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解淀粉芽孢杆菌菌株

阅读：911发布：2021-02-26

IPRDB可以提供解淀粉芽孢杆菌菌株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及解淀粉芽孢杆菌的菌株，其超产生淀粉酶和蛋白酶。该菌株亦适于产生脂肪酶以供降解油状材料如脂肪、油脂和烹调用油。该菌株亦具有优异的杀真菌和抑真菌品质。本公开的菌株及其产生的酶由此具有多种用途，包括农业用途，洗衣和洗碟剂，排水管清洁剂和污迹去除剂，以及烘烤用途等。，下面是解淀粉芽孢杆菌菌株专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株NRRL B-50350的生物学纯培养物。

2.一种杀灭真菌的非治疗目的的方法，其包括将真菌与有效量的权利要求1的生物学纯培养物相接触。

3.一种组合物，其包含权利要求1的生物学纯培养物。

4.一种依照权利要求3的组合物，进一步包含一种或多种其他微生物。

5.权利要求3的组合物，其进一步包含表面活性剂。

6.权利要求5的组合物，其进一步包含一种或多种酶。

7.权利要求6的组合物，其中所述酶选自下组：α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、氧化酶和蛋白酶，或其混合物。

8.权利要求7的组合物，其中所述氧化酶是过氧化物酶。

9.权利要求3的组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的成分：分散剂、稳定剂、香料、染料和杀生物剂。

10.权利要求9的组合物，所述杀生物剂是抗微生物剂。

11.权利要求3的组合物，其中所述生物学纯培养物中的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL

5 10

B-50350以1×10 至1×10 每ml的浓度存在。

说明书全文

解淀粉芽孢杆菌菌株

[0001] 对相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2010年5月4日提交的美国临时申请号61/331,203根据35U.S.C.119的权益，其内容通过提述全部并入本文。

[0003] 对保藏微生物的交叉引用

[0004] 本公开涉及保藏的微生物。保藏的微生物的内容通过提述全部并入本文。发明领域

[0005] 本公开涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株NRRLB-50350。该菌株表征为具有优异的淀粉酶、表面活性剂和抗真菌活性的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。此外，本公开的菌株产生多种有用的酶，并具有脂肪酶活性，噬菌体抗性和对pH、盐和温度的高耐受性。本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株及其产生的酶在农业生产、洗涤剂工业、生物乙醇工业和烘烤工业领域中具有许多应用。

[0006] 发明背景

[0007] 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens或B.amyloliquefaciens)是公知的有氧细菌，常常见于土壤样品，其承担世界上大部分α-淀粉酶和蛋白酶的生产。解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、能动的(motile)、杆状的细菌，其通常形成链状(chains)。其生长的最适温度是30至40℃，在低于15℃或高于50℃不生长。该生物体之前在Priest等 ,Bacillus amyloliquefaciens sp.nov.,nom.rev.,International Journal of Systematic Bacteriology,37,69-71(1987)(通过提述以其整体并入本文)中描述并与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)相区分。该生物体亦表征为具有较低G+C的生物体。

[0008] 已显示解淀粉芽孢杆菌的菌株BNM122可为有希望的化学农业处理的生态替代方案，并用于开发可持续的农业管理以替代或减少农用化学品的使用和/或滥用。举例而言，一项研究报道使用解淀粉芽孢杆菌作为以环境友好的替代方案为特征的微生物生物控制剂(MBCA)，以减少或替代植物疾病的化学控制。参见，例如Correa等,Bacillus amyloliquefaciens BNM122,a potentialmicrobial biocontrol agent applied on soybean seeds,causes a minor impact onrhizosphere and soil microbial communities,Applied Soil Ecology 41,185-194(2009)(通过提述以其整体并入本文)。在此解淀粉芽孢杆菌的菌株当作为种子上的覆层以控制土壤传播的真菌病原体等时，显示为定殖于种子和根。

[0009] 解淀粉芽孢杆菌的菌株MIR-41亦已描述为α- 淀粉酶超生产者(hyperproducer)。该菌株已与其他微生物组合用于从淀粉底物产生乙醇。参见，例如 Abate 等 ,Production of amylolytic enzymes by Bacillus amyloliquefaciens inpure culture and in co-culture with Zymomonas mobilis,Biotechnology Letters21,249-252(1999)(通过提述并入本文)。

[0010] 感兴趣的现有技术包括美国专利号6,960,342，其涉及的解淀粉芽孢杆菌呈现广谱抗真菌活性。该公开亦涉及使用解淀粉芽孢杆菌菌株或包含该新颖菌株的抗真菌组合物以供控制广泛范围的真菌植物病原体。

[0011] 美国专利号6,589,524涉及含有芽孢杆菌属特定菌株的生物控制组合物和方法，所述菌株选自下组：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)NRRL B-30517和NRRL B-30519，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NRRL B-30518以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRRL B-30520。在此，所述特定菌株在组合中提供了针对病原性真菌的作用。所述病原性真菌包括多种疫霉属(Phytoph thora)菌种如辣椒疫霉(P.capsici)。

[0012] WO/2005/059112涉及解淀粉芽孢杆菌KTGB0202，和使用其控制植物病原体的方法。该菌株具有针对作物白粉病(powdery mildew)的控制作用和针对植物病原性真菌的广谱抗真菌活性，并抑制烟草花叶病毒感染，以及含有该细菌、用于控制白粉病的生态友好的细菌培养液。

[0013] 感兴趣的现有技术还包括美国专利申请号12/511,499，12/503,272和12/492,816(所有这些均通过提述以其整体并入本文)，其分别涉及解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50154，NRRL B-50151和NRRL B-50141，以及这些菌株的组合物和用途。

[0014] 解淀粉芽孢杆菌菌株SB3200包括在由Novozymes出售的、用于清洁和气味控制应用的产品中，其中酶帮助去除导致无机污物粘着并产生恶臭的有机污物，以及用于排水管线/油脂捕获(grease trap)应用的产品中，其中菌株帮助降解导致造成阻塞的排水管线积聚物的有机物和油脂。

[0015] 持续地需要鉴定出作为适于工业用途的酶的优异生产者和分泌者的菌株。此外，持续地需要鉴定出产生/分泌多种有用的酶和/或具有抗真菌应用的新菌株。期望鉴定出一个菌株，其可产生优异的淀粉酶、表面活性剂和淀粉酶活性。需要鉴定出新菌株以解决用于改善农业生产、洗涤剂工业、生物乙醇工业和烘烤工业领域中的产业应用的持续的产业需求。

发明内容

[0016] 现已鉴定并分离出新菌株，即解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350。该菌株表征为芽孢杆菌属细菌的菌株，其产生具有优异淀粉酶、表面活性剂和抗真菌活性的酶。此外，本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株具有脂肪酶活性，噬菌体抗性，并耐受极端pH、盐和极端温度。本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株及其产生的酶可用于农业生产、洗涤剂工业、生物乙醇工业和烘烤工业领域中如下所示的多种用途。

[0017] 更具体而言，本公开涉及解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的生物学纯培养物(biologically pure culture)。解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350是解淀粉芽孢杆菌的细菌噬菌体抗性(噬菌体抗性)菌株。为了繁殖解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350至大到足以允许该菌株广泛应用的数目，需要反复的、大规模发酵。已知天然细菌噬菌体的自然导入可在标准大规模发酵系统中在反复的生长事件或批次中发生。此种感染可在几小时或几日之内迅速导致培养物的完全丧失，抵消了提供该菌株以供实际施用的能力。解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350对此种噬菌体具有抗性，并因此保持生长并实现本文中所述的益处。

[0018] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350能够产生淀粉酶，其催化排液残余物(drain residues)的主要化学组分如淀粉的降解。

[0019] 本公开还涉及在水性溶液例如蒸馏水、自来水、盐溶液或其他水性溶液中包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的液体组合物。

[0020] 本公开还涉及增强植物根发育和植物生长培养基的生物增进的配制物。

[0021] 本公开亦涉及包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的排液清洁剂(drain opener)配制物。

[0022] 本公开亦涉及通过将真菌与解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触以杀灭真菌的方法。

[0023] 本公开亦涉及包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的杀灭真菌的液体配制物。

[0024] 本公开亦涉及处理植物种子的方法，其包括将种子与有效量的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触。

[0025] 本公开亦涉及处理植物生长培养基的方法，其包括将生长培养基与有效量的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触。

[0026] 本公开亦涉及杀灭真菌的方法，其包括将真菌与有效量的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触。

[0027] 本公开亦涉及降解淀粉的方法，其包括将淀粉与有效量的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触。

[0028] 本公开亦涉及改变烘烤成分的方法，其包括将烘烤成分与有效量的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触。

[0029] 本公开亦涉及降解脂质的方法，其包括将脂质与有效量的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触。

[0030] 本公开亦涉及处理废水的方法，其包括将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350添加至废水的步骤。

[0031] 本公开亦涉及清洁表面的方法，其包括将表面与解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相接触的步骤。

[0032] 本公开亦涉及包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的组合物。合适的组合物包含一种或多种其他微生物。在实施方案中，合适的组合物包含一种或多种表面活性剂，和/或一种或多种酶。合适的酶的非限定性的实例包括一种或多种α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、过氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。在实施方案中，组合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：分散剂、稳定剂、抗微生物剂、香料、5
染料和杀生物剂。在组合物实施方案中解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350以约1x10 至
10
1x10 每ml的浓度存在。

[0033] 如用于本文中术语“有效量”指能够提供有益作用或防止、减轻或消除不希望的状况的量。有益作用的非限定性实例包括改善的植物种子品质，改善的植物生长培养基品质，对于真菌群体的杀生物作用，对于真菌群体的抑生物作用，淀粉降解，烘烤成分改变，脂质降解，改善的废水品质，改善的表面清洁度，和/或减少的恶臭，及其组合。

[0034] 如用于本文中，词语“处理”(“treat,”“treating”或“treatment”)指使用本公开的菌株或组合物预防性地防止一种或多种不希望的状况的发作，或治疗性地减轻一种或多种存在的不希望的状况。依照本公开的处理方案改善植物种子品质，改善植物生长培养基品质，减少和/或消除不希望的真菌，并改善表面的清洁度。

[0035] 本公开的这些和其他方面当参考下述详细描述时会是明显的。

附图说明

[0036] 图1是显示随时间淀粉酶比活性的图。

[0037] 图2是显示随时间淀粉酶比活性的图。

[0038] 图3是显示随时间蛋白酶比活性的图。

[0039] 图4是显示随时间脂肪酶比活性的图。

[0040] 图5是比较解淀粉芽孢杆菌的两个菌株的生物表面活性剂产生的图。

[0041] 图6是比较解淀粉芽孢杆菌的两个菌株之间生物表面活性剂产生的图。

[0042] 图7是比较解淀粉芽孢杆菌的两个菌株之间表面张力对稀释系数的图。

[0043] 优选实施方案的详述

[0044] 本公开涉及解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350。该菌株表征为具有优异淀粉酶、表面活性剂和/或抗真菌活性的芽孢杆菌属细菌。此外，本公开的菌株产生多种有用的酶，并具有脂肪酶活性，噬菌体抗性和对盐(例如，高至7.5%氯化钠)和温度(例如，高至50℃)的高耐受性。本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株及其产生的酶在农业生产、洗涤剂工业、生物乙醇工业和烘烤工业领域中具有多种应用。

[0045] 在实施方案中，本公开涉及解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的生物纯培养物。

[0046] 在实施方案中，本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350适用于多种组合物和方法。合适的本公开的组合物的非限定性实例包括任何含有解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的组合物；含有解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350的水性溶液，含有解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350和一种或多种其他微生物的组合物；含有解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350和表面活性剂的组合物；含有解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350和一种或多种酶的组合物。适于依照本公开使用的非限定酶包括α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、过氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。组合物的其他非限定性实例包括解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350和一种或多种分散剂、稳定剂、抗微生物剂、香料、染料和杀生物剂。

[0047] 在实施方案中，依照本公开的组合物为含有水溶剂的液体形式。

[0048] 考虑到本公开的组合物具有以约1x105至1x1010每ml的浓度存在的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350。

[0049] 依照本公开的合适的组合物的其他非限定性实例包括排水管清洁剂配制物，卫生消毒剂配制物，或气味去除组合物。

[0050] 在实施方案中，本公开涉及在水性介质中包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350的排水管清洁剂配制物。合适的排水管清洁剂配制物的非限定性实例可进一步包含表面活性剂和/或防腐剂。本公开的排水管清洁实施方案相对于目前可获得的排水管清洁剂具有许多优点：如在接近中性的pH的活性，和对皂类、脂肪、油和油脂的溶解能力。实施方案进一步提供了对糖类具特异性的生物活性，并在排水管中和下游表面上形成生物膜以持续协助天然的生物降解过程。

[0051] 在实施方案中，所述排水管清洁剂配制物在水性介质中含有活微生物，表面活性剂，防腐剂，和任选的香料的稳定悬液，具有大约5至6的优选pH。

[0052] 对于微生物可操作的浓度范围是约1x 106至1x 109CFU/ml，且在实施方案中，约8 7
1x 10CFU/ml的浓度，如约1x 10CFU/ml配制物。

[0053] 不像通常的洗涤剂主要仅清洁表面，本公开的配制物实施方案中的表面活性剂可溶解油脂，并使其为生物可用的。所述表面活性剂可为任何容易生物可降解的表面活性剂，或对系统中含有的微生物具有低毒性的表面活性剂的混合物。所述表面活性剂应具有高油脂溶解能力。具有接近10的亲水/亲脂平衡的非离子/离子表面活性剂的混合物或离子表面活性剂对于必需的油脂溶解是特别优选的。适用于本公开的表面活性剂的非限定性实例包括正烷基苯磺酸盐/酯和烷基磺酸盐/酯。非离子表面活性剂的非限定性实例包括脂族醇烷氧化物，醇乙氧化物，聚烯氧化物共聚物(polyalkylene oxide copolymers)，烷基酚烷氧化物，羧酸酯，羧酸酰胺，等等。在实施方案中，表面活性剂以总组合物或配制物的约3至10重量百分比的浓度存在。

[0054] 在排水管清洁剂配制物实施方案中，溶液的pH应维持在尽可能接近中性，以确保充足的细菌活性，并最小化健康风险，但应在与表面活性剂活性相容并有助于细菌存活的范围。可操作的pH范围可为约3至10。

[0055] 在排水管清洁剂配制物实施方案中，添加防腐剂如对羟基苯甲酸酯(paraben)，对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)，或1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(1-2-benzisothiazolin-3-one)以抑制或防止产品中不希望的微生物污染物的生长。当pH接近中性时，对防腐剂的需求最大，而当pH在可操作范围的极端时，需求最小。防腐剂的浓度根据出售者的推荐确定。用于实施例中的防腐剂的通常的浓度范围是总组合物或配制物的约0.075至0.75重量百分比。

[0056] 可特别添加其他任选的防腐剂以保存微生物的孢子/芽孢形式。在实施方案中，按照重量计为约25至50ppm(w/v)的浓度的邻氨基苯甲酸甲酯是令人满意的添加剂。

[0057] 在排水管清洁剂配制物实施方案中，任选地，添加螯合剂以增强配制物的稳定化。

[0058] 在排水管清洁剂配制物实施方案中，可任选地添加香料以遮掩产物组分的气味，以及用于市场吸引力。该香料必须与配制物的其他组分相容。

[0059] 在实施方案中，本公开亦涉及包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的卫生消毒剂配制物。所述配制物包含卫生消毒组合物，细菌芽孢，和表面活性剂均包含于水性溶液中的悬液。这些配制物具有下述优点：其为良好的表面清洁剂和良好的卫生消毒剂，并提供有益细菌的长效作用，即控制病原体，并在表面上和接受表面漂洗的污泥(sewage)系统中降解废物。

[0060] 卫生消毒剂或组合物以及消毒剂属于同类的抗微生物(活性)成分。抗微生物(活性)成分为杀灭微生物或者防止或抑制其生长和繁殖的化合物，并有助于包含其的产品中要求保护的作用。更具体而言，卫生消毒剂是将微生物污染物或病原体的数目减少至根据公共卫生要求判断的安全水平的作用剂。

[0061] 在卫生消毒剂实施方案中，表面活性剂组分起到通过去除污物、灰尘、干燥的尿液和皂而清洁表面的作用，并帮助对表面进行卫生消毒。卫生消毒组合物对表面进行卫生消毒(杀灭病原体)，并维持配制物不受不希望的微生物的污染。细菌芽孢和营养细胞起到接种废物收集系统、控制气味并提供健康的优势微生物群体的作用，所述群体通过底物竞争、产生抗生素等抑制病原体的生长。

[0062] 在本公开的一个卫生消毒剂实施方案中，所述组合物以选择范围的浓度包含1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(Proxel)，乙二胺四乙酸四钠(EDTA)和异丙醇(IPA)，其与配方的其他成分组合能够有效地使指标生物失活。该卫生消毒组合物优选处于中性pH且不含有通常用作卫生消毒剂的与氯相关的物质。因此，该卫生消毒组合物对环境更加友好，并具有较少或不具腐蚀性。

[0063] 在实施方案中，当将卫生消毒配制物施于浴室附属装置(bathroomﬁxture)，水池，便盆等时，可将其喷洒或从容器直接挤出至表面或刷具上。然后将该配制物留在表面上，或用刷具洗刷表面不少于10分钟。然后用水冲洗或漂洗该产品，并从装置卸除。

[0064] 在实施方案中，本公开的卫生消毒配制物含有卫生消毒剂、细菌芽孢和表面活性剂。亦分别添加香料和染料以控制配制物的气味和颜色。取决于意欲的用途，所述配制物可任选地含有磨蚀剂(abrasive)。尽管关键组分保持相同，可在含和不含磨蚀剂的配制物中使用不同的增稠剂。

[0065] 尽管许多卫生消毒剂可用于使表面上的病原体失活，但并非所有这些均可用于本公开的实施方案。这是因为用于本公开的卫生消毒剂不仅需要有效地使病原体失活，但必须不对配制物中含有的细菌芽孢的活性和稳定性具有负面作用。此外，所述卫生消毒剂需要对于环境较为友好，且不应导致皮肤致敏(sensitization)，且不应腐蚀其使用的装置的构建材料。

[0066] 在实施方案中，本公开的卫生消毒组合物以选定的浓度范围包含Proxel，EDTA和IPA。Proxel不太会导致皮肤致敏的最大浓度是约2900mg/L。用于在10分钟内产生指标生物计数的4log减少的Proxel，Versene(Versene含有39%EDTA)和IPA的合适浓度分别是0.087至0.29%(体积)，0.36至1.19%(体积)，和3.5至7%(体积)。亦可将另一种化合物，邻氨基苯甲酸甲酯用于本发明的配制物中。使用邻氨基苯甲酸甲酯的目的是帮助配制物的防腐。

[0067] 在实施方案中，亦可将卫生消毒剂如季铵化合物(QAC)，含氮有机硫和硫-氮化合物用于本公开的卫生消毒组合物。

[0068] 在卫生消毒实施方案中，对于微生物可操作的浓度范围是1x 105至1x109CFU/ml，7
如10CFU/ml(CFU,菌落形成单位)配制物。

[0069] 在实施方案中，在本公开的卫生消毒配制物中含有表面活性剂。所述表面活性剂可润湿和乳化存在于脏表面上的污物，包括脏污(dirt)、干燥的尿液、皂等等。此外，表面活性剂帮助表面的卫生消毒。不像通常用于表面清洁的表面活性剂，用于本公开的表面活性剂对配制物内含有的微生物具有低毒性。在实施方案中，可使用一种表面活性剂或几种表面活性剂的混合物。

[0070] 适用于卫生消毒剂实施方案的表面活性剂的非限定性实例包括非离子表面活性剂，因为其提供期望的润湿和乳化作用，而不显著地抑制芽孢的稳定性和活性。非离子表面活性剂是当溶解或分散于水性介质中时不具有电荷的表面活性剂。非离子表面活性剂的非限定性实例包括脂族醇烷氧化物，醇乙氧化物，聚烯氧化物共聚物，烷基酚烷氧化物，羧酸酯，羧酸酰胺，等等。

[0071] 阴离子表面活性剂或阴离子和非离子表面活性剂的混合物亦可用于本公开的配制物。阴离子表面活性剂是在水溶液中具有处于阴离子或负电荷状态的亲水模块的表面活性剂。适于本文中使用的阴离子表面活性剂的非限定性实例包括磺酸，硫酸酯，羧酸，及其盐。

[0072] 在实施方案中，本公开的组合物包括磨蚀剂，其为不溶于水的固体颗粒。使用磨蚀剂的目的是提供深度洗刷和清洁。取决于应用，磨蚀剂可任选地用于本公开的配制物。合适的磨蚀剂的非限定性实例包括碳酸钙，碳酸镁，二氧化硅等。在实施方案中，磨蚀剂可以80至325筛目的筛目尺寸存在(ASTM E 11-70(1995)。

[0073] 因为细菌芽孢的比重通常高于水，在本公开中需使用增稠剂以悬浮芽孢。合适的水性增稠剂的非限定性实例包括：聚丙烯酸，聚苯乙烯，聚乙烯醇，聚丙烯等等。在实施方案中，用于悬浮细菌芽孢的增稠剂是聚丙烯酸(例如来自Rohm and Haas Co.的Acrysol TT615)。如果在配制物中使用磨蚀剂，可需要除了聚丙烯酸之外的增稠剂以维持磨蚀剂的悬浮。

[0074] 在实施方案中，可任选地分别添加香料和染料以掩蔽产品成分的气味和控制产品组分的颜色，以及用于市场吸引力。所述香料和染料必须与配制物的其他组分相容。

[0075] 在实施方案中，本公开亦涉及在水溶液中包含解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的组合物。在实施方案中，设计水溶液以提供短期和长期气味控制作用，并对环境友好，使用经济。

[0076] 在实施方案中，对于解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350可操作的浓度范围是约5 10 6 8
1x 10 至1x 10 CFU/ml，例如约1x 10 至1x 10CFU/ml。在实施方案中，对于解淀粉芽孢
8
杆菌菌株NRRL B-50350可操作的浓度范围是约1x 10CFU/ml配制物的量，或在实施方案
7
中约1x 10CFU/ml配制物。

[0077] 在实施方案中，本公开的除臭组合物可包含气味中和剂，其为可与有气味化合物迅速通过化学反应相互作用以产生无气味化合物的作用剂。这些作用剂不应依赖香料的遮掩机制来控制气味。此外，这些作用剂必须对于使用是安全的，且为合算的。所述中和剂必须与微生物组分相容。

[0078] 在本公开的一个实施方案中，所述中和剂是碳酸丙酯，其具有分子式 C4H6O3。适于依照本公开使用的碳酸丙酯可从商业卖家如Huntsman ChemicalCorporation获得。

[0079] 与组合物的其他组分组合，碳酸丙酯可有效地减少气味，包括胺和氨气味如三甲胺、二甲胺和氨，其为主要的目标臭味化合物(target odorouscompound)。此外，即使在长期接触之后，碳酸丙酯并不使微生物组分失活。

[0080] 其他气味中和化合物，如柠檬酸钠，碳酸氢钠和碳酸钠，亦可用于本公开的实施方案。

[0081] 在实施方案中，所述气味中和剂或化合物以总组合物1-15wt.％，如2-10wt.%的量存在。

[0082] 在本公开的组合物中，其他微生物组分适于在其中使用。能够在普通家用、工业、宠物和动物废物上生长并且降解这些，能够在配制物中生存，并与配制物相容，且当起作用时不产生恶臭的活微生物，或其混合物，可用于本公开的实施方案。

[0083] 可用于本公开的组合物的其他微生物的非限定性实例包括已知产生能够分解可在地毯或其他纤维材料上导致气味的有机材料的酶的产碱菌属(Alcaligens)，芽孢杆菌属(Bacillus)，肠杆菌属(Enterobacter)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，乳杆菌属(Lactobacillus)，硝化杆菌属(Nitrobacter)，亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)和链球菌属(Streptococcus)的菌株。

[0084] 其他成分可用于本公开的组合物，包括表面活性剂、香料和染料。

[0085] 在组合物实施方案中，表面活性剂可润湿并乳化经处理的系统中存在的不溶性废物材料，且在本公开的组合物中纳入表面活性剂会增加其清洁能力。此外，表面活性剂可用于分解不溶性废物，因此增加它们对于微生物降解的可利用性。本公开的合适的表面活性剂包括非离子型和阴离子型。在实施方案中，表面活性剂以组合物的0-8wt.%，如0-6wt.%的量存在。

[0086] 在实施方案中，可任选地分别添加香料和染料以遮掩本公开的组合物的气味，并控制其颜色，并用于市场吸引力。

[0087] 所述香料和染料必须与植物的其他成分相容。

[0088] 已发现本公开的菌株具有非常强的表面活性剂活性。此外，本公开的菌株适用于控制病原性真菌。病原性真菌的一个非限定性实例是产生已知导致猝倒病(damping off disease)的卵孢子(ooze spore)的真菌。在实施方案中，卵孢子对表面活性剂，包括本公开的菌株产生的表面活性剂敏感。将卵孢子与本公开的菌株和/或表面活性剂相接触对于已知产生卵孢子的真菌具有杀生物或抑生物作用。在实施方案中，本公开的菌株针对腐霉属菌种(Pythium spp.)具有优异的抗真菌活性。在实施方案中，将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350和含有该菌株的组合物与需处理的种子和/或具有不希望的真菌的生长培养基相接触。解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350对真菌具有杀生物作用，并减轻不希望的真菌状况。相应地，所述种子和/或植物生长培养基受改变，并更适于在其中生长植物。在实施方案中，依照本公开的方法适于杀灭称作腐霉属的寄生卵菌属(genus of parasitic oomycete)。

[0089] 在本公开的实施方案中，方法和组合物适用于洗涤剂领域。令人惊讶地发现，本公开的菌株包含非常高的淀粉酶、表面活性剂和抗真菌活性。举例而言，本公开的菌株产生优异量的淀粉酶、表面活性剂，且针对腐霉属菌种具有优异的抗真菌活性。在实施方案中，将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50350和含有该菌株的组合物与需要处理的沾污的底物相接触。解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350分解其中的淀粉和淀粉污迹，并减轻不希望的不清洁状况。相应地，改变了底物如织物或表面，且其表观更加清洁。

[0090] 在实施方案中，含有本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的菌株和组合物适用于多种方法应用。合适的方法的非限定性实例包括处理植物种子，即将种子与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触；处理植物生长培养基，即将生长培养基与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触；杀灭真菌，即将真菌与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触；降解淀粉，即将脂肪与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触；改变烘烤成分，即将烘烤成分与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触；降解脂质，即将脂质与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触；处理废水，其包括向废水添加本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株的步骤；和清洁表面，即将表面与有效量的本公开的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。用于依照本公开清洗的合适表面的非限定性实例包括硬表面，优选由一种或多种选自下组的材料组成：金属、塑料、橡胶、板(board)、玻璃、木材、纸、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料如瓷料；或软表面，优选由一种或多种选自纤维例如纱线(yarn)、织物、植物纤维的材料组成；石棉，毛发；皮肤；角质材料；和内脏例如肺；或有孔表面。

[0091] 在实施方案中，所述处理包括施用有效量的一种或多种菌株组合物。非限定性实例包括排水管清洁剂配制物，卫生消毒配制物和气味中和剂组合物。此类处理可防止、减轻或消除不希望的状况。

[0092] 有益作用的非限定性实例包括改善的植物种子品质，改善的植物生长培养基品质，对于真菌群体的杀生物作用，对于真菌群体的抑生物作用，淀粉降解，烘烤成分改变，脂质降解，改善的废水品质，改善的表面清洁度，和/或减少的恶臭，及其组合。

[0093] 生物材料的保藏

[0094] 解淀粉芽孢杆菌菌株根据布达佩斯条约的条款于2010年3月4日保藏于农业研究培养物保藏中心/农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection),1815North University Street,Peoria,Illinois61604,U.S.A.，保藏号为NRRL B-50350。该保藏在授予的专利的整个有效期内应在保藏机构维持在活的条件，并可为任何个人或单位以非商业用途不受限制地获得，但须符合管理该保藏物的法律的规定。

[0095] 下述实施例作为本公开的示例给出，但不意欲对其进行限制。为使得本领域技术人员更加能够实现本文中所述的组合物和方法，下述实施例作为本组合物和方法的制备的说明。应注意本公开并不限于实施例中实现的具体细节。

[0096] 实施例

[0097] 实施例1

[0098] 材料和方法

[0099] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350(“菌株SB3778”)从研究实验室区域分离。进行了研究，包括细菌鉴定研究；DNA指纹研究；生物表面活性剂活性研究；抗真菌活性研究；应力耐受研究；蛋白酶活性研究；和对于淀粉酶的基因克隆。

[0100] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的分离和鉴定

[0101] 从解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350分离株获得1600碱基的全长16sDNA，并分析序列。该分析将所述细菌分离株鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

[0102] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350在SM平板上具有独特的形态

[0103] 将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350与解淀粉芽孢杆菌的已知菌株相比较。具体而言，比较了生长和形态。解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350在SM培养基上与所有其他解淀粉芽孢杆菌菌株形态上不同。所有其他解淀粉芽孢杆菌菌株在SM琼脂平板上产生表多糖(exopolysaccharide)，而解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350则不然。

[0104] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350具有独特的基因型

[0105] 将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350与解淀粉芽孢杆菌的已知菌株通过DNA指纹分析相比较。结果表明解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350与解淀粉芽孢杆菌的已知菌株具有70%相似性。

[0106] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350与用于内部(in house)纤维素酶产生的解淀粉芽孢杆菌的公知菌株相比产生更高淀粉酶活性

[0107] 评价了解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350相对于已知为淀粉酶生产者的解淀粉芽孢杆菌的已知的菌株(即，DD3，具有保藏登录号NRRL B-50154)的淀粉酶活性。淀粉酶活性使用BAN用Konelab KNU-B分析确定。在该方法中，α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)通过切割1,4-α-糖苷键催化聚合糖类如直链淀粉、支链淀粉和糖原的水解降解。在多糖和寡糖中，多个糖苷键同时水解。麦芽三糖，最小的这种单位，转化为麦芽糖和葡萄糖，尽管非常缓慢。这里描述的动力学方法是基于公知的α-淀粉酶对4,6-亚乙基-(G7)-1,4-硝基苯基-(G1)-α-D-麦芽七糖苷的切割，以及所有降解产物在α-葡糖苷酶的协助下随后水解为对硝基苯酚。这导致生色团的100%释放。

[0108] 该过程在Konelab Arena 30中自动进行，具有下述步骤：1)将200微升R1试剂移液入小杯，2)将16微升样品添加至小杯，3)将混合物温育300秒以获得37℃的温度，4)将20微升R2试剂移液入小杯，并将混合物温育180秒，和5)在405nm每18秒测量吸收，对于每个样品进行总共7次测量。

[0109] 限定的寡糖在α-淀粉酶的催化作用下受切割。所得的PNP衍生物通过α-葡糖苷酶的作用直接切割为PNP，且形成的对硝基苯酚的色强度与α-淀粉酶活性成正比，并通过分光光度法测量。

[0110] 5亚乙基-G7PNP+H2O→.2亚乙基-G5+2G2PNP+2 亚乙基 -G4+2G3PNP+亚乙基-G3+G4PNP(1)

[0111] 2G2PNP+2G3PNP+G4PNP+14H2O→5PNP+14G(2)

[0112] 反应(1)由从标样或样品添加的淀粉酶介导。反应(2)由试剂盒中提供的葡糖苷酶介导。结果证明来自解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的淀粉酶活性比已知的菌株，即DD3(菌株NRRL B-50154)高至至少5倍。

[0113] 酶分析：对于每个菌株，将单菌落接种入10mL PCB培养基并放置过夜。将每个4
菌株大约1x10 个细胞接种入100mL淀粉培养基。在下图中指明的每个时点取得O.D.读数。对于每个时点的每个菌株，将2mL的不含细胞的上清材料与1mL 50%甘油合并，并储藏于-20℃。对于所有样品的酶活性如前所述使用BAN通过Konelab KNU-B分析确定。进行该步骤的重复以供结果确认。

[0114] 现参见图1，该研究在当amy1(菌株NRRL B-50350)与DD3(菌株NRRLB-50154)相比较时在淀粉酶产生方面得到了大约五倍增加。

[0115] 第二次试验在当amy1(菌株NRRL B-50350)与DD3(菌株NRRL B-50154)相比较时在淀粉酶产生方面得到了四倍增加。这些结果示于表2。在两个研究中，菌株NRRL B-50350在淀粉酶产生中均持续地表现优于标准菌株，并对于菌株NRRL B-50350具有约800KN的最大淀粉酶产生。

[0116] 定义的单位

[0117] BAN是可从Novozymes获得的α-淀粉酶。其分析标准以360KNU(B)/g=360NU(B)/mg提供。

[0118] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350具有蛋白酶和脂肪酶活性

[0119] 蛋白酶测定根据对于上述淀粉酶测定所述的实验方案设定。如下所述进行Konelab分析：

[0120]

[0121] 蛋白酶水解DMC(N,N-二甲基酪蛋白)。当肽键水解时，羧酸和伯胺作为寡肽两个新末端形成。然后该伯胺在碱性条件下与三硝基苯磺酸(TNBS)反应以形成有色复合物：

[0122]

[0123] 该有色复合物在KonelabArena 30中在405nm以动力学方法检测，使用下述步骤：1)将180微升DMC溶液移液入小杯，2)将混合物温育480秒以获得50℃的温度，3)将36微升的TNBS移液入小杯并混合，4)将混合物温育60秒以重新获得50℃的温度，5)将18微升样品移液入小杯并混合，6)将混合物温育120秒并每18秒测量405nm处的吸收，进行总共7次测量。伯胺与TNBS之间的反应假定为比DMC的切割更快，从而使得在过量底物存在下的反应可假定仅为酶浓度的函数。

[0124] 参考图3，提供了蛋白酶比活性的比较。解淀粉芽孢杆菌amy1(菌株NRRL B-50350)与DD3(菌株NRRL B-50154)产生大约相同量的蛋白酶

[0125] 脂肪酶测定根据对于上述淀粉酶测定所述的实验方案设定。如下所述进行Konelab分析：

[0126] 脂肪酶为特殊类型的酯酶。脂肪酶通常与甘油三酯分解为甘油和3个脂肪酸相关。有时脂肪酶会对含有特定链长度的脂肪酸的甘油三酯具有特异性，或在其他情况下，对甘油模块上的脂肪酸的位置化学具有特异性。脂肪酶趋于在水-油界面起作用。在本文中所述的反应中，使用脂肪酸的对硝基衍生物作为脂肪酶的底物。对于该实验室测定，可以选择数种脂肪酸链长度。这些包括：

[0127] pNP-酪酸：C4

[0128] pNP-缬草酸：C5

[0129] pNP-棕榈酸：C16

[0130] pNP-缬草酸是最常用于该测定的底物。该底物是无色的，而其切割产物对硝基苯酚在450nm具有强吸收。因此可通过监视A405随时间的增加来追踪酶活性。反应方案如下所示：

[0131]

[0132] 有色复合物在Konelab Arena 30中在405nm以动力学方法检测，使用下述步骤：1)将175微升的pNP-缬草酸溶液移液入小杯，2)将混合物温育480秒以获得37℃的温度，
3)将50微升的样品移液入小杯并混合，4)将混合物温育250秒以重新获得37℃的温度，5)将混合物温育600秒并每54秒测量在405nm的吸收，进行总共12次测量。

[0133] 参见图4，解淀粉芽孢杆菌amy 1(菌株NRRL B-50350)与DD3(菌株NRRL B-50154)产生大约相同量的脂肪酶。

[0134] 解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350具有抗真菌活性

[0135] 将菌株NRRL B-50350的抗真菌能力与DD3(菌株NRRL B-50154)相比较。对于菌株，DD3(菌株NRRL B-50154)抑制腐霉属(Pythium)，但更强烈抑制立枯丝核菌(R.solani)和核盘菌(S.sclerotiorum)。菌株NRRL B-50350抑制所有三种真菌，对腐霉属最强。与之相比，DD3(菌株NRRL B-50154)在抑制立枯丝核菌和核盘菌方面比菌株NRRL B-50350更有效，然而，菌株NRRLB-50350与DD3(菌株NRRL B-50154)相比更加强烈地抑制腐霉属。该数据特别有趣，因为找到良好的腐霉属抑制剂是困难的。结果示于下表1：

[0136] 表1：抑制区的直径(mm)(来自SSGN的数据)

[0137]腐霉属立枯丝核菌核盘菌
对照(无抑制) 90.0mm 90.0mm 90mm
野生型dd3(菌株NRRL B-50154)1 5.0x 5.0 20x 12 25x 10.0
2 5.0x 3.0 19x 13 25x 8.0
3 5.0x 4.0 20x 13 25x 10.0
菌株NRRL B-503501 15x 15.0 10x 10.0 10x 10.0
2 15x 13.0 8x 10.0 10x 11.0
3 10x 10.0 10x 9.0 10x 10.0

[0138] 实施例2：温度耐受性

[0139] 方法：将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350和一种内部菌株(用作比较的对照)接种入PCB并在下述每个温度生长过夜：35℃，40℃，45℃和50℃。耐受性是根据生长的存在与否测量的。

[0140] 结果：对于每个菌株，生长在直至50℃是可见的。因此，本公开的菌株具有热耐受性。

[0141] 实施例3：盐度耐受性

[0142] 方法：将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350和一种内部菌株(用作比较的对照)接种入具有下述盐浓度的细菌胰蛋白胨(10g/L)酵母提取物(5g/L)培养基：2%，5%，7.5%，10%和12.5%。耐受性是根据生长与否测量的。

[0143] 结果：对于解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350，生长直至7.5%是可见的，而对照显示直至12.5%的生长。

[0144] 实施例4：生物表面活性剂活性

[0145] 方法：将解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350(“amy1”，且之前称作“菌株X”)和具有已知生物表面活性剂活性的另一种解淀粉芽孢杆菌菌株NRRLB-50017(“SB3195”，且之前称作“菌株Y”)接种入100mL的生物表面活性剂培养基使得每个烧瓶具有0.001的O.D.。在8、24、56和72小时测量表面张力和O.D.。在56小时，进行了多种稀释以确定对于amy1和SB3195的生物表面活性剂强度。

[0146] 结果：尽管amy1和SB3195以相同比率接种，但SB3195与amy1相比显示更快的生长(图5)。在56小时，SB3195生长比amy1高至3倍。然而，amy1的生物表面活性剂产生起始于8小时，而SB3195在24小时呈现生物表面活性剂产生(图6)。良好的生物表面活性剂活性是根据少于50mN/m的表面张力确定的。由amy1产生的生物表面活性剂要稀释100倍才丧失生物表面活性剂活性，而SB3195在25倍稀释丧失生物表面活性剂活性(图
7)。尽管amy1呈现SB3195生长的1/3，amy1产生的表面活性剂在稀释性方面比SB3195强至4倍。

[0147] 本发明通过下述编号段落描述：

[0148] 1.一种解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350的生物纯培养物。

[0149] 2.一种处理植物种子的方法，其包括将种子与有效量的段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。

[0150] 3.一种处理植物生长培养基的方法，其包括将生长培养基与有效量的段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。

[0151] 4.一种杀灭真菌的方法，其包括将真菌与有效量的段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。

[0152] 5.一种降解淀粉的方法，其包括将淀粉与有效量的段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。

[0153] 6.一种改变烘烤成分的方法，其包括将烘烤成分与有效量的段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。

[0154] 7.一种降解脂质的方法，其包括将脂质与有效量的段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触。

[0155] 8.一种处理废水的方法，其包括将段1的解淀粉芽孢杆菌菌株添加至废水的步骤。

[0156] 9.一种清洁表面的方法，其包括将表面与段1的解淀粉芽孢杆菌菌株相接触的步骤。

[0157] 10.段9的方法，其中所述表面是硬表面，如一种或多种选自下组的材料：金属、塑料、橡胶、板(board)、玻璃、木材、纸、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料(ceramic material)如瓷料(porcelain)；或软表面，如由一种或多种选自下组的材料制成：纤维例如纱线(yarn)、织物(textile)、植物纤维；石棉，毛发；皮肤；角质材料；和内脏例如肺；或有孔表面。

[0158] 11.段9-10任一项的方法，其中所述方法定期重复。

[0159] 12.段9-11任一项的方法，包括将表面与酶相接触，所述酶如选自下组的酶：α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、过氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。

[0160] 13.段9-12任一项的方法，进一步包括对表面施以一种或多种选自下组的试剂：分散剂、稳定剂、抗微生物剂和杀生物剂。

[0161] 14.一种组合物，其包含段1的解淀粉芽孢杆菌菌株。

[0162] 15.一种依照段14的组合物，进一步包含一种或多种其他微生物。

[0163] 16.段14的组合物，其进一步包含表面活性剂。

[0164] 17.段16的组合物，其进一步包含一种或多种酶。

[0165] 18.段17的组合物，其中所述酶选自下组：α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶、过氧化物酶/氧化酶和蛋白酶，或其混合物。

[0166] 19.段14的组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的成分：分散剂、稳定剂、抗微生物剂、香料、染料和杀生物剂。

[0167] 20.段14的组合物，其中解淀粉芽孢杆菌菌株NRRL B-50350以约1x105至1x1010每ml的浓度存在。

[0168] 21.菌株芽孢杆菌属NRRL B-50350的分离的微生物。

[0169] 应理解的是，可对本文中公开的实施方案进行多种修饰。因此，上述描述不应视作限制性的，但仅作为实施方案的例示。在所附权利要求的范围和精神内，本领域技术人员会想到其他修饰。

标题	发布/更新时间	阅读量
杀生物剂-专利编号CN106163282A	2020-05-11	1115
杀生物剂-专利编号CN103209590B	2020-05-11	657
杀生物剂组合物-专利编号CN101274997B	2020-05-12	678
杀生物剂组合物-专利编号CN101274997A	2020-05-12	739
杀生物剂和装置-专利编号CN101151219A	2020-05-13	913
浆料杀生物剂-专利编号CN106170458B	2020-05-13	1065
杀生物剂组合物-专利编号CN105451555A	2020-05-12	1030
埋入式杀生物剂-专利编号CN1921762A	2020-05-13	303
杀生物剂组合物-专利编号CN110651792A	2020-05-11	706
杀生物剂-专利编号CN103209590A	2020-05-11	721

解淀粉芽孢杆菌菌株

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