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从植物基因组中切除核酸序列的方法

阅读：1079发布：2020-11-19

IPRDB可以提供从植物基因组中切除核酸序列的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法。该方法基于以下步骤：用编码DNA双链断裂诱导酶(DSBI)的构建体转化植物细胞，产生转基因植物品系，实施瞬时测试法以分析该转基因酶的功能性，将该植物品系与含有待切除核酸序列的品系杂交并且进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。该方法也可以反向进行，这意指用编码待切除核酸序列的构建体转化植物细胞，并且与含有DSBI的植物品系进行杂交。作为此杂交步骤的备选，也可以进行用第二构建体再转化转基因植物品系。本发明也涉及通过这种方法获得的植物或从这种植物衍生的后代、繁殖材料、部分、组织、细胞或细胞培养物。最后，本发明涉及从这种方法衍生的植物或后代、繁殖材料、部分、组织、细胞或细胞培养物的用途，用作食物、饲料或种子或用于产生药物或化学品。，下面是从植物基因组中切除核酸序列的方法专利的具体信息内容。

1.用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法，所述方法包括：

a)用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体转化植物细胞，

b)从步骤a)的细胞产生转基因植物品系，

c)用步骤b)的植物品系或其细胞或部分实施瞬时测试法以分析该转基因DNA双链断裂诱导酶的功能性，

d)将步骤b)的植物品系与含有待切除核酸序列的植物品系杂交，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，和e)进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。

2.用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法，所述方法包括：

a)用编码待切除核酸序列的构建体转化植物细胞，其中待切除的核酸序列包含对DNA双链断裂诱导酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，b)从步骤a)的细胞产生转基因植物品系，

c)用步骤b)的植物品系或其细胞或部分实施瞬时测试法以分析步骤a)的构建体的识别序列和重复序列的功能性，d)将步骤b)的植物品系与含有DNA双链断裂诱导酶的植物品系杂交，和

e)进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。

3.根据权利要求1或2的方法，其中DNA修复机制是同源重组。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤b)或c)之后鉴定单拷贝转基因品系。

5.根据权利要求4的方法，其中单拷贝转基因品系的鉴定通过包括定量PCR或

Southern杂交在内的分子技术进行。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤b)或c)之后分析转基因表达水平。

7.根据权利要求6的方法，其中转基因表达水平的分析通过包括RT-PCR或Northern杂交在内的分子技术进行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤b)或c)之后对转基因植物品系授粉，其中所述授粉是自花授粉或与野生型品系异花授粉。

9.根据权利要求8的方法，其中对通过授粉所获得的种子和/或籽苗分析它们的接合性。

10.根据权利要求9的方法，其中选择在接合性分析后鉴定的纯合品系用于步骤d)的杂交。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的转化选自农杆菌介导的转化、生物射弹转化、原生质体转化、聚乙二醇转化、电穿孔、超声处理、微量注射、大量注射、真空抽滤、感染和在含DNA的溶液中孵育干燥胚。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的瞬时测试法是染色体内同源重组测定法。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的瞬时测试法包括报告构建体的瞬时转化。

14.根据权利要求13的方法，直到它引用权利要求1或从属权利要求为止，其中报告构建体选自GUS构建体、绿色荧光蛋白构建体、氯霉素转移酶构建体、萤光素酶构建体、β-半乳糖苷酶构建体、R-基因座基因产物构建体、β-内酰胺酶构建体、xyl E基因产物构建体和α淀粉酶构建体、酪氨酸酶构建体和水母发光蛋白构建体。

15.根据权利要求13或14的方法，直到它们引用权利要求1或从属权利要求为止，其中报告构建体包含待切除的核酸序列，其中该核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中该核酸序列在两个末端邻接允许DNA修复机制的重复序列，所述的DNA修复机制包括同源重组。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对通过步骤e)所获得的种子和/或籽苗分析包括同源重组在内的DNA双链断裂介导的修复机制。

17.根据权利要求16的方法，其中分析种子和/或籽苗中包括同源重组在内的DNA修复机制是通过包括PCR分析法、比色或生物化学测定法或者DNA测序法在内的分子技术确定的。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中DNA双链断裂诱导酶选自归巢核酸内切酶、限制性核酸内切酶、II类核酸内切酶、重组酶、转座酶和嵌合核酸内切酶。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中DNA双链断裂诱导酶选自I-SceI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HspNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PpbIP、I-PpoI、I-SPBetaIP、I-ScaI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiS3bP、I-TdeIP、I-TevI、RTII-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAlP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI和PI-TliII。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中DNA双链断裂诱导酶选自具有SEQ ID NOs：26或27中所示氨基酸序列的酶或其基本的同源物。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的构建体选自载体、质粒、粘粒、细菌构建体或病毒构建体。

22.根据权利要求21的方法，其中载体选自pCB系列、pLM系列、pJB系列、pCER系列、pEG系列、pBR系列、pUC系列、M13mp系列和pACYC系列。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的构建体分别包含用于表达DNA双链断裂诱导酶或用于表达待切除核酸序列的启动子。

24.根据权利要求23的方法，其中启动子选自组成型启动子、发育依赖的启动子、植物病毒衍生的启动子、诱导型启动子、化学诱导型启动子、生物胁迫或非生物胁迫诱导型启动子、病原体诱导型启动子、组织特异的启动子、对胚、盾片、胚乳、胚轴、花药、子房、花粉、分生组织、花、叶、茎、根、种子、果实和/或块茎具有特异性的启动子、能够在包括玉米、大麦、小麦、黑麦和稻在内的单子叶植物中种子特异性表达的启动子、超级启动子和此类启动子的功能性组合。

25.根据权利要求23或24的方法，其中启动子选自遍在蛋白启动子、甘蔗杆状病毒启动子、菜豆蛋白启动子、35S CaMV启动子、19S CaMV启动子、短或长USB启动子、Rubisco小亚基启动子、豆球蛋白B启动子、胭脂碱合酶启动子、TR双重启动子、章鱼碱合酶启动子、液泡ATP酶亚基启动子、富含脯氨酸的蛋白启动子、PRP1启动子、苯磺酰胺诱导型启动子、四环素诱导型启动子、脱落酸诱导型启动子、水杨酸诱导型启动子、乙醇诱导型启动子、环己酮诱导型启动子、热诱导型hsp80启动子、寒冷诱导型α-淀粉酶启动子、创伤诱导的pinII启动子、2S白蛋白启动子、豆球蛋白启动子、未知种子蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子、蔗糖结合蛋白启动子、豆球蛋白B4启动子、油质蛋白启动子、Bce4启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、麦醇溶蛋白启动子、分支酶启动子、ADP-葡萄糖焦磷酸酶启动子、合酶启动子、bgp1启动子、lpt2或lpt1启动子、大麦醇溶蛋白启动子、谷蛋白启动子、水稻素启动子、谷醇溶蛋白启动子、麦醇溶蛋白启动子、谷蛋白启动子、玉米醇溶蛋白启动子、kasirin启动子、黑麦碱启动子、ory s1启动子、ZM 13启动子、Bp10启动子、Lcg1启动子、AtDMC1启动子、I类patatin启动子、B33启动子、组织蛋白酶D抑制剂启动子、淀粉合酶启动子、GBSS1启动子、甘薯块根特异蛋白启动子、番茄果实特异性启动子、胞质FBP酶的启动子、ST-LSI启动子、CP12启动子、CcoMT1启动子、HRGP启动子、超级启动子、与赋予内含子介导增强作用的内含子组合的启动子和此类启动子的功能性组合。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述启动子包含SEQ ID NO：6第

1至1112位核苷酸中描述的核酸序列。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中待切除的核酸包含T-DNA区或其部分的序列或编码选择标记或其部分。

28.根据权利要求27的方法，其中选择标记选自负选择标记、赋予针对杀生物代谢抑制剂、针对抗生素或针对除草剂的抗性的标记、正选择标记和反选择标记。

29.根据权利要求27或28的方法，其中选择标记选自乙酰羟酸合酶、D-丝氨酸脱氨酶、膦丝菌素乙酰转移酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦降解酶、失活茅草枯的脱卤素酶、失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶、降解溴苯腈的腈水解酶、卡那霉素-或G418-抗性基因、新霉素磷酸转移酶、6-磷酸-2-脱氧葡萄糖磷酸酶、潮霉素磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、D-氨基酸代谢酶、D-氨基酸氧化酶、庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3-腺苷酰转移酶、博来霉素耐药性决定子、异戊烯基转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、UDP-半乳糖-4-差向异构酶、胞嘧啶脱氨酶、细胞色素P-450酶、吲哚乙酸水解酶、卤代烷脱卤素酶和胸苷激酶。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中植物选自玉米、拟南芥属

(Arabidopsis)植物、高粱、稻、油菜籽、烟草、小麦、黑麦、大麦、燕麦、马铃薯、番茄、甜菜、豌豆、甘蔗、芦笋、大豆、苜蓿、落花生、向日葵和西葫芦。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，直到它们涉及权利要求1或从属权利要求为止，其中用编码待切除核酸序列的构建体再转化步骤b)的植物品系来替换步骤d)的杂交，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接允许DNA修复机制的重复序列。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，直到它们涉及权利要求2或从属权利要求为止，其中用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体再转化步骤b)的植物品系来替换步骤d)的杂交。

33.通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的植物，或从这种植物衍生的后代、繁殖材料、部分、组织、细胞或细胞培养物。

34.根据权利要求33的植物或后代、繁殖材料、部分、组织、细胞或细胞培养物的用途，用作食物、饲料或种子或用于产生药物或化学品。

说明书全文

从植物基因组中切除核酸序列的方法

[0001] 发明概述
[0002] 本发明涉及用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法。该方法基于以下步骤：用编码DNA双链断裂诱导酶(DSBI)的构建体转化植物细胞，产生转基因植物品系，
实施瞬时测试法以分析该转基因酶的功能性，将该植物品系与含有待切除核酸序列的品系
杂交并且进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。该方法也可以反向进
行，这意指用编码待切除核酸序列的构建体转化植物细胞，并且与含有DSBI的植物品系进
行杂交。作为此杂交步骤的备选，也可以进行用第二构建体再转化转基因植物品系。本发
明也涉及通过这种方法获得的植物或从这种植物衍生的后代、繁殖材料、部分、组织、细胞
或细胞培养物。最后，本发明涉及从这种方法衍生的植物或后代、繁殖材料、部分、组织、细
胞或细胞培养物的用途，用作食物、饲料或种子或用于产生药物或化学品。

背景技术

[0003] 植物生物技术的目标是产生具备有利的新特性如提高农业生产力、改善食品品质或用于产生某些化学品或药物的植物(Dunwell J.M.(2000)J.Exp.Bot.51：487-96)。
[0004] 转基因植物可以由通常涉及导入分别的性状和选择标记基因的多种技术(综述：Potrykus I.和Spangenberg G编辑(1995)Gene transfer toplants.Springer，柏林)产
生。性状基因或目的基因提供想要的性状，而选择标记基因(如除草剂抗性基因)提供在
转化过程期间选择含有所导入DNA的植物的一种手段。一旦已经鉴定到转化植物，该选择
标记基因一般不提供有用功能。选择标记基因的持续存在成为消费者中不接受这些“基因
食品”产品的主要原因。因此，需要开发这样的技术，其中借助所述技术可以从植物基因组
中以省时和高效方式切除标记DNA。
[0005] 除了改善公众接受度之外，去除选择标记可以通过如下方式提高多个性状组合到单株植物中(性状堆积)的容易程度，即通过促进用相同的选择标记再转化或允许多个性
状杂交到单一品系中，同时不导致选择标记的多重拷贝。
[0006] 技术人员熟悉用于位点定向地除去重组导入的核酸序列的多种系统。一种这样的系统基于使用序列特异性重组酶(双链断裂诱导酶或DSBI)和分布于待除去区域侧翼的
所述重组酶的两个识别序列。DSBI对这种构建体的作用引起侧翼序列切除，但具有仍在基
因组中保留的所述识别序列之一。描述了多种序列特异性重组系统，如噬菌体P1的Cre/
lox系统(Dale EC和Ow DW(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：10558-10562；Russell SH
等(1992)Mol Gene Genet 234：49-59；Osborne BI等(1995)Plant J.7，687-701)、酵母
FLP/FRT系统(Kilby NJ等(1995)Plant J 8：637-652；LyznikLA等(1996)Nucleic Acids
Res 24：3784-3789)、Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌Pin重组酶或质粒pSR1的R/RS系
统(Onouchi H等(1995)MolGene Genet 247：653-660；Sugita K等(2000)Plant J.22：
461-469)。
[0007] 序列特异性重组系统的缺点是反应的可逆性，这就是说，所讨论标记序列的切除与整合之间存在平衡。这经常因多个连续插入和切除引起不希望的突变。这不仅对Cre-lox
系统是这样，对于其他序列特异性重组酶(见上文)也是如此。又一个缺点是这样的事实，
即该重组酶的识别序列之一仍留在基因组中，因而修饰了所述基因组。仍保留的识别序列
排除了该重组系统的进一步用途，例如用于第二遗传修饰，因为不能排除与随后导入的识
别序列相互作用。可能导致显著的染色体重排或缺失。
[0008] 鉴定转基因植物品系中双链断裂(DSB)诱导的同源重组(HR)的常规方法需要最少约19个月的时间。在i)用编码DSBI的载体转化植物品系和ii)用编码待切除序列的
载体转化植物品系后，在这两个植物品系的T0至T2世代中鉴定单拷贝纯合品系。随后，将
这两个品系杂交以产生F1品系，并且仅对F2品系分析DSB诱导的HR(见图9)。
[0009] 发明详述
[0010] 本发明人阐述了一种植物再生新策略的研发，其中所述的植物再生新策略可以允许缩短获得DSB介导的修复植物品系、收集比杂交法更多的数据(体外组织培养材料对常
规杂交方法)并减少温室空间和劳动的过程(见图9)。
[0011] 在本上下文中，本发明人开发了用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的改良方法。待切除的序列可以是例如标记基因，并且该标记基因可以是例如用于选择转基
因植物的选择标记基因盒或转基因植物中用于含有性状这一目的的完整T-DNA区。本发明
涉及关于建立DSB介导的修复以使用DSBI酶、尤其归巢核酸内切酶(HEN)在植物中切除标
记的数据。导入的DSB可以优选地通过同源重组(HR)、非同源的末端连接(NHEJ)、精确连
接(PL)或其他机制修复，从而完全切除目的序列。
[0012] 本发明因而涉及用于从植物或植物细胞的基因组切除核酸序列的方法，该方法包括：
[0013] a)用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体转化植物细胞，
[0014] b)从步骤a)的细胞产生转基因植物品系，
[0015] c)用步骤b)的植物品系或其细胞或部分实施瞬时测试法以分析该转基因DNA双链断裂诱导酶的功能性，
[0016] d)将步骤b)的植物品系与含有待切除核酸序列的植物品系杂交，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断
裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接了允许DNA修复机制的重复序列，和
[0017] e)进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。
[0018] 优选地，步骤d)的DNA修复机制是同源重组。
[0019] 术语“DNA双链断裂诱导酶”(DSBI)一般是指能够在双链DNA中以序列特异性方式在一个或多个识别序列或识别位点处产生双链断裂的全部那些酶。DNA断裂或切割可以
产生DNA的平末端或所谓″粘性″末端(具有5’-或3’-突出端)。切割位点可以位于
该酶的识别序列内部或外部。优选地通过同源序列或“重复”序列之间应当由双链断裂诱
导的同源重组实现从植物或植物细胞的基因组中后续切除该核酸序列。一般方法例如在
WO03/004659中披露。适合诱导双链断裂的多种酶是本领域已知的。以下DSBI以举例而非
限制的方式提到：
[0020] 1)限制性核酸内切酶(例如II型)，优选地是如本文中详细描述的归巢核酸内切酶。
[0021] 2)重组酶(例如，Cre/lox；R-RS；FLP/FTR)。
[0022] 3)转座酶，例如P元件转座酶(Kaufman P D和Rio D C(1992)Cell69(l)：27-39)或AcDs(Xiao Y L和Peterson T(2000)Mol Gen Genet263(l)：22-29)。原则上，
全部转座酶或整合酶是合适的，只要它们具有序列特异性(Haren L等人，(1999)Annu Rev
Microbiol.1999；53：245-281；BeallE L，Rio D C(1997)Genes Dev.11(16)：2137-2151)。
[0023] 4)如本文中描述的嵌合核酸酶。
[0024] 5)在免疫系统中诱导双链断裂的酶，如RAG1/RAG2系统(AgrawalA等人，(1998)Nature 394(6695)：744-451)。
[0025] 6)II类核酸内切酶或第II类内含子核酸内切酶。对内含子序列的修饰允许第II类内含子实际上指向双链DNA中的任意序列，其中第II类内含子可以随后通过逆剪接机制
插入(Mohr等人，(2000)Genes&Development 14：559-573；Guo等人，(2000)Science 289：
452-457)。在这个逆剪接机制期间，双链断裂被导入靶DNA，切除的内含子RNA切割有义
链，同时第II类内含子核酸内切酶的蛋白质部分水解反义链(Guo等人，(1997)EMBO J 16：
6835-6848)。若仅想要诱导双链断裂，而不实现彻底的逆剪接，这一点是本发明中优选的情
形，则可能求助于例如缺乏逆转录酶活性的第II类内含子核酸内切酶。尽管这不能防止双
链断裂产生，但逆剪接机制不能推进至完成。
[0026] 优选地，以这样的方式选择DSBI，从而其相应的识别序列即便存在，也极少地存在于靶植物生物的未修饰基因组中。理想地，该识别序列在基因组中的仅有的一个拷贝(或
多个拷贝)是在待切除核酸内部包含的一个序列或多个序列，因而消除了当表达DSBI时，
切除或重排此基因组中其他DNA的可能性。
[0027] 术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA并且-任选地-随后mRNA翻译成一种或多种多肽。
[0028] 术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传基因信息。所述基因组DNA包含细胞或生物的完整遗传物质，其中所述的遗传物质包括细胞核的DNA(染色体DNA)、染
色体外DNA和细胞器(例如线粒体和质体如叶绿体的)DNA。优选地，术语“基因组”或“基
因组DNA”指细胞核的染色体DNA。
[0029] 术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”将理解为独立于细胞周期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA因而可能在染色体或染色单体中组织起来，它们可能是浓缩或解螺
旋的。向染色体DNA中的插入可以通过本领域已知的多种方法例如聚合酶链反应(PCR)分
析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR进行展示和分析。
[0030] 用于选择合适DSBI的一个标准是该酶相应识别序列的长度。该识别序列具有允许稀有切割(或DSB)、更优选仅在本发明DNA构建体中所包含的识别序列处切割的适宜长
度。从统计的观点看，决定该识别序列最小长度的一个因素是宿主植物的基因组大小。在
一个优选的实施方案中，该识别序列具有至少10碱基对、优选地至少14碱基对、更优选至
少16碱基对、特别优选至少18碱基对、最优选至少20碱基对的长度。切割10碱基对识别
序列的DSBI酶在Huang B.等人，(1996)J Protein Chem 15(5)：481-9中描述。
[0031] 合适的酶不仅有天然酶，还有人工酶。优选的酶是其识别序列已知并且可以以其蛋白质形式(例如通过纯化)获得或使用其核酸序列表达的全部那些DSBI酶。特别优选
在特定植物的基因组序列中除了在待切除的核酸中存在的识别序列之外，没有或还仅有少
数识别序列的那些酶。这避免在该基因组中不希望的基因座处的其他双链断裂。
[0032] 这是为何非常特别优选归巢核酸内切酶的原因(综述：Beifort M.和RobertsR.J.(1997)Nucleic Acids Res 25：3379-3388；Jasin M.(1996)Trends Genet.12：
224-228；Internet：http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing.html)。因所述酶的
长识别序列，它们在大多数情况下在真核生物的基因组DNA中没有或仅有少数其他识别序
列。
[0033] 编码归巢核酸内切酶的序列可以例如从衣藻的叶绿体基因组分离(Turmel M等人，(1993)J Mol Biol 232：446-467)。它们是小分子蛋白(通常18至26kD)并且其
可读框(ORF)具有直接适合在真核生物中胞核表达的“密码子使用”(Monnat R.J.Jr等
人，(1999)Biochem Biophys Res Com255：88-93)。特别优选分离的归巢核酸内切酶是归
巢核酸内切酶I-SceI(WO96/14408)、I-SceII(Sarguiel B等人，(1990)Nucleic Acids
Res18：5659-5665)、I-SceIII(Sarguiel B等人，(1991)Mol Gen Genet.255：340-341)、
I-Ceul(Marshall(1991)基因104：241-245)、I-Crel(Wang J等人，(1997)Nucleic Acids
Res 25：3767-3776)、I-ChuI(Cote V等人，(1993)Gen 129：69-76)、I-TevI(Chu等人，
(1990)Proc Natl Acad Sci USA87：3574-3578；Bell-Pedersen 等 人，(1990)Nucleic
Acids Res 18：3763-3770)、I-TevII(Bell-Pedersen等人，(1990)Nucleic Acids Res 18：
3763-3770)、I-TevIII(Eddy等人，(1991)Genes Dev.5：1032-1041)、内切SceI(Kawasaki
等 人，(1991)J Biol Chem 266：5342-5347)、I-CpaI(Turmel M等 人，(1995a)Nucleic
Acids Res 23：2519-2525) 和 I-CpaII(Turmel M 等 人，(1995b)Mol.Biol.Evol.12，
533-545)。
[0034] 可以提到的其他实例是以下归巢核酸内切酶，如F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、
I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-CsmI、I-CvuI、
I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HspNIP、I-LlaI、
I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、
I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PpbIP、
I-PpoI、I-SPBetaIP、I-ScaI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、
I-SceVII、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、
I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiS3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、
I-UarHGPAlP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIP、PI-PfuI、
PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、
PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII及其组合。
[0035] 酶可以从其来源生物以技术人员熟悉的方式分离，和/或可以克隆其编码核酸序列。多种酶的序列在GenBank保藏。
[0036] 可以通过举例方式提到的其他合适的DSBI酶是包含非特异性催化性核酸酶结构域和由锌指组成的序列特异性DNA结合结构域的嵌合核酸酶(Bibikova M等人，(2001)
Mol Cell Biol.21：289-297)。可以修改这些结合DNA的锌指结构域以适应任何DNA序列。
描述了用于制备合适锌指结构域的合适方法并且是技术人员已知的(Beerli R.R等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97(4)：1495-1500；Beerli R.R等人，J.Biol.Chem 2000；
275(42)：32617-32627；Segal D.J. 和 Barbas CF.3rd.，Curr.Opin.Chem.Biol.2000；
4(1)：34-39；Kang J S和Kim J S，J Biol Chem 2000；275(12)：8742-8748；Beerli R R 等
人，Proc Natl Acad Sci USA 1998；95(25)：14628-14633；Kim J S等人，Proc Natl Acad
Sci USA 1997；94(8)：3616-3620；Klug A，J Mol Biol 1999；293(2)：215-218；Tsai S Y
等人，Adv Drug Deliv Rev 1998；30(1-3)：23-31；Mapp A K等人，Proc Natl AcadSci USA
2000；97(8)：3930-3935；Sharrocks A D等人，Int J Biochem CellBiol 1997；29(12)：
1371-1387；Zhang L 等人，J Biol Chem 2000；275(43)：33850-33860)。
[0037] 在本发明的一些方面，可以使用分子进化来产生改良的DSBI。编码候选DSBI酶的多核苷酸可以例如用DNA改组方法修改。DNA改组法是一个递归的重组和突变的方法，通过
使相关基因的汇集物随机片段化，随后通过聚合酶链反应样过程再装配所述片段进行。见，
例如，Stemmer(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature
370：389-391；和US 5,605,793、US 5,837,458、US 5,830,721和US5,811,238。用于修饰
DSBI的DNA改组法的备选方案是合理设计。合理设计涉及基于对DNA和/或蛋白质相互作
用的现有理解而定向突变基因，从而预见了突变的结果。
[0038] DSBI酶也可以表达为具核定位序列(NLS)的融合蛋白。这种NLS序列能够促进运输到细胞核中并提高重组系统的效力。多种NLS序列是技术人员已知的并且尤其由Jicks
G R和Raikhel N V(1995)Annu.Rev.CellBiol.11：155-188描述。对于植物生物，优选例
如SV40大抗原的NLS序列。由于许多DSBI酶(例如归巢核酸内切酶)的大小是小的，因
而实际上不要求有NLS序列。这些酶可能能够穿过核孔，无需NLS介导的运输过程。
[0039] 对于本发明，DNA双链断裂诱导酶优选地选自由归巢核酸内切酶、限制性核酸内切酶、II类核酸内切酶、重组酶、转座酶和嵌合核酸内切酶组成的组。
[0040] 更优选地，DNA双链断裂诱导酶选自由I-SceI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、
I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、
I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HspNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、
I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、
I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PpbIP、I-PpoI、I-SPBetaIP、
I-ScaI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-SexIP、I-SneIP、
I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、
I-SthPhiS3bP、I-TdeIP、I-TevI、RTI I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAlP、
I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIp、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、
PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、
PI-ThyI、PI-TliI和PI-TliII组成的组。
[0041] 最优选地，DNA双链断裂诱导酶选自由具有如SEQ ID NO：26或27或其基本的同源物中所述核苷酸序列的酶组成的组。
[0042] 如本文中所用，术语“氨基酸序列”指一串代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或词。氨基酸可以在本文中由其通常所知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会
(IUPAC-IUB Biochemical NomenclatureCommission)推荐的单字母符号指称。同样，核苷
酸可以由其通常接受的单字母代码指称。
[0043] 术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换地用来指示连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。
[0044] 术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其处于单链或双链形式、有义或反义形式的聚合物或杂合体。除非另外说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守方式修饰
的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”可以代表
例如基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。
[0045] 术语“核苷酸序列”指脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，通常从5’端阅读到3’端。它可以具有从仅几个核苷酸至多个千碱基的任意长度并且
包括染色体DNA、自我复制型质粒、DNA或RNA的感染性聚合物和主要履行结构作用的DNA
或RNA。
[0046] 术语“编码区”指被转录成mRNA并且指导特定蛋白质序列翻译的核酸部分。最终该mRNA以序列特异性方式翻译以产生特定的多肽或蛋白质。称该编码区编码这种多肽或
蛋白质。真核生物中，编码区在5’侧以编码起始物甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界并
且在3’侧以特定终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的3种三联体之一种为界。除含有内含子
之外，基因的基因组形式也可以包括在RNA转录物中存在的位于序列5’-和3’-末端的序
列。这些序列称作非翻译区或UTR；这些UTR位于mRNA编码区的5’或3’。5’-UTR可含有
能够控制或影响基因转录的调节序列如增强子。3’-侧翼区可以含有这样的序列，其中所
述序列可以提供对于mRNA加工、稳定性和/或表达相关的信息，以及指导转录终止和涉及
正确的mRNA加工(包括转录后切割和聚腺苷酸化)的后续功能。
[0047] 术语“基因”指与能够以一些方式调节多肽表达的适宜调节序列有效连接的编码区。基因包括DNA中位于编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的非转录和
/或非翻译的调节区(例如启动子、增强子、阻抑物等)，以及根据需要，在各个编码区(即
外显子)之间的间插序列(即内含子)。如本文中所用的术语“结构基因”意指转录成mRNA
的DNA序列，其中所述的mRNA随后翻译成作为具体多肽的特征的氨基酸序列。
[0048] (多核苷酸)“构建体”指至少部分地由重组方法产生的核酸。术语“DNA构建体”指由脱氧核糖核苷酸组成的多核苷酸构建体。该构建体可以是单链的或优选是双链的。该
构建体可以是环状或线状的。技术人员熟悉多种获得和产生DNA构建体的方式。
[0049] 构建体可以通过例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring
Harbor，NY(1989)中、在T.J.Silhavy，M.L.Berman和 L.W.Enquist，Experiments with
Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)
中、和 在 Ausubel，F.M. 等 人，Current Protocols in Molecular.Biology，Greene
PublishingAssoc，and Wiley Interscience(1987)中描述的惯用重组和克隆技术制备。
[0050] 当谈及双链核酸序列如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本上同源的”或“基本的同源物”指可以在如下文中所述的低严格条件下与双链核酸序列的两条链之一或这两条
链杂交的任意探针。当谈及单链核酸序列使用时，术语“基本上同源的”指可以在如下文中
所述的低严格条件下与单链核酸序列杂交的任意探针。
[0051] 如本文中所用，术语“杂交”包括核酸链通过碱基配对作用与互补链结合的任意过程(Coombs 1994)。杂交和杂交的强度(即核酸之间结合的强度)受此类因素影响，如核酸
之间的互补性程度、所涉及条件的严格性、所形成杂合体的Tm和核酸内部的G：C比。
[0052] 如本文中所用，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是这样的温度，在该温度处双链核酸分子群体的50％解离成单链。用于计算核酸Tm的等式是本领域熟知的。如标准
参考文献所示，当核酸在1M NaCl水溶液中存在时，可以通过等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)
计算，简单估计Tm值[见例如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，
in NucleicAcid Hybridization(1985)]。其他参考文献包括考虑结构特征及序列特征以
计算Tm的复杂计算法。
[0053] 当谈及核酸杂交使用时，低严格条件包含这样的条件，其等同于当使用约100至约1000个核苷酸长度的DNA探针时，在68℃，在由5xSSPE(43.8g/L NaCl、6.9g/L
NaH2PO4、H2O和1.85g/LEDTA，用NaOH调节pH至7.4)、1％SDS、5x Denhardt’s试剂[50x
Denhardt’s，每500mL含有：5g菲可(400型，Pharmacia)、5g BSA(第V级分；Sigma)]和
100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在室温于包含0.2xSSPE和0.1％
SDS的溶液中洗涤。
[0054] 当谈及核酸杂交使用时，高严格条件包含这样的条件，其等同于当使用约100至约1000个核苷酸长度的DNA探针时，在68℃，在由5x SSPE、1％SDS、5x Denhardt’s试剂和
100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在68℃于包含0.1x SSPE和0.1％
SDS的溶液中洗涤。
[0055] 术语“等同”当因涉及目的杂交条件而谈及杂交条件时，意指所述杂交条件和目的杂交条件导致具有相同范围的同源性百分数(％)的核酸序列杂交。例如，若目的杂交条件
导致第一核酸序列与对该第一核酸序列具有80％至90％同源性的其他核酸序列杂交，那
么若另外的杂交条件也导致第一核酸序列与对该第一核酸序列具有80％至90％同源性的
其他核酸序列杂交，称这种另外的杂交条件等同于所述目的杂交条件。
[0056] 当谈及核酸杂交使用时，本领域熟知可以使用许多等同条件来包含低严格条件或高严格条件；考虑了这样的因素，如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质
(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或被固定等)以及盐和其他组分的浓度(例如甲酰胺、
硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或缺乏)并且可以变动杂交溶液以产生区别于、但等同于以
上所列条件的低严格性或高严格性杂交条件。本领域技术人员知道尽管可以优选较高的严
格性以降低或消除非特异性结合，然而可以优选较低的严格性以检测更大数目的具有不同
同源性的核酸序列。
[0057] DSBI由可以优选地是核酸构建体的构建体编码。使用包含编码DSBI酶的核酸的表达盒产生DSBI酶。将该表达盒导入植物细胞或植物。术语“表达盒”-例如当指DSBI酶
的表达盒时，还涉及本发明待表达的任何其他序列时-意指其中待表达的“编码序列”DNA
与引起或调节其表达(即转录和/或翻译)的至少一个遗传控制元件有效连接的那些构建
体。这里，表达可以是例如稳定的或瞬时的，组成型或诱导型的。为导入表达盒，技术人员
可以借助于多种直接方法(例如转染、粒子轰击、微量注射)或间接方法(例如用农杆菌或
病毒感染)，全部这些方法在下文进一步详述。
[0058] 以下关于表达盒、遗传控制元件、启动子、增强子等的详细说明指编码DSBI的构建体以及可以在本发明范围内可能被表达的任何其他核酸序列，如待切除的序列、标记基
因序列、针对抗生素或除草剂的抗性基因等。
[0059] 用于根据本发明方法步骤a)转化的构建体可以是与至少一个遗传控制元件有效连接的编码DNA双链断裂诱导酶的任意核酸分子。优选地，编码DNA双链断裂诱导酶的构
建体选自由载体、质粒、粘粒、细菌构建体或病毒构建体组成的组。
[0060] 载体是能够被导入细胞的遗传构建体。存在例如克隆载体、表达载体、基因融合载体、穿梭载体、靶向载体等。若所述构建体是载体，则该载体优选地选自由pCB系列、pLM系
列、pJB系列、pCER系列、pEG系列、pBR系列、pUC系列、M13mp系列和pACYC系列组成的组
中的载体。
[0061] 质粒是环状的DNA双链分子。它可以设计成允许用重组DNA技术克隆和/或表达DNA。粘粒(由Collins J.和Hohn B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1978年9月；75(9)：
4242-6首次描述)是从λ细菌病毒(噬菌体)衍生的载体。它通常含有至少一个或两个
粘性(“cos”)位点。粘粒的克隆容量高达约47kb。
[0062] 术语“约”在本文中用于指大约、大致、左右和在......范围内。当术语“约”与一个数字范围使用时，它通过使界限值延伸高于和低于所述数值而修饰该范围。通常，术语
“约”在本文中用来修饰高于和低于所述数值20％以上或以下(更高或更低)、优选15％、
更优选10％并且最优选5％变异的数值。
[0063] “有效连接”通常理解为意指这样的排列，其中遗传控制序列能够对待表达、例如同时编码DSBI酶的核酸序列发挥其功能。在本上下文中，功能可以意指例如控制核酸序列
(例如编码DSBI酶的核酸序列)的表达，即转录和/或翻译。在本上下文中，控制包括例如
起始、提高、掌控或抑制表达，即，转录和(根据需要)翻译。控制可以接下来例如是组织和
/或时间特异性的。它也可以是诱导型的，例如由某些化学品、胁迫、病原体等诱导。
[0064] 有效连接理解为意指例如启动子、待表达的核酸序列-在本发明的情况下例如编码DSBI酶的核酸序列-和根据需要的其它调节元件例如终止子以如下方式顺序排列，以致
当核酸序列-例如编码DSBI酶的核酸序列-表达时，所述调节元件的每一种均能够实现其
功能。
[0065] 这不一定需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列也能够从位于远距离的位置或甚至从其它DNA分子对靶序列发挥它们的功能。优选的排列是这样的排
列，其中待表达的核酸序列-例如编码DSBI酶的核酸序列-位于充当启动子的序列之后，
从而这两个序列彼此共价地连接。启动子序列与该核酸序列(例如编码DSBI酶的核酸序
列)之间的距离优选地小于200碱基对、特别优选小于100碱基对、非常特别优选小于50
碱基对。
[0066] 技术人员熟悉多种旨在获得这种表达盒的方式。例如，它优选地通过充当启动子的核酸序列与待表达的核苷酸序列(例如编码DSBI酶的核酸序列)直接融合来制
备。有效连接可以通过例如在T.Maniatis，E.F.和J.Sambrook，Molecular Cloning：A
Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)
中、 在 T.J.Silhavy，M.L. 和 L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold
SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)中、和在Ausubel，F.M.等
人，Current Protocols in Molecular.Biology，Greene PublishingAssoc，and Wiley
Interscience(1987)中描述的惯用重组和克隆技术实现。
[0067] 然而，表达盒也可以用这种方式构建，从而例如通过同源重组或通过随机插入，使待表达的核酸序列(例如编码DSBI酶的核酸序列)处于内源性遗传控制元件例如启动子
的控制下。这类构建体同样理解为是本发明目的的表达盒。
[0068] 技术人员知道核酸分子也可以使用锌指蛋白型人工转录因子表达(Beerli R R等人，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(4)：1495-500)。可以修改这些因子以适应任意序
列区并且能够独立地表达某些启动子序列。
[0069] 术语“遗传控制序列”将在广泛含义上理解并且指影响本发明表达盒的存在或功能的全部那些序列。例如，遗传控制序列确保在生物中的转录和根据需要翻译。优选地，本
发明的表达盒包含待表达的相应核酸序列5’-上游的启动子和3’-下游的终止子序列作为
额外的遗传控制序列，和根据需要，还包含其他惯用调节元件，在每种情况下，它们均与待
表达的核酸序列有效连接。遗传控制序列在例如“Goeddel；Gene Expression Technology：
Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)”或“Gruber和
Crosby，在Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，CRC Press，Boca
Raton，FIa.，编者Glick和Thompson，第7章，89-108”及其中引用的参考文献中描述。
[0070] 此类控制序列的实例是与诱导物或阻抑物结合并且因而调节核酸表达的序列。除这些新的控制序列之外或取代这些序列之外，在实际的结构基因之前的所述序列的天然调
节作用仍可以存在，并根据需要，可以用这样的方式遗传地修饰，从而关闭这种天然调节作
用并增加基因表达。然而，表达盒也可以在结构上更简单，也就是说在上文提到的基因之前
不插入额外的调节信号，并且不消除天然启动子连同其调节作用。取而代之的是，以这样的
方式突变该天然控制序列，从而调节作用不再发生并且增加基因表达。这些修饰的启动子
也可以本身位于天然基因之前以提高活性。
[0071] 多种控制序列是适用的，这取决于在本文中更详细描述的宿主生物或起始生物，其中所述的生物因表达盒或载体的导入而变成基因修饰生物或转基因生物。
[0072] “转基因”、“转基因的”或“重组”指由人操作过的多核苷酸或由人操作过的多核苷酸的副本或互补物。例如，包含与第二多核苷酸有效连接的启动子的转基因表达
盒可以包括由于人操作包含该表达盒的分离核酸而对于所述第二多核苷酸为异源的启
动子(例如通过Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring
Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，(1989)或Current Protocols in
MolecularBiology第1-3卷，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)中描述的方法)。在另
一个实例中，重组表达盒可以包含以这样方式组合的多核苷酸，从而所述多核苷酸极不可
能在自然界中找到。例如，由人操作过的限制性位点或质粒载体序列可以分布于侧翼或将
启动子与第二多核苷酸隔开。技术人员会认识到可以用许多方式操作多核苷酸并且不限于
如本文中描述的实例。
[0073] 当谈及细胞时使用的术语“转基因的”或“重组的”指含有转基因的或其基因组已经因导入转基因而改变的细胞。
[0074] 当谈及组织或植物时使用的术语“转基因的”分别指包含一个或多个这样细胞的组织或植物，其中所述的细胞含有转基因或其基因组已经因导入转基因而改变。转基因细
胞、组织和植物可以由几种方法产生，所述方法包括通过人类干预如通过本文中描述的方
法，将包含核酸(通常DNA)的“转基因”导入靶细胞中或将该转基因整合到靶细胞的染色
体中。
[0075] 原则上，优选的启动子是能够控制基因、尤其外来基因在植物中表达的任意启动子。优选的启动子是能够在植物中组成型表达的那些启动子(Benfey等人，(1989)EMBO
J.8：2195-2202)。优选使用的启动子特别是植物启动子或从植物病毒衍生的启动子。尤
其优选花椰菜花叶病毒35S转录物的启动子(Franck等人，(1980)Cell 21：285-294；
Odell等人，(1985)Nature 313：810-812；Shewmaker等人，(1985)Virology 140：281-288；
Gardner等人，1986，Plant Mol.Biol.6，221-228)或19S CaMV启动子(美国专利号
5,352,605和WO 84/02913)。已知这种启动子包含转录效应物的多个识别序列，从而在整
体上引起所导入基因的持久和组成型表达(Benfey等人，(1989)EMBO J 8：2195-2202)。又
一个合适的组成型启动子是Rubisco小亚基(SSU)启动子(美国专利号4,962,028)。合
适启动子的又一个实例是豆球蛋白B启动子(GenBank登录号：X03677)。其他优选的组成
型启动子例如是农杆菌胭脂碱合酶启动子、TR双重启动子、农杆菌OCS(章鱼碱合酶)启动
子、遍在蛋白启动子(Holtorf S等人，(1995)Plant Mol Biol29：637-649)、液泡ATP酶亚
基的启动子或小麦富含脯氨酸的蛋白的启动子(WO 91/13991)。
[0076] 表达盒也可以包含诱导型、优选化学诱导型启动子(Aoyama T和ChuaN H(1997)Plant J 11：605-612；Caddick M X等人，(1998)Nat.Biotechnol16：177-180；综述：Gatz，
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1997，48：89-108)，其中借助所述启动子可以
在特定时间点上控制植物中外源基因的表达。同样可以使用此类启动子，例如PRP1启动
子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、
苯磺酰胺诱导型启动子(EP-A-0388186)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，(1992)Plant
J.2，397-404)、脱落酸诱导型启动子(EP-A 335528)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)
或乙醇诱导型启动子(Salter M G等人，(1998)Plant J16：127-132)或环己酮诱导型启动
子(WO 93/21334)。
[0077] 在一个尤其优选的实施方案中，特别地在诱导型启动子的控制下表达编码DSBI酶的核酸。这导致受控的、可掌控的表达和缺失-例如在植物中-，并且避免了由组成型表
达DSBI酶所致的任何潜在有害作用。
[0078] 其他优选的启动子是通过生物胁迫或非生物胁迫诱导的启动子，例如PRP1基因的病原体诱导型启动子(Ward等人，Plant Mol Biol 1993，22：361-366)、番茄热诱
导型hsp80启动子(美国专利号5,187,267)、马铃薯寒冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO
96/12814)或创伤诱导的pinll启动子(EP375091)。其他优选的启动子是对花药、子房、
花粉、分生组织、花、叶、茎、根和种子具有特异性的启动子。受发育调节的启动子尤其由
Baerson等人(Baerson S R，Lamppa G K(1993)Plant Mol Biol22(2)：255-67)描述。
[0079] 尤其优选的启动子是这些启动子，它们在进行淀粉和/或油类或其前体的生物合成或有利地积累所述产物的组织或植物部分中确保表达。淀粉生物合成的细胞位置是叶
的叶绿体或贮藏组织(如种子、果实或块茎)的淀粉质体。在这些器官内部，合成过程正
是在胚乳细胞或胚的子叶中优势地进行。除上文提到的组成型启动子之外，优选的启动
子因此尤其是种子特异性启动子，例如菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200，Bustos
M M等，Plant Cell.1989；1(9)：839-53)、2S白蛋白基因的启动子(Joseffson L G等
人，(1987)J Biol Chem 262：12196-12201)、豆球蛋白启动子(Shirsat A等人，(1989)
Mol Gen Genet.215(2)：326-331)、USP(未知种子蛋白质)启动子(Bumlein H等人，
(1991)Molecular&General Genetics 225(3)：459-67)、油菜籽蛋白基因启动子(美国专
利号5,608,152；Stalberg K，等人，(1996)L.Planta 199：515-519)、蔗糖结合蛋白启动
子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Bumlein H等人，(1991)Mol Gen Genet
225：121-128；Baeumlein等人，(1992)Plant Journal 2(2)：233-239；Fiedler U等人，
(1995)生物技术(Biotechnology)(NY)13(10)：1090-1093)、Ins拟南芥油质蛋白启动子
(WO9845461)、芸苔属(Brassica)Bce4启动子(WO 91/13980)。其他合适的种子特异性启
动子是编码“高分子量麦谷蛋白”(HMWG)、麦醇溶蛋白、分支酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶(AGP
酶)或淀粉合酶的基因的那些启动子。进一步更优选的启动子是在单子叶植物如玉米、大
麦、小麦、黑麦、稻等中能够种子特异性表达的那些启动子。可以有利使用的启动子是lpt2
或lpt1基因的启动子(WO 95/15389，WO 95/23230)或WO 99/16890中描述的启动子(大麦
醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、
玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或黑麦碱基因的启动子)。
[0080] 此外，优选作为遗传控制元件的启动子是花粉特异性启动子，例如小白菜(B.campestris)bgp1基因的启动子(GenBank登录号：X68210；Xu H等人，(1993)Mol
Gen Genet 239(1-2)：58-65；WO 94/13809)、稻ory s1基因的启动子(GenBank登录号：
AJ012760；Xu H等人，(1995)Gene 164(2)：255-259)、花粉特异性玉米基因ZM13的启动子
(Hamilton D A等人，(1998)Plant Mol Biol 38(4)：663-669；美国专利号5,086,169)、欧
洲油菜(B.napus)基因Bp10的启动子(GenBank登录号：X64257；Albani D(1992)Plant J
2(3)：331-342；美国专利号6,013,859)和此类启动子的功能性组合。其他优选的启动子
是用于雄性配子中细胞特异性表达的Lcg1启动子(WO99/05281；XU H等人，(1999)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA Vol.96：2554-2558)和AtDMC1基因的启动子(Klimyuk V I等人，
(1997)Plant J 11(1)：1-14)。其他合适的启动子是例如块茎、贮藏根或根的特异性启动
子，例如I类patatin启动子(B33)、马铃薯组织蛋白酶D抑制剂启动子、淀粉合酶(GBSS1)
启动子或甘薯块根特异蛋白(sporamin)启动子，和果实特异性启动子，例如番茄果实特异
性启动子(EP-A 409625)。
[0081] 此外，还合适的启动子是确保叶特异性表达的那些启动子。可以提到的启动子是马铃薯胞质FBP酶的启动子(WO 98/18940)、Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU(小
亚基)启动子、马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人，(1989)EMBO J 8(9)：2445-2451)
或此类启动子的功能性组合。其他优选的启动子是掌控种子和植物胚中表达的那些启动
子。其他合适的启动子是例如果实成熟特异性启动子例如番茄果实成熟特异性启动子
(WO94/21794)、花特异性启动子例如八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)或P-rr基因
的启动子(WO 98/22593)，或者可以有利地使用如EP-A 249676中所述的另一种结节特异
性启动子。
[0082] 原则上，全部天然启动子连同其调节序列，如上文提到的那些，可以用于本发明的方法。另外，也可以有利地使用人工启动子。遗传控制序列也包括能够调节表达特异性特征
的其他启动子、启动子元件或最小启动子。因此，例如，组织特异性表达可以此外因遗传控
制序列而与某些胁迫因素有关地发生。例如对水胁迫、脱落酸(Lam E和Chua N H(1991)J
BiolChem 266(26)：17131-17135)和热胁迫(Schoffl F等人，(1989)Molecular&General
Genetics 217(2-3)：246-53)描述了此类元件。另外，能够在其他植物组织或其他生物(例
如大肠杆菌(E.coli))中表达的其他启动子可以与待表达的核酸序列有效连接。适合的植
物启动子原则上是全部上述启动子。
[0083] 优选地，本发明的启动子选自由以下组成的组：组成型启动子、发育依赖性启动子、植物病毒衍生的启动子、诱导型启动子、化学诱导型启动子、生物胁迫或非生物胁迫诱
导型启动子、病原体诱导型启动子、组织特异性启动子、对胚、盾片、胚乳、胚轴、花药、子房、
花粉、分生组织、花、叶、茎、根、种子、果实和/或块茎具有特异性的启动子、能够在包括玉
米、大麦、小麦、黑麦和稻在内的单子叶植物中进行种子特异性表达的启动子、超级启动子
和此类启动子的功能性组合。
[0084] 更优选地，启动子选自由以下组成的组：遍在蛋白启动子、甘蔗杆状病毒启动子、菜豆蛋白启动子、35S CaMV启动子、19S CaMV启动子、短或长USB启动子、Rubisco小亚基启
动子、豆球蛋白B启动子、胭脂碱合酶启动子、TR双重启动子、章鱼碱合酶启动子、液泡ATP
酶亚基启动子、富含脯氨酸的蛋白的启动子、PRP1启动子、苯磺酰胺-诱导型启动子、四环
素-诱导型启动子、脱落酸-诱导型启动子、水杨酸-诱导型启动子、乙醇诱导型启动子、
环己酮诱导型启动子、热诱导型hsp80启动子、寒冷诱导型α-淀粉酶启动子、创伤诱导的
pin II启动子、2S白蛋白启动子、豆球蛋白启动子、未知种子蛋白启动子、油菜籽蛋白启动
子、蔗糖结合蛋白启动子、豆球蛋白B4启动子、油质蛋白启动子、Bce4启动子、高分子量麦
谷蛋白启动子、麦醇溶蛋白启动子、分支酶启动子、ADP-葡萄糖焦磷酸酶启动子、合酶启动
子、bgp1启动子、lpt2或lpt1启动子、大麦醇溶蛋白启动子、谷蛋白启动子、水稻素启动子、
谷醇溶蛋白启动子、麦醇溶蛋白启动子、谷蛋白启动子、玉米醇溶蛋白启动子、kasirin启动
子、黑麦碱启动子、ory s1启动子、ZM 13启动子、Bp10启动子、Lcg1启动子、AtDMC1启动
子、I类patatin启动子、B33启动子、组织蛋白酶D抑制剂启动子、淀粉合酶启动子、GBSS1
启动子、甘薯块根特异蛋白(sporamin)启动子、番茄果实特异性启动子、胞质FBP酶启动
子、ST-LSI启动子、CP12启动子、CcoMT1启动子、HRGP启动子、超级启动子、与赋予内含子
介导增强作用(IME)的内含子组合的启动子(优选地位于启动子与“结构”基因(即待表
达的序列)之间)和此类启动子的功能性组合。
[0085] 最优选地，该启动子包含如SEQ ID NO：6的第1至1112位核苷酸中描述的核酸序列。
[0086] 此外，遗传控制序列还包括5’-非翻译区、内含子或基因的非编码3’区域。已经证实它们可以在调节基因表达中发挥重要作用。因此，已经证实5’-非翻译序列能够增强
异源基因的瞬时表达。另外，它们可以促进组织特异性(Rouster J等人，Plant J.1998，
15：435-440.)。相反，不透明二号基因的5’-非翻译区抑制表达。缺失所讨论的该区域导
致基因活性提高(Lohmer S等人，Plant Cell 1993，5：65-73)。
[0087] 遗传控制序列也可以包括用于起始翻译的核糖体结合序列。当待表达的核酸序列不提供合适的序列或当它们与表达系统不兼容时，这是特别优选的。遗传控制序列进一步
理解为还包括产生融合蛋白的序列，其包含指导蛋白质亚细胞定位的信号肽序列。
[0088] 表达盒可以有利地包含与启动子有效连接的能够增加核酸序列的转基因表达的一个或多个所谓增强子序列。也可以在待重组表达的核酸序列的3’末端插入额外的有利
序列，如其他调节元件或终止子。待重组表达的核酸序列的一个或多个拷贝可以存在于基
因构建体中。
[0089] 适合作为遗传控制序列的聚腺苷酸化信号是植物聚腺苷酸化信号、优选是基本上与来自根癌农杆菌的T-DNA聚腺苷酸化信号、尤其Ti质粒pTiACHS的T-DNA(章鱼碱合酶)
中基因3的T-DNA聚腺苷酸化信号或其功能等同物相对应的那些聚腺苷酸化信号(Gielen
等，EMBO J.3(1984)，835 et sec.)。特别适合的终止子序列实例是OCS(章鱼碱合酶)终
止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。
[0090] 如本文中所用的术语“转化”指将核酸分子(例如转基因)导入植物细胞。优选地，转化方法选自由农杆菌介导转化法、生物射弹转化法(基因枪)、原生质体转化法、聚
乙二醇转化粉、电穿孔法、超声处理法、微量注射法、大量注射法、真空抽滤法、感染法、在含
DNA的溶液中孵育干燥胚、渗透压休克法、二氧化硅/碳纤维法、激光介导的转化法、分生组
织转化法(浸花法、真空渗入法)和花粉转化法组成的组。
[0091] 技术人员熟悉的用于转化植物细胞/植物和用于从植物组织或植物细胞再生出植物的方法用于瞬时转化或稳定转化。适用的DNA递送的直接方法尤其是用于原生质体转
化或借助聚乙二醇诱导的DNA摄取而用于完整细胞和组织的那些方法、生物射弹方法如基
因枪(“粒子轰击”方法)、电穿孔法、干胚在含有DNA的溶液中孵育法、超声处理和微量注
射法、组织或胚的微量或大量注射法、组织电穿孔法、干胚在含有DNA的溶液中孵育法或种
子的真空渗入法。在将DNA注射或电穿孔到植物细胞中的情况下，所用质粒不需要满足任
何特殊要求。可以使用简单质粒如pUC系列的那些质粒，进行或不进行线性化。若将从转
化的细胞再生完整植物，则质粒中存在额外的选择标记基因是有用的。
[0092] 任意植物组织可以充当靶材料。同样，表达可以发生在愈伤组织、胚发生的组织或体细胞胚中。
[0093] 除了这些“直接”转化技术之外，也可以通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)实施转化。这些菌株含有质粒
(Ti或Ri质粒)。在农杆菌感染后，这种质粒中称作T-DNA(转移DNA)的部分转移至植物
并整合到植物细胞的基因组中。
[0094] 术语“农杆菌”指引起冠瘿的土源、革兰氏阴性、杆状植物病原性细菌。术语“农杆菌”包括但不限于根癌农杆菌菌株(其通常在感染的植物中引起冠瘿)和发根农杆菌菌株
(其在感染植物中引起毛状根病)。
[0095] 用农杆菌感染植物细胞通常引起感染的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂氨酸、农杆碱、章鱼碱等)。
[0096] 术语细菌“感染”指目标生物样品(例如细胞、组织等)与细菌在这样的条件下共孵育，从而将该细菌中所含的核酸序列导入目标生物样品的一个或多个细胞。
[0097] 通常，细胞的转化可以是稳定或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时地转化”指在转基因没有整合到宿主细胞基因组中的情况下，将一种或多种转基因导入细胞。瞬时转化
可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测，其中所述的酶联免疫吸附测定法检测由
一种或多种转基因编码的多肽的存在性。备选地，瞬时转化可以通过评估如本文中所示的
转基因编码的蛋白质的活性进行检测(例如，通过用X-葡糖醛酸糖苷酶染色对GUS酶活性
进行组织化学测定，其中所述的X-葡糖醛酸糖苷酶在GUS酶的存在下产生蓝色沉淀物；以
及使用GUS-光试剂盒(Tropix)对GUS酶活性进行化学发光测定)。术语“瞬时转化体”指
短暂含有一种或多种转基因的细胞，而未将导入的DNA并入其基因组。
[0098] 相反，术语“稳定转化”或“稳定地转化”指将一种或多种转基因导入和整合到细胞的基因组中，优选地导致染色体整合以及经受有丝分裂和减数分裂的稳定遗传性。细胞
的稳定转化可以在发生转基因整合到植物基因组的一段时间后，通过细胞的基因组DNA与
能够结合至一种或多种转基因的核酸序列进行DNA印迹杂交来检测。备选地，也可以通过
扩增转基因序列的细胞基因组DNA的聚合酶链式反应检测细胞的稳定转化。术语“稳定的
转化体”指已经将一种或多种转基因稳定整合到基因组DNA中的细胞。因此，稳定的转化体
与瞬时转化体的区别在于：来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或多种转基因，但是来
自瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。转化也包括遗传物质以植物病毒载体形式导入
植物细胞，涉及可以相对于减数分裂稳定性表现可变属性的染色体外复制和基因表达。
[0099] DNA构建体可以通过多种常规技术导入植物培养物或植物器官中的细胞内。例如，DNA构建体可以使用射弹法如DNA粒子轰击法直接导入植物细胞，或DNA构建体可以使
用技术如电穿孔法和细胞微量注射法导入。粒子介导的转化技术(又称作“生物射弹法”)
在例如Klein等人，(1987)Nature 327：70-73；Vasil V等人，(1993)Bio/Technol 11：
1553-1558；和Becker D等人，(1994)Plant J 5：299-307中描述。这些方法包括用在小珠
或粒子的基质内部或表面上具有核酸的小粒子穿透细胞。
[0100] 术语“轰击”和“生物射弹轰击”指将粒子向目标生物样品(例如细胞、组织等)加速运动以实现损伤目标生物样品中细胞的细胞膜和/或使粒子进入目标生物样品的过程。
用于生物射弹轰击的方法在本领域是已知的(例如US 5,584,807)并且是市售的(例如氦
气驱动的微抛射体加速仪(PDS-1000/He)(BioRad)。
[0101] 生物射弹PDS-1000基因枪(Biorad，Hercules，CA)使用氦气压力来使DNA涂覆的金或钨微载体向靶细胞加速运动。该方法适用于广泛类型的来自生物(包括植物)的组织
和细胞。当提到植物组织时，术语“致微型创伤”指在该组织中导入微型创伤。致微型创伤
可以由例如如本文中描述的粒子轰击法实现。
[0102] 微量注射技术是本领域已知并在科学及专利文献中充分描述。细胞也可以被化学透化，例如使用聚乙二醇，从而DNA可以通过扩散进入细胞。DNA也可以通过采用含DNA的
其它单元如微细胞、细胞、溶酶体或脂质体的原生质体融合而导入。在Paszkowski等人，
(1984)EMBO J 3：2717中描述了使用聚乙二醇(PEG)沉淀法导入DNA构建体。
[0103] 基 于 脂 质 体 的 基 因 递 送 法 例 如 在 WO 93/24640；Mannino 和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；US 5,279,833；WO91/06309； 和
Feigner等人，(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84：7413-7414)中描述。
[0104] 导入DNA的另一种合适方法是电穿孔法，其中用电脉冲来可逆地透化细胞。电穿孔法技术在Fromm等人(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：5824中描述。在Lazzeri
P(1995)Methods Mol.Biol.49：95-106中也讨论了植物原生质体的PEG介导的转化和电
穿孔。可以提到的优选常用方法是磷酸钙介导的转染法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、阳
离子脂质介导的转染法、电穿孔法、转导和感染。此类方法是技术人员已知的并且在例如
Davis等人，Basic Methods In Molecular Biology(1986)中描述。用于植物和细胞培
养物的基因转移方法的综述，见，Fisk等人，(1993)ScientiaHorticulturae 55：5-36和
Potrykus(1990)CIBA Found Symp 154：198。
[0105] 用于单子叶植物和双子叶植物中导入和表达异源基因的方法是已知的。见，例如US 5,633,446、US 5,317,096、US 5,689,052、US 5,159,135和US 5,679,558；Weising等
人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477。
[0106] 单子叶植物的转化尤其可以使用多种技术，包括电穿孔法(例如，Shimamoto等人，(1992)Nature 338：274-276)；生物射弹法(例如，EP-A1270,356)和农杆菌法(例
如，Bytebier等人，(1987)Proc Natl Acad SciUSA.84：5345-5349)。特别地，农杆菌介导
的转化法目前是单子叶植物中高效的转化方法(Hiei等人(1994)Plant J 6：271-282)。
可以使用这种方法在禾谷类植物玉米、稻、小麦、燕麦和大麦中实现能育转基因植物的产
生(综述见Shimamoto K(1994)Current Opinion in Biotechnology 5：158-162；Vasil
等 人(1992)Bio/Technology 10：667-674；Vain 等 人 (1995)Biotechnology Advances
13(4)：653-671；Vasil(1996)NatureBiotechnology 14：702；Wan 和 Lemaux(1994)Plant
Physio.104：37-48)。在农杆菌转化法低效或无效的情况下，可以优选其他方法，如微抛
射体或粒子轰击法(US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、电穿孔法(EP-A290395、
WO 87/06614)、微量注射法(WO 92/09696、WO 94/00583、EP-A331083、EP-A 175966、Green
等人(1987)Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press)、直接DNA摄取法(DE
4005152，WO 90/12096，US 4,684,611)、脂质体介导的DNA摄取法(例如Freeman等人
(1984)Plant CellPhysiol 29：1353)或涡旋混合方法(例如，Kindle(1990)Proc Natl
Acad SciUSA 87：1228)。
[0107] 特别地，裸子植物如松柏类的转化可以使用粒子轰击20技术进行(Clapham D等人，(2000)Scan J For Res 15：151-160)。用于转化植物细胞的物理方法在Oard，(1991)
Biotech.Adv.9：1-11中综述。备选地，可以使用不同技术的组合来增强转化方法的效率，
例如用农杆菌涂覆的微粒子轰击(EP-A-486234)或微抛射体轰击以诱导创伤，随后与农杆
菌共培养(EP-A-486233)。
[0108] DSBI酶的表达盒优选地整合到特定质粒，或整合到穿梭载体或中间载体或整合到双元载体中。例如，若Ti或Ri质粒将用于转化，Ti或Ri质粒T-DNA的至少右边界，不过
在大多数情况下，所述质粒的左边界和右边界作为侧翼区域与待导入的表达盒连接。优选
使用双元载体。双元载体能够在大肠杆菌和在农杆菌中复制。它们含有选择标记基因和在
侧翼具有T-DNA右边界和左边界侧翼序列的接头或多接头。可以将它们直接转移到农杆菌
中(Holsters(1978)Mol Gen.Genet 163：181-187)。选择标记基因允许选择转化的农杆菌
并且例如是赋予卡那霉素抗性的nptII基因。在此情况下充当宿主生物的农杆菌应当已经
含有带vir区的质粒。对于T-DNA转移到植物细胞中需要vir区。如此转化的农杆菌可以
用于转化植物细胞。
[0109] 根癌农杆菌利用组织培养外植体转化植物的用途已经由Horsch等人(HorschRB(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83(8)：2571-2575)、Fraley等人(Fraley等人1983，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，4803-4807)和Bevans等人(Bevans等人1983，Nature 304，
184-187)描述。
[0110] 许多根癌农杆菌菌株能够转移遗传物质，例如菌株[pEHA101]、EHA105[pEHA105]、LBA4404[pAL4404]、C58C1[pMP90] 和C58C1[pGV2260]。 菌 株 EHA101[pEHA101] 已 经
由Hood等 人(Hood E E等 人，(1996)J Bacteriol 168(3)：1291-1301)描 述，菌 株
EHA105[pEHA105]已经由Hood等人(Hood等人，1993，Transgenic Research 2，208-218)，
菌株LBA4404[pAL4404]已经由Hoekema等人(Hoekema等人，1983，Nature303，179-181)
描述，菌株C58C1[pMP90]已经由Koncz和Schell等人(Koncz和Schell 1986，Mol Gen.
Genet.204，383-396))描述并且菌株C58C1[pGV2260]已经由Deblaere等人(Deblaere等
人，1985，Nucl.AcidsRes.13，4777-4788)描述。
[0111] 对于农杆菌介导的植物转化，本发明的DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区组合并导入常规的根癌农杆菌宿主载体中。当根癌农细菌感染细胞时，根癌农杆菌对宿主的
毒力功能将指导转基因和相邻标记基因(若存在的话)插入植物细胞DNA。根癌农杆菌介
导的转化技术在科学文献中描述。见，例如，Horsch等人(1984)Science 233：496-498，
Fraley等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：4803-4807，Hooykaas(1989)Plant Mol
Biol 13：327-336，Horsch RB(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83(8)：2571-2575)，Bevans
等人(1983)Nature 304：184-187，Bechtold等人(1993)ComptesRendus De LAcademie Des
Sciences Series III-Sciences De La Vie-LifeSciences 316：1194-1199，Valvekens等
人(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5536-5540。
[0112] 除了卸甲Ti质粒之外，用于转化的农杆菌菌株还包含带有待转移T-DNA的双元质粒，其中所述的双元质粒通常包含用于选择转化细胞的基因和待转移的基因。两种基因必
须均配备转录性和翻译性起始与终止信号。双元质粒可以由例如电穿孔法或其他转化方法
转移到农杆菌菌株中(Mozo和Hooykaas 1991，Plant Mol.Biol.16，917-918)。植物外植
体与农杆菌菌株的共培养通常进行2至3日。
[0113] 可能或可以使用多种载体。原则上，可以区分用于农杆菌介导的转化法或农杆菌感染法的那些载体，即包含表达盒的那些载体，以表达T-DNA中的DSBI酶，这实际上允许
T-DNA稳定整合到植物基因组中。另外，可以使用无边界序列的载体，该载体可以例如由粒
子轰击法转化到植物细胞中，在那里它们可以引起瞬时转化和稳定表达。
[0114] 已经深入地研究和描述了T-DNA转化植物细胞的用途(EP 120516；Hoekema，TheBinary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，第V章；
Fraley等人，Crit.Crit.Rev.Plant.Sci，4：1-46和An等人，EMBO J.4(1985)，277-287)。多
种双元载体是已知的，其中一些是市售的例如pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。
[0115] 为转移DNA至植物细胞，将植物外植体与根癌农杆菌或发根农杆菌共培养。从感染的植物材料(例如叶、根或茎部分、及植物细胞的原生质体或悬液)开始，使用可以含有
例如用于选择转化细胞的抗生素或杀生物剂的适宜培养基，可以再生出完整植物。随后可
以对所得植物筛选导入的DNA(在这种情况下是本发明的DSBI酶表达盒)的存在性。一旦
DNA已经整合到宿主基因组中，则所讨论的基因型通常是稳定的，并且所讨论的插入也存在
于后续世代中。通常，整合的表达盒含有向转化植物赋予针对杀生物剂(如除草剂)或抗生
素如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等抗性的选择标记。选择标记允许选择
转化的细胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5：81-84)。所得的植物可以用惯
常方式培育和杂交。应当培育两个或更多个世代以确保基因组整合是稳定的和遗传性的。
[0116] 以上提及 的方法例 如在S.D.Kung和R.Wu编辑 的Techniques forGeneTransfer，在 Transgenic Plants，第 1 卷，Engineering and Utilization，Academic
Presss(1993)，128-143， 和 在 Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.
Biol.42(1991)，205-225)中描述。优选地将待表达的构建体克隆到适合转化根癌农杆菌例
如pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)的载体中。
[0117] 农杆菌介导的转化最适合于双子叶植物细胞，并且已经成功地对某些单子叶植物细胞进行优化，而直接转化技术适用于任何细胞类型。
[0118] 若选择标记是所导入DNA的部分，则可以从未转化的细胞选出转化的细胞，即包含整合到宿主细胞DNA中的DNA的那些细胞。标记基因可以是例如能够赋予针对抗生素或
除草剂的抗性的任意基因。表达这种标记基因的转化细胞能够在杀死非转化野生型的适宜
抗生素或除草剂的浓度存在下存活。在上文中描述了多种正选择和负选择标记。实例是赋
予磺酰脲和咪唑啉酮除草剂抗性的ahas(乙酰羟酸合酶)基因、赋予除草剂膦丝菌素抗性
的bar基因(Rathore K S等人，Plant Mol Biol.1993年3月；21(5)：871-884)、赋予卡
那霉素抗性的nptll基因、赋予潮霉素抗性的hpt基因或赋予除草剂草甘膦抗性的EPSP基
因。
[0119] 一旦已经产生转化的植物细胞，则可以使用技术人员已知的方法获得完整植物。例如，使用愈伤组织培养物作为起始材料。可以在这种仍未分化的细胞生物质中以已知的
方式诱导幼枝和根形成。可以对获得的幼枝在合适的条件下诱导根发育。所获得的植物可
以随后体外培养，并种植在土壤中。
[0120] 在用编码DSBI酶的构建体转化植物细胞后，从转化的植物细胞产生转基因植物品系。这种产生根据本领域技术人员已知的方法进行。通常，本发明的步骤b)可以如下进
行。
[0121] 为产生含有编码DSBI酶的基因的完整转基因植物，在含有促幼枝的植物激素(例如细胞分裂素)和还含有选择剂的再生培养基上培养抵抗化学选择剂的推定的转基因愈
TM
伤组织，取决于所用选择标记基因而使用D-丝氨酸或咪草烟(Pursuit )。形成的幼枝转
移至存在选择剂、但缺少植物激素的生根培养基。转基因在所产生的推定的转基因植物基
因组中的整合由例行分子技术如DNA印迹分析或PCR分析证实。
[0122] 在下文中将描述通过DSBI酶作用待切除核酸序列的特征。
[0123] 术语“待切除的核酸序列”指任意长度的任意核苷酸序列，其切除或缺失可以因任意原因(例如，赋予改善的品质)由本领域普通技术人员认为是想要的。此类核苷酸序列
包括但不限于结构基因(例如报道基因、选择标记基因、癌基因、药物耐药性基因、生长因
子等)的编码序列和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码性调节序列(例如启动子序列、聚
腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。
[0124] 优选地，待切除序列的长度是至少约10或至少约50碱基对、更优选至少约100或至少约500碱基对、特别优选至少约1000或至少约5000碱基对并且最优选至少约10000
或至少约50000碱基对。另外，优选地，待切除序列的长度是最大约50000或最大约10000
碱基对、更优选最大约5000或最大约1000碱基对、尤其优选至少约500或至少约100碱基
对。那些下限值和上限值可以按照任何适当的方式组合。
[0125] 待切除的核酸可以最初是一种构建体、一种所谓“重组构建体”的部分，其中所述的重组构建体起到例如转化植物细胞或植物的作用，旨在产生含有待切除核酸序列的植物
品系(见本发明方法的步骤d))。
[0126] 待切除的核酸序列(例如T-DNA区或其部分，或选择标记如抗生素抗性或除草剂抗性基因)从植物的基因组中以可预测的方式被缺失或切除。待消除的序列包含位点定向
地诱导DNA双链断裂的至少一个识别序列(例如稀有切割的限制性酶的识别序列)并且在
两侧邻接重复序列(或“同源”序列)。双链断裂由适合在识别序列处诱导DNA双链断裂的
酶(DSBI酶)诱导，这随后引起同源序列的同源重组并且因而引起位于所述同源序列之间
的任意核酸序列缺失。用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列同样地被缺失。
[0127] 术语“识别序列”指由如上所述DSBI识别的DNA序列。用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列通常指在所用植物细胞或植物中的条件下，能够被DSBI酶在每种情
况下识别并切割的那些序列。识别序列一般将是至少10碱基对长度，更通常是10至30碱
基对长度，并自在大多数实施方案中是小于50碱基对长度。在本领域中描述了用于序列特
异性DSBI(例如归巢核酸内切酶)的识别序列。各DSBI酶的识别序列和来源生物可以例
如取自WO 03/004695。
[0128] 还包括的是识别序列的少量偏离(简并)，所述偏离仍能够由所讨论的DSBI酶识别和切割。已经描述了此类偏离-还描述了与不同框架条件例如钙或镁浓度方面的联系
(Argast G M等人，(1998)J Mol Biol 280：345-353)。还包括的是这些识别序列的核心序
列。已知识别序列的内侧部分足以诱导双链断裂并且外侧部分不是绝对相关的，不过可以
共同决定切割效力。因此，例如，可以对I-SceI定义一个18bp核心序列。
[0129] I-SceI的识别序列
[0130] 5’-AGTTACGCTAGGGATAAΛCAGGGTAATATAG(SEQ ID NO：28)
[0131] 3’-TCAATGCGATCCCΛTATTGTCCCATTATATC
[0132] I-SceI的核心序列：
[0133] 5’-TAGGGATAAΛCAGGGTAAT(SEQ ID NO：29)
[0134] 3’-ATCCCΛTATTGTCCCATTA
[0135] 被缺失或切除的序列是位于两个同源序列(例如称作“A”和“B”的同源性或重复序列)之间的那些序列。技术人员知道当实施重组时，他不限于特定序列，但是只要存在足
够的长度和同源性，任意序列可以与其他序列发生同源重组。
[0136] “同源重组”是在两个同源(“重复”)DNA位点处发生并因存在所述DNA位点而促进的DNA重组事件，它通过在相同序列区范围内杂交而引起DNA序列重排或联合。
[0137] 提及“同源性”或“重复”序列A和B时，“足够的长度”优选地指具有至少20碱基对、优选至少50碱基对、特别优选至少100碱基对、非常特别优选至少250碱基对、最优选
至少500碱基对长度的序列。
[0138] 提及同源序列A和B时，“足够的同源性”优选地指在这些同源序列内部，在至少20碱基对、优选至少50碱基对、特别优选至少100碱基对、非常特别优选至少250碱基对、
最优选至少500碱基对长度范围内具有至少70％、优选80％、优选至少90％、特别优选至少
95％、非常特别优选至少99％、最优选100％同源性的序列。
[0139] 两个核酸序列之间的“同源性”理解为意指核酸序列在每种情况下覆盖完整序列长度范围内的同一性，其中所述同一性通过比对，借助程序算法GAP(Wisconsin Package第
10.0版，威斯康辛大学，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，美国)设置如下参数计
算：空位权重：12，长度权重：4，平均匹配：2.912平均不匹配：-2.003。
[0140] 在一个实施方案中，仅一个用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列位于同源序列A和B之间，从而待切除的核酸序列(或用于转化靶植物或植物细胞以产生本发明
方法步骤d)的植物品系的重组构建体)以5’-至3’-方向构建如下：
[0141] a1)第一同源序列A，
[0142] b1)用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列，和
[0143] a2)第二同源序列B，其中同源序列A和B具有足够的长度和足够的同源性旨在能够高效同源重组。
[0144] 在另一个实施方案中，其他核酸序列位于同源序列A与B之间，从而待切除的核酸序列(或用于转化靶植物或植物细胞以产生本发明方法步骤d)的植物品系的重组构建体)
以5’-至3’-方向构建如下：
[0145] a1)第一同源序列A，
[0146] b1)用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列，
[0147] c)其他核酸序列，和
[0148] a2)第二同源序列B，其中同源序列A和B具有足够的长度和足够的同源性旨在能够高效同源重组。
[0149] 用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列也可以位于所述其他核酸序列之后或位于其中。
[0150] 在又一个实施方案中，用于位点定向地诱导双链断裂的第二识别序列存在于所述其他核酸序列之后。该实施方案在同源序列A与B进一步分开的情况下或在其他核酸序列
较长的情况下是尤其有利的，因为重组效力提高。在这个实施方案中，待切除的核酸序列
(或用于转化靶植物或植物细胞以产生本发明方法步骤d)的植物品系的重组构建体)以
5’-至3’-方向构建如下：
[0151] a1)第一同源序列A，
[0152] b1)用于位点定向地诱导DNA双链断裂的第一识别序列，和
[0153] c)其他核酸序列，和
[0154] b1)用于位点定向地诱导DNA双链断裂的第二识别序列，和
[0155] a2)第二同源序列B，其中同源序列A和B具有足够的长度和足够的同源性旨在能够高效同源重组。
[0156] 此外，除用于位点定向地诱导DNA双链断裂的第二识别序列之外，其他识别序列也可以存在于同源序列A和B之间。用于位点定向地诱导DNA双链断裂的各个识别序列
(例如b1或b2)可以是相同的或不同的，即它们可以充当某个酶的识别序列或充当多种酶
的识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂。在本上下文中，优选这样的实施方案，其
中用于位点定向地诱导DNA双链断裂的识别序列充当某个酶的用于位点定向地诱导DNA双
链断裂的识别序列。
[0157] 技术人员熟悉多种方式以获得包含待切除核酸序列的重组构建体和获得含有待切除核酸序列的植物品系。所述构建体可以通过例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和
J.Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，
Cold Spring Harbor，N.Y.(1989) 中、 在 T.J.Silhavy，M.L.Berman 和 L.W.Enquist，
Experimentswith Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，
N.Y.(1984)中和在Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular.Biology，
Greene Publishing Assoc，and Wiley Interscience(1987)中描述的惯用重组和克隆技
术制备。优选地，通过如下方式产生本发明的重组构建体，即使用技术人员熟悉的重组和克
隆技术，将上文提及的重组构建体的必需组件与上文提及的序列连接起来，并将产物随后
导入宿主植物的基因组。
[0158] 另外，技术人员熟悉可以将本发明的重组构建体导入植物细胞或植物的基因组中的多种方式。在本上下文中，插入可以是定向的(即在定义的插入位点处发生)或非定向
的(即随机发生)。适合的技术是技术人员已知的。
[0159] 除了上文就DSBI酶表达盒所述的元件(遗传控制元件、启动子、增强子等)外，重组构建体(包含待切除的核酸序列)可以包含其他核酸序列。此类核酸序列可以优选地构
成表达盒。可以通过举例方式、而非限制性方式提到在表达构建体中待表达的以下DNA序
列：
[0160] i)正选择标记：
[0161] 正选择标记是这样的基因，它的存在赋予细胞或植物能够在否则是有害的处理存在下持续存在或被鉴定。就植物转化而言，需要选择标记以选择已经整合并表达任何目的
DNA(例如T-DNA)的细胞。连同表达构建体一起导入的选择标记可以向已经成功发生重组
或转化的细胞赋予针对杀生物剂(例如除草剂如膦丝菌素、草甘膦或溴苯腈)、代谢抑制物
如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)或抗生素(例如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、
G418、新霉素、博来霉素或潮霉素)的抗性。该选择标记允许从未转化的细胞选出转化的细
胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5：81-84)。特别优选的选择标记是赋予除
草剂抗性的那些选择标记。可以提到的选择标记实例是：
[0162] ·编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的DNA序列，其中膦丝菌素乙酰转移酶使谷氨酰胺合酶抑制剂膦丝菌素(PPT)的游离氨基乙酰化并且因而引起PPT解毒(de Block等人，
1987，EMBO J.6，2513-2518)(也称作双丙氨膦RTM抗性基因(bar))，
[0163] ·赋予草甘膦RTM(N-(膦酰甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS合酶基因)，
[0164] ·编码草甘膦.RTM.降解酶(草甘膦氧化还原酶)的gox基因，
[0165] ·deh基因(编码使茅草枯.RTM.失活的脱卤素酶)，
[0166] ·对磺酰脲和咪唑啉酮不敏感的突变乙酰乳酸合酶，
[0167] ·编码降解溴苯腈.RTM.的腈水解酶的bxn基因，
[0168] ·卡那霉素或G418抗性基因(NPTII)。NPTII基因编码因磷酸化反应而降低卡那霉素、新霉素、G418和巴龙霉素抑制作用的新霉素磷酸转移酶。
[0169] ·DOG.sup.R1基 因。DOG.sup.R1 基 因 已 经 从 酿 酒 酵 母 (Saccharomycescerevisiae)分离(EP 0 807 836)。该基因编码赋予2-DOG抗性的6-磷酸-2-脱氧葡萄
糖磷酸酶(Randez-Gil等人1995，Yeast 11，1233-1240)。
[0170] ii)负选择或反选择标记能够鉴定缺少指定基因功能的细胞和/或使之存活，例如选择成功地缺失包括该标记基因在内的序列的生物(Koprek T等人，(1999)The Plant
Journal 19(6)：719-726)。TK胸苷激酶(TK)和白喉毒素A片段(DT-A)、编码胞嘧啶脱
氨酶(Gleve A P等人，(1999)Plant MolBiol.40(2)：223-35；Pereat R I等人，(1993)
Plant Mol.Biol 23(4)：793-799；Stougaard J；(1993)Plant J 3：755-761)的codA基
因、细胞色素P450基因(Koprek等人，(1999)Plant J 16：719-726)、编码卤代烷脱卤素酶
的基因(Naested H(1999)Plant J 18：571-576)、iaah基因(Sundaresan V等人，(1995)
Genes&Development 9：1797-1810)或tms2基因(Fedoroff N V和Smith D L 1993，Plant
J 3：273-289)。
[0171] iii)编码轻易可定量的蛋白质并且也可以通过固有颜色或酶活性确保评估转化效力或表达定位或时间的报道基因。本文非常特别优选编码报道蛋白的基因(也见
Schenborn E，Groskreutz D.Mol Biotechnol.1999；13(1)：29-44)，所述的报道蛋白例如
是
[0172] ·“绿色荧光蛋白”(GFP)(Chui W L等人，Curr Biol 1996，6：325-330；LeffelS M等人，Biotechniques.23(5)：912-8，1997；Sheen等人，(1995)PlantJournal 8(5)：
777-784；Haseloff等人，(1997)Proc Natl Acad Sci USA94(6)：2122-2127；Reichel等
人，(1996)Proc Natl Acad Sci USA93(12)：5888-5893；Tian等人，(1997)Plant Cell Rep
16：267-271；WO97/41228)。
[0173] ·氯霉素转移酶，
[0174] ·萤光素酶(Millar等人，Plant Mol Biol Rep 1992 10：324-414；Ow等人，(1986)Science，234：856-859)；允许检测生物发光。
[0175] ·β-半乳糖苷酶，编码可用多种生色底物的酶，
[0176] ·β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS；Jefferson等(1987)EMBO J 6：3901-3907)或uidA基因，编码具有多种生色底物的酶，
[0177] ·R基因座基因产物：调节植物组织中花青苷色素(红颜色)产生并且因此可以使得直接分析启动子活性而不添加额外辅助剂或生色底物成为可能的蛋白质(Dellaporta
等人，在Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts，第18届Stadler
遗传学研讨会，11：263-282，1988)。
[0178] ·β-内酰胺酶(Sutcliffe(1978)Proc Natl Acad Sci USA 75：3737-3741)，具有多种生色底物的酶(例如PADAC，一种生色的头孢菌素)。
[0179] ·xylE基因产物(Zukowsky 1983，Proc Natl Acad Sci USA80：1101-1105)，能够转化生色性儿茶酚的儿茶酚双加氧酶，
[0180] ·α-淀粉酶(Ikuta等人(1990)Bio/technol.8：241-242)，
[0181] ·酪氨酸酶(Katz等人(1983)J Gene Microbiol 129：2703-2714)，将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，其中所述的DOPA和多巴醌随后形成可轻易检测的黑色素。
[0182] ·水母发光蛋白(Prasher等人(1985)Biochem Biophys Res Commun126(3)：1259-1268)，可以在钙敏感性生物发光检测中使用。
[0183] 上文提及的编码标记和报道基因的核酸可以包含于本发明待切除的核酸内部。这同样适用于例如T-DNA区或其部分。
[0184] 重组构建体和从其衍生的任意载体可以包含其他功能性元件。术语“其他功能性元件”将在广义上理解。它优选地指影响本发明重组系统、本发明重组构建体或包含它们的
细胞或生物的产生、增殖、功能、用途或价值的全部那些元件。以下其他功能性元件可以用
举例、但非限制的方式提到。
[0185] ·确保本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中复制的复制起点。可以提到的实例是ORI(DNA复制起点、pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等：Molecular Cloning.A
Laboratory Manual，第二版.Cold SpringHarbor Laboratory Press编辑，Cold Spring
Harbor，NY，1989)。
[0186] ·能够并且促进一个或多个核酸序列插入的多克隆位点(MCS)。
[0187] ·使同源重组或插入宿主生物基因组中成为可能的序列。
[0188] ·使植物细胞中农杆菌介导的转移成为可能的用于转移和整合到植物基因组中的元件，例如边界序列，例如T-DNA的右边界或左边界或vir区。
[0189] 所有上文提及的表达盒或其他功能性元件均可以是位于待切除核酸序列的同源或重复序列A和B之间，如所提到的那样。然而，它们也可以位于A和B之外。这在边界序
列的情况下是尤其有利的。
[0190] 本发明的方法用于获得已经从其基因组中切除核酸序列的植物。除了“完整”植物或“成熟”植物之外，本发明也包括从通过本发明方法获得的植物衍生的后代、繁殖材料
(如叶、根、种子(包括胚、胚乳和种衣)、籽苗、果实、花粉、幼枝等)、部分(器官、幼枝营养
器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花、插条和花器官/结构例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、
心皮、花药和胚珠)、组织(例如维管组织、地下组织等)、细胞(例如保卫细胞、卵细胞、香
毛簇等)、细胞培养物和收获材料。
[0191] “成熟植物”理解为意指除了籽苗之外的处于任意发育期的植物。“籽苗”理解为意指处于发育早期的幼龄、非成熟植物。“后代”(或下代)尤其包括克隆、种子、果实、自交
或杂合后代和后代和这些后代和后代任意者的任意繁殖体，如插条和种子，它们在有性或
无性再生或繁殖中使用。本发明也包括这种植物以有性或无形方式繁殖的子孙、克隆或后
代或所述植物、子孙、克隆或后代的任意部分或繁殖体。
[0192] 如本文中所用的单数术语“细胞”或“植物细胞”指单个细胞。复数术语“细胞”指细胞群体。该群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。同样，该群体可以包含多于一种细
胞类型。在本发明中，不限制细胞群体可以包含的细胞类型数目。细胞可以是同步或不同
步的。属于本发明含义的植物细胞可以是分离的(例如在悬浮培养物中)或包含于植物组
织、植物器官或处于任何发育期的植物中。
[0193] 就植物而言，术语“组织”(或“植物组织”)意指多个植物细胞的排列，包括分化和未分化的排列。植物组织可以构成植物器官的部分(例如，植物叶的表皮)，不过也可以
构成瘤组织(例如，愈伤组织)和多种类型的培养细胞(例如，单个细胞、原生质体、胚、愈
伤组织、原胚体样体等)。植物组织可以在植物原位、在器官培养物、组织培养物或细胞培养
物中。
[0194] 在本发明范围中包括植物界的全部属和物种的高等和低等植物。可以用在本发明方法中的植物类别总体上如适用于转化技术的高等和低等植物那么广泛，包括被子植物
(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。它包括多个倍性水平的植物，
包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
[0195] 本发明的方法可以优选地用于以下植物科：苋科(Amaranthaceae)、芸苔 科 (Brassicaceae)、石 竹 科(Caryophyllaceae)、藜 科 (Chenopodiaceae)、菊 科
(Compositae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)-蝶形
花亚科(Papilionoideae)、百合科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、
虎耳草科(Saxifragaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanacea)、番杏科
(Tetragoniacea)及其转基因组合。
[0196] 一年生、多年生、单子叶和双子叶植物是产生转基因植物的优选宿主生物。本发明方法的用途还在全部观赏植物、用材树或观赏树、花、切花、灌木或草坪草中更有利。可以
用举例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔藓植物例如獐耳细辛属(Hepaticae)
(hepaticas(獐耳细辛))和藓纲(Musci)(藓类植物)；蕨类植物如蕨类、木贼类和石松
类；裸子植物如松柏类植物、苏铁植物、银杏(ginkgo)和买麻藤科(Gnetaeae)植物；藻
类如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophpyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、粘藻纲
(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻类)和裸藻
纲(Euglenophyceae)。
[0197] 出于本发明目的植物以举例方式但非限制性方式包含蔷薇科如玫瑰、杜鹃花科(Ericaceae)如杜鹃花(rhododendron)和印度杜鹃花(azaleas)、大戟科(Euphorbiaceae)
如一品红(poinsettias)和巴豆(croton)、石竹科(Caryophyllaceae)如石竹(pinks)、茄
科如牵牛花(petunias)、苦苣苔科(Gesneriaceae)如非洲紫苣苔(African violet)、凤仙
花科(Balsaminaceae)如凤仙花(touch-me-not)、兰科(Orchidaceae)如兰花(orchids)、
鸢尾科(Iridaceae)如唐菖蒲(gladioli)、鸢尾花(iris)、小苍兰(freesia)和番红花
(crocus)、菊科如万寿菊、牻牛儿苗科(Geraniaceae)如geraniums、百合科如龙血树属
植物(drachaena)、桑科(Moraceae)如榕属(ficus)植物、天南星科(Araceae)如黄蘖
(philodendron)和许多其他植物。
[0198] 可以通过举例方式并且不以限制性方式提到的开花植物是以下科的植物：豆科如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麦；茄科如烟草和许多其他植
物；伞形科(Umbelliferae)，特别是胡萝卜属(Daucus)(更特别是物种胡萝卜(carota))
和芹属(Apium)(更特别是物种旱芹(graveolens dulce(旱芹)))及许多其它植物；
茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，更特别是物种番茄(tomato)和茄
属(Solanum)，更特别是物种马铃薯(tomato)和茄子(aubergine)、烟草(tobacco)及
许多其它植物；辣椒属(Capsicum)、更特别是物种辣椒(Capsicum annum(pepper))物
种及许多其它植物；豆科(Leguminosae)，特别是大豆属(Glycine)，更特别是物种大豆
(soybean)及许多其它植物；和十字花科(Cruciferae)，特别是芸苔属(Brassica)，更特别
是物种欧洲油菜(oilseed rape)、芸苔(beet)、甘蓝(Brassicaoleracea cv Tastie(卷
心菜))、花椰菜(Brassica oleracea cv Snowball Y(花椰菜))和花茎甘蓝(oleracea
cv Emperor(broccoli))；和拟南芥属，更特别是物种拟南芥及许多其它植物；菊科
(Compositae)，特别是莴苣属(Lactuca)，更特别是物种莴苣(lettuce)及许多其它植物。
[0199] 本发明的转基因植物尤其选自单子叶作物植物例如禾谷类植物如小麦、大麦、高粱和谷子、黑麦、黑小麦、玉米、稻或燕麦和甘蔗当中。还优选树，例如苹果树、梨树、木瓜
树(quince)、李树、樱桃树、桃树、油桃树(nectarine)、杏树、番木瓜树(papaya)、芒果树
和其他木本物种，包括针叶树和落叶树，如杨树(poplar)、松(pine)、红杉(sequoia)、雪
松(cedar)、橡树(oak)等。特别优选的是拟南芥、烟草(Nicotiana tabacum)、油籽油菜、
大豆、玉蜀黍(玉米(maize))、小麦、亚麻、马铃薯和万寿菊(tagete)。本发明的转基因植
物尤其还选自双子叶作物植物例如芸苔科如欧洲油菜、水芹、拟南芥属植物、卷心菜或卡诺
拉油菜，豆科植物如大豆、苜蓿、豌豆、豆类或落花生当中。茄科如马铃薯、烟草、番茄、茄子
或辣椒、菊科如向日葵、万寿菊、莴苣或金盏花。葫芦科如甜瓜、西葫芦(pumpkin)/南瓜
(squash)或小西葫芦和亚麻子、棉花、大麻、亚麻属植物、红椒、胡萝卜、甜菜和多种树、坚果
与藤本(wine)物种。
[0200] 对于本发明方法，特别优选的是玉米、拟南芥、烟草和油籽油菜和用作食物和饲料的全部属和物种，如上述的禾谷类物种，或适合产生油的全部属和物种，如油料作物(例如
油籽油菜)、坚果物种、大豆、向日葵、南瓜/西葫芦和落花生。
[0201] 对于本发明方法，最优选的是玉米、拟南芥属植物、高粱、稻、油菜籽、烟草、小麦、黑麦、大麦、燕麦、马铃薯、番茄、甜菜、豌豆、甘蔗、芦笋、大豆、苜蓿、落花生、向日葵和南瓜
组成的组。
[0202] 在本发明方法步骤b)中产生的转基因植物品系或该转基因植物品系的细胞或部分用在步骤c)中以实施瞬时测试法。该测定法起到分析DSBI酶功能性的作用。该测定法
可以避免费时地评估DSBI酶的活性并且取而代之的是可以允许简单且迅速地评价DSBI功
能性。
[0203] 在一个优选的实施方案中，该瞬时测试法是染色体内同源重组(ICHR)测定法。这种测定法用来监测染色体内HR的频率。
[0204] 优选地，本发明方法步骤c)的瞬时测试法包括报告构建体的瞬时转化。这种转化可以通过上述关于转化(编码DSBI的)构建体的任意转化方法进行，优选地通过生物射弹
轰击法或PEG介导的原生质体转染法进行。
[0205] 优选地，报告构建体包含待切除的核酸序列，其中所述核酸序列包含对本发明方法步骤a)的酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中
所述核酸序列在两个末端邻接允许同源重组的同源序列。
[0206] 以举例方式，但非限制性方式，那些报告构建体的概念将解释如下。瞬时测定系统可以使用例如由该报告构建体中所包含的重组基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基
因)的重叠部分组成的“重组陷阱”。可以通过HR除去在该基因(例如GUS基因)的两个
片段之间的重叠部分，导致恢复功能基因。当植物或植物部分或细胞以组织化学方式染色
时，可以检测到此类HR事件，例如在GUS基因的情况下，检测为蓝色斑点或区域。
[0207] 优选地，报告构建体选自由GUS构建体、绿色荧光蛋白(GFP)构建体、氯霉素转移酶构建体、萤光素酶构建体、β-半乳糖苷酶构建体、R-基因座基因产物构建体、β-内酰胺
酶构建体、xyl E基因产物构建体、α淀粉酶构建体、酪氨酸酶构建体和水母发光蛋白构建
体组成的组。检测这些基因产物的方法是技术人员熟知的，并且在上文引用的文献中描述。
[0208] 在步骤c)的瞬时测试法之后，本发明方法步骤b)中产生的植物品系与含有待切除核酸序列的植物品系杂交，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的至少一
个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两侧邻接
允许DNA修复机制的重复序列(步骤d)。
[0209] “DNA修复”是鉴定和校正DNA损伤例如双链断裂的一个过程。在本发明中，这种修复机制优选地是同源重组(HR)。备选地，修复所导入双链断裂的机制可以是非同源的末
端连接(NHEJ)、精确连接(PL)或其他机制修复，从而完全切除目的序列。
[0210] 非同源的末端连接(NHEJ)是可以用来修复DNA中双链断裂的一种途径。NHEJ称作″非同源的″，原因是直接连接断裂末端，无需同源模板，与需要同源序列以指导修
复的同源重组相反。术语“非同源的末端连接”由Moore J.K.和Haber J.E.(Mol Cell
Biol.1996年5月；16(5)：2164-73)在1996年创造。NHEJ一般利用名为微型同源物的短
同源DNA序列来指导修复。使用往往存在于双链断裂末端的单链突出端中的微型同源物来
促进可恢复性修复。
[0211] 当这些突出端是相容的时候，NHEJ几乎总是精确地修复断裂，无序列丢失。引起核苷酸丢失的不精确修复也可以发生，不过比通常少得多。许多蛋白质参与NHEJ。由Ku70
和Ku80组成的Ku异二聚体与DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)形成复合体，其在
哺乳动物中存在，但在酵母中不存在。由催化亚基DNA连接酶IV及其辅因子XRCC4组成的
DNA连接酶IV复合体执行修复的连接步骤。NHEJ还需要最近发现的蛋白质XLF(又称作
Cernunnos)。
[0212] 术语“杂交”意指两株植物(最终代表两个植物品系)之间的交配，其中所述的两个独立植物具有不相同的遗传背景。换句话说，两种亲代类型具有不同的遗传构成。对于
与包含待切除核酸的植物异花授粉，T0品系和纯合的T1品系均可以使用。
[0213] 杂交可以通过授粉进行。通常，授粉是花粉从花的雄性繁殖结构转移到花的雌性繁殖结构的过程。更精确地，授粉是花粉(雄蕊的)花药转移到(雌蕊的)柱头的过程。代
表植物中有性繁殖的授粉引起受精，并且通常引起种子产生。通常，授粉可以在单个植物上
(自花授粉)或在不同植物或植物品种之间(异花授粉)发生。
[0214] 在一个优选的实施方案中，“待切除的核酸序列”包含T-DNA区或其部分。另一种可能是待切除的核酸序列编码选择标记。这种选择标记优选地选自由负选择标记、赋予针
对杀生物代谢抑制剂、针对抗生素或针对除草剂的抗性的标记、正选择标记和反选择标记
组成的组。
[0215] 最优选地，该选择标记选自由乙酰羟酸合酶、D-丝氨酸脱氨酶、膦丝菌素乙酰转移酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦降解酶、失活茅草枯的脱卤素酶、失活
磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶、降解溴苯腈的腈水解酶、卡那霉素-或G418-抗性基
因、新霉素磷酸转移酶、6-磷酸-2-脱氧葡萄糖磷酸酶、潮霉素磷酸转移酶、二氢叶酸还原
酶、D-氨基酸代谢酶、D-氨基酸氧化酶、庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖
苷-3-腺苷酰转移酶、博来霉素耐药性决定子、异戊烯基转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、甘露
糖-6-磷酸异构酶、UDP-半乳糖-4-差向异构酶、胞嘧啶脱氨酶、细胞色素P-450酶、吲哚
乙酸水解酶、卤代烷脱卤素酶和胸苷激酶组成的组。
[0216] 最后，在杂交步骤d)后，进行未成熟胚转换(步骤e)。“未成熟胚转换”是通过体外转换/萌发未成熟胚成完整籽苗而从未成熟胚恢复植物或籽苗的过程，无愈伤组织形
成。在此过程期间，可以将未成熟胚置于生根培养基上并将未成熟胚转换成籽苗。该过程已
经在例如Green C.E.和PhillipsR.X.Crop Science，第15卷，1975年5-6月，第417-421
页中描述。所述转换是胚萌发并且优选地随后发育成建立的自养型植物的能力。萌发是胚
中生理过程的起始，通常由摄取水和暴露于诱导性环境信号诱导，导致分生组织生长(细
胞分裂和伸长)并且以子叶完全发育为终结。
[0217] 术语“未成熟胚”指从种子/谷粒衍生的未充分发育并成熟至具有适宜大小、重量和含水量的胚。
[0218] 这些正在发育的胚具有在合适的体外条件下变成植物的能力。
[0219] 本发明未成熟胚转换方法的其他优选实施方案将以举例方式在下文描述。
[0220] 在成功授粉(自花授粉或异花授粉)后，从授粉后约10-20日的玉米粒中无菌地剥离未成熟胚，置于不补充植物激素的MS琼脂培养基上并在光照下在20-27℃温育。幼枝
和根在温育1日后开始变得可见，并且充分完整的籽苗可以在约7日获得。每个未成熟胚
变成一株完整籽苗。
[0221] 备选地对于步骤e)的“未成熟胚转换”-或该步骤后-通过愈伤组织形成进行组织培养再生。该步骤允许恢复含有DNA双链断裂诱导酶的转基因植物。
[0222] 优选地，本发明的方法也包括在步骤b)或c)之后鉴定单拷贝转基因品系。优选地，单拷贝转基因植物品系用于本发明方法的其他步骤。在本发明的上下文中，术语“单拷
贝”指双链断裂诱导酶。
[0223] 鉴定单拷贝转基因品系可以借助本领域技术人员已知的任意标准分子技术进行。优选地，单拷贝鉴定通过定量PCR或Southern杂交进行。
[0224] 定量PCR是用来同时定量和扩增给定DNA分子的特定部分的一项技术。使用这项技术来确定某个特定序列是否存在于样品中，并且若其存在，则确定在样品中的拷贝数。该
方法遵循聚合酶链反应的一般模式，但是在每轮扩增后对DNA定量。两种常用定量方法是
使用嵌入双链DNA的荧光染料和当与互补DNA杂交时发出荧光的经修饰DNA寡核苷酸探
针。所述技术包括SYBR绿色定量PCR、基于探针的定量PCR和逆转录酶定量PCR。
[0225] 关 于 PCR 技 术 的 细 节 可 以 在“PCR-Polymerase-Kettenreaktion.DasMethodenbuch”(Hans-Joachim Müller，Spektrum Akademischer Verlag，2001年6月)、
“Molekularbiologische Diagnostik”(Frank ThiemannHoppenstedt Publishing，2002)
或“Der Experimentator：Molekularbiologie/Genomics”(Cornel Mülhardt，Spektrum
AkademischerVerlag，2006年4月)中找到。
[0226] “Southern杂交”或“DNA印迹”是通过标记特异性DNA序列来增强琼脂糖凝胶电泳结果的方法。作为一般示例，但非限制，所述方法包括以下步骤：
[0227] 1.DNA片段在凝胶上电泳以基于大小分离(例如源自PCR的)DNA。
[0228] 2.若DNA大于15kb，在印迹前，凝胶可以用起到使DNA片段脱嘌呤的稀酸(如稀HCl)处理。这使DNA断裂成能够比较大片段更高效地完成转移的较小片段。
[0229] 3.来自DNA电泳的凝胶用碱性溶液(一般含有氢氧化钠)处理，以引起双链DNA变性，使之分离成单链。变性是必需的，从而DNA将黏附于膜并被探针杂交(见下文)。
[0230] 4.将一张硝化纤维素膜(或备选地，尼龙膜)置于凝胶的顶部。向凝胶均匀地施加压力(或使用抽吸，或通过将一叠纸巾和一个重物置于该膜和凝胶的顶部)。这导致在粘
附处DNA因毛细管作用从凝胶移动到与此DNA黏附的膜上。
[0231] 5.随后将膜烘烤(在硝化纤维素膜的情况下)或暴露于紫外辐射(尼龙膜)以将该DNA永久地交联于此膜。
[0232] 6.此膜现在用杂交探针-一种具有特定序列的分离的DNA分子-处理，其中所述的特定序列与适宜序列配对(所述的适宜序列是限制性酶识别的序列的互补序列)。标记
探针DNA，从而可以例如因掺入放射性或用荧光染料或生色染料标记该分子而检测到该探
针DNA。在一些情况下，杂交探针可以从RNA而非DNA产生。
[0233] 7.在杂交后，从膜上洗去过多的探针，并且杂交模式在X-光胶片上显像或作为等同技术，在放射性探针或荧光探针的情况下，通过自显影术，或若使用生色检测法，通过颜
色在膜上本身显色而显像。
[0234] 该方法首先由E.M.(1975)：“检测由凝胶电泳分离的DNA片段中的特定序列 (Detection of specific sequences among DNA fragments separatedby gel
electrophoresis)”，J Mol Biol，98：503-517描述。技术人员知道如何实施Southern印迹
法，例如根据T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory
Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中描述内容。
[0235] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法包括在步骤b)或c)之后分析转基因表达水平。在本上下文中，术语“转基因”指双链断裂诱导酶。在本上下文中，术语“表
达”包括转录和翻译。优选地，将高度或至少中度表达的植物品系用于本发明方法的进一步
的步骤。该步骤替代上文提及的“鉴定单拷贝转基因品系”步骤备选地进行，或优选地除了
“鉴定单拷贝转基因品系”步骤之外还进行该步骤，最优选在“鉴定单拷贝转基因品系”步骤
之后进行该步骤。
[0236] 这种分析可以通过本领域技术人员已知的任意标准分子技术进行。优选地，转基因表达水平的分析通过RT-PCR或Northern杂交进行。
[0237] 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是用于扩增RNA分子的定义片段的技术。RNA链首先逆转录成其DNA互补物或互补性DNA，随后使用聚合酶链反应扩增所得的DNA。这可以是
一个1步骤或2步骤过程。聚合酶链反应本身是通过温度介导的酶即DNA聚合酶用来扩增
DNA分子的特定部分的方法。
[0238] 在称作“第一链反应”的RT-PCR第一步骤中，使用dNTP和RNA依赖性DNA聚合酶即逆转录酶，通过逆转录过程，从mRNA模板产生互补性DNA。以上成分与DNA引物在逆转
录酶缓冲液中合并，于约37℃持续1小时。在逆转录酶反应结束和已经从原始的单链mRNA
产生互补性DNA后，开始名为“第二链反应”的标准聚合酶链反应。
[0239] 1.添加热稳定的DNA聚合酶以及上游和下游DNA引物。
[0240] 2.将反应加热到高于约37℃的温度以促进DNA引物对cDNA(副本DNA)的序列特异性结合。
[0241] 3.进一步加热允许这种热稳定的DNA聚合酶(“转录酶”)从引物结合的cDNA产生双链DNA。
[0242] 4.将反应加热到大约95℃以分开两条DNA链。
[0243] 5.冷却该反应，从而使引物能够再次结合并且重复该循环。
[0244] 在大约30个循环后，产生数百万个目的序列拷贝。初始RNA模板由RNA酶H降解，留下纯的cDNA(外加多余的引物)。通过使用含有该过程第二阶段所要求的酶的蜡珠，
该过程可以简化成单步骤过程，其中第二链反应中加热以使引物复性时，所述蜡珠熔化，释
放其内容物。RNA印迹法技术可以用来进一步研究RNA基因表达。
[0245] “RNA印迹法”或“Northern杂交”是用来研究基因表达的技术。该技术因与用来研究DNA的Southern印迹法的相似性得名，关键不同之处在于RNA是通过电泳分析并用杂
交探针检测的物质，而非DNA。该方法中的明显不同之处(如与Southern印迹法相比)是
在琼脂糖凝胶中添加充当变性剂的甲醛。如Southern印迹法中那样，可以从DNA或RNA产
生杂交探针。
[0246] 技术人员知道如何实施Nouthern印迹法，例如根据T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，
Cold Spring Harbor，NY(1989)中描述的内容。
[0247] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法包括在步骤b)或c)之后对转基因植物品系授粉，其中所述授粉是自花授粉或与野生型植物品系异花授粉。优选自花授粉。优
选地，将先前确定具有单拷贝DSBI转基因和/或具有高度或至少中度DSBI表达的品系用
于授粉步骤。
[0248] 在所谓“T0品系”(由本发明方法步骤b)产生的品系)自花授粉后，获得的种子叫做“T1种子”。
[0249] 就生物体、多肽或核酸序列而言，术语“野生型”、“天然”或“天然来源”意指所述生物是天然存在的或是在至少一种天然存在生物中可获得的，其中所述的天然存在生物没
有被改变、突变或没有被人类操作。
[0250] 优选地，分析通过授粉获得的种子和/或籽苗(“T1籽苗”)的接合性。在这种情况下，该分析确定DSBI转基因的存在并且起到鉴定纯合植物和半合子植物的作用。术语
“纯合的”指生物中各自位于相同基因组位置内的两个DNA序列，每个DNA序列存在于一个
同源染色体上。“杂合的”或可互换地“半合子的”描述了仅单拷贝的基因(例如转基因)
在双倍体(或多倍体)生物中的单个染色体上存在。
[0251] 接合性分析可以根据本领域技术人员已知的任意标准分子技术，例如通过定量PCR、Southern杂交和/或荧光原位杂交法进行。将后者定义为使用核酸探针检测并鉴定
染色体中DNA的或真核细胞和组织中RNA的特定互补性序列。检测借助荧光(例如与荧光
染料偶联的探针)进行。
[0252] 在又一个优选的实施方案中，选择在接合性分析后鉴定到的纯合品系用于本发明方法步骤d)的杂交。
[0253] 在本发明的另一个优选实施方案中，分析通过本发明方法步骤e)所获得的种子和/或籽苗(称为“F1”)的DNA双链断裂介导的同源重组。
[0254] 优选地，种子和/或籽苗的这种同源重组分析由包括PCR分析法、比色或生物化学测定法或者DNA测序法在内的标准分子技术确定。这种分析可以通过如对本发明方法步骤
c)所描述的方法进行。备选地或额外地，可以进行PCR分析。引物的选择取决于待切除的
核酸序列。技术人员知道如何设计适宜的PCR反应，例如，如在T.Maniatis、E.F.Fritsch和
J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，
Cold Spring Harbor，NY(1989)中描述。
[0255] 如上文所述的方法也可以反向进行，这意味着它涉及互逆方法。在这种情况下，用编码待切除核酸序列的构建体进行步骤a)的转化，进行步骤c)的瞬时测试法以评估步骤
a)的构建体的识别序列和重复序列的功能性，以及将产生的转基因植物品系与含有DNA双
链断裂诱导酶的植物品系杂交。因而，本发明也涉及用于从植物或植物细胞的基因组切除
核酸序列的方法，该方法包括：
[0256] a)用编码待切除核酸序列的构建体转化植物细胞，其中待切除的核酸序列包含对DNA双链断裂诱导酶为特异的至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且
其中待切除的核酸序列在两侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，
[0257] b)从步骤a)的细胞产生转基因植物品系，
[0258] c)用步骤b)的植物品系或其细胞或部分实施瞬时测试法以分析步骤a)的构建体的识别序列和重复序列的功能性，
[0259] d)将步骤b)的植物品系与含有DNA双链断裂诱导酶的植物品系杂交，和
[0260] e)进行未成熟胚转换或通过愈伤组织形成进行组织培养再生。
[0261] 上文定义的全部术语和方法以相同的方式适用于这种逆向方法，例外是瞬时测试法，该测定法优选地用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体进行。
[0262] 作为步骤d)杂交的备选，获得标记切除事件的另一种方法是用构建体“再转化”在步骤b)中产生并在步骤c)中分析的植物品系。
[0263] 在步骤a)的转化过程用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体进行的情况下，再转化用编码待切除核酸序列的构建体进行。因而，本发明涉及用于从如上文定义的植物或植物
细胞的基因组中切除核酸序列的方法，其中步骤d)的杂交替换为用编码待切除核酸序列
的构建体再转化步骤b)的植物品系，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的
至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两
侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，其中待切除的核酸序列包含对步骤a)的酶为特异的
至少一个识别序列，用于位点定向地诱导DNA双链断裂，并且其中待切除的核酸序列在两
侧邻接允许DNA修复机制的重复序列，
[0264] 在其中步骤a)的转化过程用编码待切除核酸序列的构建体进行时的“逆向”方法中，再转化用编码DNA双链断裂诱导酶的构建体进行。因而，本发明还涉及用于从如上文定
义的植物或植物细胞的基因组中切除核酸序列的方法，其中步骤d)的杂交替换为用编码
DNA双链断裂诱导酶的构建体再转化步骤b)的植物品系。
[0265] 用第二构建体再转化转基因植物品系的方法可以根据上文描述内容，即上文提及的任意转化方法进行。这同样适用于第二构建体的结构(遗传控制元件、启动子、增强子、
聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点等)，其可以根据上文描述内容设计。
[0266] 在这种备选方法中，技术人员明白另一种(第二)选择标记系统应当优选用于第二转化过程。例如，若用于第一构建体的选择标记系统基于“ahas”基因，则所述第二选择
标记系统可能是在编码待切除核酸序列的构建体的表达盒中所包含的“dsdA”基因，或反之
亦然。同样可以使用上文提及的任意选择标记与技术人员已知的任意选择标记的任何其他
组合。
[0267] 优选地，在含有待切除的靶DNA序列的转基因植物上进行再转化，尤其当待切除的靶DNA序列是第一选择标记基因时。例如，从含有ahas选择标记基因的第一转基因品系
衍生的未成熟胚用含有质粒的农杆菌菌株感染并与之共培养，其中所述的ahas选择标记
基因是待切除的靶，所述质粒包含携带dsdA基因作为选择标记的第二转化盒。若第一转基
因品系相对于第二选择标记基因是野生型，则遵循相似的转化步骤。例如，若第一转基因品
系含有带ahas基因的第一T-DNA，则仅施加针对dsdA基因的D-丝氨酸就可以进行选择。
对如此产生的植物分析切除事件。
[0268] 本发明还涉及通过本发明方法获得的植物或从这种植物衍生的后代、繁殖材料、部分、组织、细胞或细胞培养物。
[0269] 最后，本发明涉及本发明的植物或后代、繁殖材料、部分、组织、细胞或细胞培养物的用途，用作食物、饲料或种子或用于产生药物或化学品。
[0270] 本发明的植物可以被人或动物消费，并且因而还可以例如直接地或在本领域已知的加工法之后用作食物或饲料原料。这里，产生转基因植物时，缺失例如抗生素抗性和/或
除草剂抗性不仅因消费者接受性、还因产品安全性原因，从而是有意义的。
[0271] 本发明的又一个主题涉及上述植物和从它们衍生的结构物、药物或化学品、尤其精细化学品的用途。这里再次地说明，缺失例如抗生素抗性和/或除草剂抗性不仅因消费
者接受性、还因产品安全性原因而是有利的。
[0272] “药物”理解为意指在医学治疗、预防或接种中使用的药物(drug)、化学药或药品。“精细化学品”理解为意指可广泛使用的酶、维生素、氨基酸、糖、脂防酸、天然和合成的香
料、芳香物质或色料。特别优选的是产生生育酚和生育三烯酚和产生类胡萝卜素。通过技
术人员已知的方法培养转化的宿主生物并从宿主生物或从培养基分离。药物(例如抗体或
疫苗)的产生由Hood E E，Jilka J M.(1999)Curr Opin Biotechnol.10(4)：382-386；Ma
JK和Vine N D(1999)Curr Top Microbiol Immunol.236：275-92)描述。
[0273] 本发明的多种其他方面和实施方案将由于本公开而对本领域技术人员是显而易见的。在本说明书中提到的全部文件通过引用的方式并入本文。本发明的某些方面和实施
方案现在将以举例方式说明。应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法学、方案、细胞
系、植物物种或属、构建体和试剂。
[0274] 参考文献
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实施例
[0283] 材料和一般方法
[0284] 除非另外说明，实施例中的化学品和试剂从Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得，限制性核酸内切酶来自New England Biolabs(Beverly，MA)或
Roche(Indianapolis，IN)，寡核苷酸由MWG Biotech Inc.(High Point，NC)合成，并
且有关生物化学和分子生物测定法的其他修饰酶或试剂盒来自Clontech(Palo Alto，
CA)、Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega Corporation(Madison，WI) 或
Stratagene(La Jolla，CA)。用于细胞培养基的材料从Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或
DIFCO(Detroit，MI)获得。为本发明目的所实施的克隆步骤例如限制性切割、琼脂糖凝胶电
泳、纯化DNA片段、转移核酸至硝化纤维素膜和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、
培育细菌、增殖噬菌体和重组DNA的序列分析，如Sambrook(1989)所述实施。使用ABI激
光荧光DNA序列仪，按照Sanger方法(Sanger 1977)实施重组DNA分子的测序。
[0285] 1.用于玉米中标记切除的双链断裂(DSB)介导的同源重组
[0286] 植物细胞中的归巢核酸内切酶(HEN)表达可以增强染色体内同源重组(ICHR)。HEN植物中HEN转基因的表达水平在影响ICHR率中发挥重要作用。以常规方式，在衍生自
表达HEN的植物与含有靶序列的植物之间杂交的后代植物的组织上实施ICHR测定法(图
9A)。与作为代表体型小的和短产生时间的植物物种的拟南芥属植物相比，该系统在玉米中
的进化需要大量努力、时间和资源，包括温室空间以及长产生时间。为了克服这些差异并以
高效且有效的方式在玉米中实现成功的标记切除，研发了如下方法(图9B和9C)。
[0287] 在玉米中，所选择的T0植物(HEN品系以及能够切除的品系)自交以获得T1种子。使用TaqMan测定法，检验用于接合性试验的T1籽苗，旨在鉴定纯合品系。选择显示中度至
高度水平的转基因表达的T0品系以提高DSB介导的HR的效率并限制待用于杂交的植物数
目(图8)。首先，使用TaqMan半定量PCR测定法鉴定单拷贝品系。使用TaqMan实时RT-PCR
测试这些单拷贝品系，旨在于mRNA水平上确定所导入基因(I-SceI或GU-US，图1-4)的中
度表达至高度表达。转基因表达水平相对于内源基因(优选单拷贝基因)的表达水平进行
归一化。通过生物射弹转化法，以编码GU-US基因的质粒转化来自某些最强烈表达I-SceI
的品系的叶组织，用于瞬时ICHR测定法。在本测定法中的成功ICHR由检测到受轰击的叶
样品上的蓝色GUS阳性斑点而指示。该方法也可以通过转移I-SceI构建体至转基因GU-US
品系的叶组织中实施。这种瞬时测试法系统便于鉴定这样的HEN转基因品系，其是DSB介导
的成功HR的最佳候选者。选择的转基因品系用于进一步实验以获得DSB介导的HR植物。
[0288] 选择的HEN纯合品系与包含它们的互补构建体的植物(图3和4)异花授粉；即I-SceI品系与携带报告构建体(GU-US)的品系杂交并且报道品系与携带I-SceI构建体的
品系杂交。作为常规方法之后的对照，对包含I-SceI和GU-US构建体这两者的所得后代种
子直接分析DSB诱导的HR，并进行栽种以评价完整植物中的重组(图9A)。在包含I-SceI
和报告构建体这两者的后代种子中，在胚乳中强烈地观察到、在盾片中散在地观察到、在胚
轴中没有观察到DSB介导的HR，其中在组成型启动子(例如与玉米遍在蛋白内含子组合的
玉米遍在蛋白启动子)的控制下以表达I-SceI并切除能被切除的基因或表达盒。由于盾
片是借助农杆菌的玉米转化和再生的靶组织，故F1植物的未成熟胚用于再生过程以通过
胚性愈伤组织培养物恢复DSB介导的HR植物。该方法允许增殖和分化显示出DSB介导的
HR的组织。因而即便DSB介导的HR没有在胚轴中出现，仍显著提高了鉴定到DSB介导的
HR品系的概率(图9B)。另外，将I-SceI构建体再转化入纯合GU-US品系的未成熟胚以改
善DSB介导的HR，因为这个过程将经历再生过程(图9C)。表1是对这些新方法的基本特
征和时间表的概述。
[0289] 表1用于以HEN I-SceI基因在玉米中获得无标记事件的三种方法的概述。1基于2
图9的方法。 从最终切除获得无靶标记的事件中分离I-SceI基因所需要的产生时间。
[0290]获得切除的无靶标记
方法1 本发明中示例的特征
2
事件的时间
获得标记切除事件的机会低，和/或需要大规
A. 最少19个月
模种子筛选(因种子中完全切除的频率低)
获得标记切除事件的机会提高(因在单个细
B 8个月 胞水平上回收切除事件的潜能所致，并且组
织培养过程促进重组活性)。
获得标记切除事件的机会提高(因基于单个
C 9个月 细胞转化而获得完全切除事件的高度潜能所
致)
[0291] 如上所述，使用一个遍在的组成型强启动子表达HEN基因和GU-US时，当分析成熟的谷粒时，在玉米的胚轴中检测不到DSB介导的HR(由蓝色斑点显示)。为在胚中实现DSB
介导的HR，选择超级启动子，因为在玉米中这种启动子显示在萌发期间的整个胚(盾片和
胚轴)中强烈表达、在再生期间的愈伤组织(包括胚性愈伤组织)中强烈表达。可以通过
在超级启动子与1-SceI基因之间添加赋予内含子介导增强作用(IME)的内含子而增强在
这些组织中的表达水平。
[0292] 优化I-SceI归巢核酸内切酶基因序列以改善表达和mRNA稳定性。使用50％混合的玉米和大豆优选密码子，优化该序列。鉴定并除去RNA不稳定性基序、密码子重复序列、
隐伏的剪接位点、不希望的限制性位点和mRNA二级结构以获得最终的优化序列。合成的序
列由德国雷根斯堡Entelechon GmbH合成。合成该基因，其具有在-3位(作为翻译起始密
码子的ATG中的腺嘌呤为+1位核苷酸)为Kozak共有序列中的腺嘌呤(Kozak，1987)、所选
的限制性位点和Gateway附着区(Attachment region)(图22)。
[0293] SEQ ID NO：26编码密码子优化的I-SceI的序列，SEQ ID NO：27编码带附着区的密码子优化的I-SceI CDS。
[0294] 采用本发明的方法，在T1世代中产生了在95％置信度上分别以1.8-9.6％和5.4-16.4％效率切除完整报道基因盒和重组GU/US报道基因的完全重组的玉米。
[0295] 提供以下流程图以简短和简化地总述下文中描述的实施例。它不应当理解为限制。
[0296] 农杆菌介导的转化玉米未成熟胚
[0297] a)用I-Sce I构建体(选择标记盒：ahas)
[0298] b)用GUS假标记切除构建体(标记：ahas)
[0299] c)用GU-US报告构建体(标记：ahas)
[0300] A：农杆菌接种、共培养、选择和植物再生
[0301] 1.用农杆菌细胞悬液接种未成熟胚；
[0302] 2.在无抗生素和选择剂的培养基上进行未成熟胚和农杆菌的共培养；
[0303] 3.转移培养物至含有抗生素，但无选择剂的恢复培养基；胚性愈伤组织的产生在这个阶段始于盾片。
[0304] 4.在含选择剂的培养基上选择转基因的胚性愈伤组织；
[0305] 5.在含选择剂的再生培养基上恢复小植物；
[0306] 6.转移年幼T0籽苗至含选择剂的生根培养基；
[0307] 7.进行TaqMan拷贝数分析，并鉴定单拷贝事件；
[0308] 8.转移生根的、TaqMan阳性的单拷贝植物至土壤；
[0309] 9.通过RT-PCR确定转基因表达水平；
[0310] 10.T0品系自花授粉以获得T1种子(收获和贮藏)。通过TaqMan测定法对T1籽苗检验纯合性。
[0311] B：用于证明DSB介导的HR概念的半瞬时测定系统：
[0312] 将GU-US质粒导入表达I-Sce I的玉米品系
[0313] a)在叶组织中通过粒子枪导入，或
[0314] b)在原生质体中通过PEG介导的转化法导入
[0315] 确定报道基因的瞬时表达水平
[0316] ＝瞬时ICHR测定法(染色体内同源重组)
[0317] 检测到蓝色＝阳性斑点
[0318] →鉴定作为最佳候选的HEN转基因T0品系
[0319] C.异花授粉
[0320] 选择的纯合转基因I-Sce I品系与含有选择标记(或具有GU-US或GUS构建体)的品系异花授粉，其中所述的选择标记邻接有切除位点。
[0321] I-Sce I x GU-US＝获得F1后代(胚/种子)
[0322] D.未成熟胚转换
[0323] (通过体外转换/萌发未成熟胚成完整籽苗而从未成熟胚中恢复植物的过程，无愈伤组织形成。将F1未成熟胚置于不含植物生长素2，4-D的生根培养基上，并且随后将未
成熟胚转换成籽苗)。
[0324] (以避开耗费时间筛选从成熟种子衍生的F1植物)
[0325] 将F1未成熟胚置于含有针对选择标记的选择剂的生根培养基上，其中所述的选择标记与I-Sce I基因连接，→恢复籽苗。
[0326] E.通过胚性愈伤组织的植物再生
[0327] 这是借助愈伤组织形成，通过组织培养法恢复可能的切除标记的植物的方法。F1未成熟胚在恢复培养基上培养(以促进愈伤组织形成)，选择培养基上培养(以促进胚性愈
伤组织形成和选择含有整合的T-DNA的细胞)，在再生培养基上培养(以转换成熟愈伤组织
成小植物)并且随后在生根培养基上培养(以恢复完整的籽苗)。该方法的主要优点是从
单个细胞恢复F1植物，从而分离/选择了切除标记的细胞系。
[0328] F.转基因品系的再转化
[0329] 这是除了两种转基因品系(例如切除标记的目标品系和HEN品系)之间的常规杂交之外的还适用于标记切除的一项技术。为实施再转化，将转基因品系A(例如具有在
T-DNA中的第一选择标记基因的切除目标品系)的未成熟胚再次用其T-DNA中含有HEN基
因的农杆菌菌株转化，或转基因品系B(例如HEN品系)的未成熟胚可以再次用含有切除靶
T-DNA的农杆菌菌株转化(或反之亦然)。切除标记的籽苗可以从所述再转化过程中恢复。
[0330] G.用于DSB介导的HR或标记切除的植物分析
[0331] 用于鉴定无标记(＝完全切除标记的)植物的分子筛选法
[0332] a)叶和谷粒的GUS组织化学染色测定法
[0333] b)用于标记切除的PCR分析
[0334] 1.1载体构建
[0335] 1.1.1归巢核酸内切酶(I-SceI)构建体
[0336] 使用引物1和2从载体pCB586-4以PCR扩增I-SceI。
[0337] SEQ ID NO：7：引物1(AscI-ATG-I-SceI 5’)：
[0338] 5’-AGGCGCGCCATGAAAAACATCAAAAAAAACCA
[0339] SEQ ID NO：8：引物2(Sbfl-TAA-I-SceI 3’)：
[0340] 5’-GCTCCTGCAGGTTATTTCAGGAAAGTTTC
[0341] 所得的PCR产物用AscI和Sbfl消化并克隆到经AscI和Sbfl消化的载体pLM065中，以产生包含表达盒的载体pJB010，在所述的表达盒中玉米遍在蛋白启动子驱动I-SceI
表达。
[0342] 载体pCER 040b是其中玉米遍在蛋白启动子驱动I-SceI表达的双元表达载体并且通过将T4 DNA聚合酶补平的pJB010的PmeI-XbaI片段连接到T4 DNA聚合酶补平的
AscI-PacI消化的pEG085中产生。
[0343] 载体pCER 041是其中甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子驱动I-SceI表达的双元表达载体，并且通过将T4 DNA聚合酶补平的pJB010的PacI-AscI连接到T4 DNA聚合酶补平的
EcoRV-AscI消化的pEG085中产生。
[0344] 1.1.2GU-US构建体
[0345] 载体pCB642-2编码其中GUS ORF包含610碱基对内部重复的、带有一个位于该重复区之间的I-SceI识别位点(GU-US)的表达盒。通过HindIII和SpeI消化从pCB642-2
分离编码GU-US和NOS终止子的片段，并克隆到HindIII和SpeI消化的pBluescript以产
生pJB028。
[0346] 双元GU/US表达载体pJB034通过将T4 DNA聚合酶补平的pJB028的SpeI-XhoI片段连接到EcoRV-AscI消化的T4 DNA聚合酶补平的pEG085中产生。
[0347] 1.1.3假标记切除构建体
[0348] 载体pJB035通过将包含GUS表达盒的pBPSMM247b(p-ScBV：GUS：t-NOS)的AscI片段连接到AscI-消化的pUC001中产生。
[0349] 为了在pJB035中导入分布于GUS表达盒侧翼的I-SceI位点，产生了编码识别序列的寡聚物。寡聚物3和4的复性产生在一个末端带SalI-匹配突出端和在另一个末端带
XbaI-匹配突出端的双链I-SceI识别位点。
[0350] SEQ ID NO：9：寡聚物3(SalI I-SceI)：5’-TCGATAGGGATAACAGGGTAAT
[0351] SEQ ID NO：10：寡聚物4(XbaI-I-SceI)：5’-CTAGATTACCCTGTTATCCCTA
[0352] 通过用SalI和XbaI消化pJB035并连接复性的寡聚物3和4，在GUS表达盒下游添加一个I-SceI位点，因而产生pJB036。
[0353] 产生寡聚物5和6旨在产生带PacI匹配末端的双链I-SceI序列。
[0354] SEQ ID NO：11：寡聚物5(PacI-I-SceI 5’)：5’-TAGGGATAACAGGGT AAT
[0355] SEQ ID NO：12：寡聚物6(PacI-I-SceI3’)：5’-TACCCTGTTATCCCTAAT
[0356] 将复性的寡聚物5和6连接到PacI消化的pJB036以产生pJB037。
[0357] 最终的假标记切除载体需要分布在I-SceI位点侧翼的重复DNA序列以便充当同源重组的靶序列(HR靶)。为此目的，将玉米AHAS终止子的一部分重复。从载体pEG085通
过850bp EcoRI-KpnI片段切除该区域。将这个EcoRI-KpnI片段克隆到EcoRI和KpnI消化
的pJB037以产生pJB038，其中所述的pJB038包含[I-SceI：p-ScBV：GUS：t-NOS：I-SceI：
HR靶]假标记盒。
[0358] 通过连接来自pJB038的5.2Kb HpaI-PmeI片段到T4 DNA聚合酶补平的PacI-AscI消化的pEG085以产生pJB039，产生了所述假标记双元载体。
[0359] 1.2农杆菌介导的玉米转化和再生
[0360] 1.2.1植物组织培养和细菌培养基
[0361] 除非另外说明，实施例中的化学品和试剂从Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得。细胞培养基的材料从Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)获
得。本发明目的所实施的克隆步骤例如转化大肠杆菌细胞、培育细菌、增殖噬菌体和重组
DNA的序列分析，如Sambrook(1989)所述实施。以说明方式且不以限制方式提供以下实施
例。
[0362] 培养基配方
[0363] 通过将28.9mg Pursuit溶解到100ml DMSO(Sigma)中制备咪草烟(Pursuit)贮存液(1mM)并在4℃贮存于黑暗中。将乙酰丁香酮贮存液制备为DMSO中的200mM溶液并贮
存在-20℃。D-丝氨酸贮存液在双蒸水中制备、滤过消毒并贮存在4℃。
[0364] 表2.玉米YP培养基(用于培育农杆菌)
[0365]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
酵母提取物 Sigma Yl 626 5g/L
胨(来自肉) EM V298413 10g/L
培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
NaCl Sigma S5886 5g/L
[0366] 用1M NaOH调节pH至6.8。对于固体培养基，每250mL瓶添加3g琼脂(EMScience)。等分100mL培养基至每个250mL瓶，高压灭菌、使其冷却并在瓶内固化。为制备
平板，将瓶内的培养基在微波炉中熔化，并将该瓶置于水浴中并冷却至55℃。当冷却时，添
加壮观霉素(SigmaS-4014)至终浓度50mg/L，充分混合并倾倒制备平板。
[0367] 表3玉米LS-inf培养基
[0368]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
MS(Murashige和Skoog基础培养基) Sigma M-5524 4.3g/L
维生素测定法水解酪蛋白氨基酸 Difco维生素测定法 1.0g/L
(Difco)
葡萄糖 Sigma G7528 36g/L
蔗糖 Sigma S5391 68.5g/L
2，4-D(0.5mg/mL贮存液) Sigma D7299 1.5mg/L
烟酸(0.5mg/mL贮存液)，无菌 Sigma N4126 0.5mg/L
HCl吡哆醇(0.5mg/mL)，无菌 Sigma P8666 0.5mg/L
HCl硫胺素(1.0mg/mL)，无菌 Sigma T4625 1.0mg/L
肌醇(100mg/mL)，无菌 Sigma 15125 100mg/L
[0369]
[0370] 用1M HCl调节pH至5.2，滤过消毒，以100mL等分试样分装，在用于农杆菌感染前即刻添加乙酰丁香酮(100μM)至该培养基(将50μL添加至100mL培养基-200mM贮存
液)。
[0371] 表4.玉米1.5LSAs培养基(用于共培养)
[0372]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
MS(Murashige和Skoog基础培养基) Sigma M-5524 4.3g/L
葡萄糖 Sigma G7528 10g/L
培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
蔗糖 Sigma S5391 20g/L
2，4-D(0.5mg/mL贮存液) Sigma D7299 1.5mg/L
烟酸(0.5mg/mL贮存液)，无菌 Sigma N4126 0.5mg/L
HCl吡哆醇(0.5mg/mL)，无菌 Sigma P8666 0.5mg/L
HCl硫胺素(1.0mg/mL)，无菌 Sigma T4625 1.0mg/L
肌醇(100mg/mL)，无菌 Sigma 15125 100mg/L
L-脯氨酸(350mg/mL贮存液) Sigma P5607 700mg/L
MES(250mg/mL贮存液) Sigma M3671 500mg/L
[0373] 用1M NaOH调节培养基pH至5.8。每瓶称取4g Sigma纯化琼脂(8g/L)和每瓶分配500mL培养基，高压灭菌。当冷却时，添加AgNO3(15mM的贮存液)至终浓度15μM并
且添加L-半胱氨酸(150mg/ml的贮存液)至终浓度300mg/L。倾倒至100x 20mm培养皿。
含有乙酰丁香酮的培养基应当随即使用，而不长期贮存。
[0374] 表5.玉米恢复培养基：IM培养基
[0375]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
MS(Murashige和Skoog基础培养基) Sigma M-5524 4.3g/L
蔗糖 Sigma S5391 30g/L
2，4D(0.5mg.ml贮存液) Sigma D7299 1.5mg/mL
酪蛋白水解物 V919638 100mg/L
脯氨酸 Sigma P5607 2.9g/L
[0376] 量取约四分之三的所需ddH2O总体积，添加蔗糖和盐，并在搅拌下溶解。在全部成分溶解后，用ddH2O调节至终体积并使用1M KOH调节至pH 5.8。等分500ml液体培养基至
含0.9g脱乙酰吉兰糖胶的IL瓶中，高压灭菌20分钟(液体循环)。高压灭菌后，将瓶子置
于水浴中以冷却至55C并添加MS维生素(至终浓度1.0mg/mL)、硝酸银(至终浓度15μM)
和特美汀(至终浓度150mg/L)。倾倒培养基至100X 20mm培养皿并使培养基保留在层流柜
中过夜以防止过度凝缩。
[0377] 表6a选择培养基
[0378]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
MS(Murashige和Skoog基础培养基) Sigma M-5524 4.3g/L
蔗糖 Sigma S5391 20g/L
2，4-D(2.0mg/mL贮存液) Sigma D7299 0.5mg/L
烟酸(0.5mg/mL贮存液)，无菌 Sigma N4126 0.5mg/L
HCl吡哆醇(0.5mg/mL)，无菌 Sigma P8666 0.5mg/L
HCl硫胺素(1.0mg/mL)，无菌 Sigma T4625 1.0mg/L
肌醇(100mg/mL)，无菌 Sigma 15125 100mg/L
L-脯氨酸(350mg/mL贮存液) Sigma P5607 700mg/L
MES(250mg/mL贮存液) Sigma M3671 500mg/L
[0379] 用1M NaOH调节培养基pH至5.8。添加Sigma纯化琼脂(8g/L)，每1L瓶分配500mL培养基，高压灭菌，当冷却时添加(表6b)：
[0380]
[0381]
[0382] 表7a玉米再生培养基
[0383]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
MS(Murashige和Skoog基础培养基) Sigma M-5524 4.3g/L
蔗糖 Sigma S5391 20g/L
烟酸(0.5mg/mL贮存液)，无菌 Sigma N4126 0.5mg/L
HCl吡哆醇(0.5mg/mL)，无菌 Sigma P8666 0.5mg/L
HCl硫胺素(1.0mg/mL)，无菌 Sigma T4625 1.0mg/L
肌醇(100mg/mL)，无菌 Sigma I5125 100mg/L
L-脯氨酸(350mg/mL贮存液) Sigma P5607 700mg/L
MES(250mg/mL贮存液) Sigma M3671 500mg/L
[0384] 用1M NaOH调节培养基pH至5.8。每瓶(8g/L)称取4g Sigma纯化琼脂(SigmaA7921)。每瓶分配500mL培养基，高压灭菌并使其在瓶内固化。对于使用，用微波炉熔化培
养基，当冷却时，添加(表7b)；
[0385]
[0386]
[0387] 倾倒至100x 20mm培养皿。
[0388] 表8玉米生根培养基
[0389]培养基组分 供应商/目录号# 终浓度
1/2的MS(Murashige和Skoog基
础培养基) Sigma M-5524 2.15g/L
蔗糖 Sigma S5391 20g/L
烟酸(0.5mg/mL贮存液)，无菌 Sigma N4126 0.5mg/L
HCl吡哆醇(0.5mg/mL)，无菌 Sigma P8666 0.5mg/L
HCl硫胺素(1.0mg/mL)，无菌 Sigma T4625 1.0mg/L
肌醇(100mg/mL)，无菌 Sigma I5125 100mg/L
L-脯氨酸(350mg/mL贮存液) Sigma P5607 700mg/L
MES(250mg/mL贮存液) Sigma M3671 500mg/L
[0390] 用1M NaOH调节培养基pH至5.8，每瓶添加1g脱乙酰吉兰糖胶(2g/L)，每瓶分配500mL培养基，高压灭菌，添加选择剂后，倾倒至一次性植物托盘内。
[0391]
[0392] 1.3制备供体植物用于转化实验
[0393] 1.3.1在布达佩斯条约下的保藏物
[0394] 在布达佩斯条约下对以下材料进行保藏：
[0395] 1.玉米品系BPS553的种子；专利保藏物命名PTA-6170
[0396] 2.玉米品系BPS631的种子；专利保藏物命名PTA-6171。
[0397] 于2004年8月26日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA20110-2209 USA进行该保藏。
[0398] 1.3.2制备杂合的供体植物
[0399] 以下玉米近交系用于以下步骤：
[0400] 1.HiIIA：HiII亲代A；保藏号：T0940A，玉米遗传和基因组数据库)，可获自玉米遗传公司-种质中心(Maize Genetics Cooperation-Stock Center)USDA/ARS&Crop Sci/
UIUC，S-123 Turner Hall，1102 S.GoodwinAvenue，Urbana IL USA 61801-4798；http://
www.maizegdb.org/stock.php。
[0401] 2.A188：Agronomy&Plant Genetics，411 Borlaug Hall，明尼苏达大学，SaintPaul MN 55108。
[0402] 3.BPS533(ATCC专利保藏物命名PTA-6170)。
[0403] 4.BPS631(ATCC专利保藏物命名PTA-6171)。
[0404] 玉米基因型HiIIAxA188的F1种子通过HiIIA(雌性亲代)与近交系A188(雄性)杂交来产生，并种植在温室中作为花粉供体。(HiIIAxA188)的F2种子通过F1(HiIIAxA188)
植物在温室或大田中自花授粉产生，并种植在温室中作为花粉供体。使用近交系
BPS553(ATCC专利保藏物命名PTA-6170)或BPS631(ATCC专利保藏物命名PTA-6171)作为
雌性亲代和F1或F2(HiIIAxA188)植物作为雄性亲代在温室中产生BPS553x(HiIIAxA188)
或BPS631x(HiIIAxA188)的杂合未成熟胚。
[0405] 种子在含有Metromix的花钵中播种。一旦种子萌发和生根，维护一个籽苗/花钵用于产生未成熟胚，并且抛弃第二籽苗；备选地，在4x4英寸花钵中播种种子，并且将籽苗
在播种所述种子2周后移植至10英寸花钵。添加大约一汤勺Osmocote 14-14-14(一种缓
释肥料)至每个花钵的表面。温室中的温度维持在夜间24℃和昼间28℃。自动地进行浇
水，不过若需要每日人工补充浇水。每周两次，用1∶15稀释的Peters 20-20-20肥料给
植物浇水。
[0406] 1.3.3制备近交的供体植物
[0407] 在4英寸花钵中直接播种近交系BPS553或BPS631的种子，并且将籽苗在播种所述种子2周后移植至10英寸花钵。备选地，将种子直接播种在10英寸花钵中。进行自花
授粉或近缘授粉。培育条件如上文对杂交品系那样相同。
[0408] 1.3.4手工授粉
[0409] 对每株玉米植物监测幼穗，并且当幼穗出现时，用小的白色幼穗袋(Lawson)盖住它们。一旦幼穗已经产生产生玉米须，则切除玉米须并且再次用幼穗袋覆盖。相同植物的
玉米穗状花序用棕色纸袋包裹(条件是该玉米穗状花序已经进入开花期)。次日早晨，摇动
该玉米穗状花序以将花粉和花药移至该袋中。随后将该袋子取下并在幼穗的玉米须上方抖
动。授粉在早晨8点和10点之间进行。确保棕色纸袋在幼穗上方和玉米杆周围。授粉后，
从植物中除去玉米穗状花序以减少温室中的花粉(其对于许多人是变应原)。
[0410] 为确保对相同基因型的同步授粉并且因此避免周末收获/转化，再次切短那些开花早的植物的幼穗。随后在相同日对一组植物例如＞5至10株植物授粉。然而，这种操作
取决于植物上花粉的品质/数量。近交系需要近缘授粉。例如，BPS553或BPS631可以自
花授粉或在相同基因型之间近缘授粉。
[0411] 1.3.5收获和预处理玉米穗
[0412] 在授粉后(DAP)8至14(平均10)日收获来自玉米植物的玉米穗(最佳是出现的首个玉米穗)。根据生长条件和玉米品种，收获时间不同。未成熟胚的大小是其发育期的良
好指标。用于转化的未成熟胚最佳长度是约1至1.5mm，包括盾片的长度。胚应当是半透明
的，并非不透明的。若玉米穗是可用的，但不能用于那一日的转化，则可以收获玉米穗，放入
授粉袋并贮存在4℃冰箱的塑料袋中1至3日。
[0413] 1.4农杆菌介导的转化
[0414] 1.4.1农杆菌的制备
[0415] 农杆菌甘油贮备物贮存在-80℃。来自甘油贮备物的农杆菌接种物在含有适宜抗生素(例如50mg/L壮观霉素和/或10mg/L四环素或100mg/l卡那霉素)的YP琼脂培养
基(A-1)上划线。在黑暗中在28℃温育细菌培养物1至3日，或直至可见到单个菌落。
[0416] 获得的平板可以在4℃贮存1个月并且用作主平板以划线得到新鲜细胞。新鲜细胞应当在转化前至少2日，从主平板上的单菌落划线到含适宜抗生素的YP琼脂上。可以在
黑暗中于28℃温育这些细菌培养物1至3日。
[0417] 备选地，冷冻的农杆菌贮存物可以通过来自冷冻贮存物的农杆菌细胞对平板B-YP-002(YP+50mg/L壮观霉素+10mg/L四环素)划线并在28℃培育2至3日制备。将它作
为主平板保存并贮存在4℃至多1个月。从该主平板中，将一个接种环的农杆菌细胞对含有
25mL液体B-YP-000培养基的烧瓶划线，其中所述的培养基补充有50mg/L壮观霉素+10mg/
l四环素。在设于300转/分钟和28℃的摇床上培育2至3日。通过将1份上述农杆菌培
养物与1份无菌的30％甘油混合，制备冷冻的农杆菌贮存物。涡旋混合以充分混匀并且分
配10μL农杆菌/甘油混合物至50μLEppendorf管。贮存在-80℃。
[0418] 一个满接种环(直径2mm)的细菌培养物悬浮在补充有200nM乙酰丁香酮的1.0至1.8mL的LS-inf培养基中。这产生了光密度(OD600)大约在0.5至2.0之间的细菌悬液。
涡旋混合0.5至3小时。通过(例如用胶带)将微量离心管水平地(而非垂直地)固定
在涡旋混合器的平台上进行涡旋混合，以确保更好地将农杆菌细胞分散到该溶液中。在小
瓶中将100μL农杆菌细胞悬液与900uL LS-inf溶液混合，并且测量OD600。用LS-inf(具
100nM乙酰丁香酮)溶液调节初始农杆菌溶液的OD至0.6至2.0。该农杆菌悬液必须在感
染之前于LS-inf+乙酰丁香酮培养基中涡旋混合至少0.5至3小时。在开始收获胚之前制
备该悬液。
[0419] 备选地，用于玉米转化的农杆菌悬液可以制备如下：转化前2日，从-80℃贮存物中，来自一只管的农杆菌对含有B-YP-002(固化的YP+50mg/L壮观霉素+10mg/l四环素)
的平板划线，并且在28℃于黑暗中生长2日。转化前约1至4小时，将一勺细菌细胞置于一
只2mL Eppendorf管中的1.5mL M-LS-002培养基(LS-inf+200μM乙酰丁香酮)中。涡旋
混合该管以将细菌细胞分散到溶液，并且以1000转/分钟振摇该管1至4小时。OD600应当
8
是0.6至1.0范围或约10cfu/mL。
[0420] 出于以下实施例的目的，使用以双元载体质粒pBPSMM232转化的根癌农杆菌菌株LBA4404或卸甲农杆菌菌株K599(NCPPB 2659))。pBPSMM232含有ahas基因(作为选择标
记)和gus报道基因。
[0421] 1.4.2玉米穗的表面消毒和未成熟胚的分离
[0422] 在授粉后8至12日从温室收获玉米穗。除去全部外壳和玉米须并将玉米穗在棕色授粉袋中运回组织培养实验室。将穗轴移到无菌柜中。将一对大镊子插入玉米穗的基部
端并且使用镊子作为操作穗轴的手柄。任选地，当玉米穗上存在昆虫/真菌时，应当首先用
20％商业漂白剂对玉米穗消毒10分钟(备选地用30％Clorox溶液消毒15分钟)，并且随
后用灭菌水漂洗3次。通过镊子握紧该穗轴，同时用70％乙醇彻底喷淋玉米穗并且随后用
无菌ddH2O漂洗。
[0423] 1.4.3接种方法-1改良“管”法
[0424] 将带镊子手柄的穗轴置于一只大培养皿中。可以使用一个解剖级培养皿。用10#解剖刀切下并移去谷粒的顶部分(2/3)(出于安全考虑，通过远离持握镊子手柄的手而切
割，产生谷粒上的切口)。随后用解剖刀(#11解剖刀)从穗轴上的谷粒切下未成熟胚：解剖
刀片以一个角度插入谷粒的一端。向上撬起胚乳，胚位于胚乳下面。在大约含有LS-inf液
体培养基(见上文；A-2)中的1.5至1.8mL农杆菌悬液的微量离心管(或小培养皿)中收
集切下的胚，其中所述的LS-inf液体培养基含有乙酰丁香酮。每个管可以含有至多到100
个胚。手动混合含有胚的管数次，并使管/平皿在室温(20至25℃)静置30分钟。用吸管
从管/平皿除去过多的细菌悬液。转移残余LS-inf培养基中的未成熟胚和细菌至含有共
培养琼脂培养基的培养皿。通过灭菌接种环转移仍留在微量离心管中的任何胚。用吸管除
去过多的细菌悬液。平皿中必须留下少量液体以避免涂布时胚干透。将未成熟胚置于共培
养培养基上，平侧面向下(盾片向上)。不要将胚埋入培养基。在无菌柜中使平板盖开启
约15分钟以蒸发笼罩未成熟胚的过多潮气。用3M微孔胶带密封培养皿。约100个胚可以
置于培养皿上共培养。密封平板并用一张铝箔包裹。将平板在在黑暗中于22℃温育2至3
日。若使用GUS构建体来评估瞬时GUS表达，则取3至5个未成熟胚用于GUS染色。
[0425] 1.4.4方法2：“滴注”法
[0426] 直接将切下的未成熟胚放在共培养培养基(附录A-3)上，平侧面向下(盾片向上)。每只平板(20x100mm平板)可以容纳至多100个未成熟胚。用复式移液器向每个未
成熟胚施加5μL稀释的农杆菌细胞悬液。通过在无菌柜中使平板盖开启约15分钟，除去
笼罩未成熟胚的过多潮气。用3M微孔胶带密封该平板并用铝箔包裹。将平板在黑暗中于
22℃温育2至3日。若使用GUS构建体来评估瞬时GUS表达，则取3-5个未成熟胚用于GUS
染色。
[0427] 1.4.5恢复
[0428] 在共培养后，将胚转移至恢复培养基(A-4)并且将平板在黑暗中于27℃温育约5至10日。保持盾片侧向上并且不得埋入培养基。
[0429] 1.4.6选择
[0430] 转移未成熟胚至第一选择培养基(A-6)。可以在每个平板上安置大约25至50个未成熟胚。小心保持所述胚处于相同方向(盾片向上)。不得将胚埋入培养基。用白色胶
带密封培养平板。在黑暗中于27℃温育10至14日(第一轮选择)继代培养产生不定愈伤
组织的全部未成熟胚至第二选择培养基(A-6)。尽量避免转移粘质或柔软的愈伤组织。在
此阶段，使用剪子除去已经形成的任何幼枝(若可能，尽量从盾片中取出完整胚并弃之)。
将愈伤组织稳固地安置在培养基上-勿埋入培养基。用3M微孔胶带包裹平板并置于黑暗
中27℃。在与第一轮选择相同的条件温育2周(第二轮选择)。使用2副细镊子，在立体
显微镜下从盾片中切下可再生的愈伤组织。这种可再生的愈伤组织呈发白/淡黄色，紧凑，
不呈粘质并且可以具有一些胚样结构。转移愈伤组织至新鲜的第2选择培养基(A-6)，用
3M微孔胶带包裹并在黑暗中于27℃温育2周。将愈伤组织稳固地安置在培养基上-勿埋
入培养基。小心分组和标记来自相同胚的愈伤组织片。
[0431] 1.4.7再生和移植转化的植物
[0432] 以与第二轮选择下相同的方式切下增殖的愈伤组织(稍白色，形成胚结构)并转移至25x100mm平板中的再生培养基(A-7)上。将愈伤组织稳固地安置在培养基上-勿埋
入培养基。用3M微孔胶带包裹平板并置于25或27℃的光照下。小心分组和标记来自相同
胚的愈伤组织片并且通过胚对它们编号。
[0433] 在光照(大约2,000lux；14/10小时光照/黑暗)下于25或27℃温育2至3周，或直至可见到幼枝样结构。若需要，转移至新鲜再生培养基。转移带再生幼枝或幼枝样结
构的愈伤组织部分至含有生根培养基(A-8)的Phytatray盒或深红色盒并在与上述步骤相
同的条件下温育2周，或直至生根的小植物已经发育。在生根培养基上2至4周后，转移
仍具有绿色区域(但无再生籽苗)的愈伤组织至新鲜的生根Phytatray。取籽苗样品用于
TaqMan分析以确定T-DNA插入数目。
[0434] 转移生根的籽苗至温室中的Metromix土壤并且用塑料罩盖住每株籽苗至少1周，直至籽苗已经建立。每日浇水维持所述植物，并且一周补充液体肥料两次。当植物长到3
叶至4叶期时，对它们施Osmocote肥料。根据需要，含有ahas基因的推定的转基因植物由
TM
持证人员用70至100g/公顷Pursuit 喷洒，并在温室中培育另外2周。非转基因植物应
TM
当产生除草剂症状或此时死亡。将存活的植物移植到具MetroMix和1茶匙Osmocote 的
10英寸花钵中。
[0435] 在开花期，将转基因植物的玉米穗状花序用棕色纸袋包装以防止花粉逸出，并且还用玉米穗袋盖住幼穗以防止花粉混杂。在所述转基因植物上进行授粉。最好使转基因植
物自花授粉。若玉米出须和开花期不同步，与转基因T0植物具有相同遗传背景的野生型花
粉供体或受体植物应当可用于进行异花授粉。收获T1种子、干燥并正确地贮存，同时在种
子袋上加上适当标签。在收获转基因T1种子后，包含T0植物的土壤和花钵应当装入高压灭
菌袋中并高压灭菌(双重袋装)。
[0436] 1.5鉴定显示高转基因表达的单拷贝转基因品系(T0)
[0437] 1.5.1鉴定单拷贝品系
[0438] 使用TaqMan拷贝测定法(Applied Biosystems目录号#4326270)鉴定单拷贝品系。
[0439] 1.5.2鉴定对于转基因在mRNA水平高表达的品系。
[0440] 1.5.2.1采样
[0441] 将用来确定拷贝数的核酸样品(见上文的实施例1.5.1)用于测试转基因(pCER040b和pCER041：I-SceI，pJB034：GU-US和JB039：GUS)的mRNA表达水平。
[0442] 使用来自Ambion的无DNA试剂盒(目录号1906)，以DNA酶处理用于拷贝数分析的T0叶核酸样品，如制造商所述进行。
[0443] 1.5.2表达分析反应的建立
[0444] 一旦样品已经用DNA酶处理，则进行表达分析。为分析每个样品，进行两个反应，一个反应针对目的基因(NOS终止子、GUS报道基因或I-SceI基因)并且一个反应针对用
来定量该反应中RNA浓度的内源基因对照。内源基因的表达应当在整个测试条件期间保持
稳定，从而精确地反应目的基因的相对浓度。对于这些实验，鉴定到一个在正常温室生长条
件下显示稳定表达水平的玉米基因(BPS-NC克隆ID 62054718)。引物12和13用来分析这
个基因的表达水平。
[0445] SEQ ID NO：13：引物12(正向引物Endo)：
[0446] 5’-TCTGCCTTGCCCTTGCTT-3’
[0447] SEQ ID NO：14：引物13(反向引物Endo)：
[0448] 5’-CAATTGCTTGGCAGGTCTTATTT-3’
[0449] NOS终止子引物在该终止子中转录停止之前复性。所述引物的序列如下。
[0450] SEQ ID NO：15：引物14(正向引物NOS)：
[0451] 5’-TCCCCGATCGTTCAAACATT-3’
[0452] SEQ ID NO：16：引物15(反向引物NOS)：
[0453] 5’-CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT-3’
[0454] GUS报道基因引物在该基因序列的中央复性。所述引物的序列如下。
[0455] SEQ ID NO：17：引物16(正向引物GUS)：
[0456] 5’-TTACGTGGCAAAGGATTCGAT-3’
[0457] SEQ ID NO：18：引物17(反向引物GUS)：
[0458] 5’-GCCCCAATCCAGTCCATTAA-3’
[0459] I-SceI基因引物在可读框内复性。所述引物的序列如下。
[0460] SEQ ID NO：19：引物18(正向引物I-SceI)：
[0461] 5’-GACCAGGTATGTCTGCTGTACGA-3’
[0462] SEQ ID NO：20：引物19(反向引物I-SceI)：
[0463] 5’-CAGGTGGTTAACACGTTCTTTTTT-3’
[0464] 反应在带内源对照的96孔光学平板(Applied Biosystems，4314320)中进行，并且目的基因反应在相同的平板中同时进行。使用本领域已知的标准流程，使用SYBR
Green(Eurogentec#RTSNRT032X-1)，对样品进行半定量RT-PCR。在Perkin Elmer GeneAmp
5700(系列号100001042)上进行反应，如制造商所述。
[0465] 所用的热循环仪参数如下：
[0466] 阶段1：在48℃，30分钟(运行1次)
[0467] 阶段2：在95℃，10分钟(运行1次)
[0468] 阶段3：在95℃，15秒和在60℃，1分钟(运行40次)
[0469] 使用默认的解离方案：
[0470] 在95℃，15秒
[0471] 在60℃，20秒
[0472] 在35℃，20分钟，缓慢上升(60-95℃)
[0473] 1.5.2.3在GeneAmp5700上对转基因的数据分析结果
[0474] 内源对照反应的结果用来证实mRNA样品的质量和完整性。基于GeneAmp5700产生的Ct值，将T0世代玉米植物中的转基因表达划分为高度、中度或低度。将高水平视为18
至23范围内的Ct值，中度水平(Ct值：24至26)，低水平(Ct值：26至30)。产生高于30
的Ct值的样品视为不显示转基因表达。表9显示了每个构建体的转基因品系数的概要，其
中通过实验确定的mRNA表达水平进行分组。
[0475] 表9，对于每种转基因构建体的每个表达水平类别中的T0植物数目
[0476]构建体 高度 中度 低度 测试的总数
pJB034 36 28 19 83
pJB039 56 50 18 124
pJBcer040b 20 2 2 24
pJBcer041 20 38 29 87
[0477] 1.6通过半瞬时测定系统证实双链断裂(DSB)介导的同源重组概念
[0478] 1.6.1用于证实DSB介导的重组概念的瞬时表达测定法
[0479] 使用瞬时表达测定法提供证明植物细胞中DSB介导同源重组系统的概念数据。分别通过生物射弹轰击或PEG介导的转化，将GU-US报告构建体(例如pJB034)导入玉米叶组
织或原生质体。有功能的GUS可读框仅可以在GU-US基因座同源重组后从pJB034产生。来
自这些实验的结果概述于表10和图4中。与不表达I-SceI的玉米叶相比，来自表达I-SceI
的玉米植物的叶组织以pJB034轰击时，检测到显著较高水平的GUS染色。
[0480] 表10.来自瞬时轰击测定法的GUS染色结果
[0481]pJB035(GUS) pJB034(GU-US)
野生型玉米 +++ -
CER040b转基因玉米 +++ ++
CER041转基因玉米 +++ +
[0482] 1.6.2生物射弹转化
[0483] 使用Qiagen质粒试剂盒(目录号12143)分离质粒构建体。根据Sanford等人(1993)描述的方案，将DNA沉淀在0.6μM金粒子(Bio-Rad目录号165-2262)上，并利用
PDS-1000/He系统装置(Bio-Rad)加速到靶组织(例如2周龄玉米叶，BMS培养的细胞等)
上。全部DNA沉淀步骤和轰击步骤在无菌条件下于室温进行。
[0484] 2mg金粒子(2mg/3次射击)重悬于100％乙醇中，随后在贝克曼微量离心机(Beckman Microfuge)18Centrifuge以2,000转/分钟于Eppendorf管中离心。沉淀物用
无菌蒸馏水漂洗1次、离心并重悬于25μL的1μg/μL总DNA中。向该管添加以下试剂：
220μL H2O，250μL 2.5M CaCl2，50μL0.1M亚精胺游离碱。将该DNA溶液短暂涡旋混合并
置于冰上5分钟，随后以500转/分钟在贝克曼微量离心机18 Centrifuge中离心5分钟。
去掉上清液。沉淀物重悬于600μL乙醇中，随后以14,000转/分钟离心1分钟。终末沉
淀物重悬于36μL乙醇中并且立即使用或在轰击前贮存在冰上至多4小时。对于轰击，将2
周龄的玉米叶切成大约1cm长度并置于直径2英寸的消毒Whatman滤纸上。在BMS培养的
细胞的情形时，将5mL的1周龄混悬细胞真空缓慢地在置于滤器装置上的直径2英寸滤纸
上真空抽滤以除去多余液体。将截留植物材料的滤纸安置在渗透诱导培养基(N61-100-25，
0.2M甘露醇，0.2M山梨醇)上，在轰击前于27℃黑暗中持续2-3小时。射击前几分钟，从该
培养基上取下滤纸并置于无菌的开口培养皿上，以使得愈伤组织表面部分地干燥。为保持
植物材料的位置，将一张消毒的金属筛网铺在样品的顶部。对于叶材料，每个平板用10μL
金-DNA溶液以2,200psi射击1次，并且对于BMS培养的细胞，以1,100psi射击2次。轰
击后，将容留样品的滤纸转移到MS基础培养基上并在瞬时测试法之前于27℃在黑暗中温
育2日。按照如上所述的本领域方案，确定报道基因的瞬时表达水平。
[0485] 1.6.3原生质体转染
[0486] 通过遵循Sheen(1990)开发的方案，实施原生质体分离。玉米籽苗在黑暗中于25℃保持10日并且在原生质体制备前光照20小时。将叶的中间部分切成0.5mm的条(长
度约6cm)并在含有1％(w/v)纤维素RS、0.1％(w/v)离析酶R10(两者均来自日本西宫
Yakult Honsha)、0.6M甘露醇、10mM Mes(pH 5.7)、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM β-巯基乙
醇和0.1％BSA(w/v)的酶溶液中，在23℃温育3小时，随后以80转/分钟轻柔振摇10分
钟以释放原生质体。
[0487] 通过100x g离心2分钟收集原生质体，在冷的0.6M甘露醇溶液中洗涤1次，离心6
并重悬于冷的0.6M甘露醇(2x10 个/mL)中。
[0488] 将总体积100μL无菌水中的总计50μg质粒DNA添加到0.5ml的玉米原生质体6
(1x10 个细胞/mL)悬液中并轻柔混合。添加0.5mL PEG溶液(40％PEG 4000，100mM CaNO3，
0.5甘露醇)并在70℃预温，同时轻柔振摇，随后添加4.5mL MM溶液(0.6M甘露醇，15mM
MgCl2和0.1％MES)。该混合物在室温孵育15分钟。通过在600转/分钟沉淀5分钟并
重悬于1.0mL的MMB溶液[0.6M甘露醇，4mM MES(pH 5.7)和雀麦花叶病毒(BMV)盐(任
选)]，将原生质洗涤2次，并在25℃于黑暗中温育48小时。在终末洗涤步骤后，将原生质
体收集在3mL MMB培养基中，并在25℃于黑暗中温育48小时。按照本领域方案，确定报道
基因的瞬时表达水平。
[0489] 1.7通过直接转换和通过F1杂合未成熟胚的愈伤组织培养恢复无标记的转基因植物
[0490] 在含有邻接切除位点的选择标记的转基因植物与含有I-SceI基因的第二转基因植物杂交后，每一个F1后代(胚/种子)可以具有：(1)具有完整GOI和选择标记的在胚
中的全部细胞(具有完整选择标记的细胞)；(2)具GOI而无选择标记的全部细胞(完全标
记切除发生)；和(3)一些细胞使得选择标记切除，导致混合的基因型。
[0491] 根据切除在授粉期间或之后发生的阶段，在胚/种子中可能存在不同基因型。若选择标记切除正好在授粉的单个细胞阶段发生，则预期有完全切除的植物。然而，若标记切
除事件在胚发育期间晚期多细胞阶段发生，则一个合子/胚可以含有混合的细胞类型，即
带有和不带选择标记的细胞。
[0492] 常规地收获F1后代的成熟种子并种植在土壤中，以获得各单株籽苗用于将来筛选。分子技术如PCR分析和DNA印迹分析用来鉴定完全切除的植物。
[0493] 1.7.1基于F1未成熟胚转换的筛选法
[0494] 与通过筛选成熟种子的常规方法相比，为了节省时间，使用在含有选择剂的生根培养基(A-8)上转换F1未成熟胚的方法，其中所述的选择剂针对与I-Sce-I基因连接的选
择标记。例如若dsdA选择标记用于产生I-Sce-I植物，则在生根培养基中使用D-丝氨酸。
剖分未成熟胚并置于生根培养基(A-8)上，并且随后以16小时光周期在27℃培养箱中温
育。恢复的籽苗随后进行分子筛选以鉴定完全切除标记的植物。就常规方法与未成熟胚转
换方法之间比较而言，采用未成熟胚转换方法节省约80日，假定两种方法具有相同的完全
切除事件获得率(表11)。
[0495] 1.7.2基于愈伤组织培养F1未成熟胚的筛选法
[0496] 为提高获得完全切除事件的机会，在本发明中使用培养F1未成熟胚的方法。
[0497] 与筛选从成熟种子和从未成熟胚衍生的F1植物的方法相比，我们假定与未成熟胚的胚性愈伤组织培养相关的细胞分裂因胚性愈伤组织起始过程中活跃的DNA增殖和修
复活性而促进标记切除活性。由于通过玉米胚性愈伤组织培养的再生是基于单个细胞的过
程，因而再生的籽苗含有单一细胞类型，例如完全切除的基因型或不切除的基因型。例如，
若切除仅在F1未成熟胚/种子的盾片中发生，则不可能通过筛选从成熟种子或已转换的未
成熟胚衍生的植物而恢复完全切除植物。相反，嵌合的未成熟胚的愈伤组织培养物可以导
致恢复完全切除植物。
[0498] 表11.常规方法和组织培养再生方法在获得完全标记切除植物中所需要时间的比较。
[0499])
所 需 时 间 日( 07 41 41 7 07
转胚 标全 间之 产粉 胚 未从 物植 物植 胚熟
熟成未过通 完复恢法换 物植除切记 和靶除切在 代亲IecS-I 授花异过通 代后1F生 熟成未得获 )mm4-2( 换转胚过通 生产胚熟成 记标无择选 成未2F备制

)
日 0 0 0
所 需 时 间 ( 7 1 6 7
胚熟成未1F 织组伤愈过 植生再法养 和靶除切 之代亲IecS 授花异过通 代后1F生产 胚熟成未得 )mm8.1-0. 养培织组过 的胚熟成未 物植生再片 植记标无定从 通 培 物 在 -I 间 粉 获 1( 通 从 盾 鉴 物

)
需 间 日 0 0 4 02
所 时 ( 7 5 1 7 1
过通(法方 )子种 和靶除切 之代亲IecS 授花异过通 代后1F生产 1F的熟成得 子 获以子种发 苗籽1F 植记标无择 代后2F备
规常 熟成 在 -I 间 粉 获 种 萌 得 选 物 制

1 2 3 4 5
骤 骤 骤 骤 骤
步 步 步 步 步

6
41 7 91

未 植2 物
从 F 植
换 生 记
转 产 标
胚 胚 无
过 熟 定
通 成 物 鉴

74
1
4 77
1 7 2
以子 苗 植
种 籽 记
2 2 标
F F 无
发 得 定 计
萌 获 鉴 物 总

6 7
骤 骤
步 步

[0500]
[0501] 将1至1.8mm长度的F1未成熟胚剖分到恢复培养基(A-4，IM培养基)并在27℃于黑暗中温育约5至10日，并且随后将衍生的愈伤组织转移到并在选择培养基上培养约14
日，其中所述的选择培养基含有针对与Sce-I基因连接的第二选择标记基因的选择剂。愈
伤组织进一步在该选择培养基上培养另外14日，并且随后转移至再生培养基(A-7)并在组
织培养室中16小时/天的光周期下孵育约7至14日。再生的植物随后在如再生步骤那样
的相同条件下转移至生根培养基(A-8)。籽苗随后进行分子筛选以鉴定完全切除标记的植
物。
[0502] 1.7.3对于DSB介导的同源重组或标记切除的植物分析
[0503] 1.7.3.1GUS组织化学测试法
[0504] 用来监测重组事件的一种方法是在来自含pJB034的植物的叶和谷粒组织中的GUS组织化学染色法。pJB034构建体包含了含有内部部分序列重复的被打断的β-葡糖
醛酸糖苷酶(GUS)报道基因，从而有功能的可读框仅可以借助所述重复序列之间的同源重
组而重构。使用本领域技术人员已知的方法，可以通过生色底物如5-溴-4-氯-3-吲哚
基-β-D-葡萄糖醛酸用肉眼看到植物组织中功能性GUS蛋白的表达。
[0505] 通过组织化学染色法对于来自[JB034x I-SceI]和[JB034x I-SceI Null]植物的植物组织分析GUS表达。结果概述于表12和图11中。来自JB034x I-SceI杂交而产生
的植物的组织比来自JB034 x Null杂交而产生的植物的组织显示在叶和谷粒中显著更多
的GUS表达。与零植物(null plant)(即不表达I-SceI的植物)的杂交不显示可检测到
的GUS染色。
[0506] 对于全部组合，就I-SceI和JB034构建体的母性或父性传递进行互交，检测不到母性方式或父性方式提供的转基因之间GUS表达的定量或定性差异。与
CER041(ScBV::I-SceI)植物相比，通常在从与CER040b(pUbi::I-SceI)的杂交所衍生的植
物中观察到更大量的GUS染色。
[0507] 表12.来自JB034 X I-SceI植物的组织的GUS染色结果
[0508]JB034与以下对象杂交： GUS染色 评论
JB034(自交) - 在任何组织中无染色
在叶和谷粒(胚乳和盾片)中强烈
CER040b(Ubi::I-SceI) +++
染色
在叶中强烈染色并且在谷粒(胚
CER041(ScBV::I-SceI) ++
乳)中的染色强度略低
零植物 - 在任何组织中无染色
[0509] 来自不同JB034 x I-SceI植物的叶组织在GUS染色的量方面不同，即可看到代表在叶发育中相对晚发生的重组事件的点状GUS染色、代表从先前已经发生重组的细胞中
发育的组织的线状GUS染色，至代表在叶形成之前的发育期中发生的重组事件的完全蓝色
叶。由于重组在细胞水平发生，有可能的是来自相同植物的不同叶会产生不同的GUS染色
模式。
[0510] 1.7.3.2用于标记切除的PCR分析
[0511] 使用PCR来提供对来自包含pJB034或pJB039报告构建体的植物的重组事件的分子表征。
[0512] 使用引物7和8，通过PCR分析来自JB034杂交的植物，其中所述的引物分别基于ScBV启动子和GUS ORF中在重复区下游的区域。
[0513] SEQ ID NO：21：引物7(ScBV fwd)：
[0514] 5’-GATCGCAGTGCGTGTGTGACACC-3’
[0515] SEQ ID NO：22：引物8(GUS AS879 rev)：
[0516] 5’-GTCCGCATCTTCATGACGACC-3’
[0517] 为了使分析通量最大化，将基因组DNA分组合并用于PCR分析。从天然JB034构建体用引物7和8的PCR扩增产生1.7kb产物，而从重组JB034的扩增产生1.0Kb PCR产物。
图12显示了用来自[JB034 x I-SceI]植物的基因组DNA进行的PCR产生1.7kb和1.0kb
产物，当模板是来自自交的JB034的基因组DNA时，导致仅产生自未重组的JB034基因座中
所预期的1.7kb产物。随后单独地分析产生切除特异性PCR产物的来自基因组DNA合并物
的各株植物。
[0518] 使用分别基于AHAS可读框和与T-DNA右边界毗邻的区域的引物9和10，通过PCR分析来自JB039杂交的植物。用引物9和10的PCR应当从天然JB039模板产生6.7kb产
物，并且从提出的重组JB039中产生0.9kb产物。PCR在不允许高效扩增6.7kb天然产物的
条件下实施，从而旨在证实基因组DNA对于全部样品是完整的，进行一个额外的PCR，旨在
提供从包含天然JB039构建体的基因组DNA中可轻易扩增的产物。这种使用引物9和11
的证实性PCR从天然JB039中产生1.2kb产物，并且从重组的JB039中不产生产物，原因是
引物11同源序列丢失。
[0519] SEQ ID NO：23：引物9(AHAS ORF fwd)：
[0520] 5’-CTAATGGTGGGGCTTTCAAGG
[0521] SEQ ID NO：24：引物10(RB近端rev)：
[0522] 5’-CCTTAAGGCGATCGCGCTGAGGC
[0523] SEQ ID NO：25：引物11(远侧AHASRB末端rev)：
[0524] 5’-AGTGTACGGAATAAAAGTCC
[0525] 为了高效地分析来自尽可能多的植物的基因组DNA，合并来自[JB039x I-SceI]或[JB039 x Null]植物的植物基因组DNA并初始地进行分析。图13显示这些PCR分析的
常见结果。随后单独地分析产生切除特异性PCR产物的来自基因组DNA合并物的各株植物。
[0526] 1.7.3.3用于标记切除的植物分析
[0527] 产生针对GU-US报告构建体(JB034)的一系列17个杂交。用遍在蛋白I-SceI构建体(CER40b：Zm.遍在蛋白启动子：:Zm.遍在蛋白内含子::I-SceI::NOS终止子)从8个
杂交获得总计369个事件并且用ScBVI-SceI构建体(CER41：ScBV启动子：:I-SceI::NOS
终止子)从9个杂交获得总计520个事件。对遍在蛋白I-SceI杂交的组织化学筛选产生
了由蓝色条纹和斑点显示的118个阳性重组事件，每个杂交平均15个重组事件。对354个
这些事件的PCR分析产生58个阳性PCR产物，每个杂交平均7个重组事件。当使用ScBV
I-SceI进行所述杂交时，从520个事件中获得14个组织化学阳性事件，每个杂交平均2个
重组事件。PCR分析从516个事件中鉴定出28个阳性PCR产物，每个杂交平均4个重组事
件(表3)。较弱的ScBV启动子产生源自组织化学和PCR筛选方法的较少重组事件。JB034
与I-SceI零植物品系的杂交产生93个事件，其中之一呈组织化学和PCR阳性。阳性事件
可能是自发重组事件或误差的结果。
[0528] 对于JB039品系和所述两个I-SceI构建体进行类似的系列杂交。4个假GUS x遍在蛋白I-SceI杂交产生188个事件，其中18个事件产生阳性PCR产物，每个杂交平均5
个阳性事件。使用ScBV-I-SceI构建体，其余7个杂交产生434个事件，其中仅8个事件为
PCR阳性，每个杂交平均1个重组事件(表13)。对所述事件的亚组进行组织化学染色，然
而在强烈蓝色背景中不能辨出白色条纹和斑点，从而放弃了进一步染色。就被打断的GUS
构建体而言，使用较弱的ScBV启动子产生约低4倍的重组事件。
[0529] 表13.来自全部再生植物的分子筛选结果。阳性1重组由蓝色斑点或条纹显示并且阳性PCR事件由适宜大小的条带显示。全部结果是嵌合的，这在本质上因为合并了来自
2
相同事件的组织和/或在任意单株植物中所得到的不完全切除。平均数 表述为事件数/
杂交
[0530]
[0531] 含有GU-US报告构建体JB034的834个再生事件中总计132个再生事件对于重组为染色阳性，而870事件中的86事件产生了指示重组基因的PCR条带。这些阳性事件中50
个重组事件对两项标准均为阳性(表14)。在缺I-SceI的杂交中获得的一个阳性事件是自
发事件或误差。
[0532] 表14.用再生和筛选结果获得的事件的概述。从每个类型杂交获得的经组织化学法或用PCR分析的事件概述。所筛选GU-US事件对于每个试验是不同的，因为在事件采样
时间上，每个植物的组织对于组织化学分析而言并非总是可获得的。对切除事件的组织化
学分析是不连续的并且专门进行PCR分析。
[0533]总共#个事件 #个 总共#个 #个 #个事件
所测试的
杂交 染色 事件所测试 事件 染色和
GUS组织
化学测试 事件 的PCR PCR+ PCR均为+
JB034xI-SceI 834 132 870 86 50
JB034 x I-SceI Null 93 1 93 1 1
JB039 x I-SceI 28 0 622 26
JB039 x I-SceI Null 76 0 172 0
[0534]
[0535] 1.7.4用于产生具有I-SceI和靶切除这两者的植物的再转化策略
[0536] 我们还评估了获得推定的标记切除事件的另一种方法：用含有I-SceI基因的构建体再转化靶切除的植物，其中所述的构建体具有第二选择标记。既然组织培养方法可以
促进切除活性(假设)，用几个试验性构建体(HEN构建体：JB084、LM319或M320)实施再转
化实验。
[0537] 为进行再转化实验，我们遵循上文所述的转化方法，使用切除靶的植物(带有AHAS作为选择标记)作为转化供体材料并使用针对用于第二转化构建体的选择盒的选择
剂(例如dsdA基因的D-Ser)。
[0538] 当使用遍在的组成型强启动子表达HEN基因和GU-US时，分析成熟的谷粒后，在玉米的胚轴中检测不到DSB介导的HR(由蓝色斑点显示)。为在胚中实现DSB介导的HR，选
择超级启动子，因为在玉米中这种启动子显示在萌发期间的整个胚(盾片和胚轴)中强烈
表达、在再生期间的愈伤组织(包括胚性愈伤组织)中强烈表达。可以通过在超级启动子
与I-SceI基因之间添加赋予内含子介导增强作用(IME)的内含子来增强在这些组织中的
表达水平。
[0539] 1.7.4.1胚特异的启动子
[0540] 为了使正在发育的玉米谷粒的胚中的I-SceI表达最大化，产生了这样的载体，其包含其中I-SceI基因受超级启动子(一种已经被描述成驱动这些组织中高水平表达的启
动子)驱动的表达盒。
[0541] 载体pJB082是包含p-Super::I-SceI::t-Nos表达盒的基于pUC的载体，并且通过3重连接T4 DNA聚合酶补平的来自pLM266的HindIII-BglII超级启动子片段、T4 DNA
聚合酶补平的pJB010的Ascl-SbfI片段和T4DNA聚合酶补平的pCER039的Ascl片段产生。
最终如何装配JB084？
[0542] 双元载体pLM319包含p-Super::I-SceI::t-Nos盒，并且通过将T4 DNA聚合酶补平的pJB082的PacI-PmeI片段连接到T4 DNA聚合酶补平的AscI消化的pLM151中产生。
[0543] 在pUC载体骨架中通过将T4 DNA聚合酶补平的来自pLM303的BglII-AscI遍在蛋白内含子片段连接到T4 DNA聚合酶补平的SphI消化的pJB082产生了包含
p-Super::I-Ubi::I-SceI::t-Nos的表达盒，从而产生pJB083。双元载体pLM320通过将T4
DNA聚合酶补平的来自pJB083的PacI-PmeI p-Super::I-Ubi::I-SceI::t-Nos片段连接到
T4 DNA聚合酶补平的AscI消化的pLM151中产生。
[0544] 1.7.4.2报道基因事件的再转化
[0545] 每种报告构建体JB034和JB039的纯合事件进行胚拯救并用具有受超级启动子驱动的I-SceI基因的JB084再转化。据信这种启动子在正在萌发的胚和盾片层中产生较高
的表达，这可以改善重组植物的恢复。使用来自JB034纯合事件的胚，以RLM319和RLM320
进行相似的再转化设置。总计112个胚用RLM319转化并且100个胚用RLM320转化。
[0546] 1.7.4.3用于标记切除的植物分析
[0547] 含有具假标记基因的JB039的总计16个品系从采用JB084的再转化实验中恢复。对9个品系在五叶期染色并检验白色斑块。3个品系显示一半白色一半蓝色样式的叶。其
余显示完全蓝色的叶。来自6个品系的叶在授粉时染色并且均显示完全蓝色的叶，其中所
述的6个品系包括先前显示一半白色模式的一个品系。含有间断的GUS的基因JB034的总
计11个品系从采用JB084的再转化实验中恢复。全部品系均对重组进行染色，但均不显示
任何蓝色着染。
[0548] 含有间断的GUS基因的JB034的总计20个品系从采用LM319的2个再转化实验中恢复。含有间断的GUS基因的JB034的总计28个品系从采用LM320的2个再转化实验
中恢复。对这些再转化的植物筛选选择标记的存在并进行GUS染色以筛选重组。对9株
LM319和15株LM320植物进行GUS染色以筛选重组。没有同源重组阳性事件从使用具无内
含子的超级启动子的JB084或RLM319所产生的转化体中恢复。从利用带内含子的超级启
动子的RLM320的转化中鉴定到11个阳性事件，其中3个在组织培养中是完全蓝色的(表
15，图5和6)。用所述超级启动子构建体产生的再转化数据表明与内含子(即LM320中的
玉米遍在蛋白内含子)组合的超级启动子高效地驱动I-SceI基因的表达到有功能的水平。
无这种内含子时(LM319)，该超级启动子无效。
[0549] 表15.用于每个转化的构建体和证实的品系数。GUS染色显示使用与遍在蛋白内含子偶联的超级启动子发生重组，而使用无该内含子的超级启动时，没有获得重组。
[0550]第二 感染 证实的 重组事件/ 完全重组的
第一构建体
构建体 的胚 事件数 #事件 事件
JB039 JB084 12 3/9 0
JB034 JB084 11 0/11 0
JB034 LM319 112 7 0/9 0
第二 感染 证实的 重组事件/ 完全重组的
第一构建体
构建体 的胚 事件数 #事件 事件
JB034 LM320 100 12 11/15 3/15
[0551] JB034转基因植物用RLM320或JB084再转化，随后自交以结出种子。含有JB084的后代均不显示同源重组。对来自含有RLM320的总计15个T0事件的叶检验同源重组。借
助GUS组织化学分析和PCR，15个事件中的11个显示同源重组。11个事件中的3个是完全
重组的。11个事件中的5个在T1世代中进行检验。每个事件分析3至4株植物。总计12
个T1植物中的2株植物是完全重组的。
[0552] 2.使用微型玉米作为用于确定玉米中标记切除频率的高效工具
[0553] 为了减少获得无标记转基因植物的时间，可以使用一种迅速循环的矮化玉米品系。这种可转化的矮化品系提供胜过常规玉米品系的优势，原因在于它体型小和短生活周
期-它在约60日内完成从种子到种子的生活周期，相对于常规玉米品系的120日。该品系
在确定玉米中HEN的标记切除效率中极有用。
[0554] 转化实验主要基于采用实施例3中所述农杆菌介导转化法的方案实施。另一方面，转化实验也可以基于DNA直接递送方法如生物射弹转化法，例如本领域技术人员已知
的粒子轰击法实施。转化供体材料的制备也遵循上文所述的方法。
[0555] 附图简述
[0556] 图1.载体pCER 040b。包含驱动I-SceI表达的玉米遍在蛋白启动子/内含子盒的双元I-SceI表达载体。
[0557] 图2.载体pCER 041。包含驱动I-SceI表达的ScBV启动子的双元I-SceI表达载体。
[0558] 图3.载体pJB 034。包含GU-US报道基因盒的双元报道基因载体。
[0559] 图4.载体pJB 039。包含假标记切除盒的双元报道基因载体。
[0560] 图5.载体pLM 319。包含驱动I-SceI表达的超级启动子的双元I-SceI表达载体。
[0561] 图6.载体pLM 320。包含由联合Zm遍在蛋白内含子的超级启动子所驱动的I-SceI表达的双元I-SceI表达载体。
[0562] 图7.用于DSB诱导的同源重组的构建体的简图。(A)GU-US构建体编码其中GUSORF包含内部重复(即650bp的GUS编码序列：加阴影的条)的表达盒，具有位于重复区
(GU-US)之间的一个I-SceI识别位点。加阴影的短线)，带一个位于重复区(GU-US)之间的
I-SceI识别位点。(B)假标记切除载体包含在I-SceI位点侧翼分布的重复DNA序列(即，
选择标记盒的850bp AHAS终止子区域：灰色条)，旨在充当同源重组的靶序列(HR靶)。(C)
I-SceI构建体包含I-SceI表达盒。除了上述元件之外，全部这些载体的T-DNA区还包含选
择标记盒(SMS)。
[0563] 图8.使用瞬时测试法鉴定显示潜在DSB介导的HR的T0品系的选择过程。包含I-SceI(或GU-US)的中度至高度表达品系用GU-US(或I-SceI)构建体转染。选择到显示
GUS组织化学阳性表达(蓝色斑点)的品系。T0植物中的幼胚用于未成熟胚转换以鉴定纯
合品系，这与常规玉米育种时间表相比，加快至少1.5个月，因为省略了种子发育和成熟、
种子干燥时间。这种包括未成熟胚转换的瞬时测定方法不仅引起所需的总时间减少，还引
起鉴定候选品系的频率提高，其中所述的候选品系显出显示高比率同源重组的潜能。
[0564] 图9.用于鉴定转基因玉米品系中出现的DSB诱导的HR的方法。每种方法需要多种时间范围以获得显示DSB介导的HR的转基因品系：使用杂交(A)的常规方法需要最少
＊＊＊
19个月。再生(B)和再转化(C)方法需要大约8-9个月。 提示图8和10中描述的瞬
时测试法系统。
[0565] 图10.在玉米叶组织中对DSB诱导的同源重组进行瞬时测试法。(A)用包含功能性GUS ORF(左侧)或GU-US ORF(右侧)的表达盒的载体轰击野生型玉米叶组织，证实GU-US
的表达没有导致通过组织化学染色法检测到有功能的GUS。(B)用GU-US表达盒轰击来自
表达I-SceI的植物的叶组织，导致通过组织化学染色法产生可检测的GUS。该结果在使用
遍在蛋白启动子(左侧)和ScBV启动子(右侧)来驱动I-SceI表达的玉米植物中见到。
[0566] 图11.[JB034 X I-SceI]植物谷粒的组织化学分析。(A)对通过杂交携带GU-US表达盒的玉米品系与表达I-SceI的玉米品系产生的谷粒进行组织化学染色，显示产生有
功能的GUS。当分析来自表达I-SceI的纯合植物(在左侧平板底部右孔)的种子时，无GUS
染色。B)纯合GU-US谷粒的组织化学染色显示在I-SceI表达缺乏时，不产生有功能的GUS
蛋白。
[0567] 图12.[JB034 X I-SceI]植物(汇集样品)的基因组PCR。(A)制备来自[GU-USX I-SceI]植物的基因组DNA样品并汇集。相似的基因组DNA汇集物从自花授粉的GU-US
植物制备。如实施例中所述进行基因组PCR。使用纯化的pJB034载体的阳性对照反应产
生从原有构建体中预期的1.7Kb产物；该反应也产生显示重组基因座的1.0Kb产物，表明细
菌传代期间的低水平载体重组。在GU-US基因座处同源重组后，载体pCER044等同于载体
pJB034，并且产生预期的1.0Kb PCR产物。用来自野生型玉米植物的基因组DNA进行的PCR
扩增没有导致任何PCR产物产生，表明在这些反应中产生的PCR产物是对JB034基因座特
异的。分析基因组DNA汇集物表明用[JB034 X I-SceI]和纯合JB034汇集物产生了1.7Kb
的未重组产物，但是重组的1.0Kb产物仅在使用[JB034 X I-SceI]基因组DNA作为模板时
产生。(B)来自纯合JB034植物(左侧)和[JB034 X I-SceI]植物(右侧)的谷粒和叶样
品的组织化学染色，显示GUS基因座的同源重组仅在表达I-SceI的植物中可检测到。
[0568] 图13.[JB039 X I-SceI]植物(汇集样品)的基因组PCR。产生[JB034 XI-SceI](蓝色)和[JB034 C Null](红色)植物的基因组DNA汇集物。使用证实JB039模板存在
的引物9和10并用检测植物的引物9和11进行PCR，其中所述的植物包含在该基因座已经
发生同源重组的细胞(左侧)。用引物9和10的PCR从全部样品产生预期的1.2Kb产物，
表明全部基因组DNA汇集物包含天然JB039基因座(上部右侧)。用引物9和11的PCR
仅在基因组DNA汇集物A2和A4中产生0.9Kb产物，其中所述的A2和A4分别从[JB039 X
I-SceI]杂交(底部右侧)集成而来。
[0569] 图14.分别的[JB039 X I-SceI]植物的基因组PCR。使用如实施例中描述的引物组合9:10(上部)和9:11(底部)，通过PCR分析来自各[JB039 xI-SceI]植物的基因
组DNA。对照反应(无DNA、载体对照pJB039和野生型玉米基因组DNA)均从两种引物组中
产生预期产物。对基因组DNA汇集物A2的分析鉴定到包含重组的JB039基因座的两株分
别的植物，即植物8a和9b。分析形成基因组DNA汇集物A4的植物，表明仅植物17b包含
重组的基因座。标为15a和109的泳道代表来自不包括于前述基因组DNA汇集物当中的各
[JB039 X I-SceI]植物的基因组DNA样品。
[0570] 图15.合成的归巢核酸内切酶I-SceI基因序列的图示。Gateway附着区Att-L1和Att-L2由斜线框显示。Kozak共有序列由垂直箭头指示并且可读框由实心箭头指示。显
示了所选限制性位点的位置。
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