体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体为固体形式。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体是膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组丝为分散在所述增塑剂中的重组丝粉末。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，成型前，所述重组丝的结晶度相似于或小于18B的所述结晶度。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组丝蛋白为人面蜘蛛鞭状丝或大腹园蜘蛛丝。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组丝是18B。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组丝包含SEQ ID NO:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述增塑剂选自由以下组成的组：三乙醇胺、亚丙基二醇或丙二醇。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物包含按重量计15％的亚丙基二醇。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述增塑剂占所述组合物按重量计10‑50％。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热是在130℃的温度下施加的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述压力是在1,500至15,000psi的范围内施加的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体具有通过A型硬度计测量的100的硬度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体具有通过A型硬度计测量的90以上的硬度。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体具有通过D型硬度计测量的50以上、
60以上、或70以上的硬度。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体可被机加工、切割或钻孔并保持其所需形状。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，与处于所述可流动状态的所述组合物的重组丝相比，所述成型体具有至少50％、60％、70％、80％或90％的全长18B单体。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体具有至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的全长重组丝单体。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体具有至少50％的总重组丝单体、重组丝聚集体和高分子量中间体。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热和压力被施加分钟、2分钟、3分钟、4分钟、
5分钟、6分钟、8分钟、10分钟或15分钟。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，施加所述热和压力5至8分钟。
23.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述成型体暴露于至少50％的相对湿度至少24小时。
24.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述成型体暴露于65％的相对湿度72小时。
25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述压力是通过至少1公吨、至少2公吨、至少3公吨、至少4公吨或至少5公吨的压制载荷施加的。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述压力是通过1至5公吨、或3至5公吨的压制载荷施加的。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷却以约1℃/min、约3℃/min或约45℃/min的速率进行。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物的弯曲模量为50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大、90MPa或更大、100MPa或更大、150MPa或更大、200MPa或更大、250MPa或更大或者300MPa或更大。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物的最大弯曲强度为10MPa或更大、
20MPa或更大、30MPa或更大、40MPa或更大、50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大MPa或更大、90MPa或更大或者100MPa或更大。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物具有1至4％的断裂伸长率。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物具有大于20％的断裂伸长率。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物还包含过硫酸铵。
33.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述成型体浸入过硫酸铵中。
34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体是交联的。
35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成型体是化妆品或护肤制剂。
36.一种包含重组丝和增塑剂的组合物，其中，所述组合物为固体形式。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体为固体形式。
38.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体是膜。
39.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述重组丝为分散在所述增塑剂中的重组丝粉末。
40.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述重组丝是18B。
41.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述重组丝包含SEQ ID NO:1。
42.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述增塑剂选自由以下组成的组：三乙醇胺、亚丙基二醇或丙二醇。
43.根据权利要求36所述的组合物，其中，其中，所述组合物包含按重量计15％的亚丙基二醇。
44.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述增塑剂占所述组合物按重量计10‑50％。
45.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体具有通过A型硬度计测量的100的硬度。
46.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体具有通过A型硬度计测量的90以上的硬度。
47.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体具有通过D型硬度计测量的50以上、60以上、或70以上的硬度。
48.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体可被机加工、切割或钻孔并保持其所需形状。
49.根据权利要求36所述的组合物，其中，与处于所述可流动状态的所述组合物的重组丝相比，所述成型体具有至少50％、60％、70％、80％或90％的全长18B单体。
50.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体具有至少35％、至少40％、至少
45％或至少50％的全长重组丝单体。
51.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体具有至少50％的总重组丝单体、重组丝聚集体和高分子量中间体。
52.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述组合物的弯曲模量为50MPa或更大、
60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大、90MPa或更大、100MPa或更大、150MPa或更大、
200MPa或更大、250MPa或更大或者300MPa或更大。
53.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述组合物的最大弯曲强度为10MPa或更大、
20MPa或更大、30MPa或更大、40MPa或更大、50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大MPa或更大、90MPa或更大或者100MPa或更大。
54.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述组合物具有1至4％的断裂伸长率。
55.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述组合物具有大于20％的断裂伸长率。
56.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述组合物还包含过硫酸铵。
57.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体是交联的。
58.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述成型体是化妆品或护肤制剂。
说明书全文

重组丝固体及膜

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2020年2月12日提交的美国临时申请第62/975,656号的权益，其全部内容通过引用合并于此。
[0003] 序列表
[0004] 现申请含有已以ASCII格式以电子方式提交并在此通过引用整体并入本文的序列表。所述ASCII副本创建于2021年2月12日，名为BTT‑036WO_SL.txt，大小为102,055字节。

技术领域

[0005] 本公开涉及一种用于成型体的组合物，其包含重组蜘蛛丝蛋白和增塑剂。此外，本公开涉及一种包含重组蜘蛛丝蛋白和增塑剂的成型体，以及一种用于制备该成型体的方法。

背景技术

[0006] 作为石油基产品的替代品，生物可再生和可生物降解材料越来越受到关注。为此，已经做出了相当多的努力来开发由衍生自植物和动物衍生的分子(包括重组丝)制造材料和纤维的方法。
[0007] 然而，加工重组丝的传统方法(诸如湿纺法)使用溶剂和凝固浴来生产纤维。这是不利的，因为需要在纺丝过程之后从纤维中提取出用作溶剂和凝固浴中的化学品并进行闭环过程，以提供可持续且可靠的过程。也使用了熔融纺丝，但高温会导致重组丝纤维的降解，这会对最终重组丝材料的性质产生负面影响。此外，期望由重组丝制成其他材料形式，诸如固体或膜，用于各种应用。
[0008] 因此，需要重组丝多肽的组合物，其包括固体和膜，它们具有所需的机械和美学特性，同时使重组丝的降解最小化。此外，整个组合物中重组丝的均质性可能很重要。因此，还需要生产这种组合物的新方法。发明内容
[0009] 根据一些实施方式，本文提供了一种制备成型体的方法，其包括：提供包含重组丝和增塑剂的组合物，其中所述组合物处于可流动状态；将所述组合物置于模具中；对所述模具中的所述组合物施加热和压力；冷却所述组合物以形成包含所述重组丝的成型体。
[0010] 在一些实施方式中，成型体为固体形式。在一些实施方式中，成型体是膜。
[0011] 在一些实施方式中，重组丝是分布在所述增塑剂中的重组丝粉末。在一些实施方式中，成型前，重组丝的结晶度相似于或小于18B的结晶度。在一些实施方式中，重组丝蛋白是人面蜘蛛鞭状丝(nephila spider flagelliform silk)或大腹园蜘蛛丝(araneus spider silk)。在一些实施方式中，重组丝是18B。在一些实施方式中，重组丝包含SEQ ID NO:1。
[0012] 在一些实施方式中，增塑剂选自由以下组成的组：三乙醇胺、亚丙基二醇(trimethylene glycol)或丙二醇。在一些实施方式中，组合物包含按重量计15％的亚丙基二醇。在一些实施方式中，增塑剂占所述组合物的按重量计10‑50％。
[0013] 在一些实施方式中，在130℃的温度下施加热。在一些实施方式中，在1,500至15,000psi的范围内施加压力。
[0014] 在一些实施方式中，成型体通过A型硬度计测量具有100的硬度。在一些实施方式中，成型体通过A型硬度计测量具有90或更高的硬度。在一些实施方式中，成型体通过D型硬度计测量具有50或更高、60或更高、或70或更高的硬度。在一些实施方式中，成型体可被机加工、切割或钻孔并保持其所需形状。
[0015] 在一些实施方式中，与处于所述可流动状态的所述组合物的重组丝相比，成型体具有至少50％、60％、70％、80％或90％的全长18B单体。在一些实施方式中，成型体具有至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的全长重组丝单体。在一些实施方式中，成型体具有至少50％的总重组丝单体、重组丝聚集体和高分子量中间体。
[0016] 在一些实施方式中，热和压力施加持续分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、8分钟、10分钟或15分钟。在一些实施方式中，热和压力施加5至8分钟。
[0017] 在一些实施方式中，该方法进一步包括将所述成型体暴露于至少50％的相对湿度至少24小时。在一些实施方式中，该方法还包括将所述成型体暴露于65％的相对湿度72小时。
[0018] 在一些实施方式中，通过至少1公吨、至少2公吨、至少3公吨、至少4公吨或至少5公吨的压制载荷来施加压力。在一些实施方式中，通过1至5公吨或3至5公吨的压制载荷来施加压力。
[0019] 在一些实施方式中，冷却以约1℃/min、约3℃/min或约45℃/min的速率进行。
[0020] 在一些实施方式中，组合物的弯曲模量为50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大、90MPa或更大、100MPa或更大、150MPa或更大、200MPa或更大、250MPa或更大或者300MPa或更大。在一些实施方式中，组合物的最大弯曲强度为10MPa或更大、20MPa或更大、30MPa或更大、40MPa或更大、50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大MPa或更大、90MPa或更大或者100MPa或更大。
[0021] 在一些实施方式中，组合物的断裂伸长率为1至4％。在一些实施方式中，组合物的断裂伸长率大于20％。
[0022] 在一些实施方式中，组合物进一步包括过硫酸铵。在一些实施方式中，方法还包括将所述成型体浸入过硫酸铵中。在一些实施方式中，成型体是交联的。
[0023] 在一些实施方式中，成型体是化妆品或护肤制剂。
[0024] 本文还提供了包含重组丝和增塑剂的组合物，其中所述组合物为固体形式。
[0025] 在一些实施方式中，成型体为固体形式。在一些实施方式中，成型体是膜。
[0026] 在一些实施方式中，重组丝是分布在所述增塑剂中的重组丝粉末。在一些实施方式中，重组丝是18B。在一些实施方式中，重组丝包含SEQ ID NO:1。
[0027] 在一些实施方式中，增塑剂选自由以下组成的组：三乙醇胺、亚丙基二醇(trimethylene glycol)或丙二醇。在一些实施方式中，组合物包含按重量计15％的亚丙基二醇。在一些实施方式中，增塑剂占所述组合物的按重量计10‑50％。
[0028] 在一些实施方式中，成型体通过A型硬度计测量具有100的硬度。在一些实施方式中，成型体通过A型硬度计测量具有90或更高的硬度。在一些实施方式中，成型体通过D型硬度计测量具有50或更高、60或更高、或70或更高的硬度。在一些实施方式中，成型体可被机加工、切割或钻孔并保持其所需形状。
[0029] 在一些实施方式中，与处于所述可流动状态的所述组合物的重组丝相比，成型体具有至少50％、60％、70％、80％或90％的全长18B单体。在一些实施方式中，成型体具有至少35％、至少40％、至少45％或至少50％的全长重组丝单体。在一些实施方式中，成型体具有至少50％的总重组丝单体、重组丝聚集体和高分子量中间体。
[0030] 在一些实施方式中，组合物的弯曲模量为50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大、90MPa或更大、100MPa或更大、150MPa或更大、200MPa或更大、250MPa或更大或者300MPa或更大。在一些实施方式中，组合物的最大弯曲强度为10MPa或更大、20MPa或更大、30MPa或更大、40MPa或更大、50MPa或更大、60MPa或更大、70MPa或更大、80MPa或更大MPa或更大、90MPa或更大或者100MPa或更大。
[0031] 在一些实施方式中，组合物的断裂伸长率为1至4％。在一些实施方式中，组合物的断裂伸长率大于20％。
[0032] 在一些实施方式中，组合物进一步包括过硫酸铵。在一些实施方式中，成型体是交联的。
[0033] 在一些实施方式中，成型体是化妆品或护肤制剂。附图说明
[0034] 如附图中所示，前述和其他目的、特征和优点将从以下对本发明特定实施方式的描述中变得明显。
[0035] 图1示出了在压制过程中从塑化粉末中压出的额外溶剂的图像。
[0036] 图2示出了具有亚丙基二醇的压制固体(即，成型体)。
[0037] 图3示出了表明蛋白质颜色随时间变暗的压制固体的图片。
[0038] 图4A、图4B和图4C示出了温度与时间的函数的分析。(图4A)模具内固体的缓慢冷却产生0.92℃/min的冷却速率(图4B)模具外的在环境空气中的固体中等冷却产生2.7℃/min的冷却速率(图4C)模具外的在干冰中的固体的快速冷却产生45.2℃/min的冷却速率。
[0039] 图5示出了力与距离的曲线，以评估在65％的RH条件下至少72小时对18B固体的机械性能的影响。系列1、3、5、7和9有被调节，而系列2、4、6、8和11没有被调节。
[0040] 图6示出了在65％的RH环境中经过1分钟的保持时间(L)调节72小时和(R)未调节的固体形态。粒度相当，但经调节的试样在颗粒之间具有更明显的无定形区域，这可能有助于提高延展性。
[0041] 图7示出了力与距离的曲线，以评估冷却速率对18B固体机械性能的影响。10、11和12系列分别对应于缓慢、中等和快速冷却速率。
[0042] 图8示出了重组丝成型体在(A)缓慢冷却(B)中等冷却和(C)快速冷却之间的比较。
[0043] 图9显示了力与距离的曲线，以评估平均载荷对18B固体机械性能的影响。13、14、15、16和17系列分别对应1、2、3、4和5公吨。
[0044] 图10示出了在固体表面上具有多孔空隙的重组丝成型体的图像。图像左侧许多固体表面的表面上可见空隙。右侧示出了分散的蛋白质颗粒。
[0045] 图11示出了平均压制载荷对重组丝成型体的影响。随着平均载荷从(A)1公吨增加到(B)3公吨到(C)5公吨，分散的蛋白质颗粒的量减少。
[0046] 图12示出了力与距离的曲线，以评估成型时间对18B固体机械性能的影响。系列2、4、6、8、11、18、19、20和21分别对应1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、8分钟、10分钟和15分钟。
[0047] 图13示出了重组丝成型体的平均弯曲模量(MPa)随保持时间的变化。误差线显示样品标准偏差。
[0048] 图14示出了重组丝成型体的平均弯曲强度(MPa)随保持时间的变化。误差线显示样品标准偏差。
[0049] 图15示出了重组丝成型体的平均断裂伸长率(％)随保持时间的变化。误差线显示样品标准偏差。
[0050] 图16示出了成型时间对未调节的重组丝成型体的形态的影响，这些未调节的重组丝成型体经历各种保持时间同时保持相等的平均载荷和冷却速率：(A)1分钟(B)3分钟(C)5分钟(D)8分钟(E)10分钟(F)15分钟。
[0051] 图17示出了模具时间对经历1分钟保持与5分钟保持的未调节的重组丝成型体的形态的影响。对以下进行1分钟保持时间和5分钟保持时间之间对(A)固体黑色表面(B,C)强光下进行肉眼检查。更长的保持时间具有更少的明显粉末团块并且更透明。
[0052] 图18示出了用Benchtop SEM成像的重组丝成型体的断裂后表面。对跨不同保持时间的表面成像。(A)1分钟保持时间的变暗以实现更大的对比度(B)5分钟保持时间(C)15分钟保持时间。
[0053] 图19示出了重组丝成型体的交联18B/TEOA样品。
[0054] 图20A和图20B示出了干燥(图20A)或在水中放置1小时后(图20B)的APS交联的18B/甘油膜。左侧膜在交联溶液中浸泡10分钟，而右侧膜浸泡1小时。
[0055] 图21示出了放置在水容器中的使用戊二醛化学的交联18B固体框架在30分钟测试时间内没有显示任何结构变化。
[0056] 图22示出了分散在表面上的18B/甘油粉末。
[0057] 图23示出了重组丝/甘油膜的透明度和悬垂性。
[0058] 图24示出了激光切割的重组丝/甘油膜的实施例。
[0059] 图25示出了在130℃下压制的没有增塑剂的18B粉末的图像。
[0060] 图26示出了在压制成型过程中溢料的形成。
[0061] 图27示出了通过用1,3‑丙二醇压制来制备的成型18B固体的图像(左)和在130℃下再加工和压制以形成膜的固体的图像(右)。

具体实施方式

[0062] 以下描述中列出了本发明的各种实施方式的细节。根据描述，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见。除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，以及复数术语应包括单数。除非上下文另有说明，否则术语“一个(a)”和“一个(an)”包括复数引用。通常，本文所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交相关的术语和技术是本领域众所周知和常用的。
[0063] 定义
[0064] 以下术语，除非另有说明，应理解为具有以下含义：
[0065] 术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式。该术语包括DNA分子(例如，cDNA或基因组或合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA类似物。核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四链体的、部分双链的、支链的、发夹的、环状的或呈挂锁构象。
[0066] 除非另有说明，并且作为本文以通用格式“SEQ ID NO:”描述的所有序列的实施例，“包含SEQ ID NO:1的核酸”是指一种核酸，其至少一部分具有(i)SEQ ID NO:1的序列，或(ii)与SEQ ID NO:1互补的序列。两者之间的选择由上下文决定。例如，如果将核酸用作探针，则两者之间的选择取决于探针与所需靶标互补的要求。
[0067] “分离的”RNA、DNA或混合聚合物是基本上与其天然宿主细胞中天然地伴随自然的多核苷酸的其他细胞成分分离，例如，基本上与其天然缔合的核糖体、聚合酶和基因组序列分离。
[0068] “分离的”有机分子(例如，丝蛋白)是基本上与其来源的宿主细胞的细胞成分(膜脂、染色体、蛋白质)分离的分子，或者是与培养宿主细胞的培养基分离的分子。该术语不要求生物分子已与所有其他化学品分离，尽管某些分离的生物分子可以纯化至接近均质性。
[0069] 术语“重组体”是指一种生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然存在的环境中移除，(2)与在自然界中发现的基因的多核苷酸的全部或部分不相关，(3)与其在自然界中不与其相连的多核苷酸可操作地连接，或(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可用于指代克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mRNA。
[0070] 如果异源序列与内源核酸序列相邻放置，使得该内源核酸的表达顺序被改变，则生物体基因组中的内源核酸序列(或该序列的编码蛋白质产物)在本文中被认为是“重组体”。在此背景下，异源序列是不与内源核酸序列天然相邻的序列，无论异源序列本身是内源的(源自相同的宿主细胞或其后代)还是外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。举例来说，可以用启动子序列取代(例如，通过同源重组)宿主细胞基因组中基因的天然启动子，使得该基因具有改变的表达模式。该基因现在将变成“重组体”，因为它与至少一些自然侧翼的序列分离。
[0071] 如果核酸包含基因组中相应核酸不会自然发生的任何修饰，则该核酸也被认为是“重组体”。例如，如果内源编码序列包含(例如通过人为干预)人工引入的插入、缺失或点突变，则它被认为是“重组体”。“重组核酸”还包括在异源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。
[0072] 如本文所用，术语“肽”是指短多肽，例如，其长度通常小于约50个氨基酸，更通常小于约30个氨基酸。如本文所用的术语涵盖模拟结构和因此生物功能的类似物和模拟物。
[0073] 术语“多肽”涵盖天然存在的和非天然存在的蛋白质，及其片段、突变体、衍生物和类似物。肽可以是单体的或聚合的。此外，多肽可以包含许多不同的结构域，每个结构域具有一种或更多种不同的活性。
[0074] 术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是一种蛋白质或多肽，由于其来源或衍生来源而(1)不以其天然状态与伴随其的天然缔合成分缔合，(2)以自然界中未发现的纯度存在，其中可以相对于其它细胞物质的存在来判定纯度(例如，不含来自相同物种的其它蛋白质)(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在(例如，它是自然界中发现的多肽的片段，或者它包括自然界中未发现的氨基酸类似物或衍生物，或标准肽键以外的连接)。因此，化学合成或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽将从其天然相关成分中“分离”。也可以使用本领域熟知的蛋白质纯化技术通过分离使多肽或蛋白质基本上不含天然缔合的成分。如因此所定义的，“分离的”不一定要求如此描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已经从其天然环境中物理地去除。
[0075] 术语“多肽片段”是指与全长多肽相比具有缺失，例如氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在一个优选的实施方式中，多肽片段是连续序列，其中该片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置相同。片段通常为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选地为至少12、14、16或18个氨基酸长，更优选地为至少20个氨基酸长，更优选地为至少25、30、35、40或45个氨基酸，甚至更优选地为至少50或60个氨基酸长，且甚至更优选地为至少70个氨基酸长。
[0076] 如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列相似的序列，则蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或是“同源的”。或者，如果两种蛋白质具有“相似”的氨基酸序列，则蛋白质与第二蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白质”被定义为意味着两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。如本文所用，氨基酸序列的两个区域之间的同源性(尤其是关于预测的结构相似性)被解释为暗示在功能上相似性。
[0077] 当“同源”用于指代蛋白质或肽时，应认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会显着改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或同源性程度以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的装置对于本领域技术人员来说是众所周知的。参见，例如，Pearson,1994,Methods Mol.Biol.24:307‑31和25:365‑89(通过引用并入本文)。
[0078] 二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology‑A Synthesis(Golub和Gren编,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.,第2版,1991)，其通过引用并入本文。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸如α‑、α‑二取代氨基酸、N‑烷基氨基酸和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如，D‑氨基酸)也可以是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的实施例包括：4‑羟基脯氨酸、γ‑羧基谷氨酸、ε‑N,N,N‑三甲基赖氨酸、ε‑N‑乙酰赖氨酸、O‑磷酸丝氨酸、N‑乙酰丝氨酸、N‑甲酰甲硫氨酸、3‑甲基组氨酸、5‑羟基赖氨酸、N‑甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4‑羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手端对应于氨基末端，右手端对应于羧基末端。
[0079] 以下六组中的每组都包含相互保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0080] 多肽的序列同源性，有时也称为序列同一性百分比，通常使用序列分析软件测量。参见，例如，遗传计算机组(GCG)的序列分析软件包(the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group(GCG))，University of Wisconsin 
Biotechnology Center,910University Avenue,Madison,Wis.53705.蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的同源性测量来匹配相似序列。例如，GCG包含诸如“Gap”和“Bestfit”之类的程序，它们可以使用默认参数来确定密切相关的多肽(例如来自不同物种的生物体)之间或者野生型蛋白质和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG 6.1版。
[0081] 当将特定多肽序列与包含来自不同生物的大量序列的数据库进行比较时，一种有用的算法是计算机程序BLAST(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403‑410(1990)；Gish和States,Nature Genet.3:266‑272(1993)；Madden等人,Meth.Enzymol.266:131‑141(1996)；Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389‑3402(1997)；Zhang和Madden,Genome Res.7:649‑656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:
3389‑3402(1997))。
[0082] BLASTp的首选参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；起始空位罚分：11(默认)；空位延伸罚分：1(默认)；最高比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数：100(默认)；处罚矩阵：BLOWSUM62。
[0083] BLASTp的首选参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；起始空位罚分：11(默认)；空位延伸罚分：1(默认)；最高比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数：100(默认)；处罚矩阵：BLOWSUM62。用于同源性比较的多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，通常至少约28个残基，优选多于约35个残基。在搜索包含来自大量不同生物的序列的数据库时，最好比较氨基酸序列。可以通过本领域已知的除blastp之外的算法来测量使用氨基酸序列的数据库搜索。例如，可以使用FASTA(GCG 6.1版的程序)比较多肽序列。FASTA提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和百分比序列同一性。Pearson,Methods Enzymol.183:63‑98(1990)(通过引用并入本文)。例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如GCG 6.1版所提供的的FASTA以其默认参数(字长2和评分矩阵的NOPAM系数)来确定，所述程序通过引用结合在此。
[0084] 在整个此说明书和权利要求中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises和comprising)”等变体将被理解为暗旨包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
[0085] 如本文所定义的术语“成型体”或“固体”是指通过使用称为模具的刚性框架使液体或柔韧原材料定型而制造的体，例如成型过程包括但不限于挤出成型、注塑成型、压缩成型、吹塑、层压、基质成型(matrix molding)、旋转成型、旋铸、转送成型、热成型等。
[0086] 如本文所用，术语“玻璃化转变”是指物质或组合物从坚硬、刚性或“玻璃状”状态转变为更柔韧的“橡胶状”或“粘性”状态。
[0087] 如本文所用，术语“玻璃化转变温度”是指物质或组合物经历玻璃化转变的温度。
[0088] 如本文所用，术语“熔体转变”是指物质或组合物从橡胶态转变为有序度较低的液相或可流动状态。
[0089] 如本文所用，术语“熔融温度”是指物质经历熔体转变的温度范围。
[0090] 如本文所用，术语“增塑剂”是指与多肽序列相互作用以防止多肽序列形成三级结构和键和/或增加多肽序列的移动性的任何分子。
[0091] 如本文所用，术语“可流动状态”是指具有与液体基本相同的特性(即，已从橡胶态转变为更液态)的组合物。
[0092] 如本文所用，术语“交联的(crosslinked或cross‑linked)”是指在两种或更多种蛋白质上的反应基团之间形成的键。例如，可以通过酶交联或光交联进行交联。例如，过硫酸铵和光或过硫酸铵和热可用于交联丝或丝样多肽。
[0093] 下面描述了示例性方法和材料，尽管与本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可以用于本发明的实践中并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文提及的所有出版物和其他参考文献都通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
[0094] 概述
[0095] 本文提供了一种用于成型体的组合物，其包含重组蜘蛛丝蛋白和增塑剂，其中该组合物包含所需的机械性能，例如强度、柔韧性、刚度。此外，在一些实施方式中，组合物在熔融或可流动状态下是均质的或基本上均质的。此外，在一些实施方式中，重组蜘蛛丝蛋白在其形成成型体之后基本上不降解(例如以小于按重量计10％，或通常小于按重量计6％的量降解)。在优选的实施方式中，重组丝蛋白为粉末的形式。本文还提供了产生此类组合物的方法，其包括将包含丝蛋白和增塑剂的组合物放入模具中，并通过对模具中的组合物施加压力和热来形成成型体，然后冷却成型体并可选地暴露于额外的条件，例如高相对湿度。在优选的实施方式中，热足够低，使得成型的热和时间足够低，使得成型体中重组丝蛋白的降解最小，以保持由使用重组丝产生的所需特性。
[0096] 重组丝蛋白
[0097] 本公开描述了本发明的实施方式，其包括由诸如丝或丝样重组多肽的合成蛋白质共聚物(即，重组多肽)合成的诸如固体和膜的成型体。在一些实施方式中，诸如固体或膜的成型体形成化妆品或护肤制剂(例如，用于皮肤或头发的溶液)。本文提供的成型体可包含各种保湿剂、润肤剂、封闭剂、活性剂和化妆品佐剂，这取决于实施方式和制剂的所需的功效。
[0098] 合适的蛋白质共聚物在2016年8月45日公开的美国专利公开第2016/0222174号、2018年4月26日公开的美国专利公开第2018/0111970号和2018年3月1日公开的美国专利公开第2018/0057548号中讨论，每一个都通过引用整体并入本文。此外，具有类似于或小于
18B的结晶度和/或类似的延展性指数的蛋白质共聚物(例如，蜘蛛鞭毛状丝、蜘蛛丝、再生丝素蛋白)适合用于本文所述的成型体中。在一些实施方式中，具有类似性质的适于形成成型体的其他非丝蛋白，诸如肌联蛋白，是用于形成如本文所述的成型体的合适的蛋白质共聚物。
[0099] 在一些实施方式中，合成蛋白质共聚物由丝样多肽序列制成。在一些实施方式中，丝样多肽序列是1)通过混合和匹配源自丝多肽序列的重复结构域产生的嵌段共聚物多肽组合物和/或2)具有足够大的尺寸(约40kDa)以通过从工业可放大的微生物(industrially scalable microorganism)中分泌形成有用的成型体组合物的嵌段共聚物多肽的重组表达。从丝重复结构域片段工程改造而来的大(约40kDa至约100kDa)的嵌段共聚物多肽，其包括来自几乎所有已发表的蜘蛛丝多肽氨基酸序列的序列，可以在本文所述的修饰微生物中表达。在一些实施方式中，丝多肽序列经匹配和设计以产生能够形成成型体的高度表达和分泌的多肽。
[0100] 在一些实施方式中，嵌段共聚物是经由跨越丝多肽序列空间的丝多肽结构域的组合混合物工程改造的。在一些实施方式中，嵌段共聚物通过在可放大的生物体(例如酵母、真菌和革兰氏阳性细菌)中表达和分泌来制备。在一些实施方式中，嵌段共聚物多肽包含0个或更多个N‑末端结构域(NTD)、1个或更多个重复结构域(REP)和0个或更多个C‑末端结构域(CTD)。在实施方式的一些方面，嵌段共聚物多肽是>100个氨基酸的单一多肽链。在一些实施方式中，嵌段共聚物多肽包含与国际公开第WO/2015/042164号“用于合成改进的丝纤维的组合物和方法(Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers)”(其通过引用整体并入本文)中公开的嵌段共聚物多肽的序列有至少80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％同一性的结构域。
[0101] 已经确定了几种类型的天然蜘蛛丝。每种天然纺丝类型的机械性能被认为与该丝的分子组成密切相关。参见，例如，Garb,J.E.等人,Untangling spider silk evolution with spidroin terminal domains,BMC Evol.Biol.,10:243(2010)；Bittencourt,D.等人,Protein families,natural history and biotechnological aspects of spider silk,Genet.Mol.Res.,11:3(2012)；Rising,A.等人,Spider silk proteins:recent advances in recombinant production,structure‑function relationships and 
biomedical applications,Cell.Mol.Life Sci.,68:2,pg.169‑184(2011)；和Humenik,M.等人,Spider silk:understanding the structure‑function relationship of a 
natural fiber,Prog.Mol.Biol.Transl.Sci.,103,pg.131‑85(2011)。例如：
[0102] 葡萄状腺(AcSp)丝往往具有高韧性，这是适度的高强度加上适度的高延展性的结果。AcSp丝的特征在于大嵌段(“整体重复”)尺寸，通常并入有多聚丝氨酸和GPX的基序。管状腺(TuSp或圆柱形)丝往往具有较大的直径，具有适度的强度和高延展性。TuSp丝的特征在于它们的聚丝氨酸和聚苏氨酸含量，以及短束的聚丙氨酸。大壶状腺(MaSp)丝往往具有高强度和适度的延展性。MaSp丝可以是两种亚型之一：MaSp1和MaSp2。MaSp1丝通常比MaSp2丝的延展性更小，并且特征在于聚丙氨酸、GX和GGX基序。MaSp2丝的特征在于聚丙氨酸、GGX和GPX基序。小壶状腺(MiSp)丝往往具有适度的强度和适度的延展性。MiSp丝的特征在于GGX、GA和poly A基序，并且通常包含大约100个氨基酸的间隔元件。鞭毛腺(Flag)丝往往具有非常高的延展性和适度的强度。Flag丝通常特征在于GPG、GGX和短间隔基序。
[0103] 每种丝类型的特性可能因物种而异，过着不同生活方式的蜘蛛(例如，纺足目蜘蛛(sedentary web spinner)与流浪猎蛛(vagabond hunter))或进化上较老的蜘蛛可能会产生与上述描述不同的丝(用于描述蜘蛛多样性和分类，参见Hormiga,G.和Griswold,C.E.,Systematics,phylogeny,and  evolution  of  orb‑weaving  spiders,Annu.Rev.Entomol.59,pg.487‑512(2014)；和Blackedge,T.A.等人,Reconstructing web evolution  and  spider  diversification  in  the  molecular  era,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,106:13,pg.5229‑5234(2009))。然而，与天然丝蛋白的重复结构域具有序列相似性和/或氨基酸组成相似性的合成嵌段共聚物多肽可用于在商业规模上制造一致的成型体，其具有重现由天然丝多肽制成的相应成形体的性质的性质。
[0104] 在一些实施方式中，可以通过在GenBank中搜索相关术语来编译推定的丝序列列表，例如“spidroin”“fibroin”“MaSp”，并且可以将这些序列与通过独立测序工作获得的额外序列合并。然后将序列翻译成氨基酸，过滤重复条目，并手动拆分为结构域(NTD、REP、CTD)。在一些实施方式中，将候选氨基酸序列反向翻译成优化用于在毕赤酵母(Pichia(Komagataella)pastoris)中表达的DNA序列。DNA序列各自被克隆到表达载体中并转化到毕赤酵母中。在一些实施方式中，显示成功表达和分泌的各种丝结构域随后以组合方式组装以构建能够形成成型体的丝分子。
[0105] 丝多肽特征性地由侧接非重复区域(例如，C‑末端和N‑末端结构域)的重复结构域(REP)组成。在一个实施方式中，C‑末端和N‑末端结构域的长度都在75‑350个氨基酸之间。重复结构域呈现出层次架构，如图1所描绘。重复结构域包含一系列嵌段(也称为重复单元)。嵌段在整个丝重复结构域中重复，有时完美地重复有时不完美地重复(构成一个准重复结构域)。嵌段的长度和组成因不同的丝类型和不同的物种而异。表1列出了来自选定物种和丝类型的嵌段序列实施例，进一步的实施例见Rising,A.等人,Spider  silk 
proteins:recent advances in recombinant production,structure‑function 
relationships and biomedical applications,Cell Mol.Life Sci.,68:2,pg 169‑184(2011)；以及Gatesy,J.等人,Extreme diversity,conservation,and convergence of spider silk fibroin sequences,Science,291:5513,pg.2603‑2605(2001)。在某些情况下，嵌段可能以规则模式排列，形成在丝序列的重复结构域中出现多次(通常为2‑8次)的更大的宏观重复体。重复结构域或宏观重复体内的重复嵌段，以及重复结构域内的重复的宏观重复体，可以由间隔元素分隔。在一些实施方式中，嵌段序列包含富含甘氨酸的区域，然后是polyA区域。在一些实施方式中，短(～1‑10)个氨基酸基序在嵌段内多次出现。出于本发明的目的，在不参考环状排列的情况下，可以选择来自不同天然丝多肽的嵌段(即，丝多肽之间在其他方面相似的识别嵌段可能由于环状排列而不对齐)。因此，例如，为了本发明的目的，SGAGG(SEQ ID NO:3)的“嵌段”与GSGAG(SEQ ID NO:4)相同并且与GGSGA(SEQ ID NO:5)相同；它们都只是彼此的循环排列。为给定的丝序列选择的特定排列最大程度上可以由便利性(通常以G开始)决定。从NCBI数据库获得的丝序列可以划分为嵌段和非重复区域。
[0106] 表1：嵌段序列的样品
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112] 根据本发明的某些实施方式，来自嵌段和/或宏观重复体结构域的成型体形成嵌段共聚物多肽描述于国际公开第WO/2015/042164号，通过引用并入。按结构域(N‑末端结构域、重复结构域和C‑末端结构域)对从蛋白质数据库(诸如GenBank)或通过de novo测序获得的天然丝序列进行分解。为了合成和组装成纤维或成型体的目的而选择的N‑末端结构域和C‑末端结构域序列包括天然氨基酸序列信息和本文所述的其他修饰。重复结构域被分解成含有代表性嵌段的重复序列，该嵌段通常为1‑8个，具体取决于丝的类型，它们捕获关键的氨基酸信息，同时将编码氨基酸的DNA的大小减小为易于合成的片段。在一些实施方式中，适当形成的嵌段共聚物多肽包含至少一个重复结构域，该重复结构域包含至少1个重复序列，并且任选侧接N‑末端结构域和/或C‑末端结构域。
[0113] 在一些实施方式中，重复结构域包含至少一个重复序列。在一些实施方式中，重复序列是150‑300个氨基酸残基。在一些实施方式中，重复序列包含多个嵌段。在一些实施方式中，重复序列包含多个宏观重复体。在一些实施方式中，一个嵌段或一个宏观重复体被分割成多个重复序列。
[0114] 在一些实施方式中，重复序列以甘氨酸开始，并且不能以苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、甲硫氨酸(M)或天冬氨酸(D)结束，以满足DNA组装要求。在一些实施方式中，与天然序列相比，可以改变一些重复序列。在一些实施方式中，可以改变重复序列，诸如通过向多肽的C末端添加丝氨酸(以避免其终止于F、Y、W、C、H、N、M或D)。在一些实施方式中，可以通过用来自另一嵌段的同源序列填充不完整的嵌段来修饰重复序列。在一些实施方式中，可以通过重新排列嵌段或宏观重复体的顺序来修饰重复序列。
[0115] 在一些实施方式中，可以选择非重复的N‑和C‑末端结构域用于合成。在一些实施方式中，N‑末端结构域可以通过去除例如，如SignalP(Peterson,T.N.等人,SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions,Nat.Methods,8:10,pg.785‑786(2011)识别的前导信号序列来实现。
[0116] 在一些实施方式中，N‑末端结构域、重复序列或C‑末端结构域序列可以源自漏斗网蜘蛛(Agelenopsis aperta)、Aliatypus gulosus蜘蛛、哥斯达黎加斑马脚蜘蛛(Aphonopelma seemanni)、短牙蛛种AS217(Aptostichus sp.AS217)、短牙蛛种AS220、十字园蛛、猫脸蜘蛛、大腹圆蛛、悦目金蛛(Argiope amoena)、银色金蛛(Argiope argentata)、横纹金蛛(Argiope bruennichi)、三带金蛛、Atypoides riversi、黄带粉趾(Avicularia juruensis)、沟穴蛛属(Bothriocyrtum californicum)、食人魔脸蜘蛛、灰色迪格蛛
(Diguetia canities)、黑捕鱼蛛、Euagrus chisoseus、苗圃网络蜘蛛、乳突棘旗蜘蛛(Gasteracantha mammosa)、Hypochilus thorelli、Kukulcania hibernalis、黑寡妇蜘蛛、Megahexura fulva、Metepeira grandiosa、金圆网蛛(Nephila antipodiana)、棒络新妇蛛、络新妇蛛、马达加斯加新妇蛛(Nephila madagascariensis)、斑络新妇蛛(Nephila pilipes)、Nephilengys cruentata、帕拉威夏双条纹蛛(Parawixia bistriata)、绿色猞猁蜘蛛(Peucetia viridans)、原始食肉蛛、印度华丽雨林蛛(Poecilotheria regalis)、长爪绿色突光蝴蛛或全異蟱蛛。
[0117] 在一些实施方式中，丝多肽核苷酸编码序列可以被可操作地连接至α交配因子核苷酸编码序列。在一些实施方式中，丝多肽核苷酸编码序列可以被可操作地连接到另一内源或异源分泌信号编码序列。在一些实施方式中，丝多肽核苷酸编码序列可以被可操作地连接到3XFLAG核苷酸编码序列。在一些实施方式中，丝多肽核苷酸编码序列被可操作地连接至其他亲和标签，诸如6‑8个His残基(SEQ ID NO:33)。
[0118] 在一些实施方式中，重组蜘蛛丝多肽基于源自MaSp2(诸如源自横纹金蛛物种)的重组蜘蛛丝蛋白片段序列。在一些实施方式中，成型体含有包括二至二十个重复单元的蛋白质分子，其中每个重复单元的分子量大于约20kDa。在共聚物的每个重复单元内有超过约60个氨基酸残基，通常在60至100个氨基酸的范围内，它们被组织成许多“准重复单元”。在一些实施方式中，本公开中描述的多肽的重复单元与MaSp2牵引丝蛋白序列具有至少95％的序列同一性。
[0119] 形成具有良好机械性能的成型体的蛋白质嵌段共聚物的重复单元可以使用丝多肽的一部分来合成。这些多肽重复单元包含富含丙氨酸的区域和富含甘氨酸的区域，并且长度为150个氨基酸或更长。在共同拥有的PCT公开WO 2015/042164中提供了可用作本公开的蛋白质嵌段共聚物中的重复序列的一些示例性序列，其通过引用整体并入，并且被证明使用毕赤酵母表达系统表达。
[0120] 在一些实施方式中，所述蜘蛛丝蛋白包含：至少两次出现的重复单元，所述重复单元包含：超过150个氨基酸残基并且具有至少10kDa的分子量；具有6个或更多个连续氨基酸的富含丙氨酸的区域，其包含至少80％的丙氨酸含量；具有12个或更多连续氨基酸的富含甘氨酸区域，其包含至少40％的甘氨酸含量和小于30％的丙氨酸含量。
[0121] 在一些实施方式中，其中重组蜘蛛丝蛋白包含重复单元，其中每个重复单元与包含2至20个准重复单元的序列具有至少95％的序列同一性；每个准重复单元包括{GGY‑[GPG‑X1]n1‑GPS‑(A)n2}(SEQ ID NO:34)，其中对于每个准重复单元；X 1独立地选自由以下组成的组：SGGQQ(SEQ ID NO:35)、GAGQQ(SEQ ID NO:36)、GQGPY(SEQ ID NO:37)、AGQQ(SEQ ID NO:38)和SQ；n1是从4到8，且n2是从6到10。重复单元由多个准重复单元组成。
[0122] 在一些实施方式中，3个“长”准重复单元之后是3个“短”准重复单元。如上所述，短的准重复单元是其中n1＝4或5的那些准重复单元。长准重复单元定义为其中n1＝6、7或8的那些准重复单元。在一些实施方式中，所有的短准重复在重复单元的每个准重复单元内的相同位置具有相同的X1基序。在一些实施方式中，6个中不超过3个准重复单元共享相同的X1基序。
[0123] 在另外的实施方式中，重复单元由准重复单元组成，所述准重复单元在重复单元内的行中使用相同X1不超过两次。在另外的实施方式中，重复单元由准重复单元组成，其中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个准重复在重复单元的单个准重复单元中使用相同的X1不超过2次。
[0124] 在一些实施方式中，重组蜘蛛丝多肽包含SEQ ID NO:1(即，18B)的多肽序列。在一些实施方式中，重复单元是包含SEQ ID NO:2的多肽。表2中提供了这些序列：
[0125] 表2‑重组蛋白和重复单元的示例性多肽序列
[0126]
[0127] 在一些实施方式中，由所述重组蜘蛛丝多肽形成的成型体的结构形成β‑折叠结构、β‑转角结构或α‑螺旋结构。在一些实施方式中，所形成的成型体的二级、三级和四级蛋白质结构被描述为具有纳米晶β‑折叠区域、无定形β‑转角区域、无定形α‑螺旋区域、嵌入非晶基质中的随机空间分布的纳米晶区域、或者嵌入非晶基质中的随机取向的纳米晶区域。虽然不希望受理论束缚，但理论上蜘蛛丝内的蛋白质的结构特性与成型体的机械特性有关。结晶区域与强度有关，而无定形区域与延展性有关。与鞭状丝相比，主壶腹腺(MA)丝往往具有比鞭毛腺丝更高的强度和更小的延展性，并且与鞭状丝相比，MA丝具有更高的结晶区体积分数。
[0128] 在一些实施方式中，丝蛋白的分子量的范围可以在20kDa至2000kDa、或大于20kDa、或大于10kDa、或大于5kDa、或5至400kDa、或5至300kDa、或5至200kDa、或5至100kDa、或5至50kDa、或5至500kDa、或5至1000kDa、或5至2000kDa、或10至400kDa、或10至300kDa、或
10至200kDa、或10至100kDa、或10至50kDa、或10至500kDa、或10至1000kDa、或10至2000kDa、或20至400kDa、或20至300kDa、或20至200kDa、或40至300kDa、或40至500kDa、或20至
100kDa、或20至50kDa、或20至500kDa、或20至1000kDa、或20至2000kDa。
[0129] 重组蜘蛛丝多肽粉末杂质及降解的表征
[0130] 基于蛋白质形成的二级和三级结构的强度和稳定性，不同的重组蜘蛛丝多肽具有不同的理化特性诸如熔融温度和玻璃化转变温度。丝多肽以单体形式形成β折叠结构。在存在其他单体的情况下，丝多肽形成β折叠结构的三维晶格。β折叠结构与多肽序列的无定形区域分开并散布在其中。
[0131] β‑折叠结构在高温下非常稳定——通过快速扫描量热法测量，β‑折叠的熔融温度约为257℃。参见Cebe等人，Beating the Heat–Fast Scanning Melts Silk Beta Sheet Crystals,Nature Scientific Reports 3:1130(2013)。由于β折叠结构被认为在丝多肽的玻璃化转变温度以上保持完整，因此假设在重组丝多肽的玻璃化转变温度下看到的结构转变是由于β折叠之间的无定形区域的流动性增加。
[0132] 增塑剂通过增加无定形区域的流动性和潜在地破坏β折叠形成来降低丝蛋白的玻璃化转变温度和熔融温度。用于此目的的合适增塑剂包括但不限于水和多元醇(多元醇)，诸如甘油、三甘油、六甘油和十甘油。其他合适的增塑剂包括但不限于：异山梨醇二甲酯(Dimethyl Isosorbite)；二甲氨基丙胺和己二酸的双酰胺；2,2,2‑三氟乙醇；二甲氨基丙胺和辛酸/癸酸的酰胺；DEA乙酰胺及其任意组合。其他合适的增塑剂在Ullsten等人,Chapter 5:Plasticizers for Protein Based Materials Viscoeleastic and 
Viscoplastic Materials(2016)(可于https://www.intechopen.com/books/
viscoelastic‑and‑viscoplastic‑materials/plasticizers‑for‑protein‑based‑materials获取)和Vierra等人,Natural‑based plasticizers and polymer films:A review,European Polymer Journal 47(3):254‑63(2011)中讨论，其全部内容通过引用并入本文。
[0133] 由于丝多肽的亲水部分可以结合作为湿气存在于空气中的环境水，因此水几乎总是存在，结合的环境水可以使丝多肽增塑。在一些实施方式中，合适的增塑剂可以是甘油，单独存在或与水或其他增塑剂组合存在。上面讨论了其他合适的增塑剂。
[0134] 此外，在重组蜘蛛丝多肽通过发酵生产并作为重组蜘蛛丝多肽粉末自其回收的情况下，在重组蜘蛛丝多肽粉末中可能存在杂质，它们充当增塑剂或以其他方式抑制三级结构的形成。例如，残留的脂质和糖可以作为增塑剂且因此通过干扰三级结构的形成来影响蛋白质的玻璃化转变温度。
[0135] 各种公认的方法可用于评估重组蜘蛛丝多肽粉末或组合物的纯度和相对组成。尺寸排阻色谱法基于分子的相对大小分离分子且可用于分析重组蜘蛛丝多肽在其全长聚合和单体形式中的相对量以及重组蜘蛛丝多肽粉末中高子量、低子量和中等分子量杂质的量。类似地，快速高效液相色谱法可用于测量溶液中存在的各种化合物，诸如单体形式的重组蜘蛛丝多肽。离子交换液相色谱法可用于评估溶液中各种微量分子的浓度，包括诸如脂质和糖等杂质。各种分子的其他色谱法和定量方法，诸如质谱法在本领域中已是公认的。
[0136] 根据实施方式，重组蜘蛛丝多肽可以具有基于单体形式的重组蜘蛛丝多肽相对于重组蜘蛛丝多肽粉末的其他组分按重量计的量来计算的纯度。在各种情况下，纯度可以在按重量计50％至按重量计90％的范围内，这取决于重组蜘蛛丝多肽的类型以及用于回收、分离和加工后的重组蜘蛛丝多肽粉末的技术。
[0137] 尺寸排阻色谱法和反相高效液相色谱法均可用于测量全长重组蜘蛛丝多肽，这使得它们成为通过比较加工前后组合物中全长蜘蛛丝多肽的量来确定加工步骤是否降解了重组蜘蛛丝多肽的有用技术。在本发明的各种实施方式中，在加工前后组合物中存在的全长重组蜘蛛丝多肽的量可能会受到最小程度的降解。降解的量可以在按重量计0.001％至按重量计10％，或按重量计0.01％至按重量计6％，例如按重量计小于10％或8％或6％，或按重量计小于5％，按重量计小于3％或按重量计小于1％的范围内。
[0138] 重组丝固体和膜组合物和制备方法
[0139] 根据实施方式，重组蜘蛛丝组合物中重组蜘蛛丝多肽粉末按重量计的合适浓度范围为：按重量计1至90％、按重量计3至80％、按重量计5至70％、按重量计10至60％、按重量计15至50％、按重量计18至45％或者按重量计20至41％。
[0140] 在一些实施方式中，重组蜘蛛丝组合物中增塑剂按重量计的合适浓度范围为：按重量计1至60％、按重量计10至60％、按重量计10至50％、10至40按重量计％、按重量计15至40％、按重量计10至30％或者按重量计15至30％。在一些实施方式中，增塑剂是甘油。在一些实施方式中，增塑剂是三乙醇胺、亚丙基二醇或丙二醇。
[0141] 在将水用作增塑剂的情况下，重组蜘蛛丝组合物中水按重量计的合适重量浓度范围为：按重量计5至80％、按重量计15至70％、按重量计20至60％、按重量计25至50％、按重量计19至43％或者按重量计19至27％。当将水与另一种增塑剂结合使用时，它可以以按重量计5至50％、按重量计15至43％或按重量计19至27％的范围存在。
[0142] 成型体形成后，可以提高成型体中重组蛋白质的结晶度，从而强化成型体。在一些实施方式中，通过X射线晶体学测量的成型体的结晶度指数为2％至90％。在一些其他实施方式中，通过X射线晶体学测量的成型体的结晶度指数为至少3％、至少4％、至少5％、至少6％或至少7％。
[0143] 在一些实施方式中，可以将各种剂添加到重组蜘蛛丝组合物中以改变成型体的特性，例如硬度、弯曲模量和弯曲强度。这些包括聚乙二醇(PEG)、Tween(聚山梨醇酯)、十二烷基硫酸钠、聚乙烯或其任何组合。其他合适的试剂在本领域中是众所周知的。
[0144] 在一些实施方式中，可以添加第二种聚合物以与重组蜘蛛丝组合物形成聚合物共混物或双成分纤维。在这些情况下，包括第二种聚合物可能是有用的，该第二种聚合物的熔融温度使其适合于与重组蜘蛛丝组合物本身一起熔融，而不会降解重组蜘蛛丝多肽的无定形区域。在各种实施方式中，适合与重组蜘蛛丝多肽共混物的聚合物将具有低于200℃、180℃、160℃、140℃、120℃或100℃的熔融温度(Tm)。通常，重组蜘蛛丝多肽的熔融温度度会超过20℃、25℃或50℃。示例性聚合物和熔融温度的非限制性列表包括在下表3中。
[0145]
[0146] 在一些实施方式中，水可以在冷却或成型后调节期间蒸发。在一些实施方式中，基于所述总水量，成型后的失水量可以为按重量计1至50％、按重量计3至40％、按重量计5至30％、按重量计7至20％、按重量计8至18％或按重量计10至15％。通常损失将小于按重量计
15％，在某些情况下小于10％，例如1至10％。蒸发可能是有意的，也可能是由于所应用的处理造成的。蒸发程度可以容易地控制，例如通过选择操作温度、流速和所施加的压力，如本领域所理解的。
[0147] 在一些实施方式中，合适的增塑剂可包括多元醇(例如，甘油)、水、乳酸、甲基过氧化氢、抗坏血酸、1,4‑二羟基苯(1,4‑苯二醇)苯‑1,4‑二醇、磷酸、乙二醇、丙二醇、三乙醇胺、乙酸乙酸酯(acid acetate)、丙烷‑1,3‑二醇或其任意组合。
[0148] 在各种实施方式中，增塑剂的量可以根据重组蜘蛛丝多肽粉末的纯度和相对组成而变化。例如，较高纯度的粉末可能具有较少的杂质，例如可作为增塑剂的低分子量化合物，因此需要添加较高按重量计百分比的增塑剂。
[0149] 在具体实施方式中，增塑剂(例如，甘油和水的组合)与重组蜘蛛丝多肽粉末的各种比例(按重量计)范围可以为按重量计0.5或0.75至350％的增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末、按重量计1或5至300％的增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末、按重量计10至300％的增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末、按重量计30至250％的增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末、按重量计50至
220％的增塑剂:重组蜘蛛丝蛋白、按重量计70至200％的增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末、或按重量计90‑180％增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末。如本文所用，关于按重量计0.5至350％的增塑剂:重组蜘蛛丝多肽粉末对应于0.5:1至350:1的比例。
[0150] 不受理论的限制，在本发明的各种实施方式中，诱导重组蜘蛛丝组合物转变为可流动状态可以用作任何制剂中的预加工步骤，在这种情况下，包括单体形式的重组蜘蛛丝多肽是有益的。更具体地，诱导重组蜘蛛丝熔体组合物可用于希望在加工的后期阶段防止单体重组蜘蛛丝多肽聚集成其结晶聚合物形式或控制重组蜘蛛丝多肽转变为其结晶聚合物形成的应用。在一个具体实施方式中，重组蜘蛛丝熔体组合物可用于在将重组蜘蛛丝多肽与第二聚合物共混之前防止重组蜘蛛丝多肽聚集。在另一个具体实施方式中，重组蜘蛛丝熔体组合物可用于产生化妆品或护肤产品的基质，其中重组蜘蛛丝多肽以其单体形式存在于基质中。在该实施方式中，在基质中具有单体形式的重组蜘蛛丝多肽允许单体在与皮肤接触或通过各种其他化学反应时受控聚集成其结晶聚合物形式。
[0151] 化妆品或护肤产品可以直接施用于皮肤或头发。在一些实施方式中，成型体具有低熔融温度。在各种实施方式中，成型体具有低于体温(约34‑36℃)的熔融温度并且在与皮肤接触时熔化。
[0152] 上述化妆品或护肤产品可包含各种保湿剂、润肤剂、封闭剂、活性剂和化妆品佐剂，这取决于产品的实施方式和所需功效。
[0153] 如本文所用，术语“保湿剂”是指与水分子形成键的吸湿物质。合适的保湿剂包括但不限于甘油、丙二醇、聚乙二醇、戊二醇、银耳提取物、山梨糖醇、二氨腈、乳酸钠、透明质酸、芦荟提取物、α‑羟基酸和吡咯烷酮羧酸盐(NaPCA)。如本文所用，术语“润肤剂”是指通过填充皮肤表面的裂缝为皮肤提供柔软或柔软外观的化合物。合适的润肤剂包括但不限于乳木果油、可可脂、角鲨烯、角鲨烷、辛酸辛酯、芝麻油、葡萄籽油、含油酸的天然油(例如甜杏仁油、摩洛哥坚果油、橄榄油、鳄梨油)、天然含有γ亚油酸的油(例如月见草油、琉璃苣油)、含有亚油酸的天然油(例如红花油、向日葵油)或它们的任何组合。术语“封闭剂”是指在皮肤表面形成屏障以保持水分的化合物。在某些情况下，润肤剂或保湿剂可能是封闭剂。其他合适的封闭剂可包括但不限于蜂蜡、卡努巴蜡、神经酰胺(ceramide)、植物蜡、卵磷脂、尿囊素。不受理论的限制，本文提出的重组蜘蛛丝组合物的成膜能力产生形成保湿屏障的封闭剂，因为重组蜘蛛丝多肽起到吸引水分子的作用并且还起到保湿剂的作用。
[0154] 术语“活性剂”是指在护肤配方或防晒霜中具有已知有益效果的任何化合物。各种活性剂可包括但不限于乙酸(即，维生素C)、α羟基酸、β羟基酸、氧化锌、二氧化钛、视黄醇、烟酰胺、其他重组蛋白(作为全长序列或水解成子序列或“肽”)、铜胜肽、姜黄素类化合物、乙醇酸、对苯二酚、曲酸、L‑抗坏血酸、α硫辛酸、壬二酸、乳酸、阿魏酸、扁桃酸、二甲氨基乙醇(DMAE)、白藜芦醇、含有抗氧化剂的天然提取物(例如，绿茶提取物、松树提取物)、咖啡因、α‑熊果苷、辅酶Q‑10和水杨酸。术语“化妆品佐剂”是指用于制造具有商业所需特性的化妆品的各种其他试剂，包括但不限于表面活性剂、乳化剂、防腐剂和增稠剂。
[0155] 在各种实施方式中，将在成型过程中将重组蜘蛛丝组合物加热到的温度降至最低，以最小化或完全防止重组蜘蛛丝多肽的降解。在具体实施方式中，重组蜘蛛丝熔体将被加热至低于120℃、低于100℃、低于80℃、低于60℃、低于40℃或低于20℃。通常，在成型过程中，熔体的温度范围为10℃至120℃、10℃至100℃、15℃至80℃、15℃至60℃、18℃至40℃或18℃至22℃。
[0156] 在本发明的一些实施方式中，重组蜘蛛丝固体或膜将是基本上均质的，这意味着如通过光学显微镜检查，该材料具有少量或不具有任何夹杂物或沉淀物。在一些实施方式中，光学显微镜可用于测量双折射，其可用作将重组蜘蛛丝排列成三维晶格的代表。双折射是一种材料的光学特性，其折射率取决于光的偏振和传播。具体而言，通过双折射测量的高度轴向顺序可以与高拉伸强度相关联。在一些实施方式中，重组蜘蛛丝固体和膜将具有最小的双折射率。
[0157] 可以使用各种技术测量重组蜘蛛丝多肽的降解量。如上所述，重组蜘蛛丝多肽的降解量可以使用尺寸排阻色谱法测量以测量存在的全长重组蜘蛛丝多肽的量。在各种实施方式中，组合物在形成成型体之后以小于6.0重量％的量降解。在另一个实施方式中，组合物在成型后以小于4.0重量％、小于3.0重量％、小于2.0重量％或小于1.0重量％的量降解(使得降解量可以在按重量计0.001％至按重量计10％、8％、6％、4％、3％、2％或1％，或按重量计0.01％至按重量计6％、4％、3％、2％或1％)。在另一个实施方式中，熔体组合物中的重组蜘蛛丝蛋白基本上未降解。
[0158] 在一些实施方式中，成型体是交联的。例如，在一些实施方式中，在形成成型体期间或之后，将成型体浸泡在过硫酸铵中以促进成型体中蛋白质之间的交联。在一些实施方式中，所述交联是酶交联。在一些实施方式中，所述交联是光化学交联。
[0159] 在一些实施方式中，本文提供了具有所需机械性能的交联重组丝成型体和生产它们的方法。本文提供的交联成型体组合物可以经交联以获得所需的机械性能，例如在某些应用中优选的柔韧性、硬度或强度。在一些实施方式中，本文提供了交联重组丝成型体组合物以形成交联重组丝固体的方法。在一些实施方式中，交联反应包括将成型体暴露于过硫酸盐，例如过硫酸铵。可以施加热量以引发由过硫酸盐催化的交联反应。这种类型的交联反应不会在组合物中留下任何光活性或酶化合物。此外，这种交联反应不需要光活化，因此可以有效地大批量生产，而不需要光到达交联溶液的所有部分。在一些实施方式中，交联发生在容器或模具中，使得获得的重组丝成型体具有特定的形状或形式。
[0160] 在一些实施方式中，成型体通过3D打印形成。因此，在一些实施方式中，成型体通过连续沉积或形成包含处于可流动状态的重组丝和增塑剂的组合物的薄层来形成，以便建立所需的3‑D结构。例如，通过在工件上移动某种类型的印刷头并激活印刷头的元件来产生“印刷”可聚合液体材料，形成每一层，就好像它是一层印刷。因此，在一些实施方式中，成型体是逐层形成的。每一层包含分散组合物，该分散组合物包含流动状态的重组丝和增塑剂，并且分散组合物以与穿过待形成的物体的横截面相同的图案交联或硬化。一层完成后，分布式组合物的水平会在一小段距离内升高，并重复该过程。每个聚合层应该足够稳定以支撑下一层。
[0161] 在另一个实施方式中，根据要形成的物体的横截面形状，将包含重组丝和增塑剂的组合物分布到基材上并聚结。在又一个实施方式中，包含重组丝和增塑剂的组合物以液滴的形式沉积，所述液滴以根据要形成的物体的相关横截面的图案沉积。还有一种方法涉及在升高的温度下分配组合物的液滴，然后在与较冷的工件接触时固化。
[0162] 重组丝固体和膜的再形成
[0163] 在本发明的一些实施方式中，制备重组蜘蛛丝成型体的方法可以另外包括再加工包含重组蜘蛛丝的成型体(例如，由重组蜘蛛丝形成的固体、膜或其他成型制品)。
[0164] 不受理论的限制，在诸如甘油的增塑剂存在下使重组蜘蛛丝多肽经受热和加压将重组蜘蛛丝多肽转化为“开放形式的重组蜘蛛丝多肽”，其中未结晶的和无定形的重组蜘蛛丝多肽片段展开并与增塑剂形成相互作用。由于与增塑剂的相互作用，这种“开放式重组蜘蛛丝多肽”能够成型并形成固体。具体而言，防止开放形式的重组蜘蛛丝多肽形成分子间相互作用以形成不可逆的三维晶格。
[0165] 因为在成型过程中重组蜘蛛丝多肽的降解(如果有的话)最小，在一些实施方式中，通过将成型体转化回可流动的重组蜘蛛丝组合物，然后将其再成型，来对重组蜘蛛丝成型体进行再加工。在各种实施方式中，重组蜘蛛丝成型体可以再成型至少20次、至少10次或至少5次。在这些实施方式中，在多个再成型步骤中看到的退化可能低至10％。在不降解的情况下重新成型的选择允许生产基本上均质的组合物，并且还允许重新利用或重新设计由组合物形成的产品。例如，质量不合格的成型产品可能会被重新成型。报废产品回收也是一种可能。
[0166] 等同物和范围
[0167] 本领域技术人员应当认识到或仅使用常规实验就能够确定根据本文所描述的本发明的具体实施方式的很多等同物。本发明的范围并不旨在限于以上说明书，而是如所附的权利要求书中阐述的那样。
[0168] 在权利要求书中，诸如“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”之类的冠词可以表示一个或更多个，除非有相反的指示或从上下文中明显看出。如果一组成员中的一个、多于一个或全部成员存在于、使用于或以其他方式关联给定的产品或过程，则包含所述组中的一个或更多个成员“或”在所述组中的一个或多个成员之间的权利要求或描述被认为得到满足，除非有相反的指明或另外从上下文明显可见。本发明包括实施方式，在所述实施方式中，所述组中的恰好一个成员存在于、使用于或以其它方式关联给定的产品或过程。本发明包括实施方式，在所述实施方式中，所述组中多于一个或全部成员存在于、使用于或以其它方式关联给定的产品或过程。
[0169] 还应注意，术语“包括”旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当本文使用术语“包括”时，术语“由……组成”因此也被涵盖和公开。
[0170] 在给出范围的地方，包括端点。此外，应理解，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，表示为范围的值可在本发明的不同实施方式中采用所述范围内的任何特定值或子范围。除非上下文另有明确说明，否则本发明的范围的下限为单位的十分之一。
[0171] 所有引用的来源，例如参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本文引用的技术，都通过引用并入本申请，即使在引用中没有明确说明。引述来源与本申请的表述有冲突的，以本申请中的表述为准。
[0172] 章节和表格标题不旨在限制。
[0173] 实施例
[0174] 以下是用于执行本发明的具体实施方式的实施例。提供的实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字的准确性(例如，数量、温度等)，但当然应该允许一些实验误差和偏差。
[0175] 除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中进行充分解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition)；Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,
1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,
Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Easton,Pennsylvania:
Mack Publishing Company,1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 
3rd Ed.(PlenumPress)Vols A and B(1992)。
[0176] 实施例1：重组丝蛋白固体的形成
[0177] β折叠在丝材料的结构完整性中起重要作用。它们构成了丝的结晶片段。通常，当β折叠形成时，需要强离液溶剂来破坏β折叠。β折叠的熔融温度高于其降解点。然而，玻璃化转变温度低于降解温度，并且可以通过使用增塑剂进一步降低。
[0178] 为了制造固体，需要足够的缠结。β‑折叠的熔融温度度太高，但由于大部分蛋白质是无定形的，因此可以为无定形链提供链移动性以允许足够的缠结。加热和增塑剂的应用可以降低热玻璃化转变温度。获得18B固体所需的三个组分是热量、压力和增塑剂。
[0179] 18B多肽序列(SEQ ID NO:1)的重组蜘蛛丝通过多批次大规模发酵生产，回收并干燥成粉末(“18B粉末”)。18B重组丝粉末的生产细节可见于PCT公开号WO2015/042164，“用于合成改进的丝纤维的方法和组合物(Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers)”，其通过引用整体并入本文。使用家用香料研磨机混合重组丝粉末。将各比例的水和增塑剂添加到18B粉末中以产生具有不同比例的蛋白粉与增塑剂的重组蜘蛛丝组合物。所得组合物为按重量计10‑50％的三乙醇胺(TEOA)、亚丙基二醇或丙二醇。然后在130℃下将混合物加压。使用1500至15000psi范围内的压力在模具中压制样品。
[0180] 在按重量计30％的TEOA下，在压制过程中，一些TEOA增塑剂从模具中挤出，如图1所示。这表明如果TEOA可以均匀地分布在整个粉末中，则可以降低TEOA的量。使用压力来压实粉末颗粒。
[0181] 用硬度计测量固体的硬度。硬度计有压入材料的压头。刺入越大，材料越软，测得的硬度值越低。有多种类型的硬度计适用于各种硬度范围。A型硬度计适用于软塑料，如果值超过90，则应使用D型硬度计。它们之间的区别在于压头几何形状和施加的力。由于硬度计D适用于较硬的塑料，因此它具有更锋利的压头和更高的压痕力。用TEOA、丙二醇、亚丙基二醇(1,3丙二醇)压制的固体在用A型测量时的硬度都为100，表明它们的硬度超过了A型硬度计可测量的硬度。TEOA加工过的固体的硬度为76HD，由D型硬度计测量。经D型硬度计测量，亚丙基二醇加工过的固体的硬度为71HD(图2)。作为比较，高密度聚乙烯(HDPE)安全帽具有相似的硬度。由D型硬度计测量，丙二醇固体具有最低的硬度，从55HD开始，并在10秒内降至30。固体可以被加工、切割和钻孔成所需的形状，因为它们的刚度可以防止固体在工具力下变形(图2)。
[0182] 实施例2：重组丝在丝固体中的降解
[0183] 压制膜和固体的SEC结果显示固体样品、膜样品(参见实施例5)和对照18B粉末之间的低分子量和中等分子量相似。这表明由压制引起的退化是最小的或不存在的。
[0184] 表4.压制固体和膜以及对照粉末的SEC数据。N＝2的平均结果和标准偏差。HMWI＝高分子量杂质；IMWI＝中等分子量杂质；LMWI＝低分子量杂质。所有样品均来自同一批次的18B粉末。用30wt％(按重量计的％)的TEOA压制固体，用40wt％的甘油压制膜。
[0185]
[0186] 蛋白质降解数据总结在表5中。在这里，样品在130℃下加热到并增加压制时间。在每个时间点，对固体进行取样并放回模具中，在模具中加热和加压。根据HMWI、18B聚集体和18B单体，以及样品之间的IMWI和LMWI值，多达10分钟内没有明显的降解。从20分钟开始，
18B单体含量下降，而中等(IMWI)和低(LMWI)分子量组分增加，表明20分钟后降解。随着固体被压制的时间更长，它也变得更暗(图3)。
[0187] 表5.对照粉末(SLD33‑P)、溶剂增塑粉末(SLD33‑PH)和增加压制时间的压制固体(SLD33)的SEC数据。所有样品均来自同一批次的18B粉末。用按重量计15％的1,3丙二醇压制固体。
[0188]
[0189]
[0190] 实施例3：18B固体的弯曲表征
[0191] 当通过如本文所述(例如，实施例1)所述的压缩成型烧结时，18B蛋白质粉末已显示出作为有所需的固体特性的稳定蛋白质粉末有前景的能力。亚丙基二醇(TMG或1,3‑丙二醇)被确定为有助于成型的合适增塑剂。为了优化成型工艺，需要进一步表征18B‑TMG固体的机械性能。根据ASTM D790标准，制造具有按重量计15％的TMG固体粉末的数批18B，并对其进行3点弯曲测试。
[0192] 如下所述，提供了一系列加工参数的18B固体的机械性能，包括成型保持时间、冷却速率、成型后调节和平均压制载荷。还发现了对最终固体产品的机械性能有益或有害的加工参数，从而提高了加工效率和能力。
[0193] 材料与方法
[0194] 为了测试重组丝固体的弯曲特性，ASTM D790标准建议跨深(厚度)比尽可能接近16:1，而Zwick建议将跨深比(span‑to‑depth ratio)保持在15:1和17:1之间。对于这个实验，设备的跨度固定在38.1mm，这样最终的试样深度在2.25mm和2.54mm之间。
[0195] 使用25.4mm x 50.8mm(1”x 2”)的压缩模具可得到每最终重量0.66mm的厚度(以克计)。基于观察到成型过程中重量减少约10％，每个试样的预成型重量为3.8g至4.0g，以达到最终样品深度。
[0196] 使用255.16g的18B粉末和45.347g的TMG制备18B/TMG混合物，其使用香料研磨机将其混合五次，产生300.5g的按重量计15.1％TMG/按重量计84.9％的18B的总母料。将它们分成各4.0g的试样，用于在规定的条件下成型并随后测试弯曲特性。
[0197] 在用于测试的63个试样中，平均跨深比为15.72，标准差为0.35，得到变异系数为0.022。根据ASTM D790测试程序文件对Zwick ProLine进行测试配置。关键测试参数为
0.1MPa的预载荷、3mm的起始位置间隔和254mm/min的十字头速度。
[0198] 测试的重组丝固体制备条件是成型时间、冷却速率、成型后调节和成型期间的平均载荷。
[0199] 将成型时间定义为模具在130℃下受压的时间(以分钟为单位)。对成型时间为1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、8分钟、10分钟、15分钟进行了测试。
[0200] 对于成型后调理，成型时间后，经过调节的样品在65％相对湿度(RH)下保持在调节室中至少72小时。在环境实验室条件下将未经调节的试样储存在工作台顶部。
[0201] 平均载荷是试样承受的以公吨为单位的载荷。因为试样尺寸和模具尺寸是恒定的，所以样品组中的每个试样在成型过程中都受到几乎相等的压力。测试了1公吨、2公吨、3公吨、4公吨和5公吨的平均载荷。
[0202] 最后，冷却速率水平被定义为缓慢、中等或快速。从打开模具取出固体试样开始，使用IR温度计以1分钟间隔(缓慢、中等)或10秒间隔(快速)记录固体表面温度来量化每个水平。下面显示的曲线的结果产生了0.92℃/min、2.7℃/min和45.2℃/min的冷却速率分别为缓慢、中等和快速。尽管在图4A‑4C中，具有中等冷却速率的样品与具有缓慢和快速冷却速率的样品相比处于不同的保持时间，但冷却速率与保持时间没有显着差异。测试了如上定义的缓慢、中等和快速冷却速率。
[0203] 下面的表6显示了用于制备每个样品ID的条件。每个样品ID一式三份地进行，共制备63个18B固体样品。
[0204]
[0205] 成型后调节
[0206] 如上所述使用4.0g样品成型18B固体样品并在130℃在2公吨的平均载荷下成型。模塑样品以中等冷却速率冷却，并在成型后暴露或不暴露于65％相对湿度(RH)下至少72小时的调节。样品成型1、2、3、4或5分钟。评估成型后调节效果的条件基于表6中提供的样品1‑
9和11。
[0207] 图5显示了从未经调节的18B固体样品与经过调节的18B固体样品产生的应力‑应变曲线。应力‑应变曲线用于确定18B固体的机械性能，包括断裂伸长率。对样品ID 1、3、5、7和9进行了调节，而未对样品ID 2、4、6、8和11进行调节，如表6和表7所示。
[0208] 调节与未调节的18B固体样品的弯曲数据显示在下表7中。提供了一式三份测量的每个调节样品与未调节样品的弯曲模量(MPa)、最大弯曲强度(MPa)和断裂伸长率(％)的平均值(连同测量的标准偏差(SD))。请注意，20％的伸长率表示没有固体破损，因为20％是最大可测试伸长率。
[0209]
[0210] 图6示出了在65％的RH环境中经过1分钟的保持时间(L)调节72小时和(R)未调节的固体形态。固体具有相当的粒度，但经调节的试样在颗粒之间具有更明显的无定形区域，这可能有助于提高延展性。
[0211] 宏观上，很明显，所有65％RH调节的样品在载荷下比未调节的样品更具延展性。TMG增塑剂中存在的两个羟基基团有助于提高水溶性和吸湿性。如图6所示，成型时间越短，产生的固体具有粉末状形态并包含更多颗粒。
[0212] 基于调节的影响，调节样品的刚度和伸长率之间存在折衷。调节试样产生的试样不是很坚固也不是很硬，也不会断裂。测试设备的安全限制要求测试在最大20％的伸长率处停止，并且在达到该伸长率的情况下，没有任何经过调节的样品断裂。未经调节的样品也有更多的可变性。对于未交联的18B固体，调节效果显着，表明它们易受水影响。因此，将产生经交联的18B固体以降低18B固体对水的响应。经交联的18B固体的强度、刚度和伸长率的机械特性也将最大化。
[0213] 调节过的样品没有断裂，因为它们的伸长率超过了Zwick ProLine的安全措施。出于这个原因，无法评估经调节的样品断裂表面。未经调节的样品断裂表面的宏观(肉眼观察)断裂后观察表明，几乎所有的弯曲断裂都可以表征为高度脆性，并且延展性行为取决于加工而略有不同。起始点通常在试样宽度中心的0.5cm范围内。三个表面的SEM成像证实了这些结论。
[0214] 成型后冷却速率
[0215] 如上所述使用4.0g的样品成型18B固体样品并在130℃在2公吨的平均载荷下成型达5分钟。成型样品以缓慢、中等或快速的冷却速率冷却。测量冷却速率的方法以及缓慢、中等和快速冷却的定量基础在上面的材料和方法中进行了说明。评估冷却速率影响的条件基于表6中提供的样品10‑12。
[0216] 图7显示了从样品10‑12产生的应力应变曲线，以评估冷却速率对18B固体机械性能的影响。10、11和12系列分别对应于缓慢、中等和快速冷却速率。
[0217] 18B固体样品在缓慢、中等和快速冷却速率下的弯曲数据如下表8所示。提供了一式三份测量的每个调节样品与未调节样品的弯曲模量(MPa)、最大弯曲强度(MPa)和断裂伸长率(％)的平均值(连同测量的标准偏差(SD))。
[0218]
[0219] 图8显示了暴露于(A)缓慢冷却(B)中等冷却和(C)快速冷却的18B固体的形态。
[0220] 在结构聚合物中，增加的冷却速率会产生更坚固、更硬且伸长率相对相似的样品。更快的冷却导致更小的晶体和更低的结晶度(更多的无定形区域)，因此人们会期望更低的刚性。然而，目前的结果与该假设相冲突。平均而言，缓慢冷却的弯曲模量和最大强度分别为262.72MPa和5.29MPa。平均而言，中等冷却样品的弯曲模量和最大强度分别为309.54MPa和6.11MPa。平均而言，快速冷却样品的弯曲模量和最大强度分别为292.35MPa和6.12MPa。
随着冷却速率的增加，变异性降低。
[0221] 成型压力
[0222] 18B固体样品如上所述使用4.0g的样品成型并在130℃下成型达5分钟，然后以中等冷却速率冷却。在1公吨、2公吨、3公吨、4公吨或5公吨的平均载荷下成型样品。评估成型过程中平均载荷压力影响的条件基于表6中提供的样品13‑17。
[0223] 图9显示了从样品13‑17产生的应力应变曲线，以评估成型压力(平均载荷)对18B固体机械性能的影响。13、14、15、16和17系列分别对应1、2、3、4和5公吨。
[0224] 不同平均载荷下18B固体样品的弯曲数据如下表9所示。提供了一式三份测量的每个调节样品与未调节样品的弯曲模量(MPa)、最大弯曲强度(MPa)和断裂伸长率(％)的平均值(连同测量的标准偏差(SD))。
[0225]
[0226] 样品ID#13‑17展示了不同压制载荷对压制5分钟并以中等速度冷却的样品的影响。增加压制载荷的趋势是弯曲模量增加，而强度和伸长率的趋势由于可变性无法确定。随着设定载荷的增加，在平均载荷为1公吨(平均为5.68MPa)时强度较大，然后在平均载荷为2‑4公吨时降低，然后在平均载荷为5公吨时增加到最大5.85MPa。尽管如此，由于可变性，压制载荷对强度的影响尚无定论。根据平均载荷，伸长率在2.05％到4.38％之间，没有任何显着的、明显的趋势。为了使重组丝固体材料的刚度最大化，确定平均载荷为3‑5公吨是优选的。
[0227] 分散的蛋白质颗粒显示为黑点，但根据具体情况，表面可能是多孔空隙，如图10所示。颗粒倾向于优先将自己定位在这些空隙中。增加压制载荷似乎减少了分散颗粒的数量，但超过3公吨，益处会减少(如图11所示)。具体来说，图11显示了不同平均压制载荷产生的固体图像。有随着平均载荷从(A)1公吨增加到(B)3公吨到(C)5公吨，分散的蛋白质颗粒的量减少。
[0228] 成型时间
[0229] 如上所述使用4.0g样品成型18B固体样品并在130℃在2公吨的平均载荷下成型。将样品成型1、2、3、4、5、6、8、10或15分钟。成型样品以中等冷却速率冷却并且不进行调节。
评估成型后调节效果的条件基于表6和表10中提供的样品2、4、6、8、14、18、19、20和21。
[0230] 图12显示了由样品2、4、6、8、14、18、19、20和21产生的应力‑应变曲线，以评估成型时间对18B固体机械性能的影响。2、4、6、8、14、18、19、20和21系列分别对应于1、2、3、4、5、6、8、10和15分钟的成型时间。
[0231] 成型不同时间长度的18B固体样品的弯曲数据如下表10所示。提供了一式三份测量的每个调节样品与未调节样品的弯曲模量(MPa)、最大弯曲强度(MPa)和断裂伸长率(％)的平均值(连同测量的标准偏差(SD))。
[0232]
[0233] 发现增加成型保持时间仅表明固体刚度增加。随着模具时间的变化，似乎对固体的弯曲强度和断裂伸长率没有任何统计学上的显着影响。图13、图14和图15分别支持了平均弯曲模量、平均弯曲强度和平均断裂伸长率。具体而言，图13显示了保持时间的平均弯曲模量(MPa)。随着保持时间的增加，平均弯曲模量增加。误差线显示样品标准偏差。图14显示了保持时间的平均弯曲强度(MPa)。在所有测试的成型时间中，最大弯曲强度似乎没有统计学上的显着差异。图15显示了保持时间的平均断裂伸长率(％)。断裂伸长率和保持时间之间似乎没有任何显着的关系。误差线是样品标准偏差。
[0234] 弯曲模量通常随着保持时间的增加而增加。请注意，对于抗弯强度，任何给定保持时间的标称值都在其他模具时间的误差范围内。因此，可以得出结论，基于成型时间的强度似乎没有显着差异。同样，保持时间和断裂伸长率之间似乎没有任何显着的关系。由于时间限制，将测试限制在每个样品组3个试样可以部分解释相对较大的误差和可变性。根据这些结果，建议将未来的加工集中在5到8分钟左右的成型时间，平均载荷为3到5公吨以及中等冷却速度。虽然较长的成型时间平均会产生更硬的固体，但增加成型时间过长会导致产量/生产率下降。或者，较短的成型时间会导致粉末状固体在美学上不是特别令人愉悦。
[0235] 断裂前试样表面的光学显微镜旨在揭示四个因素中的每一个对固体形态的影响，并帮助理解每个因素在固体加工中的作用。仅将成型时间从1分钟更改为15分钟的结果如图16所示。具体而言，图16显示了在保持相同平均载荷和冷却速率的情况下，经受各种保持时间的未处理固体的形态：(A)1分钟(B)3分钟(C)5分钟(D)8分钟(E)10分钟(F)15分钟。随着成型时间从1分钟增加到5分钟，每增加一分钟的成型时间，颗粒聚集体就会大大减少。
[0236] 这一结论得到了肉眼检查的支持，如图17所示，其中较长的模具时间导致更均匀、半透明的固体。具体而言，图17显示了在1分钟保持时间和5分钟保持时间之间对(A)固体黑色表面(B,C)强光的肉眼检查。具有较长保持时间的固体产生较少明显的粉末团块并且更半透明。5‑6分钟后明显缺乏显着差异，尽管即使在15分钟时仍存在颗粒聚集体。建议的成型时间为5分钟，厚度不超过3mm，以避免蛋白质长时间暴露在高温下，并尽量最小化明显的颗粒聚集体。
[0237] 图18显示了在不同的成型时间用Benchtop SEM成像的重组丝成型体的断裂后表面。(A)1分钟保持时间的变暗以实现更大的对比度(B)5分钟成型时间(C)15分钟成型时间。5分钟的保持时间显示出最大的延展性和脆性组合。
[0238] 结论
[0239] 具有最大刚度的试样是较高的成型时间和增加的压制载荷荷的结果。建议探索这些样品作为硬质固体的最佳前进路径。最有希望的试样来自样品ID#11、12和17。由于样品间的高度差异，无法可靠地辨别基于成型时间的强度和伸长率趋势。
[0240] 推荐的成型时间在5到8分钟之间。虽然较长的成型时间平均会产生更硬的固体，但增加成型时间过长会导致产量/生产率下降并导致蛋白质降解。或者，低于5分钟的较短成型时间会导致粉末状固体在美学上不是特别令人愉悦。
[0241] 快速、中等和缓慢冷却之间的模量、最大强度和断裂伸长率似乎没有统计学上的显着差异。因为中等冷却和缓慢冷却实施起来最方便，所以推荐使用。
[0242] 具有最大断裂伸长率的试样在65％相对湿度(RH)中至少调节72小时，其断裂伸长率百分比远远超出Zwick ProLine设备的能力。
[0243] 实施例4：交联重组丝固体
[0244] 18B固体使用过硫酸铵进行交联。过硫酸铵溶于水，但不溶于TEOA或IPA。水对制造固体有负面影响，并且固体不能长时间留在水中，因为它会膨胀和分解。然而，可以将过硫酸铵溶解在水中并将其与另一种溶剂混合。
[0245] 尝试了两种方法来使用过硫酸铵来交联固体。在第一种方法中，将79.7mg的过硫酸铵(APS)添加到100.4mg的水中并使用涡旋混合器溶解。将溶液添加到7.79g的TEOA中并使用涡旋混合器混合。这样得到在99/1TEOA/水溶液中的50mM的过硫酸铵溶液。
[0246] 将该溶液分散在9.518g的18B中，得到按重量计55％的18B分散体。将混合物放入模具中并在130‑135℃下压制。将固体留在烘箱中固化15小时，然后放入水中。固体膨胀并开始在水中崩解，表明没有发生交联。
[0247] 在另一种交联方法中，将18B压制固体浸入过硫酸铵(APS)溶液中。将684mg的APS溶解在1.3mL的DI水中。由于固体在纯水中过度膨胀并崩解，因此将IPA添加到溶液中。添加11.45mL的IPA会导致APS从溶液中析出。再加入3.3mL的水后，盐溶解回溶液中，得到71/
29IPA/水混合物中的187mM的APS溶液。以重量百分比计，过硫酸铵为5wt％，水为32wt％，水为63wt％。
[0248] TEOA压制样品在交联溶液中浸泡1小时，然后在80℃下保存3小时。所得固体是防水的，即使在水暴露1天后也不会在水中崩解(图19)。
[0249] 对甘油压制的膜也进行了交联。将膜浸泡在APS/IPA/水溶液中10和60分钟并固化过夜。浸泡时间较长的膜更不透明，尤其是在润湿时。在烘箱中固化后，干燥的膜坚硬且易碎(图20A)。在水中浸泡不到一小时后，水在结构中扩散，导致橡胶状行为(图20B)。
[0250] 除了耐水性之外，交联还解决了固体材料的另一个问题。由于增塑剂都是吸湿性的，固体会吸水并失去尺寸稳定性。保持在高湿度水平下的固体压制样品变得柔软和有韧性，类似于甘油压制的膜。交联有助于保持材料的结构完整性。用10wt％丙二醇在130℃下压制的固体使用两种化学品戊二醛和过硫酸铵进行交联。
[0251] 戊二醛化学品由10wt％的戊二醛、10wt％的水、1.5wt％的六水合氯化铝和78.5wt％的异丙醇组成。将固体在交联溶液中浸泡12小时，然后放入125℃的热烘箱中5分钟来固化。
[0252] 过硫酸铵化学品由5wt％的过硫酸铵、25wt％的水和73wt％的异丙醇组成。将固体置于化学中1小时并在60℃下放置3小时来固化。
[0253] 在与任一化学品交联后，固体变得防水并在浸入水中时保持其形状(图21)。
[0254] 实施例5：由重组丝蛋白形成膜
[0255] 压制膜
[0256] 溶剂化的18B粉末在按重量计30‑50％甘油中作为增塑剂也分散在表面上(图22)，并在两个平行板之间用甘油压制。用甘油压制的膜很容易弯曲并且可以贴合表面，而其他溶剂则形成坚硬而脆的膜。悬垂性随着膜厚度的减小而增加。这些柔性膜是光学透明的(图23)。可以使用激光切割机或模具切割这些膜(图24)。
[0257] 作为对照，在无任何溶剂的情况下，在130℃下压制18B，得到脆性膜白色膜(图25)，其中粉末被简单地压平并压实成膜。
[0258] 膜挤出物
[0259] 溶剂化的18B被挤出为18B膜挤出物。在压制以形成实施例1和2中所述的18B固体/膜期间，涂料在齐平表面之间流动，称为溢料，并形成薄的柔性膜(图26)。因此，通过挤出进行成膜。
[0260] 实施例6：重组丝固体的再成型
[0261] 将如实施例1中所述通过用1,3丙二醇压制制备的成型18B固体再加工并在130℃压制以形成膜。再加工的膜的照片如图27所示。具体来说，左边是用1,3丙二醇压制制备的原始18B固体，右边是再加工的膜。该结果表明本文所述的重组丝固体可以使用本文所述的方法再加工以形成不同的成型体形状。
[0262] 其他实施方式
[0263] 应当理解，已经使用的词语是描述性而不是限制性词语，并且可以在所附权利要求书的范围内进行改变而不脱离本发明在更广泛方面的真实范围和精神。
[0264] 尽管已经相对于几个所描述实施方式以一定长度和一定特定性描述了本发明，但是本公开并不旨在应当限于任何此类细节或实施方式或者任何特定实施方式，而是应当参考所附权利要求书进行解释，以便根据现有技术提供对这种权利要求书的尽可能广泛的解释并且因此有效地涵盖本发明的预期范围。
[0265] 本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献都通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。此外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的并且并不意欲是限制性的。

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