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病毒的细胞许可因子及其用途

阅读：811发布：2021-02-24

IPRDB可以提供病毒的细胞许可因子及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了与产生许可病毒(尤其是猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒)生长的宿主细胞有关的方法和组合物。，下面是病毒的细胞许可因子及其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.促进从哺乳动物细胞的培养物产生猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）的方法，包括如下步骤：(a)提供以编码具有跨膜结构域的哺乳动物CD163多肽的外源多核苷酸转染的重组哺乳动物细胞，使得所述细胞中CD163多肽表达增加；

(b)将所述细胞的培养物与PRRSV病毒在允许所述细胞感染和所述病毒生长的条件下接触；和(c)从所述培养物回收病毒；

其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述细胞以前是PRRSV许可型的，现在变得对PRRSV更许可。

3.权利要求1的方法，其中所述细胞选自婴儿仓鼠肾细胞(BHK21)、猪肾细胞、猫肾细胞和猪睾丸细胞。

4.权利要求1的方法，其中PRRSV是欧洲基因型的。

5.权利要求1的方法，其中PRRSV是北美基因型的。

6.权利要求1的方法，进一步包括从回收的病毒产生疫苗的步骤。

7.权利要求6的方法，其中疫苗包含灭活的病毒。

8.权利要求6的方法，其中疫苗包含减毒活病毒。

9.权利要求1的方法，其中以外源多核苷酸转染是通过电穿孔来实现的。

说明书全文

病毒的细胞许可因子及其用途

[0001] 本申请是申请日为2005年4月5日、申请号为200580020749.1、发明名称为“病毒的细胞许可因子及其用途”的发明专利申请的分案申请。发明领域

[0002] 本发明提供了与产生许可Asfarviridae和动脉炎病毒科(Arteriviridae)病毒生长的宿主细胞有关的方法和组合物。

[0003] 发明背景

[0004] Asfarviridae

[0005] Asfarviridae是一种十二面体包膜病毒科，其基因组由长约150000-190000个核苷酸的线性双链DNA的单个分子组成。该科的名称由非洲猪瘟和相关病毒(African Swine Fever And Releted Viruses)派生而来。非洲猪瘟病毒(ASFV)是Asfivirus属的模式种并且是该科的唯一成员。近来，猪CD163多肽已被暗示推测为非洲猪瘟病毒(ASFV)的细胞受体(Sanchez-Torres et al.，2003)

[0006] 动脉炎病毒科

[0007] 动脉炎病毒科的病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶升高病毒(LDV)和猿出血热病毒(SHFV)。具有最大经济学重要性的动脉炎病毒是猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)。

[0008] PRRSV

[0009] 猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)是猪经济学上最重要的疾病之一。20世纪80年代后期，该综合征几乎同时在北美和西欧出现，并且已自此在欧洲、亚洲和美洲的主要猪生产国蔓延变为地方病。PRRS的病源性因子是已被命名为PRRS病毒或PRRSV的病毒。对于欧洲和北美PRRS，该疾病特征为母猪和小母猪繁殖失败(新近术语流产、死产和干尸)、在幼猪当中高死亡率和所有年龄的猪中的呼吸道疾病。该疾病已是近来综述的主题(Mengeling and Lager，2000；Murtaugh et al.，2002；Nodelijk，2002；Plagemann，2003)。

[0010] 在猪中，PRRSV感染限于单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞亚型。完全分化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞是病毒复制的主要靶细胞(Duan et al.，1997a；Duan et al.，1997b)。PAM细胞的无限增殖化是技术上的挑战，而且当成功时，产生不许可PRRS病毒生长的细胞系(Weingartl et al.，2002)。PRRS病毒粒体被巨噬细胞特异性结合并通过内吞作用内在化在网格蛋白包被的凹陷中。从内吞囊泡释放需要酸性pH(Nauwynck et al.，1999)。
病毒粒体的最初结合由病毒基质蛋白与硫酸肝素粘多糖的相互作用来介导(Delputte et al.，2002)。210或220kDa膜糖蛋白可以促进内在化，因为PAM细胞与这些多肽的单克隆抗体的孵育阻断感染PRRS病毒(Duan et al.，1998；Wissink et al.，2003)。210kDa糖蛋白近来被鉴定为唾液酸粘附素-唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素的siglec家族的成员(Pensaert etal.，2003)。用猪唾液酸粘附素转染非许可PK-15(猪肾)细胞系赋予内在化PRRSV颗粒的能力，但是在脱壳阶段保持明显的阻断，因为病毒粒体进入细胞囊泡，但是不经历核壳分解和囊泡膜融合。病毒基因不表达，而且转染的PK-15细胞不为PRRS病毒提供许可(Vanderheijden et al.，2003)。据我们所知，用唾液酸粘附素转染并未显示足以将任何PRRSV非许可型细胞系转换为PRRSV许可表型。

[0011] 除单核细胞/巨噬细胞谱系的主要猪细胞之外，已知许可PRRSV在细胞培养中生长的唯一其它细胞类型是无限增殖化的猴肾细胞系MA-104(Chladek et al.，1998)及其衍生物如MARC-145(Kim et al.，1993)和CL-2621。不知道为什么这一个特殊细胞系是许可型，而其它哺乳动物细胞系不是。PRRS病毒特异性结合许多不同的细胞类型，但是不启动感染(Kreutz，1998；Therrien et al.，2000)。在MARC-145细胞中，病毒通过内吞作用内在化和随后在低pH囊泡中脱壳似乎模拟PAM细胞中的相似事件(Kreutz and Ackermann，1996)。然而，与猪唾液酸粘附素结合的许多单克隆抗体没能在MARC-145细胞表面上检测到同源蛋白(Duan et al.，1998；Wissink et al.，2003)，提示MARC-145细胞可能使用相同蛋白家族的不同成员或完全不同的受体。

[0012] 当前的PRRSV疫苗在猿细胞系繁殖，这是潜在危险的活动。使用猿细胞系制备疫苗有可能将有重大意义的灵长类病毒引入为异种移植目的设计的猪系。因为猪正日益被研究作为人的异种移植器官的来源，灵长类细胞系引入猪群体可能最终给接受异种移植器官的人造成风险。因此，将谨慎在猪疫苗制剂中避免使用猿细胞系。因此鉴定或产生能够支持PRRSV复制的非猿细胞或细胞系将合乎需要。为了这个目的，有必要鉴定可能负责赋予如某些猿细胞系以及PAM细胞中所见的PRRSV复制许可的基因产物。一旦鉴定了这种基因产物，非许可型细胞通过用必需基因转染它们有可能改变成许可型，由此提供更广阔的疫苗生产系。

[0013] 一个实验室已经报道了来自MARC-145细胞的tetraspanin蛋白CD151，当转染到非许可性BHK-21细胞时，赋予PRRS病毒许可性(Kapil and Shanmukhappa，2003；
Shanmukhappa and Kapil，2001)。这个观察结果还有待在独立实验室证实。

[0014] 我们这里描述了不相关的多肽，其在转染至非许可型细胞时，赋予PRRS病毒许可性。

[0015] 引用的参考文献

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[0043] 发明概述

[0044] 本发明包括促进病毒感染一个或多个细胞的方法，该病毒选自动脉炎病毒科(Arteriviridae)和Asfarviridae，该方法包括引导所述细胞内CD 163多肽表达增加的步骤。在优选实施方案中，CD163是膜结合的。在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。

[0045] CD163多肽表达增加可以通过诸如引入编码CD163多肽的外源核酸的方法完成，这种方法包括但不限于转染、电穿孔和与包含编码CD163多肽的多核苷酸的多核苷酸的载体融合。表达增加还可以通过化学处理诱导内源CD163表达来完成。

[0046] 该方法可以致使以前非PRRSV许可型细胞许可PRRS。该方法还可以包括致使以前不表达CD163多肽的一个或多个细胞变为被诱导表达CD163多肽的细胞。

[0047] 在优选实施方案中，该细胞是动物细胞。它们可以是脊椎动物或无脊椎动物细胞。该细胞可以是哺乳动物的。该细胞或细胞系可以是昆虫细胞系。该细胞可以是BHK21细胞。
该细胞可以来源于猪肾细胞。该细胞或细胞系可以来源于猫肾细胞。该细胞或细胞系可以是但不限于BHK-21、NLST-1、NLFK-1、Vero或RL细胞。PRRSV可以是欧洲或北美基因型。

[0048] 如上所述，CD163多肽的表达增加可以通过包括但不限于以下的方法来完成：转染、电穿孔和与包含编码CD163多肽的多核苷酸的多核苷酸的载体融合。包括任何CD163多肽。优选含有跨膜区的那些多肽。示例的CD163多肽选自下列多核苷酸。

[0049] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：2具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0050] 一个这种多核苷酸包含编码经至多20个保守氨基酸置换而与SEQID NO：2不同的多肽的多核苷酸。

[0051] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：2不同的多肽的多核苷酸。

[0052] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸。

[0053] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：1所述序列的多核苷酸。

[0054] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：14所述多肽具有至少99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0055] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：14不同的多肽的多核苷酸。

[0056] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：14不同的多肽的多核苷酸。

[0057] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：14的多肽的多核苷酸。

[0058] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：13所述序列的多核苷酸。

[0059] 一个这种多核苷酸包含编码经至多2个保守氨基酸置换而与SEQID NO：24不同的多肽的多核苷酸。

[0060] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：24的多肽的多核苷酸。

[0061] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：23所述序列的多核苷酸。

[0062] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0063] 一个这种多核苷酸包含编码经至多20个保守氨基酸置换而与SEQID NO：27不同的多肽的多核苷酸。

[0064] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：27不同的多肽的多核苷酸。

[0065] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：27的多肽的多核苷酸。

[0066] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：26所述序列的多核苷酸。

[0067] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：32所述多肽具有至少98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0068] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：32不同的多肽的多核苷酸。

[0069] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：32不同的多肽的多核苷酸。

[0070] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：32的多肽的多核苷酸。

[0071] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：31所述序列的多核苷酸。

[0072] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0073] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：34不同的多肽的多核苷酸。

[0074] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：34不同的多肽的多核苷酸。

[0075] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：34的多肽的多核苷酸。

[0076] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：33所述序列的多核苷酸。

[0077] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0078] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：36不同的多肽的多核苷酸。

[0079] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：36不同的多肽的多核苷酸。

[0080] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：36的多肽的多核苷酸。

[0081] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：35所述序列的多核苷酸。

[0082] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：42所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0083] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：42不同的多肽的多核苷酸。

[0084] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：42不同的多肽的多核苷酸。

[0085] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：42的多肽的多核苷酸。

[0086] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：41所述序列的多核苷酸。

[0087] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：44所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0088] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：44不同的多肽的多核苷酸。

[0089] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：44不同的多肽的多核苷酸。

[0090] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：44的多肽的多核苷酸。

[0091] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：43所述序列的多核苷酸。

[0092] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：46所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0093] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：46不同的多肽的多核苷酸。

[0094] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：46不同的多肽的多核苷酸。

[0095] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：46的多肽的多核苷酸。

[0096] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：45所述序列的多核苷酸。

[0097] 一个这种多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：48所述多肽具有至少90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的多肽的多核苷酸。

[0098] 一个这种多核苷酸包含编码经至多15个保守氨基酸置换而与SEQID NO：48不同的多肽的多核苷酸。

[0099] 一个这种多核苷酸包含编码经至多10个保守氨基酸置换而与SEQID NO：48不同的多肽的多核苷酸。

[0100] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：48的多肽的多核苷酸。

[0101] 一个这种多核苷酸包含具有SEQ ID NO：47所述序列的多核苷酸。

[0102] 如上所述促进感染的方法可以进一步包括制备病毒培养物的步骤。

[0103] 本发明进一步包含通过如上所述方法分离的培养物。

[0104] 如上所述的任何方法可以进一步包括制备PRRS或其它病毒疫苗的步骤。该疫苗可以是灭活的或减毒活疫苗。

[0105] 本发明还包括细胞或细胞系，其中一个或多个细胞被选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的能力通过引导所述细胞内CD163多肽表达增加而被改变。

[0106] 在优选实施方案中，CD163多肽包含跨膜区。在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。

[0107] 本发明的细胞或细胞系可能以前是PRRSV非许可型并通过引导所述细胞或细胞系内CD163多肽表达增加致使变为PRRSV许可型细胞或细胞系。

[0108] 本发明的细胞或细胞系包括不表达CD163多肽并且被诱导表达CD163多肽的细胞或细胞系。

[0109] 在优选实施方案中，该细胞是动物细胞。它们可以是脊椎动物或无脊椎动物细胞。该细胞可以是哺乳动物的。该细胞或细胞系可以是昆虫细胞或细胞系。该细胞可以是BHK21细胞。该细胞可以来源于猪肾细胞。该细胞或细胞系可以来源于猫肾细胞。该细胞可以是但不限于BHK-21、NLST-1、NLFK-1、Vero或RL细胞。PRRSV可以是北美或欧洲的。

[0110] 本发明包括测定试验细胞或细胞系允许选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括：

[0111] a)提供含有来自试验细胞或细胞系的核酸的样品；

[0112] b)测定所述样品中编码CD163多肽的多核苷酸或其互补链的量；

[0113] 其中编码CD163多肽的多核苷酸相对于来源于已知不支持所述病毒生长的对照细胞或细胞系的对照样品增加的量表明试验细胞或细胞系支持所述病毒复制的倾向。

[0114] 在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。

[0115] 编码CD163多肽的多核苷酸的量可以通过杂交测定。

[0116] 编码CD163多肽的多核苷酸的量可以通过PCR测定。

[0117] 本发明还包括测定试验细胞或细胞系允许选自动脉炎病毒科和Asfarvifidae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括：

[0118] (a)提供含有来自试验细胞或细胞系的多肽的样品；

[0119] (b)测定所述样品中CD163多肽的量；

[0120] 其中CD163多肽相对于来源于已知不支持所述病毒生长的对照细胞或细胞系的对照样品增加的量表明试验细胞或细胞系支持所述病毒复制的倾向。

[0121] 在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。

[0122] 在一个实施方案中，通过使CD163多肽在CD163多肽的特异性抗体结合CD163多肽的条件下接触该抗体完成测定。

[0123] 本发明包括测定猪被选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括

[0124] a)提供含有来自待试验猪的核酸的样品；

[0125] b)测定所述样品中编码CD163多肽的多核苷酸或其互补链的量；

[0126] 其中编码CD163多肽的多核苷酸相对于来源于已知对所述病毒感染有抗性的猪的对照样品增加的量表明待试验猪被所述病毒感染的倾向。

[0127] 在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。

[0128] 在一个实施方案中，通过杂交完成该测定。在另一个实施方案中，通过PCR完成该测定。

[0129] 本发明还包括测定猪被选自动脉炎病毒科和Asfarviridae的病毒感染的倾向的方法，该方法包括

[0130] (a)提供含有来自待试验猪的多肽的样品；

[0131] (b)测定所述样品中CD163多肽的量；

[0132] 其中CD163多肽相对于来源于已知对所述病毒感染有抗性的猪的对照样品增加的量表明待试验猪被所述病毒感染的倾向。

[0133] 在一个实施方案中，该病毒选自动脉炎病毒科。在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。在另一个实施方案中，所述病毒是马动脉炎病毒(EAV)。在又一个实施方案中，所述病毒是非洲猪瘟病毒(ASFV)。

[0134] 在一个实施方案中，通过使CD163多肽在CD163多肽的特异性抗体结合CD163多肽的条件下接触该抗体完成测定。

[0135] 本发明还包括分离的多肽，其中该多肽选自如下所述的多肽。

[0136] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：2具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。

[0137] 一个这种多肽是经至多20个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：2不同的多肽。

[0138] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：2不同的多肽。

[0139] 一个这种多肽包含SEQ ID NO：2。

[0140] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：14所述多肽具有至少99％同一性的分离的多肽。

[0141] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：14不同的多肽。

[0142] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：14不同的多肽。

[0143] 一个这种多肽包含SEQ ID NO：14。

[0144] 因此本发明还包括经至多2个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：24不同的分离的多肽。

[0145] 一个这种多肽包含SEQ ID NO：24。

[0146] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。

[0147] 一个这种多肽是经至多20个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：27不同的多肽。

[0148] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：27不同的多肽。

[0149] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：27的多肽。

[0150] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：32所述多肽具有至少98％、99％同一性的分离的多肽。

[0151] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：32不同的多肽。

[0152] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：32不同的多肽。

[0153] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：32的多肽。

[0154] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。

[0155] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：34不同的多肽。

[0156] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：34不同的多肽。

[0157] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：34的多肽。

[0158] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。

[0159] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：36不同的多肽。

[0160] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：36不同的多肽。

[0161] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：36的多肽。

[0162] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：38所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。

[0163] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：38不同的多肽。

[0164] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：38不同的多肽。

[0165] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：40的多肽。

[0166] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：40所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的分离的多肽。

[0167] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：40不同的多肽。

[0168] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：40不同的多肽。

[0169] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：40的多肽。

[0170] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：42所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。

[0171] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：42不同的多肽。

[0172] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：42不同的多肽。

[0173] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：42的多肽。

[0174] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：44所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。

[0175] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：44不同的多肽。

[0176] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：44不同的多肽。

[0177] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：44的多肽。

[0178] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：46所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。

[0179] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：46不同的多肽。

[0180] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：46不同的多肽。

[0181] 一个这种多肽是包含SEQ ID NO：46的多肽。

[0182] 因此本发明还包括与SEQ ID NO：48所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的分离的多肽。

[0183] 一个这种多肽是经至多15个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：48不同的多肽。

[0184] 一个这种多肽是经至多10个保守氨基酸置换而与SEQ ID NO：48不同的多肽。

[0185] 一个这种多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO：48的多肽的多核苷酸。

[0186] 本发明还包括分离的CD163多核苷酸，其中所述多核苷酸选自以下列举的多核苷酸。

[0187] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0188] (a)SEQ ID NOs：1或5所述的多核苷酸序列，

[0189] (b)编码与SEQ ID NO：2所述多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸，

[0190] (c)编码SEQ ID：2的多肽的多核苷酸，

[0191] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0192] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0193] (a)SEQ ID NOs：12或13所述的多核苷酸序列

[0194] (b)编码与SEQ ID NO：14所述多肽具有至少99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0195] (c)编码SEQ ID：14的多肽的多核苷酸

[0196] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0197] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0198] (a)SEQ ID NOs：22或23所述的多核苷酸序列

[0199] (b)编码SEQ ID：24的多肽的多核苷酸

[0200] (c)与(a)或(b)任何一个互补的多核苷酸。

[0201] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0202] (a)SEQ ID NOs：25或26所述的多核苷酸序列

[0203] (b)编码与SEQ ID NO：27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0204] (c)编码SEQ ID：27的多肽的多核苷酸

[0205] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0206] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0207] (a)SEQ ID NOs：30或31所述的多核苷酸序列

[0208] (b)编码与SEQ ID NO：32所述多肽具有至少98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0209] (c)编码SEQ ID：32的多肽的多核苷酸

[0210] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0211] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0212] (a)SEQ ID NO s：33所述的多核苷酸序列

[0213] (b)编码与SEQ ID NO：34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0214] (c)编码SEQ ID：34的多肽的多核苷酸

[0215] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0216] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0217] (a)SEQ ID NOs：35所述的多核苷酸序列

[0218] (b)编码与SEQ ID NO：36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0219] (c)编码SEQ ID：36的多肽的多核苷酸

[0220] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0221] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0222] (a)SEQ ID NOs：37所述的多核苷酸序列

[0223] (b)编码与SEQ ID NO：38所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0224] (c)编码SEQ ID：38的多肽的多核苷酸

[0225] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0226] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0227] (a)SEQ ID NOs：39所述的多核苷酸序列

[0228] (b)编码与SEQ ID NO：40所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0229] (c)编码SEQ ID：40的多肽的多核苷酸

[0230] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0231] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0232] (a)SEQ ID NOs：41所述的多核苷酸序列

[0233] (b)编码与SEQ ID NO：42所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0234] (c)编码SEQ ID：42的多肽的多核苷酸

[0235] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0236] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0237] (a)SEQ ID NO s：43所述的多核苷酸序列

[0238] (b)编码与SEQ ID NO：44所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0239] (c)编码SEQ ID：44的多肽的多核苷酸

[0240] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0241] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0242] (a)SEQ ID NOs：45所述的多核苷酸序列

[0243] (b)编码与SEQ ID NO：46所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0244] (c)编码SEQ ID：46的多肽的多核苷酸

[0245] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0246] 因此本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0247] (a)SEQ ID NOs：47所述的多核苷酸序列

[0248] (b)编码与SEQ ID NO：48所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和或相似性的多肽的多核苷酸

[0249] (c)编码SEQ ID：49的多肽的多核苷酸

[0250] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0251] 因此本发明还包括跨膜区被缺失的CD163多肽。

[0252] 因此本发明还包括编码跨膜区被缺失的CD163多肽的多核苷酸。

[0253] 除上文之外，本发明在另外的方面包括以任何方式比上面具体提及的变型的范围窄的本发明的全部实施方案。

[0254] 序列表简述

[0255] SEQ ID NO：1-编码猪susCD163v1的cDNA序列

[0256] SEQ ID NO：2--预测的猪susCD163v1的氨基酸序列

[0257] SEQ ID NO：3--cDNA序列，Genbank登录号AJ311716

[0258] SEQ ID NO：4---预测的氨基酸序列，来源于Genbank登录号AJ311716

[0259] SEQ ID NO：5-含有侧翼(非编码)序列的susCD163v1的cDNA序列。

[0260] SEQ ID NO：6-11---引物序列

[0261] SEQ ID NO：12---含有侧翼(非编码)序列的编码猪susCD163v2的cDNA序列。

[0262] SEQ ID NO：13--编码猪susCD163v2的cDNA序列

[0263] SEQ ID NO：14---预测的猪susCD163v2的氨基酸序列

[0264] SEQ ID NO：15-16---引物序列

[0265] SEQ ID NO：17---含有侧翼(非编码)序列的编码人CD163v2的cDNA序列。

[0266] SEQ ID NO：18--编码人CD163v 2的cDNA序列

[0267] SEQ ID NO：19--预测的人CD163v2的氨基酸序列

[0268] SEQ ID NO：20-21---引物序列

[0269] SEQ ID NO：22-----含有侧翼(非编码)序列的编码鼠CD163v2的cDNA序列。

[0270] SEQ ID NO：23--编码鼠CD163v2的cDNA序列

[0271] SEQ ID NO：24--预测的鼠CD163v2的氨基酸序列

[0272] SEQ ID NO：25---含有侧翼(非编码)序列的编码鼠CD163v3的cDNA序列。

[0273] SEQ ID NO：26--编码鼠CD163v3的cDNA序列

[0274] SEQ ID NO：27--预测的鼠CD163v3的氨基酸序列

[0275] SEQ ID NO：28-29---引物序列

[0276] SEQ ID NO：30---含有侧翼(非编码)序列的编码MARC-145CD163v3的cDNA序列。

[0277] SEQ ID NO：31---编码MARC-145CD163v3的cDNA序列

[0278] SEQ ID NO：32---预测的MARC-145CD163v3的氨基酸序列

[0279] SEQ ID NO：33--编码Vero细胞CD163v2转录物的cDNA序列

[0280] SEQ ID NO：34--预测的Vero细胞CD163v2的氨基酸序列

[0281] SEQ ID NO：35--编码Vero细胞CD163v3转录物的cDNA序列

[0282] SEQ ID NO：36--预测的Vero细胞CD163v3的氨基酸序列

[0283] SEQ ID NO：37--编码Vero细胞CD163v4转录物的cDNA序列

[0284] SEQ ID NO：38--预测的Vero细胞CD163v4的氨基酸序列

[0285] SEQ ID NO：39--编码Vero细胞CD163v5转录物的cDNA序列

[0286] SEQ ID NO：40--预测的Vero细胞CD163v5的氨基酸序列

[0287] SEQ ID NO：41--编码Vero细胞CD163v6转录物的cDNA序列

[0288] SEQ ID NO：42--预测的Vero细胞CD163v6的氨基酸序列

[0289] SEQ ID NO：43--编码Vero细胞CD163v7转录物的cDNA序列

[0290] SEQ ID NO：44--预测的Vero细胞CD163v7的氨基酸序列

[0291] SEQ ID NO：45--编码犬CD163v2转录物的cDNA序列

[0292] SEQ ID NO：46--预测的犬CD163v2的氨基酸序列

[0293] SEQ ID NO：47--编码犬CD163v3转录物的cDNA序列

[0294] SEQ ID NO：48--预测的犬CD163v3的氨基酸序列

[0295] 附图简述

[0296] 图1susCD163v1与AJ311716的示意图比较

[0297] 图2susCD163v1(SEQ ID NO：2)与AJ311716(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列比对[0298] 图3susCD163v1与AJ311716的核苷酸序列比对

[0299] 图4DNA片段的产生和连接以将CD163直接放置于RSV启动子之后。用DraIII或DrdI消化质粒，之后用Klenow酶发生平端反应。清洗后，用NotI消化质粒。凝胶纯化产生DNA片段，随后利用粘性NotI末端连接。来自RSV(pRSV)和SV40(pSV40)的启动子用箭头表示。

[0300] 图5pCDNA3.1定向V5/His/TOPO克隆载体的图

[0301] 图6用PRRSV分离株P129感染三个BHK/CMV/v1细胞系#3、#5和#12以及非许可BHK细胞系并用SDOW17-FITC染色。A图显示非许可BHK21细胞克隆。B图显示BHK/CMV/
v1克隆#3。C图显示BHK/CMV/v1克隆#5。D图显示BHK/CMV/v1克隆#12。

[0302] 图7用PRRSV分离株P129感染三个BHK/RSV/v1细胞系#2、#3和#4，并用SDOW17-FITC染色。A图显示BHK/RSV/v1克隆#2。B图显示BHK/RSV/v1克隆#3。C图显
示BHK/RSV/v1克隆#4。

[0303] 图8稳定表达猪CD163v1的猫肾细胞系，显示PRRSV噬斑。用北美PRRSV分离株P129感染都在第4代的细胞系NLFK-CMV-susCD163v1-G4F和NLFK-CMV-susCD163v1-G4L并培养6天。用80％丙酮固定单层并用单克隆抗体SDOW17-FITC染色。相差显微技术(右)
显示病毒CPE(噬斑)的定位区，而FA检测(左)显示病毒核壳抗原的共同定位。

[0304] 图9用PRRSV分离株P129感染四个FK/RSV/v1细胞系#1、#2、#3和#4，并用单克隆抗体SDOW17-FITC染色。A图显示FK/RSVv1#1细胞克隆。B图显示FK/RSV/v1克隆#2。C图显示FK/RSV/v1克隆#3。D图显示FK/RSV/v1#4。

[0305] 图10用PRRSV分离株P129感染19代的PK-CMV-susCD163v1-A10细胞。左：用80％丙酮固定单层并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural
Technologies Inc)染色。右：亮视野照明下相同孔，显示细胞分布。

[0306] 图11用PRRSV分离株P129感染17代的BHK-CMVScript-susCD163v2-A9。用80％丙酮固定单层并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural
Technologies Inc)染色。

[0307] 图12BHK/RSV/v2细胞系的三个代表性实例。用PRRSV分离株P129感染细胞并随后用SDOW17-FITC染色。A图显示细胞系BHK/RSV/v2#1，B图显示细胞系BHK/RSV/v2#34，和C图显示细胞系BHK/RSV/v2#47。

[0308] 图13用PRRSV分离株P129感染15代的FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6。然后用80％丙酮固定单层并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural
Technologies Inc)染色。

[0309] 图14使用PRRSV的NVSL 94-3分离株，以生长曲线实验测定由稳定表达susCD163v1的四个重组细胞系和MARC-145细胞产生的子代PRRSV的量。以12小时间隔收获的样品在MARC-145细胞单层上滴定。

[0310] 图15CD163特异性抗体存在下，PRRSV感染的流式细胞术分析。由瞬时转染而表达MARC-145CD163的BHK-21细胞与CD163特异性抗体或正常山羊IgG(NGS)孵育并用表达GFP的PRRSV感染。每个数据点表示一式三份的孔的结果。

[0311] 图16CD163特异性抗体存在下，PRRSV感染的流式细胞术分析。稳定表达人CD163的NLFK细胞与CD163特异性抗体或正常山羊IgG(NGS)孵育并用表达GFP的PRRSV感染。感染24小时后，测定表达GFP的受感染细胞的百分比。每个数据点表示细胞单一孔的结果。

[0312] 图17.从Vero细胞回收的CD163mRNA的六个可变剪接变异体的图形描述。六个变异体在存在或缺少三个外显子(命名为E6、E105和E83)方面不同。外显子E6和E105
长度是三的倍数，因此当缺乏时不引起阅读框改变。相比之下，E83的缺乏引起阅读框移动和蛋白羧基末端的可变氨基酸序列(在图中用阴影图案表示)。疏水跨膜(TM)区编码在
E105内。

[0313] 图18.用PRRSV分离株P129感染的PK-RSVScript-susCD163v2#9细胞。来自PRRSV分离株P201感染的PAMs的未稀释上清液用于感染PK-RSVScript-susCD163v2#9细
胞。培养两天后，如实施例11所述固定细胞并用单克隆抗体SDOW17染色。

[0314] 图19.用PRRSV分离株P129感染的FK-RSVScript-susCD163v2#51细胞。来自PRRSV分离株P201感染的PAMs的未稀释上清液用于感染FK-RSVScript-susCD163v2#51细胞。感染两天后，如实施例11所述丙酮固定细胞并用单克隆抗体SDOW17染色。

[0315] 图20.用PRRSV分离株P201感染PK-RSVScript-susCD163v2克隆#9细胞。A图显示用PRRSV P201感染二十四小时后的第1代细胞单层。B图显示用无细胞上清液PRRSV P201感染后2天的第10代细胞单层。

[0316] 图21.检测NLFK亲本细胞和FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6的一个亚克隆的CD163表达。80％丙酮固定细胞并与山羊抗人CD163(R&DSystem；1∶200)反应一个小时，随后用PBS洗涤。对于显象，使用与偶联FITC的驴抗山羊IgG(Biodesign Inc，1∶100)。在NLFK亲本细胞中没有检测到特异性荧光，如图21A所示。大多数FK.A6.A2亚克隆显示好的荧光染色，表明CD163的存在(图21B)。

[0317] 发明详述

[0318] 一般的定义

[0319] 细胞和细胞系可以是“病毒许可型”或“非病毒许可型”。例如，病毒许可型细胞或细胞系能够允许病毒感染、随后的复制和病毒产生。非病毒许可型细胞或细胞系不能允许病毒感染、随后的复制和病毒产生。已经在某种程度上许可的细胞系通过本发明的方法可致使更许可。

[0320] 动脉炎病毒科是指属于Nidovirales目的有包膜、正链RNA病毒科。该科包括小鼠乳酸脱氢酶病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)和PRRSV。

[0321] Asfarviridae是icosohedral、有包膜病毒科，其基因组由长约150000-190000个核苷酸的线性双链DNA的单个分子组成。该科的名称由非洲猪瘟和相关病毒派生而来。非洲猪瘟病毒(ASFV)是Asfivirus属的模式种并且是该科的唯一成员。

[0322] 术语“PRRSV”或PRRS病毒是指欧洲和北美PRRS病毒基因型。每个基因型内，分离株典型地共享85％或更高的核苷酸同一性。然而在基因型之间，序列同一性水平仅约60％。

[0323] PRRS病毒是动脉炎病毒科的成员。动脉炎病毒基因组是正极性的单链RNA，长度在12和16kb之间、5′端加帽和3′端聚腺苷酸化。基因组三分之二以上用作开放读框(ORFs)1a和1b，它们编码该病毒的非结构功能。ORF1b是ORF1a的延伸，是核糖体移码的结果。ORFs 1a和1b直接从基因组RNA翻译而来。这些大的多肽产物被病毒蛋白酶切割产生
12个或13个分开的较小肽。编码病毒结构蛋白的剩余ORFs由一系列3′共同末端亚基因组RNAs(sgRNAs)表达。sgRNAs由负链RNA不连续转录产生，以致共同的5′前导序列变得与每个转录物融合。主要结构蛋白是核壳(N，由ORF 7编码)、基质蛋白(M，由ORF6编码)和主要包膜糖蛋白(GP5，由ORF5编码)。剩余蛋白GP4(ORF4)、GP3(ORF3)、GP2(ORF2a)和E(ORF2b)是病毒粒体的次要结构组分，其功能还未被阐明。PRRSV的分子生物学已是最近的综述(Dea et al.，2000；Meulenberg，2000；Snijder and Meulenberg，2001)的主题。

[0324] 本文使用的术语“CD163多肽”意思是由哺乳动物CD163基因编码的蛋白，包括含有保守或非保守改变的等位变异体。已经报道了编码猪CD163多肽的cDNA序列(Genbank登录号AJ311716)。也已报道了鼠CD163多肽(Genbank登录号AF274883)，以及多个人变异体，Genbank登录号AAH51281和CAA80543是示例。我们在本文报道了编码猪、人、鼠、犬和非洲绿猴CD163多肽的多核苷酸，其包含SEQ IDNO：1、5、12、13、17、18、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、42、43、45和47所述序列。“CD163多肽”是清除性受体富含半胱氨酸(SRCR)家族跨膜糖蛋白的成员，并被认为仅在单核细胞和巨噬细胞上表达。CD163的一个确定作用是通过内吞作用消耗血红蛋白：结合珠蛋白复合物，来抑制溶血后氧化组织损伤。
白介素-10的随后释放和血红素加氧酶-1的合成引起抗炎和细胞保护作用(Philippidis et al.，2004；Graversen et al.，2002)。人CD163基因跨越染色体12上的35kb并由17个外显子和16个内含子组成。CD163多肽的很多同工型，包括膜结合型、胞质型和分泌型，已知通过可变剪接产生(Ritter et al.，1999)。特别优选包含跨膜结构域的同工型。

[0325] 跨膜结构域的特征为暴露于膜两面的较大序列的多肽片段。胞质和胞外域被至少一个横越脂质双分子层疏水环境的跨膜片段分隔开。跨膜片段由具有非极性侧链的氨基酸残基组成，通常是α螺旋形式。含有约20-30个疏水残基的片段长度足以如α螺旋跨越膜，和它们常常可以通过亲水性图鉴定。SEQ ID NO：2和14的预测跨膜结构域在说明书中用粗体表示。为了确定其它CD163序列是否含有相似序列，通过序列检测或亲水性图可容易地确定该特征。SEQ ID NOS：37-40是代表性的变异CD163蛋白它不含有跨膜结构域及其编码核酸。

[0326] 在下文使用的“多核苷酸”泛指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单和双链DNA、单和双链区混合DNA、单和双链RNA、单和双链区混合RNA、和包含单链或更典型双链的或单和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA的三链区。术语“多核苷酸”也包括含有一个或多个修饰碱基的DNAs或RNAs和具有为稳定性或其它理由而修饰的主链的DNAs或RNAs。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基和稀有碱基如肌苷。DNA和RNA可以进行各种修饰；因而“多核苷酸”包含如在自然界中典型发现的化学、酶学或代谢修饰型多核苷酸，以及病毒和细胞特征性的化学形式的DNA和RNA。
“多核苷酸”也包含相对短的多核苷酸，常常称为寡核苷酸。

[0327] 在下文使用的“多肽”是指包含通过肽键或修饰肽键彼此连接的氨基酸的任何肽或蛋白。“多肽”是指皆为短链，通常称为肽、寡肽或低聚物，和较长链，泛指蛋白。多肽可以含有除20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然加工，如翻译后加工修饰的，或者通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这种修饰在基础正文中很好描述和在专题论文以及长篇研究参考文献中更详细描述。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应该理解相同类型的修饰可以在给定多肽的几个位点以相同或不同程度存在。同样，给定多肽可以含有很多类型修饰。由于遍在蛋白化，多肽可以分支，和它们可以是环状的，有或者没有分支。环状、分支和分支环状多肽可以在翻译后自然加工产生，或可以通过合成方法制备。修饰或修改型包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GP I锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化外消旋、氢硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸添加至蛋白如氨酰化和遍在蛋白化(参见例如Proteins-Structure and Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，Post-translational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，pgs.1-12in Postranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter et al.， ″ Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors ″，Meth Enzymol(1990)182：626-646 and Rattan et al.， ″ Protein Synthesis：
Post-translational Modifications and Aging″，Ann NY Acad Sci(1992)663：4842)。

[0328] 下文使用的“分离的”是指由人工从自然状态改变而来。如果自然界存在“分离的”组合物或物质，它与其原始环境已经变化或远离该环境，或二者皆是。例如，天然存在于活动物的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其自然状态的共存材料分离的同一多核苷酸或多肽是″分离的″，如同本文使用的术语。因此本文使用的和本领域理解的“分离的”，无论是指“分离的”多核苷酸还是多肽，意思是与通常发现多肽或核酸的原始细胞环境分离。因此本文使用的，仅举例来说，用本发明多核苷酸构建的转基因动物或重组细胞系使用“分离的”核酸。特别从本发明的分离的多核苷酸定义中排除的是来自最初获得该多核苷酸的天然宿主细胞的完整分离的染色体。

[0329] 在随后的公开内容中，我们将常常使用应用于多肽氨基酸序列的术语“同一性”或相似性。对于多肽的氨基酸序列“同一性”百分比在本文定义为候选序列和靶序列比对，和如有必要，为达到最大序列同一性百分比而引入缺口，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，候选序列中与靶序列中残基相同的氨基酸残基的百分比。通过传统方法测定序列同一性百分比。例如，BLASTP 2.2.6[Tatusova TA and TL Madden，″BLAST2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences.″(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250.]。

[0330] 简言之，如上所述，比对两个氨基酸序列，使用Henikoff和Henikoff(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89：10915-10919.1992)的缺口开放罚分为10、缺口延伸罚分为0.1和“blosum62”得分矩阵，优化比对得分。

[0331] 然后如下计算同一性百分比：

[0332]

[0333] 对于本发明多肽的序列“相似性”(常常称为“同源性”)百分比在本文定义为候选序列和靶序列比对，和如有必要，为达到最大序列同一性百分比而引入缺口(如上所述)，并且也不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，候选序列中与靶序列中残基相同的氨基酸残基的百分比。

[0334]

[0335] 可以根据物理性能和对二级和三级蛋白结构的贡献对氨基酸进行分类。本领域公认保守置换为一个氨基酸被具有相似性能的另一个氨基酸置换。

[0336] 示例的保守置换在下表1、2和3中列出。

[0337] 表1

[0338] 保守置换I

[0339]

[0340] 可供选择地，保守氨基酸可以如Lehninger，[Biochemistry，Second Edition；Worth Publishers，Inc.NY：NY(1975)，pp.71-77]所述进行分组，如就在下面表2所列。

[0341] 表2

[0342] 保守置换II

[0343]

[0344]

[0345] 仍如另一选择方案，示例的保守置换在就在下面的表3中列出。

[0346] 表3

[0347] 保守置换III

[0348]

[0349]

[0350] 涉及生产本发明病毒和宿主细胞的方法

[0351] 本发明提供了在细胞中生产动脉炎病毒科和Asfarviridae科成员的病毒的改进方法，包括指导所述细胞表达CD163多肽的步骤。这可以包括致使病毒非许可型细胞变成病毒许可型细胞，或可以包括致使细胞对病毒更许可。

[0352] 在一个实施方案中，动脉炎病毒科或Asfarviridae科成员的病毒选自小鼠LDV、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪PRRSV和猪ASFV。

[0353] 在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。

[0354] 本发明进一步提供了制备病毒培养物的方法，该病毒是动脉炎病毒科成员，包含步骤：提供细胞系；指导所述细胞系表达CD163多肽；用病毒感染所述细胞系；和使所述细胞系生产病毒子代。

[0355] 在一个实施方案中，动脉炎病毒科成员的病毒选自小鼠LDV、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪PRRSV和猪ASFV。

[0356] 在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。

[0357] 以上全部方法利用表达CD163多肽的细胞和细胞系。包括外源核酸引入细胞的方法可以促进或增加CD163。这种细胞可以以允许所编码CD163多肽表达的方式包含多核苷酸或载体。

[0358] 编码CD163的多核苷酸可以作为环状质粒的一部分，或作为包含分离蛋白编码区的线状DNA，或在病毒载体中引入宿主细胞。本领域熟知和常规实施的外源核酸引入宿主细胞的方法包括转化、转染、电穿孔、核注射、或与载体融合，如脂质体、胶束、血影细胞和原生质体。本发明的宿主细胞系统包括无脊椎动物和脊椎动物细胞系统。宿主可以包括但不限于下列：昆虫细胞、猪肾(PK)细胞、猫肾(FK)细胞、猪睾丸(ST)细胞、非洲绿猴肾细胞(MA-104、MARC-145、VERO和COS细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、婴儿hampster肾细胞、人293细胞和鼠3T3成纤维细胞。昆虫宿主细胞培养系统也可以用来表达CD163多肽。在另一个实施方案中，使用果蝇表达系统表达CD163多肽。

[0359] 表达CD163多肽的合适表达载体的选择当然将取决于使用的具体宿主细胞，并且在本领域普通技术人员范围之内。合适表达载体的实例包括pSport和
pcDNA3(Invitrogen)、pCMV-Script(Stratagene)和pSVL(Pharmacia Biotech)。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括来源于病毒基因组的转录和翻译控制序列。可以用于本发明的通常使用的启动子序列和修饰序列包括但不限于来源于人巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、多形瘤病毒和猿猴病毒40(SV40)的序列。例如Okayama and Berg(Mol.Cell.Biol.3：280(1983))；Cosman et al.(Mol.Immunol.23：935(1986))；
Cosman et al.(Nature 312：768(1984))；EP-A-0367566和WO 91/18982中公开了构建哺乳动物表达载体的方法。

[0360] 因为已知CD163序列存在于各个物种的细胞，所以内源基因可以被修饰以允许或增加CD163多肽表达。细胞可以被修饰(例如通过同源重组)以提供表达增加，通过用全部或部分异源启动子全部或部分取代天然存在的CD163启动子，以致细胞以较高水平表达CD163多肽。异源启动予以它与内源CD163编码序列可操作连接的方式插入。[参见例如PCT国际公开号WO 94/12650、PCT国际公开号WO 92/20808和PCT国际公开号WO 91/09955]除了异源启动子DNA外，还包括可扩增标记DNA(例如ada、dhfr和多功能cad基因，它们编码氨甲酰磷酸合酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶)和/或内含子DNA可以与异源启动子DNA一起插入。如果与CD163编码序列连接，则标准选择法扩增标记DNA引起CD163编码序列在细胞中共同扩增。

[0361] 还可以通过化学处理诱导CD163表达。佛波酯，特别是佛波醇肉豆蔻烷基醋酸盐(PMA)活化遍在膜受体的一个或多个酶、蛋白激酶C(PKC)并且是增加CD163表达的特别优选方式。还包括胞内钙动员的其他方法。

[0362] 疫苗生产

[0363] 为了疫苗生产或诊断的目的，如上所述的方法可以用来生产动脉炎病毒科或Asfarviridae科成员的任何病毒。

[0364] 在一个实施方案中，动脉炎病毒科成员的病毒选自小鼠LDV、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)和猪PRRSV。

[0365] 在一个优选实施方案中，该病毒是PRRSV。

[0366] 疫苗生产

[0367] 为了疫苗生产或诊断的目的，如上所述的方法可以用来生产病毒。

[0368] 可以生产灭活(失活)或活疫苗。因此，为制备活疫苗，病毒分离株或其减毒或突变变异体在细胞培养中生长。根据本领域熟知方法收获病毒。然后可以浓缩、冷冻病毒并贮藏在-70℃，或冷冻干燥并贮藏在4℃。疫苗接种前，病毒与药物可接受载体如盐溶液，和3 8
任选佐剂以合适剂量混合(病毒是每毫升约10 至10 组织培养传染剂量(TCID50/ml))。

[0369] 生产的疫苗还可以包括包含本发明方法生长的病毒的失活或灭活疫苗。根据本领域熟知方法制备灭活疫苗。例如，一旦病毒繁殖至高滴度，对于本领域技术人员来说，病毒抗原性量可以通过本领域熟知方法获得是显而易见的。例如，病毒抗原性量可以通过稀释、浓缩或提取而获得。所有这些方法已被用于获得合适的病毒抗原性量以生产疫苗。然后通过用福尔马林、羟丙酸β-内酯(BPL)、二元乙亚胺(BEI)处理或本领域技术人员已知的其他方法灭活病毒。接着灭活病毒与药物可接受载体如盐溶液，和任选佐剂混合。佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、水包油和油包水乳化液、AMPHIGEN、皂草苷如QuilA、和多肽助剂包括白介素、干扰素、及其他细胞因子。

[0370] 通过病毒悬液与37％甲醛混合至甲醛终浓度为0.05％进行福尔马林灭活。病毒-甲醛混合物通过在室温下大约24小时恒定搅拌来混合。然后通过测定在合适细胞系上的生长，测试灭活病毒混合物的残留活病毒。

[0371] BEI灭活是通过本发明的病毒悬液与0.1M BEI(含2-溴基-乙胺的0.175N NaOH)混合至1mM BEI终浓度来进行。病毒-BEI混合物的混合是通过在室温下恒定搅拌大约48小时，随后添加1.0M硫代硫酸钠至终浓度0.1mM。继续混合另外两小时。通过测定在合适细胞系上的生长，测试灭活病毒混合物的残留活病毒。

[0372] 已被指导表达CD163的病毒许可型细胞也可以用于定量活病毒。本领域技术人员熟知的两个普通方法是噬菌斑法和有限稀释试验。

[0373] 为了生产用于诊断试剂盒的病毒抗原，本发明的表达CD163的细胞系可用于生长病毒。例如为了检测和定量猪血清中病毒抗体，受感染细胞的溶解产物(采用病毒颗粒的任选纯化或所选病毒蛋白的提取)可以包被在ELISA板上。

[0374] 为了产生多克隆、单特异性或单克隆抗体，在表达CD163的细胞中生长的活病毒或灭活病毒在任选分离病毒蛋白后可以用于免疫动物。这些随后可以用作检测和定量猪血清和其他生物样品中病毒的诊断试验基础。

[0375] 发明试验

[0376] 本发明提供了测定动物被动脉炎病毒科或Asfarviridae成员的病毒感染的倾向性，或细胞系支持动脉炎病毒科或Asfarviridae成员的病毒复制的倾向性的方法。获得来自二者任一来源的样品并测定CD163的表达。CD163基因表达水平可与已知不支持该病毒复制的对照水平相比。

[0377] 在动物的情况下，样品可以是包含样品核酸分子或蛋白，和从表达CD163的任何身体组织获得的任何样品，包括但不限于肺泡巨噬细胞、培养细胞、活组织检查或其他组织制剂。可以从信使RNA或所产生的蛋白任一水平或两个水平上估计表达水平。在优选实施方案中，动脉炎病毒科或Asfarviridae成员的病毒选自小鼠LDV、马动脉炎病毒(EAV)、猿出血热病毒(SHFV)、猪PRRSV和猪ASFV。

[0378] 基于核酸的试验

[0379] 测定CD163水平的方法可以基于上面指出的核酸。CD163衍生核酸可以在溶液中或在固相载体上。在一些实施方案中，它们可以单独用作微阵列中的阵列元件或
与其他阵列元件分子结合使用。基于核酸的方法通常需要从样品分离DNA或RNA和随
后杂交或PCR扩增，使用来源于任何本领域已知CD163编码序列或如SEQ ID NO：1、3、
5、12、13、17、18、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47具体公开序列的特异性引物。可以根据本领域技术人员熟知的许多方法中任何一个从样品中分离DNA或
RNA。例如，Tijssen，P.(1993)Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Prepafation，Elsevier，New York，N.Y.中描述了核酸纯化方法。在一个实施方案中，使用TRIZOL总RNA分离试剂(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg Md.)分离总RNA和使用oligo d(T)柱层析或玻璃珠分离mRNA。当扩增样品核酸分子时，期望扩增样品核酸分子和保持原始样品的相对丰度，包括低丰度转录物。RNA可以在体外、原位或体内被扩增(参见Eberwine美国专利5,514,545)。

[0380] 样品内包括对照也有利，以确保扩增和标记步骤不改变核酸分子在样品中的真实分布。为了这个目的，样品被掺加预定与其互补阵列核酸分子杂交时可被检测到的量的对照核酸分子，和核酸分子的组成包括与对照阵列核酸分子特异性杂交的参照核酸分子。杂交和加工后，获得的杂交信号应该反映添加到样品中的对照阵列核酸分子的准确量。

[0381] 杂交前，可能期望断裂样品核酸分子。断裂通过使二级结构和与样品中其他样品核酸分子或非互补核酸分子的交叉杂交最小化而提高杂交。断裂可以通过机械或化学方法进行。

[0382] 标记

[0383] 可以用一个或多个标记部分标记样品核酸分子或探针以允许检测杂交阵列/样品核酸分子复合物。标记部分可以包括可以通过分光镜、光化学、生物化学、生物电子、免疫化学、电、光学或化学方法检测的成分。标记部分包括放射性同位素如(32)P、(33)P或(35)S，化学发光化合物，标记结合蛋白，重金属原子，分光镜标记如荧光标记和染料，磁性标记，连接酶，质谱标记，自旋标记，电子转移供体和受体等等。优选的荧光标记包括Cy3和Cy5荧光团(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)。

[0384] 杂交

[0385] SEQ ID NO：1、3、5、12、13、17、18、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47的核酸分子序列或本领域中其他CD163编码序列及其片段可以用在为各种目的的各种杂交技术中。可以设计杂交探针或来源于任何哺乳动物CD163序列，但可以使用如SEQ ID NO：1、3、5、12、13、17、18、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47公开的那些序列。这种探针可以由高度特异区或保存基序组成，并用在方案中以定量CD163信息，等位变异体或相关序列。本发明的杂交探针可以是DNA或RNA并可以来源于本领域已知的任何哺乳动物CD 163序列或来源于如SEQ ID NO：1、3、5、12、13、17、18、22、23、25、26、30在此公开的那些序列或来源于基因组序列包括哺乳动物基因的启动子、增强子和内含子。可以使用oligolabeling、切口平移、末端标记或在标记核苷酸存在下PCR扩增产生杂交或PCR探针。含有核酸序列的载体可以用于体外产生mRNA探针，通过添加RNA聚合酶和标记的核酸分子。使用市场上可买到的试剂盒，如Amersham Pharmacia Biotech提供的试剂盒可以指导这些程序。

[0386] 杂交的严格性由探针的G+C含量、盐浓度和温度决定。尤其是，通过降低盐浓度或提高杂交温度可以增加严格性。在用于一些基于膜的杂交的溶液中，添加有机溶剂如甲酰胺允许反应在较低温度下发生。杂交可以在缓冲液中以低严格性进行，如含1％十二烷基磺酸钠(SDS)的5xSSC，60℃，其允许含有一些错配的核苷酸序列之间形成杂交复合物。随后用缓冲液以较高严格性进行洗涤，如含0.1％SDS的0.2xSSC，45℃(中等严格性)或
68℃(高严格性)。在高严格性下，杂交复合物将仅在核酸序列几乎完全互补的情况下保持稳定。在一些基于膜的杂交中，优选35％或最优选50％甲酰胺添加到杂交溶液中以降低进行杂交的温度，和通过利用其他洗涤剂如Sarkosyl或Triton X-100和封闭剂如鲑精DNA可以减少背景信号。杂交成分和条件的选择是本领域技术人员熟知的并且在Ausubel(supra)and Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.中综述。

[0387] 示例的高度严格杂交条件如下：在42℃，包含50％甲酰胺、1％SDS、1M NaCI、10％葡聚糖硫酸酯的杂交液中杂交，并在包含0.1XSSC和1％SDS的洗涤液中，60℃洗涤两次，30分钟。本领域理解通过温度和缓冲液，或盐浓度的变化可以获得同等严格条件，如Ausubel，et al.(Eds.)，Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons (1994)，pp.6.0.3 to 6.4.10.描述。杂交条件的改变可以凭经验确定或基于探针长度和鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对百分比精确计算。杂交条件可以如Sambrook，et al.，(Eds.)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press：ColdSpring Harbor，New York(1989)，pp.9.47 to 9.51.所述来计算。

[0388] 杂交特异性可以通过比较特异性-对照核酸分子与添加到样品中的已知量的特异性-对照样品核酸分子的杂交来评价。特异性-对照阵列核酸分子与相应阵列核酸分子比较可能具有一个或多个序列错配。用这样的方式，有可能确定是否仅互补阵列核酸分子与样品核酸分子杂交或确定是否形成错配杂交双螺旋。

[0389] 杂交反应可以以绝对或示差杂交形式进行。在绝对杂交形式中，来自一个样品的核酸分子与微阵列形式中的分子杂交，杂交复合物形成后检测到的信号与样品中核酸分子水平相关联。在示差杂交形式中，分析两个生物样品中一组基因的差异表达。为了示差杂交，制备来自两个生物样品的核酸分子并用不同的标记部分标记。两个标记核酸分子的混合物添加到微阵列。然后，在两个不同标记的发射信号可以逐一被检测的条件下检测微阵列。微阵列中与来源于两个生物样品的基本上相等数量核酸分子杂交的分子给出不同的组合荧光(Shalon et al.；PCT出版物WO95/35505)。在优选实施方案中，标记是具有可区别发射光谱的荧光标记，如Cy3和Cy5荧光团。

[0390] 杂交后，洗涤微阵列以除去未杂交核酸分子和可杂交阵列元件之间的复合物形成，和检测核酸分子。检测复合物形成的方法是本领域技术人员熟知的。在优选实施方案中，用荧光标记标记核酸分子并通过荧光显微术，优选共焦荧光显微术完成表示复合物形成的荧光水平和模式的测定。

[0391] 在示差杂交实验中，用两个或更多具有不同发射波长的不同荧光标记来标记来自两个或更多不同生物样品的核酸分子。用设置检测特定波长的不同光电倍增器分开检测荧光信号。获得两个或更多样品中核酸分子的相对丰度/表达水平。

[0392] 典型地，微阵列荧光强度可以标准化以考虑在相似检验条件下使用一个以上微阵列时杂交强度的变化。在优选实施方案中，使用来源于每个微阵列上所含内部标准化对照的强度将各个阵列样品核酸分子复合杂交强度标准化。

[0393] 基于多肽的试验

[0394] 本发明提供了检测和定量CD163多肽的方法和试剂。这些方法包括分析生化法如电泳、质谱分析法、层析法等等，或各种免疫学方法如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光法、western印迹、亲合捕获质谱法、生物活性及如下所述其他方法和在回顾本公开内容上对本领域技术人员显而易见的方法。

[0395] 免疫测定

[0396] 本发明还提供了使用一个或多个抗CD163抗体试剂(即免疫测定)检测CD163多肽的方法。如在此使用的免疫测定是利用特异性结合CD163多肽或表位的抗体(如在此宽泛限定的和具体地包括片段、嵌合体及其他结合物质)的试验。

[0397] 适于实施本发明的许多分认的免疫学结合试验形式是已知的(参见例如美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。参见例如Cell Biology Volume 37：Antibodies in Cell Biology，Asai，ed.Academic Press，Inc.New York(1993)；Basic andClinical Immunology 7th Edition，Stites & Terr，eds.(1991)；Harlow and Lane，前述[例如Chapter 14]和Ausubel et al.，前述[例如Chapter 11]中的方法。典型地，免疫结合试验(或免疫测定)利用“捕获试剂”特异性结合分析物并且常常将分析物固定于固相。在一个实施方案中，捕获试剂是特异性结合CD163多肽或子序列如抗CD163抗体的那部分。

[0398] 通常直接或使用可检测标记间接检测所测定的CD163基因产物。试验中使用的特殊标记或可检测基团通常不是本发明的关键方面，只要它不显著干扰抗体或试验中使用的抗体的特异性结合。该标记可以与捕获试剂(例如抗CD163抗体)共价连接，或可以与第三部分连接，如另一个抗体，其与CD163多肽特异性结合。

[0399] 本发明提供了检测CD163多肽的竞争和非竞争性免疫测定的方法和试剂。非竞争性免疫测定是直接测定捕获分析物(在这种情况下是CD163)的量的试验。一个这种试验是两位点，基于单克隆的免疫测定，利用与CD163多肽上两个互不干扰表位反应的单克隆抗体。背景信息参见例如，Maddox et al.，1983，J.Exp.Med.，158：1211。在一个“夹心”试验中，捕获试剂(例如抗CD163抗体)直接与固定它的固定基质结合。然后这些固定抗体捕获试验样品中存在的任何CD163多肽。由此固定的CD163多肽能因此被标记，即通过与承载标记的第二个抗CD163抗体结合。做为选择，第二个CD163抗体可以缺乏标记，但是被标记的第三个抗体结合，该抗体对第二个抗体所衍生物种的抗体是特异性的。第二个抗体也可以被可检测部分修饰，如生物素，第三个标记分子可以与可检测部分特异性结合，如酶标记的链霉抗生物素蛋白。

[0400] 在竞争性试验中，通过测定被样品中存在的CD163多肽而从捕获试剂(例如CD163抗体)替换(或竞争掉)的添加的(外源的)CD163肽的量来间接测定样品中存在的CD163多肽量。半抗原抑制试验是竞争试验的另一个实例。在这个试验中，CD163多肽固定在固体基质上。向样品中添加已知量的CD163抗体，然后使样品接触固定的CD163多肽。在这种情况下，与固定CD163多肽结合的抗CD163抗体量与样品中存在的CD163多肽量成反比。
固定抗体的量可以通过检测抗体的固定分数或保留在溶液中的抗体分数来检测。在这个方面，检测在抗体被标记的情况下可以是直接的，或在该标记与特异性结合如上所述抗体的分子结合的情况下可以是间接的。

[0401] 其他基于抗体的试验形式

[0402] 本发明还提供了通过使用免疫印迹(Western印迹)形式检测和定量样品中CD163多肽存在的试剂和方法。另一个免疫测定是所谓的“横流层析”。在非竞争性形式的横流层析中，样品通过例如毛细管作用跨越基质，并遇到结合分析物形成偶联物的可移动标记抗体。然后该偶联物跨越基质并遇到结合分析物的固定的第二个抗体。因此，通过检测标记抗体检测到固定的分析物。在竞争形式的横流层析中，标记形式的分析物跨越载体并与结合固定抗体的未标记分析物竞争。样品中分析物的量越大，标记分析物结合的越少，和因此信号越弱。参见例如，May等的美国专利5,622,871和Rosenstein的美国专利5,591,645。

[0403] 根据试验，各种成分，包括抗原、靶抗体或抗组织蛋白酶S抗体可以与固体表面或支持体结合(即基质、膜或滤纸)。将生物分子与各种固体表面固定的许多方法是本领域已知的。例如，固体表面可以是膜(例如硝化纤维)、微滴定皿(例如PVC、聚丙烯或聚苯乙烯)、试管(玻璃或塑料的)、量尺(例如玻璃、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、胶乳等等)、微量离心管或玻璃或塑料珠。期望的成分可以通过非特定键共价结合或非共价连接。

[0404] 各种有机和无机聚合物，天然和合成的都可以用作固定表面的材料。示例的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、人造丝、尼龙、聚(乙烯丁酸盐)、二氟化物(PVDF)、硅树脂、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维等等。可以使用的其他材料包括纸、玻璃、陶瓷、金属、半金属、半导电材料、水泥等等。此外，可以使用形成凝胶的物质，如蛋白(例如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。形成几个含水相的聚合物，如右旋糖酐、聚二醇或表面活性剂，如磷脂、长链(12-24个碳原子)烷铵盐等等也合适。固体表面是多孔的情况下，可以使用各种孔径，取具有系统的性质。

[0405] 质谱法

[0406] 分子的质量常常被用作分子的标识。因此，质谱方法可用于鉴定蛋白分析物。质谱仪可以测量质量，通过测定电离分析物移下射程管所需的时间和用离子检测器检测。蛋白质谱分析的一个方法是基质辅助激光解吸电离质谱(“MALDI”)。在MALDI中，分析物与吸收激光波长能量的能量吸收基质材料混合并置于探针表面。用激光打击基质时，分析物从探针表面解吸、电离和用离子检测器检测。参见例如Hillenkamp等的美国专利5,118,937。

[0407] 蛋白质谱分析的其他方法在Hutchens和Yip的美国专利5,719,060中描述。在称为亲合性提高的表面捕获(Surfaces Enhanced for Affinity Capture)(“SEAC”)的一个这种方法中，使用特异性或非特异性结合分析物的固相亲合试剂，如抗体或金属离子，将分析物与样品中其他材料分离开来。然后捕获的分析物从固相解吸，通过例如激光能量、电离，和用离子检测器检测。

[0408] 本发明的核酸

[0409] 实施例公开了我们的发现，几个新的CD163多核苷酸。本发明包括这些新的CD163多核苷酸。本发明提供了几个分离的新多核苷酸(例如DNA序列和RNA转录物，正义和互补反义链，单和双链的，包括其剪接变异体，它编码新的CD163多肽。我们在此报道了分离的新多核苷酸，其编码猪、鼠、人、犬和非洲绿猴CD163多肽和包含SEQ ID NO：1、5、12、13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47所述的序列。

[0410] 应该承认通过公开SEQ ID NOs：1、5、12、13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47，它为本领域技术人员提供了获得这些序列的很多方法。例如，将可能从SEQ ID NO：1、5、12、13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47公开的序列产生探针并筛选猪、鼠、人、犬和非洲绿猴cDNA或基因组文库，和由此获得整个SEQ ID NO：1、5、12、
13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47，或其基因组同等物。Sambrook，et al.，(Eds.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York(1989)。同样例如，本领域技术人员将立即认识到给出SEQID NO：5、12、13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47公开的序列，然后可能产生用于PCR扩增的合适引物以获得由这些序列表示的整个序列。(参见例如，PCR Technology，H.A.Erlich，ed.，Stockton Press，New York，1989；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，M.A.Innis，David H.Gelfand，John J.Sninsky，and Thomas J.White，eds.，Academic Press，Inc.，New York，1990.)

[0411] 本发明的DNA多核苷酸包括cDNA和已完全或部分化学合成的DNA，并且也意欲包括其等位变异体。等位变异体是野生型基因序列的修饰形式，由染色体分离过程中重组产生或暴露于引起基因突变的条件下的改变。等位变异体，像野生型基因，是天然存在的序列(与由体外操作产生的非天然存在变异体相反)。

[0412] 编码新的CD163多肽的DNA序列在SEQ ID NOs：5、12、13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47中阐述。本领域技术人员将容易认识到本发明的DNA包括双链分子，例如具有SEQ ID NO：5、12、13、22、23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47所述序列的分子，连同具有根据Watson-Crick DNA碱基配对法则从SEQ ID NO：5、12、13、22、
23、25、26、30、31、33、35、37、39、41、43、45和47的序列推断的序列的互补分子(“非编码链”或“补体”)。本发明还预期的是编码SEQ ID NO：2、14、24、27和32、34、36、38、40、42、44、
46、48的猪、鼠和非洲绿猴CD163多肽的其他多核苷酸，其序列由于如本领域熟知的通用遗传密码众所周知的简并性而不同于SEQ ID NOs：1、3、5、12、13、17、18、22、23、25、26、30、31、
33、35、37、39、41、43、45和47的多核苷酸。因此本发明包括在表达上编码SEQ ID NO：2、
14、24、27和32的多肽的那些其他DNA和RNA分子。已鉴定了编码猪CD163多肽的氨基酸残基序列，并且利用对每个特定氨基酸残基的所有三联密码子的知识，有可能描述编码所有这些的RNA和DNA序列。因此，除了在此具体公开的DNA和RNA分子之外的，由特定氨基酸密码子改变而简单表征的DNA和RNA分子包括在本发明范围内。

[0413] 氨基酸和它们的代表性缩写、符号和密码子表在下列表4中列出。

[0414] 表4

[0415]

[0416] 本领域熟知，密码子组成mRNA和它们相应的cDNA分子中的核苷酸三联体序列。密码子特征为当存在于mRNA分子时，尿嘧啶(u)碱基，而当存在于DNA时，特征为胸苷(T)碱基。多核苷酸内相同氨基酸残基密码子的简单改变不会改变所编码多肽的序列或结构。显然当短语开始是特定3个核苷酸序列“编码”特定氨基酸，本领域普通技术人员将认识到上表提供了鉴定在争论中的特定核苷酸的方式。例如，如果特定三个核苷酸序列编码苏氨酸，上表公开了可能的三联体序列是ACA、ACG、ACC和ACU(如果在DNA中是ACT)。

[0417] 因此本发明包括分离的多核苷酸，包含：

[0418] (a)SEQ ID NOs：1和5所述的susCD163v1多核苷酸序列

[0419] (b)编码与SEQ ID NO：2所述多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0420] (c)编码SEQ ID：2的多肽的多核苷酸，

[0421] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0422] 因此本发明包括分离的多核苷酸，包含：

[0423] (a)SEQ ID NOs：12或13所述的susCD163v2多核苷酸序列

[0424] (b)包含编码与SEQ ID NO：14所述多肽具有至少99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0425] (c)编码SEQ ID：14的多肽的多核苷酸，

[0426] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0427] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0428] (a)SEQ ID NOs：22或23所述的鼠CD63v2多核苷酸序列

[0429] (b)编码SEQ ID：24的多肽的多核苷酸，

[0430] (c)与(a)或(b)任何一个互补的多核苷酸

[0431] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0432] (a)SEQ ID NOs：25或26所述的鼠CD63v3多核苷酸序列

[0433] (b)包含编码与SEQ ID NO：27所述多肽具有至少96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0434] (c)编码SEQ ID：27的多肽的多核苷酸，

[0435] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0436] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0437] (a)SEQ ID NOs：30或31所述的非洲绿猴CD163v2多核苷酸序列

[0438] (b)包含编码与SEQ ID NO：32所述多肽具有至少98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0439] (c)编码SEQ ID：32的多肽的多核苷酸，

[0440] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0441] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0442] (a)SEQ ID NO：33所述的多核苷酸序列

[0443] (b)包含编码与SEQ ID NO：34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0444] (c)编码SEQ ID：34的多肽的多核苷酸，

[0445] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0446] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0447] (a)SEQ ID NO：35所述的多核苷酸序列

[0448] (b)包含编码与SEQ ID NO：36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0449] (c)编码SEQ ID：36的多肽的多核苷酸，

[0450] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0451] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0452] (a)SEQ ID NO：37所述的多核苷酸序列

[0453] (b)包含编码与SEQ ID NO：38所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0454] (c)编码SEQ ID：38的多肽的多核苷酸，

[0455] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0456] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0457] (a)SEQ ID NO：39所述的多核苷酸序列

[0458] (b)包含编码与SEQ ID NO：40所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0459] (c)编码SEQ ID：40的多肽的多核苷酸，

[0460] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0461] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0462] (a)SEQ ID NO：41所述的多核苷酸序列

[0463] (b)包含编码与SEQ ID NO：42所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0464] (c)编码SEQ ID：42的多肽的多核苷酸，

[0465] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0466] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0467] (a)SEQ ID NO：43所述的多核苷酸序列

[0468] (b)包含编码与SEQ ID NO：44所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸

[0469] (c)编码SEQ ID：44的多肽的多核苷酸，

[0470] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0471] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0472] (a)SEQ ID NO：45所述的多核苷酸序列

[0473] (b)包含编码与SEQ ID NO：46所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸。

[0474] (c)编码SEQ ID：46的多肽的多核苷酸，

[0475] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0476] 本发明还包括分离的多核苷酸，包含：

[0477] (a)SEQ ID NO：47所述的多核苷酸序列

[0478] (b)包含编码与SEQ ID NO：48所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽的多核苷酸。

[0479] (c)编码SEQ ID：49的多肽的多核苷酸，

[0480] (d)与(a)、(b)或(c)任何一个互补的多核苷酸。

[0481] 本发明提供的多核苷酸序列信息使得用本领域众所周知和常规实施的技术大规模表达所编码多肽成为可能。本发明的多核苷酸还允许通过熟知技术鉴定和分离编码猪CD163v1多肽相关的多核苷酸，如人等位变异体和物种同源物，该技术包括Southern和/或Northern杂交和聚合酶链式反应(PCR)。

[0482] 对在此公开的CD163序列的任何一个序列的认识还使得有可能通过使用Southern杂交或聚合酶链式反应(PCR)鉴定编码CD163调节序列的基因组DNA序列，如启动子、操纵子、增强子、阻遏子等等。

[0483] 如上面称作“本发明试验”的部分指出，本发明的多核苷酸在杂交试验中也可有效检测细胞表达CD163的能力，或测定CD163表达水平。本发明多核苷酸还可以是用于测定动物对如上所述病毒感染易感性的诊断方法的基础。

[0484] 编码CD163多肽的全长多核苷酸的在此公开使本领域普通技术人员容易获得全长多核苷酸的片段。因此本发明提供了编码CD163的多核苷酸的独特片段，包含在此公开的编码CD163的多核苷酸的至少15个直至全长序列长度(包括每个和之间的每个整数值)的连续核苷酸。因为本发明的多核苷酸(包括片段)包含对特定编码CD163的多核苷酸序列独特的序列，所以它们在高度严格或中等严格条件下将仅(即“特异性”)与编码各种CD163多肽的多核苷酸杂交。本发明多核苷酸独特的序列可通过与其他已知多核苷酸的序列比较而认识到，并且可以通过使用本领域常规利用的比对程序鉴定，例如公共序列数据库中可获得的程序。这种序列还可从Southern杂交分析测定多核苷酸将杂交的基因组DNA片段的数量而被认识到。本发明的多核苷酸可以以允许检测它们的方式标记，包括放射性、荧光和酶标记。

[0485] 一个或多个独特片段多核苷酸(或如上讨论的其他CD163多核苷酸)可以包括在用于检测编码CD163的多核苷酸存在或用于检测编码CD163的多核苷酸序列变异的试剂盒中。本发明还使得可以获得识别编码CD163的多核苷酸和与其杂交的反义多核苷酸。提供了反义多核苷酸的全长和片段。本发明反义分子的片段包括(i)特异性识别在此公开的CD163变异体和与其杂交(如通过编码CD163的DNA与编码其他已知分子的DNA的序列比较测定)的分子。新的编码CD163的多核苷酸独特序列的鉴定可以通过使用任何公众可获得的序列数据库和/或通过使用市场上可买到的序列比较程序来推导。整个基因组中所选序列的独特性可以进一步通过杂交分析来证实。鉴定到预期序列后，可以进行限制性消化而分离或使用本领域熟知的任何各种聚合酶链式反应技术扩增。反义多核苷酸与调节表达CD163mRNA的那些细胞表达CD163特别相关。

[0486] 反义核酸(优选10至20个碱基对寡核苷酸)能够特异性结合CD163表达控制序列或CD163RNA被引入细胞(例如通过病毒载体或胶体分散系统如脂质体)。反义核酸结合细胞中的猪CD163靶核苷酸序列并阻止靶序列的转录或翻译。本发明特别预期硫代磷酯和膦酸甲酯反义寡核苷酸的治疗用途。反义寡核苷酸可以进一步在其5′末端被聚L-赖氨酸、转铁蛋白聚赖氨酸或胆固醇部分修饰。猪CD163表达在转录或翻译水平的抑制对产生以异常猪CD 163表达或为特征的疾病的细胞或动物模型有用或有效作为治疗形式。

[0487] 如上更详细地描述，本发明的核酸包括含本发明多核苷酸的载体。这种载体例如可有效在宿主细胞中扩增多核苷酸而产生其有效量。在其他实施方案中，该载体是表达载体，其中本发明多核苷酸与包含表达控制序列的多核苷酸可操作连接。这种载体可有效重组生产本发明的多肽。

[0488] 仍如上所述，本发明提供了被本发明多核苷酸或本发明载体转化或转染(稳定或瞬时)的宿主细胞。如上所述，这种宿主细胞可有效生产病毒和生产疫苗。

[0489] 本发明还提供了由本发明新的多核苷酸编码的分离的CD163多肽。

[0490] 本发明的多肽

[0491] 实施例公开了我们的发现，几个新的CD163多肽。本发明包括SEQID NOs：2、14、19、24、27、32、34、36、38、40、42 44、46和48所述的这些新的CD163多肽。

[0492] 因此本发明包括分离的多核苷酸，包含SEQ ID NO：2所述的susCD163v1多肽。

[0493] 本发明还包括与SEQ ID NO：2所述多肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽。

[0494] 因此本发明包括分离的多核苷酸，包含SEQ ID NO：14所述的susCD163v2多肽。

[0495] 本发明还包括与SEQ ID NO：14所述susCD163v2多肽具有至少99％同一性和/或相似性的多肽。

[0496] 本发明还包括具有SEQ ID：24所述序列的鼠CD163v2多肽。

[0497] 本发明还包括具有SEQ ID：27所述序列的鼠CD163v3多肽。

[0498] 本发明还包括至少与SEQ ID NO：27所述多肽具有96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽。

[0499] 本发明还包括具有SEQ ID：32所述序列的多肽。

[0500] 本发明还包括与SEQ ID NO：32所述多肽具有至少98％或99％同一性和/或相似性的多肽。

[0501] 本发明还包括具有SEQ ID：34所述序列的多肽。

[0502] 本发明还包括与SEQ ID NO：34所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性和/或相似性的多肽。

[0503] 本发明还包括具有SEQ ID：36所述序列的多肽。

[0504] 本发明还包括与SEQ ID NO：36所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0505] 本发明还包括具有SEQ ID：38所述序列的多肽。

[0506] 本发明还包括与SEQ ID NO：39所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0507] 本发明还包括具有SEQ ID：40所述序列的多肽。

[0508] 本发明还包括与SEQ ID NO：40所述多肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0509] 本发明还包括具有SEQ ID：42所述序列的多肽。

[0510] 本发明还包括与SEQ ID NO：42所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0511] 本发明还包括具有SEQ ID：44所述序列的多肽。

[0512] 本发明还包括与SEQ ID NO：44所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0513] 本发明还包括具有SEQ ID：46所述序列的多肽。

[0514] 本发明还包括与SEQ ID NO：46所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0515] 本发明还包括具有SEQ ID：48所述序列的多肽。

[0516] 本发明还包括与SEQ ID NO：48所述多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性和/或相似性的多肽。

[0517] 本发明多肽可以从天然细胞来源分离或可以化学合成，但是优选通过包括本发明宿主细胞的重组程序产生。预期哺乳动物宿主细胞的使用提供了这种翻译后修饰(例如糖基化、截短、脂质化和磷酸化)，如同可能是给予本发明重组表达产物最佳生物活性所需的。包括糖基化和非糖基化形式的新的CD163多肽。

[0518] 如上所述的真核和原核宿主中的过度表达促进CD163多肽的分离。因此本发明包括如SEQ ID NOs：2、14、19、24、27、32、34、36、38、40、42、44、46、48所述的分离的CD163多肽和变异体和保守氨基酸置换，其中包括标记的多肽。

[0519] 本发明包括“标记的”新的CD163多肽。在此使用的术语“标记”是指任何合适的可检测基团，包括酶(例如辣根过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖14 125 3 32 35
苷酶)、荧光标记(例如荧光素、荧光素酶)和放射性标记(例如 C、I、H、P和 S)与待
标记的化合物结合或共价结合。标记各种化合物包括蛋白、肽和抗体的技术为大家所熟知。
参见例如，Morrison，Methods in nzymology 32b，103(1974)；Syvanen et al.，J.Biol.Chem.284，3762(1973)；Boltonand Hunter，Biochem.J.133，529(1973)。术语标记的也可以包括如下讨论的已共价连接氨基酸标记的多肽。

[0520] 此外，可以间接标记本发明的新的CD163多肽。这包括向多肽共价添加部分和随后将添加的部分与显示与添加的部分特异性结合的标记或标记化合物连接。间接标记的可能性包括肽的生物素酰化，继之与连接了上述标号基团之一的抗生物素蛋白结合。另一个实例将是将组氨酸标记特异性的放射性标记抗体与包含聚组氨酸标记的CD163s多肽一起孵育。净效果将是放射性抗体与多肽结合，由于用于标记的抗体的相当可观亲合力。

[0521] 本发明还包括新的CD163蛋白的变异体(或类似物)。在一个实例中，提供了插入型变异体，其中一个或多个氨基酸残基添加到新的CD163氨基酸序列。插入可以位于蛋白的两个末端，或者可以位于新CD163蛋白氨基酸序列的内部区域内。在两个末端之一或两个末端同时插入另外残基的变异体可以包括例如融合蛋白和包括氨基酸标签或标记的蛋白。插入型变异体包括新的CD163多肽，其中一个或多个氨基酸残基被添加到CD163酸序列，或其生物学活性片段。

[0522] 因此插入型变异体还可以包括融合蛋白，其中新CD163多肽的氨基和/或羧基末端与另一个多肽融合。各种标记多肽和它们各自的抗体是本领域熟知的。实例包
括聚组氨酸(poly-his)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；流感HA标记多肽
及其抗体12CA5[Fieldet al.，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标记及其
8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体 [Evan et al.，Molecular and CellularBiology，
5：3610-3616(1985)]，和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体[Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其他标记多肽包括Flag-肽[Hopp et al.，BioTechnology，6：1204-1210(1988)]；KT3 表位肽 [Martin et al.，Science，
255：192-194(1992)]；α- 微管蛋白表位肽[Skinner et al.，J.Biol.Chem.，266：
15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标记[Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。此外，可以用酶蛋白如过氧化物酶和碱性磷酸酶标记CD163多肽。

[0523] 在另一个方面，本发明提供了缺失变异体，其中新的CD163多肽中的一个或多个氨基酸残基被除去。缺失可以在新的CD163多肽一个或两个末端实行，或除去新的CD163氨基酸序列内的一个或多个残基。因此缺失变异体包括新的CD163多肽的所有片段。

[0524] CD163多肽含有跨膜或膜固着区域。应该承认当在异源蛋白范围内表达时，这种跨膜结构域可有效帮助异源蛋白靶向膜。还应该承认删除一些跨膜结构域可能有利于提高蛋白的纯化或溶解度。CD163的跨膜缺失变异体和编码它们的多核苷酸具有作为抗病毒治疗的潜在价值。这里具体公开了这种变异体，如SEQ ID NOs：37-40。

[0525] 本发明还包括前述多肽的变异体，就是说，经过保守氨基酸置换而与参照序列有差异的多肽。

[0526] 示例的保守置换在上面称为“定义”的部分的表1、2和3中列出。

[0527] 在那些情况下，优选部分或完全分离新的CD163多肽，可以使用本领域技术人员熟知的标准方法完成纯化。这种方法包括，但不限于，通过电泳后电洗脱、各种类型的层析(免疫亲和、分子筛和/或离子交换)、和/或高压液相色谱分离。有时候，为了完成纯化，可能优选使用这些方法中一个以上的方法。

[0528] 新的CD163多肽纯化可以使用各种技术完成。如果已经合成多肽，使得它的羧基或氨基末端含有标记如六组氨酸(CD163/hexaHis)或其他小肽如FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)或myc(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)，则基本上可以以一步方法纯化它，通过使液体通过亲和柱，其中柱基质与标记或直接与多肽具有高亲合力(即特异性识别CD163的单克隆抗体)。例如，聚组氨酸与镍以高亲合力和特异性结合，因此可以使用镍的亲和柱(如the Qiagen Registered TM镍柱)纯化CD163/polyHis。(例如参见Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，Section 10.11.8，John Wiley & Sons，New York[1993])。

[0529] 即使制备的新CD163多肽没有促进纯化的标记或标签，仍可以用免疫亲和层析纯化本发明的新的CD163。为完成这个，必须用本领域熟知的方法制备CD163多肽特异性的抗体。

[0530] 产生的抗本发明新CD163多肽的抗体可以通过以下方法获得，使用常规方案给动物，优选非人动物施用多肽或承载表位的片段、类似物、或细胞。为了制备单克隆抗体，可以使用本领域已知的提供用传代细胞系培养物产生的抗体的任何技术。实例包括各种技术，如Kohler，G.and Milstein，C.，Nature 256：495-497(1975)；Kozboret al.，Immunology Today 4：72(1983)；Cole et al.，pg.77-96in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的那些。

[0531] 制备的新的CD163多肽没有连接标签，并且不能获得抗体的情况下，可以使用纯化的其他熟知程序。这种程序包括但不限于离子交换层析、分子筛层析、HPLC、非变性凝胶电泳结合凝胶洗脱和制备型等电聚焦(“Isoprime”机器/技术，Hoefer Scientific)有时候，可以组合两个或更多这些技术来达到纯度增加。

[0532] 应该理解本发明多肽的定义意图是包括承载除氨基酸残基插入、缺失或置换之外的修饰的多肽。例如，该修饰性质可以是共价的，和包括例如化学键接聚合物、脂质、其他有机和无机部分。

[0533] 抗体

[0534] 本发明还包括新的CD163或其片段特异性的抗体(例如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双功能/双特异性抗体、人源化抗体、人抗体和互补决定区(CDR)移植抗体，包括包括特异性识别本发明多肽的CDR序列的化合物)。

[0535] 当术语“特异性的”用于描述本发明抗体时，表示本发明抗体的可变区仅仅识别和结合CD163s多肽(即由于结合亲合力的可测量差异，能将CD163s多肽与其他已知多肽相区别，尽管新的CD163和这种多肽之间可能存在定位序列同一性、同源性或相似性)。
很清楚特异性抗体也可以与其他蛋白(例如金黄色葡萄球菌A蛋白或ELISA技术中的其
他抗体)相互作用，通过与抗体可变区外部序列，和尤其是分子恒定区中的序列相互作用。测定本发明抗体结合特异性的筛选试验是本领域熟知和常规实施的。对于这种试验的广泛讨论，参见Harlow et al.(Eds)，Antibodies A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，Chapter 6。也包括识别和结合本发明CD163s多肽片段的抗体，条件是该抗体首先是新的CD163多肽特异性的。本发明抗体可以使用本领域熟知和常规实施的任何方法产生。非人抗体可以通过本领域已知的任何技术人源化。在一个方法中，非人CDRs插入人抗体或公认抗体框架序列。然后可以将更多改变引入抗体框架以调节亲合力或免疫原性。

[0536] 本发明的抗体具有检测或定量CD163s的诊断目的，以及纯化CD163s的用途。也包括包含为了在此所述任何目的的本发明抗体的试剂盒。通常，本发明试剂盒还包括抗体免疫特异性的对照抗原。

[0537] 通过下列实施例进一步阐明本发明，然而并非限制本发明。

[0538] 实施例1：用猪CD163瞬时转染向非许可型细胞系赋予了PRRS病毒感染的许可性。

[0539] 使用来自原代猪肺泡巨噬细胞的总mRNA构建质粒pCMV-Sport6.1(Invitrogen)中的cDNA文库，cDNA克隆在EcoRV和NotI位点之间。这个文库的成员，当分离和瞬时转染BHK-21(婴儿仓鼠肾)细胞系时，赋予PRRS许可表型。细胞在补充5％胎牛
血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中、5％CO2气压、37℃生长。使用
10.0μLLipofectamine 2000(Invitrogen)和2.0μg质粒瞬时转染细胞培养物。用阴性对照质粒pPAMB转染一式两份单层。这个质粒是缺乏插入的pCMV-Sport6.1。用表达绿荧光蛋白(GFP)的质粒监测转染效率。转染后大约24小时，用北美(分离株P129)或欧洲
(96V198分离株)基因型的PRRS病毒感染单层。为了检测PRRS复制，感染后大约24小时，使用80％丙酮固定单层并与偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc.)孵育大约1小时。这个单克隆抗体是开放读框7表达的PRRS病毒病毒粒子特异性的。使
用Nikon TE 300倒置荧光显微镜用10x物镜拍摄含有FITC阳性细胞的单层和阴性对照单层。

[0540] 证实了转染细胞变得对北美(分离株P129)和欧洲(96V198分离株)基因型PRRSV许可。在许多转染的BHK细胞中检测到病毒基因表达，和在上清液中可容易检测到子代病毒。使用没有插入的载体或不相关质粒的对照转染不赋予许可性。

[0541] 使用Big Dye Terminator 1.0版序列反应试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)和Applied Biosystems 3730DNA分析仪(Applied Biosystems)测序功能质粒中插入物，显示与公开的猪CD163基因cDNA(Genbank登录号AJ311716)高度同源的基因。我们鉴定的cDNA相对于AJ311716含有另外的5′和3′非翻译区，和开放读框在三个方面不同：(1)接近5’末端738bp内部缺失，(2)5′末端向上游ATG密码子延伸15bp，和(3)十六个核苷酸改变，预测引起10个氨基酸改变。序列之间核苷酸序列同一性是99.4％。新发现的猪CD163序列与以前报道的序列AJ311716的比对在图1和2中显示。新的猪CD163变异体命名为“susCD163v1”。

[0542]

[0543]

[0544]

[0545]

[0546] 实施例2：质粒pCMVsusCD163v1的构建

[0547] 质粒pCMVsusCD163v1的构建如下进行。原代猪巨噬细胞cDNA文库中鉴定的赋予PRRSV许可性的功能性克隆充当PCR扩增CD163插入物的模板，包括5′和3′非翻译区，使用引物5′DS-CD163(SEQ ID NO：6)(5′-CGGAATTCCGCGGATGTAATAATACAAGAAGA-3′)and3′CD163(SEQID NO：7)(5′CCGCTCGAGTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTT-3′)。在CD163插入物5′末端，引物5′DS-CD163合并aSacII限制酶切位点，而在插入物3′末端，引物
3′CD163合并了XhoI限制酶切位点(下划线)。按照制造商的说明，使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen cat#11708-013)扩增含有190ng质粒模板的反应。反应加热至
94℃2分钟，然后94℃20秒，55℃30秒和68℃3.5分钟循环35次，随后72℃最后延伸7
分钟。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen cat#28104)纯化所产生的PCR产品，用限制性内切酶Sacl1和XhoI消化，和使用Qiaquick Gel提取试剂盒(Qiagen cat#28704)凝胶纯化产生的片段。然后CD163PCR片段连入质粒pCMV-Script(Stratagene cat#212220)，该质粒用Sacl1和XhoI消化而准备接受消化的PCR片段，和随后如上所述凝胶纯化。连接物质转化大肠杆菌菌株DH5α和重组体通过在50μg/ml卡那霉素中生长选择并用限制性内切酶酶切分析鉴定。所产生的质粒“pCMVsusCD163v1”含有在真核CMV启动子转录控制下的实施例1中描述的内部缺失的猪CD163插入物，和在真核和原核启动子控制下的新霉素/卡那霉素抗性基因。

[0548] 实施例3：pRSV-Script表达载体和pRSVsusCD163v1的构建

[0549] 使用质粒pRc/RSV(Invitrogen)作为PCR扩增RSV启动子的模板。RSV启动子序列包含在pRc/RSV的第209直至604位核苷酸之间。合成正向引物PCIRSVLTR(SEQ ID NO：
8)(5′-ACACTCGACATGTCGATGTACGGGCCAGATATACGCGT-3′)和反向引物VSRRTLSAC(SEQ ID NO：9)(5′TTCCTTACAGAGCTCGAGGTGCACACCAATGTGGTGAA-3′)。限制性核酸内切酶Pci I和Sac I识别位点(下划线)分别与5′和3′引物合并。使用HotMaster Tag DNA聚合
酶试剂盒(Eppendorf按照制造商说明书进行PCR。该反应含有0.9ng pRc/RSV质粒模板
和如上所述的0.3μm的每个引物。反应加热至94℃2分钟，然后94℃20秒、52℃10秒和
65℃1分钟循环30次。用限制性内切酶Pci I和Sac I消化所产生的PCR片段、凝胶纯化
并克隆入已被类似消化而除去CMV启动子序列的质粒pCMV-Script(Stratagene)。最终的构建体将RSV启动子置于紧邻多克隆位点上游，并命名为“pRSV-Script”。

[0550] susCD163v1插入物如下克隆在RSV启动子后面。通过限制性内切酶消化(Kpn I和Sac II)从质粒pCMVsusCD163v1切除susCD163v1序列并凝胶纯化。这个片段连入用也已相同酶消化的pRSV-Script并凝胶纯化。连接混合物转化DH5α大肠杆菌并使用50μg/ml卡那霉素选择转化体。含有正确插入物的克隆记做“pRSVsusCD163v1”。

[0551] 实施例4：猪CD163cDNA更长变异体的克隆和表征

[0552] 根据猪CD163v1序列，使用Lasergene PrimerSelect程序(DNASTAR Inc.Madison WI)设计扩增全长猪CD163基因的正向引物5′CD163NotIlong(SEQ ID NO：10)(5′CGGTCCGGAGCGGCCGCGATGTAATAATACAAGAAGATTTAAATGG-3′)和反向引物3′CD163KpnI(SEQ ID NO：1)(5′CGGTTGGTACCCAGCAATATTCTTTTTTATTTAATGCC-3′)。Not I和Kpn I限制性核酸内切酶位点(下划线)分别包括在5′和3′引物中，以允许方便的克隆。从健康猪肺灌洗获得的原代肺泡巨噬细胞(PAM)制备总细胞RNA。使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备RNA制剂。使用SuperScript one-step RT-PCRfor Long Templates试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)准备RT-PCR反应和RT-PCR参数设置如下：50℃30
分钟、94℃2分钟、(94℃30秒、55℃30秒和68℃4分钟)循环30次，72℃10分钟。在
0.8％SeaKem GTG琼脂糖凝胶上分析PCR产物。从琼脂糖凝胶切下各种大小的RT-PCR产
物并使用GeneClean试剂盒(QBiogene)提取DNA。这些RT-PCR产物克隆入pCR2.1-TOPO
克隆载体(Invitrogen)。通过限制性内切酶消化分析克隆中插入物的存在。使用Big Dye Terminator 1.0版测序反应试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)和Applied Biosystems 3730DNA分析仪(Applied Biosystems)对于含有插入物的克隆进行测序，以证实序列真实性。使用Lasergene EditSeq和SeqMan程序(DNASTAR Inc.Madison WI)编辑和装配序列。含大插入物的一个质粒命名为“pCRsusCD163v2”(含有我们命名为SEQ ID NO：12的猪CD163变异体2的pCR2.1)。以下复制了SEQ ID NO：12内所含编码序列并命
名为SEQ ID NO：13。序列分析表明这个猪CD163编码115氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列我们命名为SEQ ID NO：14。当与GenBank(登录号AJ311716)中的猪CD163序列相比时，我们的CD163v2序列在氨基酸水平具有98.9％同一性。CD163v2在5′末端还具有另外的5个氨基酸残基，将开放读框延伸至符合读框的ATG起始密码子上游(如在实施例1中
所述的猪CD163v1序列中)。猪CD163在氨基酸水平与人CD163(GenBank登录号Z22968)
具有84.3％同一性，和与小鼠CD163(GenBank登录号AF274883)具有同一性。预测的SEQ ID NO：14的信号序列和跨膜区分别用下划线和粗体表示。为了确定其它CD163序列是否含有相似序列，通过序列检测可容易地确定该特征。

[0553]

[0554]

[0555]

[0556]

[0557] 限制性内切酶Kpn I和Not I消化后，pCRsusCD163v2中的SusCD163v2从pCR2.1载体脱离，并凝胶纯化。同样用相同的限制性内切酶对酶切受体载体pCMV-script并允许susCD163v2定向克隆入pCMV-script。susCD163v2与pCMV-script连接后，使用连接混合物转化STBL2大肠杆菌细胞(Invitrogen)。通过限制性内切酶消化分析发现一个转化体含有CD163基因并记做pCMV-scriptsusCD163v2clone#3。

[0558] 实施例5：用直接连接和转染方法基于表达系统制备RSV启动子。

[0559] 开发了产生微克数量线状DNA的基于非克隆的程序，该DNA适用于从RSV启动子产生表达CD163的稳定细胞系(图4)。该程序包括两段DNA的分离和连接，一个含有来源于pRSV-script的新霉素基因和RSV启动子盒，和另一个含有来自pCMVsusCD163v2的
susCD163v2编码序列。用DraIII在新霉素基因上游将载体质粒pRSV-Script线性化，并与大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段平端连接。然后用NotI就在RSV启动子下游消化这个
质粒。用DrdI在CD163插入物下游消化载体序列中的pCMVsusCD163v2克隆，并与DNA聚
合酶的Klenow片段平端连接。用位于紧邻CD163编码序列上游的NotI使CD163编码序列
从载体脱离。对于每个质粒消化，从琼脂糖凝胶中纯化适当的片段。大规模连接反应如下进行。大约20μg的每个DNA片段在含15单位T4DNA连接酶的600μL体积中孵育。反应在
室温下孵育20分钟，此时取出等分样品并将反应在干冰上冰冻。等分样品的琼脂糖凝胶分析显示大量剩余的未连接DNA，因此添加另外15单位连接酶并在室温下孵育另外10分钟。
连接后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化含有所有适当元件的DNA线性片段。通过粘性Not I末端连接两个DNA片段，使得CD163基因的5′序列置于RSV启动子下游，允许CD163在哺乳动物细胞中直接表达。一旦被分离，纯化DNA就用于转染各种哺乳动物细胞系。

[0560] 实施例6：人CD163cDNA的克隆和表征

[0561] 根据已知的人CD163cDNA序列(GenBank登录号BC051281)，使用PrimerSelect程序设计正向引物Hu5′Not(SEQ ID NO：15)(Hu5′CACCGCGGCCGCGAAGTTATAAATCGCCACCATGAGCAAACTCAGAATGG-3′)和反向引物Hu3′Kpn(SEQ ID NO：16)(5′-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3′)。NotI和KpnI限制性位点(下划线)分别与5′和
3′引物合并，以促进克隆入表达载体。序列CACC添加至5′引物的5′末端以允许定向克隆入pCDNA3.1D/V5/His/TOPO载体(Cat.No.K49001，Invitrogen，参见图6)。用佛波醇
12-肉豆蔻酸盐13-醋酸盐(100ng/ml)刺激3天后从U937细胞系提取RNA，从该RNA扩增
人CD163cDNAs。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)制备总细胞RNA。RT-PCR反应和测序方法
与实施例4中描述的相同。在0.8％SeaKem琼脂糖凝胶上分离PCR产物并使用GeneClean
试剂盒从凝胶中提取。按照制造商说明书将PCR产物直接克隆入pCDNA3.1D/V5/His/TOPO载体。对含大插入物的两个克隆进行测序。测序和和序列分析方法与实施例4中描述的相同。具有正确插入物的克隆记做“pcDNA3.1D-humCD163v2”和我们将插入物序列命名为SEQ IDNO：17。

[0562] pCDNA3.1D-humCD163v2中的CD163开放读框长度是1121个残基(命名为SEQID NO：18，它编码以下公开的SEQ ID NO：19)，和与Genbank Z22968(一种相同长度的人CD163cDNA)具有100％同一性。我们的人CD163v2序列同样与Genbank BC051281和
Z22969(人CD163的剪接变异体)具有100％同一性，除了两个Genbank序列中的42个非
同源残基取代了我们序列的七个羧基末端残基。这个差异是由于BC051281和Z22969中
存在83-核苷酸外显子，和产生的读框在外显子3′末端移位(Law，S.K.，Micklem，K.J.，Shaw，J.M.，Zhang，X.P.，Dong，Y.，Willis，A.C.and Mason，D.Y.(1993)A newmacrophage differentiation antigen which is a member of thescavenger receptor superfami ly.European Journal of Immunology23(9)，2320-2325)。

[0563]

[0564]

[0565]

[0566]

[0567] 实施例7：鼠CD163的克隆和表征

[0568] 根据GenBank中的鼠CD163序列(AF274883)，使用Primer Select程序设计正向引物Mus-new5′(SEQ ID NO：20)(5′-CACCGCGGCCGCCACACGGAGCCATCAAAATCATCAA-3′)和反向引物Mus-new3′(SEQ ID NO：21)(5′-GGTACCGCGAACAAGCAAACCAATAGCAATATTGTTTAATTCCCTC-3′)。Not I和Kpn I限制性内切酶位点分别包括在5′和3′引物，以允许将来克隆入其他表达载体。乙醇酸盐介质注射入腹腔后2天，从小鼠收获小鼠腹膜巨噬细胞。使用RNeasy试剂盒从腹膜巨噬细胞制备总细胞RNA。RT-PCR反应和RT-PCR参数与实施例4所述相同，除了退火温度增至60℃和延伸温度增至72℃。在0.8％SeaKem琼
脂糖凝胶上纯化PCR产物并根据制造商说明书克隆入pCDNA3.1D/V5/His/TOPO。鉴定了
具有大插入物的几个克隆用于进一步分析。含有插入物(SEQ ID NO：22)的质粒命名为“pCDNA3.1D-murCD163v2”，插入物具有编码与(SEQ IDNO：24的1121个氨基酸)长度相同，且仅有两个氨基酸与GenbankAF274883不同的蛋白的鼠CD163。

[0569] 产生另一个质粒-“pCDNA3.1D-murCD163v3”，含有插入物(SEQ IDNO：25)，插入物含有编码长度1159个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：27)的鼠CD163编码序列(SEQ ID NO：26)。它与AF274883在前1107个残基内仅仅3个氨基酸不同(99.7％同一性)，但是从第
1108个残基开始该序列完全偏离。这是由于82个核苷酸插入cDNA，和伴随的插入物下游阅读框移动。结果，小鼠CD163v3在其羧基末端含有52个氨基酸，与鼠CD163v2的14个羧基末端残基不同源。这两个择一形式的“全长”小鼠CD163很可能是同一基因的剪接变异体，如对人CD163所述(Law，S.K.，Micklem，K.J.，Shaw，J.M.，Zhang，X.P.，Dong，Y.，Willis，A.C.and Mason，D.Y.(1993)A new macrophage differentiation antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily.European Journal of Immunology
23(9)，2320-2325)。

[0570]

[0571]

[0572]

[0573]

[0574]

[0575]

[0576]

[0577] 实施例8：MARC-145CD163的克隆和表征

[0578] 使用正向引物5′simianCD163(SEQ ID NO：28)(根据人CD163的5′-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3′)和反向引物HuCD163-3′Kpn(SEQ ID NO：29)(5′-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3′)从MARC-145非洲绿猴肾细胞扩增CD163cDNA。
使用RNeasy试剂盒从MARC-145细胞制备总细胞RNA。RT-PCR参数与实施例4中描述的
相同。根据制造商说明书将RT-PCR产物直接克隆入pCDNA3.1D/V5/His/TOPO载体。分析含有大插入物的几个克隆。克隆#25命名为“pCDNA3.1D-MARC-CD163v2”。来自MARC-145细胞的这个新CD163cDNA长度是1116个氨基酸。当与GenBank数据库中的序列相比
时，MARC-145CD163氨基酸序列与人CD163(Genbank Z22968)具有96.3％同一性，与猪
CD163(Genbank AJ311716)具有84.7％同一性，和与小鼠CD163(Genbank AF274883)具有
73.9％同一性。

[0579]

[0580]

[0581]

[0582]

[0583] 实施例9来自Vero细胞的猿CD163的克隆和表征

[0584] 使用正向引物5′simianCD 163(SEQ ID NO：28)(基于人CD163的5′-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3′)和反向引物HuCD163-3′Kpn(SEQ ID NO：29)(5′-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3′)从Vero细胞扩增CD163cDNA。使用RNeasy试剂盒从Vero细胞制备总细胞RNA。RT-PCR参数与实施例4中描述的相同。根据制造商说明书将RT-PCR产物直接克隆入pCDNA3.1D/V5/His/TOPO载体。对含有大插入物的八个克隆进行测序，发现了六个慎重剪接模式。图17中图解描述了这些模式。

[0585] 六个剪接变异体在存在或缺少三个外显子-命名为E6、E105和E83方面不同。E6或E105的遗漏不改变阅读框，而E83的遗漏却改变。在猪、人和MARC-145猴细胞中也看到与v2和/或v3相似的模式。模式v4和v5缺乏编码疏水跨膜区的105个核苷酸的外显子。在瞬时转染试验中，这些cDNAs不能致使BHK细胞对PRRSV感染许可，大概因为CD163被分泌而不是保持与膜结合。尽管缺乏跨膜区的CD163分子好象如同细胞许可因子一样无功能，但是它们可能在直接病毒中和(与中和抗体相似)或作为诱导将阻断宿主动物中病毒感染的抗CD163抗体的免疫原中有用。

[0586] 最长的剪接变异体v7含有所有的三个外显子-E6、E105和E83。来自Vero细胞的这个新CD163编码长度为1153个氨基酸的多肽。当与GenBank数据库中的序列相
比时，Vero CD163v7氨基酸序列与人CD163(Genbank Z22968)具有95.4％同一性，与猪CD163(GenbankAJ31716)具有83.7％同一性，和与小鼠CD163(Genbank AF274883)具有
72.1％同一性。以下提供了Vero细胞中发现的六个剪接变异体的核苷酸和氨基酸序列
(SEQ ID NOS：33-44)。

[0587]

[0588]

[0589]

[0590]

[0591]

[0592]

[0593]

[0594]

[0595]

[0596]

[0597]

[0598]

[0599]

[0600]

[0601] 实施例10来自DH82细胞的犬CD163的克隆和表征

[0602] 使用正向引物5′simianCD163(SEQ ID NO：28)(根据人CD163的5′-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3′)和反向引物HuCD163-3′Kpn(SEQ ID NO：29)(5′-GCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3′)从DH82细胞扩增CD163cDNA。使用RNeasy试剂盒从DH82细胞制备总细胞RNA。RT-PCR参数与实施例4中描述的相同。根据制造商说明
书将RT-PCR产物直接克隆入pCDNA3.1D/V5/His/TOPO载体。分析含有大插入物的几个克隆。分析了具有大插入物的几个克隆，和这些分为其他物种中看到的v2或v3剪接模式。
v2变异体相对于v3变异体缺少81个核苷酸的外显子(E81)，引起阅读框移动和替换的羧基末端氨基酸序列。来自DH 82细胞的犬CD163v2cDNA编码1115个氨基酸的肽。当与
GenBa nk数据库中的序列相比时，它与人CD163(Genbank Z22968)具有83.9％同一性，与猪CD163(Genbank AJ311716)具有85.1％同一性，和与小鼠CD163(Genbank AF274883)具有74.3％同一性。以下提供了DH82细胞中发现的两个剪接变异体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS：45-48)。

[0603]

[0604]

[0605]

[0606]

[0607]

[0608]

[0609] 实施例11用pCMV-susCD163v1瞬时转染后，致使各种细胞系对北美PRRSV感染许可

[0610] 从Pfizer Inc.获得猪肾(PK032495)、Norden Lab s猪睾丸(NLST-1)、Norden Labs狗肾(NLDK-1)并在37℃和5％CO2下，由补充5％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。从Pfizer Inc.获得婴儿仓鼠肾(BHK21)细胞系、NordenLabs
猫肾(NLFK-1)和兔肺(RL)并在37℃和5％CO2下，由补充10％肽牛血清(FBS)、1mM丙
酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Invitrogen目录
号11965)组成的生长培养基中生长。从Pfizer Inc.获得Ve ro细胞并在37℃和5％
CO2下，由补充10％肽牛血清(FBS)、2mM L-谷酰胺和每毫升20微克庆大霉素的极限必
需培养基Alpha(MEM，Pfizer Inc.制剂)组成的生长培养基中生长。用每孔2微克质粒
pCMV-susCD163v1，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine 2000(Invi trogen
6
目录号11668-027)根据制造商说明书转染含有大约1×10 个细胞的细胞培养孔(35mm)。
用每孔1.0微克的质粒pCMV-susCD163v1转染RL细胞系。无插入物的PAM细胞cDNA文库
成员，命名为pPAMB(基本上和空pSport质粒载体)，用作阴性对照质粒。转染24小时后，抽吸孔并用DMEM/5％FBS洗涤两次，随后用北美PRRSV分离株P129感染。允许病毒吸附于
0.5ml生长培养基株至少两小时，之后添加另外的培养基至终体积2.0ml并孵育过夜。然后除去病毒，孔用生长培养基洗涤两次，并添加新鲜生长培养基(每孔2.0ml)。立即取零时间培养液样品，为了确定来自接种物的传染性病毒的背景水平。感染至少48小时，为了试验有活力的病毒，除去培养液筛选许可型的培养物，被通过荧光抗体试验(FA)检测单层中的许可型细胞。通过用80％丙酮固定单层，并用对于PRRSV核壳蛋白特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc)染色而完成FA。通过将培养稀释液接种到MARC-145细胞上滴定有活力的病毒。表5通过FA显示了病毒感染的结果和试验的每个细胞系的子代病毒的存在。

[0611] 没有从一些细胞系检测到子代病毒可能是细胞培养液中病毒滴度低于试验的检测极限的结果。susCD163v1表达增加了Vero细胞对PRRSV感染的许可性。与背景病毒的零时间测定结果相比，pCMV-susCD163v1转染的Vero细胞中病毒滴度有几乎两个对数级的增加，而阴性对照质粒pPAMB转染的细胞中滴度增加少于一个对数级。FA检测，除NLDK-1之外的所有细胞系用pCMV-susCD163v1转染后对北美PRRSV分离株P129感染的许可性是阳性。

[0612] 表5

[0613]

[0614] +++＝强阳性

[0615] ++＝中等阳性

[0616] +＝弱阳性

[0617] -＝不可检测到

[0618] NT＝未试验

[0619] 实施例12用pCMV-susCD163v1瞬时转染后，致使BHK21细胞系对欧洲PRRSV感染许可

[0620] 从Pfizer Inc.获得婴儿仓鼠肾(BHK21)细胞系并在37℃和5％CO2下，由补充10％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle
培养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2微克质粒
pCMV-susCD163v1，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen目
6
录号11668-027)根据制造商说明书转染含有大约1×10 个细胞的细胞培养孔(35mm)。转染24小时后，抽吸孔并用DMEM/5％FBS洗涤两次，随后用欧洲PRRSV分离株96V 198感染。
允许病毒吸附至少2小时。然后除去病毒，孔用生长培养基洗涤两次，并添加新鲜生长培养基(每孔2.0ml)。立即取零时间培养液样品，为了确定来自接种物的传染性病毒的背景水平。感染至少48小时，为了试验有活力的病毒，除去培养液筛选许可型的培养物，并通过荧光抗体试验(FA)检测单层中的许可型细胞。通过用80％丙酮固定单层，并用对于PRRSV核壳蛋白特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc)染色而完成FA。通过将培养稀释液接种到MARC-145细胞上滴定有活力的病毒。用pCMV-susCD163v1瞬时转染BKH21的结果致使细胞对欧洲PRRSV分离株96V198感染许可并产生子代病毒。

[0621] 实施例13：来自多个动物物种的CD163基因致使BHK21细胞对PRRS病毒感染许可

[0622] BHK21细胞在补充10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠和抗生素的DMEM(Invitrogen目录号11965)中生长，并用于瞬时转染实验。转染前，细胞用无血清或其他添加
剂的OptiMEM(Invitrogen)洗涤一次。在所有转染实验中使用Lipofectamine
2000(Invitrogen)，根据制造商提供的方案。转染混合物由每35mm孔10微升
Lipofectamine 2000和2-3微克DNA组成。培养过夜后，除去转染培养基和用PRRSV分
离株P129感染细胞。当细胞被80％丙酮固定并被偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technology Inc.，Brookings，SD)染色时，允许感染发展24-48小时。在荧光显微镜下可见核壳蛋白的染色。

[0623] 表6用各种CD163基因瞬时转染BHK21细胞致使它们对PRRS病毒感染许可

[0624] 表6

[0625]

[0626] +++＝强阳性

[0627] ++＝中等阳性

[0628] +＝弱阳性

[0629] 实施例14使用pCMV-susCD163v1产生稳定的PRRSV许可型BHK21细胞系

[0630] BHK21细胞在补充10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长。对于转染，在大约90％融合时将细胞接种于6孔板并在37℃、5％CO2中培养过夜。使用lipofectamine 2000(Invitrogen)，根据制造商的说明书，用pCMV-susCD163v1DNA转染细胞。转染后一天，胰蛋白酶化消化细胞并以稀释系列再接种入
96孔板。为选择稳定转染子，以此点向前，培养基补充1mg/ml遗传霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)。每3-5天更换培养基。培养该板直到具有源自单细胞的菌落的那些孔达到融合，在此点胰蛋白酶化消化板并接种入96孔板副板。用PRRSV分离株P129感染一个96孔板副板并用偶联FITC的单克隆SDOW17染色鉴定出对感染许可的克隆。
从第二个副板扩充阳性克隆。为确保均一性，通过有限稀释单细胞克隆阳性培养物。在每个克隆中，选择表现出生长强壮和高PRRSV许可型的亚克隆进行扩充。选择了命名为BHK/CMV/v1#3、BHK/CMV/v1#5和BHK/CMV/v1#12(图6)的三个克隆。这些细胞系经过20次传
代仍保持许可表型。

[0631] 实施例15使用pRSV-susCD163v1产生稳定的PRRSV许可型BHK21细胞系

[0632] 如实施例14所述培养BHK-21细胞。如实施例14所述，使用Lipofectamine 2000，用pRSVsusCD163v1转染BHK-21细胞。基本上如实施例14所述进行转染细胞的克隆和许可克隆的筛选。从原始克隆鉴定到3个单细胞克隆为许可型和随后再克隆另外两次以确保均一性和试图分离更高许可型的亚克隆(参见图7)。所产生的细胞系命名为BHK/RSV/V1#2、#3和#4。所有这些克隆经过试验的最高次传代(对于克隆#2，传代11次，对于克隆#3，传代7次，和对于克隆#4，传代5次)保持了许可型表型。

[0633] 实施例16使用pCMV-susCD163v1产生稳定的PRRSV许可型猫肾细胞系

[0634] 亲本Norden Labs猫肾(NLFK)细胞在37℃和5％CO2下，补充10％肽牛血清、1mM丙酮酸钠和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基(Invitrogen目录号11965-092)
中生长。用每孔4微克质粒pCMV-susCD163v1，在OptiMEM中，使用Lipofectamine
6
2000(Invitrogen目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约4×10 个
细胞的几个35mm孔。培养过夜后，使用稀释于培养基的Accutase(Innovative Cell
2 3
Technologies，目录号AT104)从基质中除去细胞、并以三种密度(每孔大约2×10、2×10
4
和2×10 个细胞)接种入三个96孔板。开始选择稳定转化体之前，允许细胞在37℃沉
淀过夜。次日早晨，用含有500微克/ml遗传霉素(G418 sulfate、Invitrogen目录号
10131-027)的100微升/孔新鲜培养基替换培养基以选择表达新霉素抗性基因的细胞。每
2或3天更换培养基以保持遗传霉素效力。选择19天后，原代细胞密度最低的96孔板(大约200个细胞/孔)产生70个空孔和具有一个或多个抗G418细胞的菌落的26个孔(使用
泊松分布计算，抗性细胞数量/孔是0.3)。这26个孔分为副孔并允许沉淀过夜。用PRRSV分离株P129感染一组孔，然后用80％丙酮固定并用对于PRRSV核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc)染色。在26个克隆中，8个含有PRRSV感染的一些细胞。这些之一，命名为“NLFK-CMV-susCD163v1-G4”，清楚地比其余病毒抗原几乎
100％细胞染色阳性的那些更加许可。

[0635] 第5代细胞，NLFK-CMV-susCD163v1-G4细胞系中有一些表型不纯一的证据。因此，通过在含有G418的培养基中有限稀释，从冷冻原料NLFK-CMV-susCD163v1-G4第4代开始，单克隆克隆了细胞。扩充十二个这种克隆(“A”-“L”)用于研究。在这些当中，克隆NLFK-CMV-susCD163v1-G4F和NLFK-CMV-susCD163v1-G4L被PRRSV分离株P129感染时，形成分散噬菌斑(位于CPE区域)的能力很显著(参见图8)。

[0636] 实施例17使用pRSV--susCD163v1产生稳定的PRRSV许可型猫肾细胞系

[0637] Norden Labs猫肾(NLFK)细胞在37℃和5％CO2下，补充10％肽牛血清和抗生素的最低必需培养基Alpha培养基(Invitrogen目录号12571-071)中生长。NLFK细胞在
大约90％融合时接种于6孔板并允许贴壁过夜。然后用pRSV-susCD163v1转染细胞，使用lipofectamine2000(Invitrogen)，按照制造商的说明书。24小时后，如实施例14所述克隆细胞。筛选PRRSV许可型细胞，如实施例14所述进行克隆。从筛选中选择了四个克隆并通过有限稀释另外两次进行单细胞克隆。选择名为FK/RSV/v1#1、FK/RSV/v1#2、FK/RSV/v1#3和FK/RSV/v1#4的四个克隆。这些细胞系经过至少8次传代，仍保持了PRRSV许可表型(参见图9)。

[0638] 实施例18使用pCMV-susCD163v1产生稳定的PRRSV许可型猪肾细胞系

[0639] 从Pfizer Inc.获得亲本猪肾(PK032495)细胞系并在37℃和5％CO2下，由补充5％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培
养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2微克质粒
pCMV-susCD163v1，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen
6
目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约1×10 个细胞的组织培养孔
(35mm)。培养过夜后，细胞用PBS洗涤并使用Accutase(Innovative Cells Technologies，目录号AT 104)从基质中除去，以每毫升1.0毫克稀释于含有遗传霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)的生长培养基并以各种密度接种入96孔板以确保遗传霉素选择后单细胞克隆的回收。遗传霉素选择始终，大约每3至5天更换培养基。选择后，含有单细胞克隆的孔扩充为96孔副板并允许培养直至达到100％融合。通过PRRSV分离株P129感染至少48小时筛选一组细胞的PRRSV许可性。发现十一个克隆是PRRSV许可型的。这
些之一，命名为“PK-CMV-susCD163v1-A10”，在很多次传代之后，清楚地保持许可表型(参见图10)。

[0640] 实施例19使用pCMVScript-susCD163v2产生稳定的PRRSV许可型BHK 21细胞系

[0641] 从Pfizer Inc.获得亲本婴儿仓鼠肾(BHK21)细胞并在37℃和5％CO2下，由补充10％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良
Eagle培养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2
微克质粒pCMVScript-susCD163v2，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine
6
2000(Invitrogen目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约1×10 个细胞
的组织培养孔(35mm)。培养过夜后，细胞用PBS 洗涤并使用Accutase(Innovative Cells Technologies，目录号AT104)从基质中除去，以每毫升1.0毫克稀释于含有遗传霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)的生长培养基并以各种密度接种入96孔板以确保遗传霉素选择后单细胞克隆的回收。遗传霉素选择始终，大约每3至5天更换培养基。选择后，含有单细胞克隆的孔扩充为96孔副板并培养直至达到100％融合。通过PRRSV分离株P129感染并培养至少48小时筛选一组孔的许可性。发现三个克隆是PRRSV许可型的，和选择这些之一命名为“BHK-CMVScript-susCD163v2-A9”用于进一步研究(参见图1)。

[0642] 实施例20使用pRSV-susCD163v2产生稳定的PRRSV许可型BHK21细胞系

[0643] 如实施例14所述培养 BHK-21细胞。用实施例 5描述的连接的DRSV-susCD163v2DNA构建体转染BHK-21细胞，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，按照制造商的说明书。随后的PRRSV许可型细胞系的克隆和选择如实施例14所述进行。在筛选的336个单细胞克隆当中，129个是阳性的。这些细胞克隆中的几个已经传代达到7次并且它们保持PRRSV许可表型(参见图12)。这些细胞系已被命名为BHK/RSV/v2，之后是克隆数字编号。

[0644] 实施例21使用pCMVScript-susCD163v2产生稳定的PRRSV许可型猪肾细胞系

[0645] 从Pfizer Inc.获得亲本猪肾(PK032495)细胞系并在37℃和5％CO2下，由补充5％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良
Eagle培养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2
微克质粒pCMVScript-susCD163v2，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine
6
2000(Invitrogen目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约1×10 个细
胞的组织培养孔(35mm)。培养过夜后，细胞用PBS洗涤并使用Accutase(I nnovative
CellsTechnologies，目录号AT104)从基质中除去，以每毫升1.0毫克稀释于含有遗传
霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)的生长培养基并以各种密度接种
入96孔板以确保遗传霉素选择后单细胞克隆的回收。遗传霉素选择始终，大约每3至
5天更换培养基。选择后，含有单细胞克隆的孔扩充为96孔副板并培养直至达到100％
融合。通过PRRSV分离株P129感染并培养至少48小时筛选一组孔的许可性。命名为
“PK-CMvScript-susCD163v2-D1”的一个克隆显示出PRRSV许可表型。

[0646] 实施例22使用pcDNA3.1D-humCD163v2产生稳定的PRRSV许可型BHK21细胞系

[0647] 从Pfizer Inc.获得亲本婴儿仓鼠肾(BHK21)细胞并在37℃和5％CO2下，由补充10％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良
Eagle培养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2
微克质粒pcDNA3.1D-humCD163v2，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine
6
2000(Invitrogen目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约1×10 个细胞
的组织培养孔(35mm)。培养过夜后，细胞用PBS洗涤并使用Accutase(Innovative Cells Technologies，目录号AT104)从基质中除去，以每毫升1.0毫克稀释于含有遗传霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)的生长培养基并以各种密度接种入96孔板以确保遗传霉素选择后单细胞克隆的回收。遗传霉素选择始终，大约每3至5天更换培养基。
选择后，含有单细胞克隆的孔扩充为96孔副板并培养直至达到100％融合。通过PRRSV分离株P129感染，培养至少48小时筛选一组孔的许可性。发现七个候选克隆是PRRSV许可型的。七个候选克隆中每一个中都有一些表型不纯一证据，可能是因为它们不是无性系的。
因此，候选克隆通过在含有G418的培养基中有限稀释而被单细胞克隆。获得了一个具有明确PRRS许可性的单细胞克隆并命名为BHK-cDNA3.1D-humCD163v2-H9。

[0648] 实施例23使用pcDNA3.1D-humCD163v2产生稳定的PRRSV许可型猫肾细胞系

[0649] 亲本Norden Labs猫肾(NLFK)细胞在37℃和5％CO2下，在由补充10％肽牛血清(FBS)、ImM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培
养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2微克
质粒 pcDNA3.1D-humCD163v2，在无 FBS或抗生素的DMEM 中，使用 Lipofectamine
6
2000(Invitrogen目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约1×10 个细胞
的组织培养孔(35mm)。培养过夜后，细胞用PBS洗涤并使用Accutase(Innovative Cells Technologies，目录号AT104)从基质中除去，以每毫升500微克稀释于含有遗传霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)的生长培养基并以各种密度接种入96孔板以确保遗传霉素选择后单细胞克隆的回收。遗传霉素选择始终，大约每3至5天更换培养基。选择后，含有单细胞克隆的孔扩充为96孔副板并培养直至达到100％融合。通过PRRSV分离株P129感染至少48小时筛选一组孔的PRRSV许可性。发现五个克隆是许可型的。这些之一，命名为“FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6”，清楚地显示许可表型(参见图13)。

[0650] 检测NLFK亲本细胞和FK-cDNA 3.1D-humCD163v2-A6的一个亚克隆的CD163表达。细胞固定于80％丙酮中并与山羊抗人CD163(R&D系统以1∶200)反应一个小时，随
后用PBS洗涤。对于显象，使用与偶联FITC的驴抗山羊IgG(Biodesign Inc以1∶100)。
在NLFK亲本细胞中没有检测到特异性荧光，如图21A所示。大多数FK.A6.A2亚克隆显示好的荧光染色，表明CD163的存在(图21B)。

[0651] 实施例24使用pcDNA3.1D-humCD163v2产生稳定的PRRSV许可型猪肾细胞系

[0652] 从Pfizer Inc.获得亲本猪肾(PK032495)细胞系并在37℃和5％CO2下，由补充5％肽牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰胺和抗生素的Dulbecco改良
Eagle培养基(DMEM，Invitrogen目录号11965)组成的生长培养基中生长。用每孔2
微克质粒pcDNA3.1D-humCD163v2，在无FBS或抗生素的DMEM中，使用Lipofectamine
6
2000(Invitrogen目录号11668-027)根据制造商说明书转染每个含有大约1×10 个细胞
的组织培养孔(35mm)。培养过夜后，细胞用PBS洗涤并使用Accutase(Innovative Cells Technologies，目录号AT104)从基质中除去，以每毫升1.0毫克稀释于含有遗传霉素(G418 sulfate，Invitrogen目录号10131-027)的生长培养基并以各种密度接种入96孔板以确保遗传霉素选择后单细胞克隆的回收。遗传霉素选择始终，大约每3至5天更换培养基。选择后，含有单细胞克隆的孔扩充为96孔副板并培养直至达到100％融合。通过PRRSV分离株P129感染至少48小时筛选一组孔的PRRSV许可性。发现两个克隆是许可型的。这些之一命名为“PK-cDNA3.1D-humCD163v2-B11”清楚地显示出PRRSV许可表型。

[0653] 实施例25使用连接的pRSV-Script MARC CD163v2产生稳定的PRRSV许可型猫肾细胞系

[0654] 开发了产生微克数量线状DNA的基于非克隆的程序，该DNA适用于从RSV启动子产生表达CD163的稳定细胞系(图4)。相似的方法适于将来自MARC-145细胞的猿CD163v2置于RSV启动子之后。该程序包括两段DNA的分离和连接，一个含有来源于pRSV-script的新霉素基因和RSV启动子盒，和另一个含有来自pCDNA3.1D MARC CD163v2的MARC CD163v2编码序列。用Hind III和Kpn I将载体质粒pRSV-Script线性化。首先用Kpn I消化质粒并用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段平端连接。然后用就在RSV启动子下游的Hind III消化这个质粒。用CD163插入物下游的EcoRV和CD163上游的Hind III消化载体序列
中的pCDNA3.1D MARC CD163v2克隆。CD163编码序列从载体释出。对于每个质粒消化，从琼脂糖凝胶中纯化适当的片段。大规模连接反应如下进行。大约20μg的每个DNA片段在含15单位T4DNA连接酶的600μL体积中孵育。反应在室温下孵育1小时。连接后，通过
琼脂糖凝胶电泳纯化含有所有适当元件的DNA线性片段。进行限制性内切酶消化分析以证实每个连接片段的真实性。通过粘性Hind III末端连接两个DNA片段，使得MARCCD163基因的5′序列置于RSV启动子下游，允许CD163在哺乳动物细胞中直接表达。一旦被分离，纯化DNA就用于转染选择的哺乳动物细胞系。

[0655] Norden Labs猫肾(NLFK)细胞在37℃和5％CO2下，补充5％肽牛血清和抗生素的DMEM中生长。NLFK细胞在大约90％融合时接种于6孔板并允许贴壁过夜。然后用
pRSV-MARC CD163v2转染细胞，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)，按照制造商的说明书。24小时后，如实施例12所述克隆细胞。筛选PRRSV许可型细胞，如实施例12所述进行克隆。一个克隆是PRRSV感染阳性的并命名为NLFK-MARCCD163D4。这个D4克隆经过9次
传代仍保持PRRSV许可表型。

[0656] 实施例26从CMV启动子稳定表达susCD163v1的重组BHK-21和NLFK细胞中PRRSV分离株NVSL 94-3的生长动力学

[0657] 测定由PRRSV感染的被稳定改造以表达susCD163v1的BHK-21或NLFK细胞产生的子代病毒的量。表达susCD163v1、BHK/CMV/susv1#3、BHK/CMV/susv1#5、BHK/CMV/susv1#12和FK/CMV/susv1 G4的四个细胞系在亚融合接种于6孔板，和培养过夜后，用PRRSV的NVSL94-3分离株感染。MARC-145细胞包括在实验株用于对比。病毒以大约0.1的m.o.i.感染细胞。吸附病毒60-90分钟并除去。细胞用PBS洗涤三次以除去残留的病毒。感染后立即开始并继续直达96小时，以12小时的间隔从培养物中收获一毫升等份。在各个时间点，向细胞添加新鲜培养基以保持培养体积足以防止细胞单层干燥。培养上清液在-80℃保存直至收集了所有样品。通过酸菌斑法在MARC-145细胞上测定培养上清液中存在的PRRSV量。
图14表明所有表达CD163的重组细胞系能够产生子代PRRSV。

[0658] 实施例27用抗CD163抗体阻断PRRSV感染：瞬时转染的细胞

[0659] 用实施例8描述的质粒pCDNA3.1D-MARC-CD163v2，使用实施例14描述的Lipofectamine 2000瞬时转染接种在24孔板中的BHK-21细胞。培养过夜允许CD163表
达后，向细胞中添加100μL体积的含人CD163特异性的山羊多克隆抗体(R&D Systems，cat#AF1607)的PBS。作为对照，使用等量正常山羊IgG(R&D Systems，cat#_AB-108-C)。
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37℃孵育一小时后，用大约1×10pfu的表达GFP的PRRSV重组P129菌株感染单层。含抗
CD163抗体和PRRSV的细胞单层在37℃孵育1小时，此时吸出病毒接种物/抗体混合物，细胞单层用PBS洗涤一次，和向孔中添加1ml生长培养基。细胞在37℃培养24小时，以允许PRRSV指导的GFP表达。为了分析，胰蛋白酶消化细胞，重悬于500μL PBS并用流式细胞术分析以通过GFP表达对PRRSV感染细胞进行计数。对于流式细胞术，使用未感染的BHK-21细胞设置荧光检测的基线，和分析来自每个随后样品的大约100,000个细胞。这个分析的结果，在图15中表示，表明与与正常山羊IgG孵育的细胞相比，CD163特异性抗体能够显著降低感染细胞的数量。

[0660] 实施例28用抗CD163抗体阻断PRRSV感染：稳定转染的细胞

[0661] 实施例23描述的稳定表达人CD163的NLFK细胞(FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6)接种入24孔板。允许细胞贴壁过夜后，向细胞中添加100μL体积的含人CD人CD163特
异性的山羊多克隆抗体(R&D Systems，cat#AF1607)的PBS。作为对照，使用等量正常山羊IgG(R&D Systems，cat#AB-108-C)。37℃孵育一小时后，用大约1×107pfu的表达GFP的PRRSV重组P129菌株感染单层。细胞单层与抗CD163抗体和PRRSV在37℃孵育1小时，此
时吸出病毒接种物/抗体混合物，细胞单层用PBS洗涤一次，和向孔中添加1ml生长培养基。细胞在37℃培养24小时，以允许PRRSV指导的GFP表达。为了分析，胰蛋白酶消化细胞，重悬于500μL PBS并用流式细胞术分析以通过GFP表达对PRRSV感染细胞进行计数。
分析来自每个样品的大约100,000个细胞。这个分析的结果，在图16中表示，表明与与正常山羊IgG孵育的细胞相比，CD163特异性抗体能够显著降低感染细胞的数量。

[0662] 实施例29使用pRSV-susCD163v2产生稳定的PRRSV许可型猪肾细胞系

[0663] 如实施例21所述培养猪肾细胞(PK032495)。对于转染，细胞在80％融合时接种于24孔板并允许复原过夜。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，按照制造商的说明书进行实施例5描述的pRSV-susCD163v2DNA的转染。PRRSV许可型细胞系随后的克隆和选择基本上如实施例14所述进行。通过有限稀释最初克隆没能产生来自单细胞的克隆，因此通过有限稀释再克隆含PRRSV许可型细胞的5个孔以产生无性细胞系。选择10个克隆进行进一步研究和这些克隆之一PK-RSVScript-susCD163v2#9显示出支持感染后早期的PRRSV集中生长的能力(参见图18)。

[0664] 实施例30使用pRSV-susCD163v2产生稳定的PRRSV许可型猫肾细胞系

[0665] 如实施例17所述培养NLFK猫肾细胞。对于转染，细胞以大约80％的最大密度接种于24孔板。培养过夜后，用连接得到的RSV/susCD163v2转染单层(参见实施例5)，使用Lipofectamine，按照制造商的说明书。转染细胞的克隆和PRRSV许可型细胞克隆的选择基本上如实施例14所述进行。在测试PRRSV许可性的67个细胞克隆中，发现20个是阳性的。观察到的染色实例在图19中显示。

[0666] 实施例31PRRSV分离株P201在PK-RSVScript-susCD163v2细胞中的传代

[0667] PRRSV临床分离株的扩增如下进行。外周肺泡巨噬细胞(PAM)以每10cm25.4E6个细胞接种于6孔皿，使用补充2％FBS的OptiMEM培养基。6小时后，吸出培养基并向细胞中添加从PRRSV感染猪收获的2ml等份血清。吸附90分钟后，除去血清接种物并用OptiMEM更换。感染大约40后，收获上清液并以10分钟离心澄清。使用6小时吸附，上清液直接用于感染PK-RSVScript-susCD163v2克隆#9细胞。接种物除去后，细胞再饲喂D-MEM。使用交互感染细胞，P201病毒在PK-RSVScript-susCD163v2#9细胞系和无细胞的上清液传代物上连续传代。我们注意到对于病毒的有效蔓延，细胞应该在感染前一天在50-70％融合时接种，使用保持低融合的细胞瓶。为了跟踪感染进展，以同一感染细胞的多个孔复制每个传代物并且每天用丙酮固定一个孔并用FITC标记的单克隆抗体SDOW17染色。如果感染细胞的百分比不大于50％并且没有看到集中发展超过前一天观察结果的显著进展，将等同孔的细胞胰蛋白酶化并传代到多个新鲜孔中。这些感染细胞传代典型地以1∶4分裂和有时包括添加来自未感染培养物的等量细胞。可供选择地，如果SDOW17染色显示感染细胞中心已蔓延到足以占到大于50％的细胞总数，则收获无细胞的上清液并用于感染新近多个孔的接种细胞(图20)。11次传代后，干扰细胞传代不是必需的，因为病毒能够生长至足以允许连续的病毒的无细胞上清液传代的滴度。

[0668] 实施例32筛选对各种欧洲和北美PRRSV分离株许可的各种CD163细胞系

[0669] 估计各种CD163转基因细胞系对低传代的欧洲和北美PRRSV分离株的许可性(参见表7)。早先实施例中描述的转基因CD163细胞系包括NLFK-MARC CD163D4、
PK-RSVScript-susCD163v2克隆#9和PK-CMV-susCD163v1-A10。每个CD163细胞系连同细胞系MARC-145、亲本猫肾、亲本猪肾细胞系(作为对照)植入96孔组织培养板上。从单层去掉生长培养基和每孔灌输每个PRRSV分离株0.1mL。在感染后3天，用80％丙酮固定板并用核壳特异性的偶联FITC的单克隆抗体SDOW17(Rural Technologies Inc.)染色。荧光抗体(FA)试验的结果在表7中。

[0670] 表7

[0671]

[0672] a除了EU98V226是欧洲分离株外，所有PRRSV分离株是北美分离株。

[0673] 实施例33佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-醋酸盐(PMA)诱导CD163致使人U937细胞对PRRSV感染许可

[0674] 根据ATCC说明书，在含有血清和添加剂的RPMI 培养基中繁殖从ATCC(CRL-1593.2)获得的人U937细胞。已知当用PMA处理而活化时，这些细胞表达
CD163(Gronlund et al.，2000)。U937细胞以副本接种在6板的孔中。用100ng/ml PMA处理一组细胞和另一组保持不处理。PMA刺激后三天，用PRRSV的P129分离株感染来自一组的一个孔。固定来自每组的另一个孔并使用山羊抗人CD163(R&D System)和与偶联FITC的驴抗山羊IgG(BioDesign International)染色，为了在间接免疫荧光抗体试验中表达CD163。

[0675] 未处理的U937细胞在最初植入后3天继续繁殖至高密度。PMA处理的U937细胞停止繁殖，变得扩张，并贴附在培养孔表面。一小部分未处理的U937的CD163染色是阳性，而几乎所有PMA处理的U937对于CD163染色是阳性的。在未处理的U937中，未观察到PRRSV感染细胞。然而，许多PMA处理的U937细胞变得被PRRSV感染。这证明非许可型细胞在化学诱导CD163表达后可以致使对PRRSV感染许可。

[0676] 根据本申请的整体，包括详细说明书，本发明的另外特征和变型对于本领域技术人员来说将是显而易见的，而且所有这些特征意欲作为本发明的方面。同样，此处描述的本发明特征可以重新组合到也意欲作为本发明方面的另外实施方案中，不论上面是否具体提及特征的组合作为本发明分方面或实施方案。同样，在此描述作为本发明决定性的这种限制应仅仅被视为其本身的限制；没有在此描述作为决定性的缺乏限制的本发明变型意欲作为本发明的方面。

[0677] 显然本发明可以以不同于上文说明书和实施例中特别描述的那样实施。

[0678] 根据上述教导，本发明的很多改变和变型是可能的，因此，在本发明范围之内。

[0679] 因此，此处引用的所有出版物的整个公开内容以它们与此处披露内容不矛盾的程度引入作为参考。

[0680] 本发明的优选实施方式：

[0681] 1.促进PRRSV感染脊椎动物细胞的方法，包括(a)引导所述脊椎动物细胞CD163多肽表达增加的步骤。

[0682] 2.项目1的方法，进一步包括用PRRSV感染所述细胞。

[0683] 3.项目1的方法，进一步包括产生PRRSV培养物。

[0684] 4.项目1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

[0685] 5.项目1的方法，其中所述CD163多肽包含跨膜结构域。

[0686] 6.项目1的方法，其中所述表达增加通过引入外源核酸来实现。

[0687] 7.项目1的方法，其中所述表达增加通过化学处理来实现。

[0688] 8.项目1的方法，其中所述细胞是PRRSV非许可型的并且通过步骤(a)致使所述细胞对PRRSV许可。

[0689] 9.项目2的方法，其中PRRSV是欧洲基因型的。

[0690] 10.项目2的方法，其中PRRSV是北美基因型的。

[0691] 11.项目2-10任一项的方法，进一步包括产生PRRSV疫苗的步骤。

[0692] 12.项目11的方法，其中疫苗是灭活的。

[0693] 13.项目11的方法，其中疫苗是减毒活疫苗。

[0694] 14.一种测定试验细胞系允许被PRRSV感染的倾向的方法，包括：

[0695] a)提供含有来自该试验细胞系的核酸的样品；

[0696] b)测定所述样品中编码CD163多肽的多核苷酸或其互补链的量；其中编码CD163多肽的多核苷酸相对于来源于已知不支持所述PRRSV生长的对照细胞系的对照样品而言增加的量表明该试验细胞系支持所述PRRSV复制的倾向。

[0697] 15.一种测定试验细胞系允许被PRRSV感染的倾向的方法，包括：

[0698] (a)提供含有来自该试验细胞系的多肽的样品；

[0699] (b)测定所述样品中CD163多肽的量；

[0700] 其中CD163多肽相对于来源于已知不支持所述PRRSV生长的对照细胞系的对照样品而言增加的量表明该试验细胞系支持所述PRRSV复制的倾向。

标题	发布/更新时间	阅读量
应用许可认证-专利编号CN103067169B	2020-05-11	437
应用许可认证-专利编号CN103067169A	2020-05-12	963
许可升级管理-专利编号CN102736930A	2020-05-12	931
内容许可证存储-专利编号CN102571763B	2020-05-11	1127
管理策略和许可简档-专利编号CN105190641A	2020-05-14	512
内容许可证存储-专利编号CN102571763A	2020-05-12	1064
许可推荐服务-专利编号CN108780551A	2020-05-11	1192
管理策略和许可简档-专利编号CN105190641B	2020-05-13	1176
软件应用许可漫游-专利编号CN102737179B	2020-05-13	225
处理认证和资源许可-专利编号CN105408912A	2020-05-13	572

病毒的细胞许可因子及其用途

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