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转基因植物

阅读：906发布：2020-05-12

IPRDB可以提供转基因植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及表达硝酸盐转运蛋白基因的具有改善的生长和氮利用效率的转基因植物，制备所述植物的方法和用于改善生长和氮利用效率的方法。，下面是转基因植物专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于提高植物的生长、产量、氮利用效率、氮转运、氮胁迫耐受性、病原体抗性、存活和/或氮获取的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列、其功能变体或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1中定义，则所述植物不是水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节序列是指导所述核酸过量表达的组成型或强启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组成型或强启动子选自CaMV‐35S，CaMV‐35Sω，拟南芥泛素UBQ1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节序列是韧皮部特异性启动子。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述韧皮部特异性启动子包含含有SEQ ID No.5的核酸。

6.用于制备具有提高的生长、产量、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率的转基因植物的方法，所述方法包括：a)在植物或植物细胞中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列、其功能变体或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1中定义，则所述植物不是水稻。

7.根据权利要求1‐6中任一项所述的方法，其中所述植物是农作物植物或生物燃料植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述农作物植物选自玉米、小麦、烟草、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。

9.由权利要求6‐8中任一项定义的方法获得的植物或可由权利要求6‐8中任一项定义的方法获得的植物。

10.一种转基因植物，其表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列、其功能变体或同源物，如果所述核酸序列如SEQ ID No.1中定义，则所述植物不是水稻。

11.根据权利要求9或10所述的植物，其中所述调节序列是指导所述核酸过量表达的组成型或强启动子。

12.根据权利要求11所述的植物，其中所述组成型启动子或强启动子选自CaMV‐35S，CaMV‐35Sω，拟南芥泛素UBQ1。

13.根据权利要求9或10任一项所述的植物，其中所述调节序列是韧皮部特异性启动子。

14.根据权利要求13所述的植物，其中所述韧皮部特异性启动子包含含有SEQ ID No.5的核酸。

15.根据权利要求9‐14中任一项所述的植物，其中所述植物是农作物植物或生物燃料植物。

16.根据权利要求15所述的植物，其中所述农作物植物选自玉米、小麦、油菜、烟草、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。

17.用于调节pH稳态的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的含有SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体或同源物。

18.用于降低植物中的酸化作用的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的含有SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体或同源物。

19.用于改变植物中的硝酸盐转运和pH稳态的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的含有SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体或同源物，其中所述核酸包含在pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)中的突变。

20.包含pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)的与SEQ ID No.1具有同源性的核酸、其功能变体或同源物在植物中在调节pH在改变硝酸盐转运和pH稳态中的应用。

21.用于提高植物的生长、产量、氮利用效率、氮转运、病原体抗性、存活、氮胁迫耐受性和/或氮获取的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列、其功能变体或同源物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

22.用于制备具有提高的生长、产量、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率的转基因植物的方法，所述方法包括：a)在植物或植物细胞中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列、其功能变体或同源物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

23.根据权利要求21‐22中任一项所述的方法，其中所述调节序列是指导所述核酸过量表达的组成型或强启动子。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述组成型或强启动子选自CaMV‐35S，CaMV‐35Sω，拟南芥泛素UBQ1。

25.根据权利要求21‐22中任一项所述的方法，其中所述调节序列是韧皮部特异性启动子。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述韧皮部特异性启动子包含含有SEQ ID No.5的核酸。

27.根据权利要求21‐26中任一项所述的方法，其中所述植物是农作物植物或生物燃料植物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述农作物植物选自玉米、水稻、小麦、油菜、烟草、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述农作物植物不是水稻。

30.由权利要求21‐29中任一项定义的方法获得或可由所述方法获得的植物。

31.在植物中表达核酸构建体的转基因植物，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列、其功能变体或同源物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

32.根据权利要求30或31所述的植物，其中所述调节序列是指导所述核酸过量表达的组成型或强启动子。

33.根据权利要求32所述的植物，其中所述组成型启动子或强启动子选自CaMV‐35S，CaMV‐35Sω，拟南芥泛素UBQ1。

34.根据权利要求30‐31中任一项所述的植物，其中所述调节序列是韧皮部特异性启动子。

35.根据权利要求34所述的植物，其中所述韧皮部特异性启动子包含含有SEQ ID No.5的核酸。

36.根据权利要求31‐35中任一项所述的植物，其中所述植物是农作物植物或生物燃料植物。

37.根据权利要求36所述的植物，其中所述农作物植物选自玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。

38.根据权利要求37所述的植物，其中所述农作物植物不是水稻。

39.来源于权利要求9‐16或31‐38中任一项定义的植物的产物。

说明书全文

转基因植物

发明领域

[0001] 本发明涉及表达硝酸盐转运蛋白基因的具有改善的特性的转基因植物，例如，改善的生长和氮利用效率，制备所述植物的方法和用于改善生长和氮利用效率的方法。

[0002] 介绍

[0003] 在过去的五十年间，全球农作物生产率已经显著提高了，这主要是由于改良的农1,2
作物品种和大量化学肥料的输入，尤其是氮(N) 。然而，许多种农作物的肥料N利用效率
2‐4
仅约为30‐50％，大部分损失在环境中，这导致多种有害的影响，诸如空气和水质量的下
5,6
降和生物多样性的丧失。已经估算目前环境中过量的N每年花费欧盟€700亿‐€3200
7
亿元。在中国，在过去的30年间，已经通过由55kg谷物/kg施用的肥料N减少至20kg谷
3
物/kg施用的肥料N的N利用效率(NUE)的显著减少实现了谷物产量的增加。在亚洲，水稻提供人口超过70％的日常卡路里摄入，但是随着可用于农业的田地逐渐减少，仅能通过增加生产率来管理增加的需求。

[0004] 因此，鉴定控制植物NUE的关键步骤是特别重要的。NUE可以定义为土壤中每单位可用的N(包括土壤中存在的残留N和肥料)的谷物产量。由此，NUE可以分成两个过程：摄入效率(NupE；植物从土壤中去除作为硝酸盐和铵离子的N的能力)和利用效率(NutE；
利用N产生谷物产量的力)。该挑战对于谷物特别相关，原因在于其需要大量的N肥来获得最大的产量，并且估测其NUE远远低于50％(Hirel等)。

[0005] 氮(N)对农作物发育是重要的，原因在于其形成多种有机分子、核酸和蛋白的基本成分。N营养影响植物功能的所有水平，从代谢到资源分配、生长和发育。植物根获得N的最丰富的来源是天然有氧土壤中的硝酸盐(NO3‐)，其由于所施用的有机物和肥料N的加强硝化作用产生。相比之下，铵(NH4+)是灌水稻田土壤(flooded paddy soils)中可用的主要形式，其是由于无氧土壤条件形成的(Sasakawa和Yamamoto，1978)。

[0006] 因此，土壤无机氮(N)主要作为在有氧高地和充分排水土壤中的硝酸盐和作为排水差的土壤和灌水无氧稻田中的铵用于植物。在多种植物中，由根获取的硝酸盐在被同化之前被转运到茎干(Smirnoff和Stewart，1985)。相比之下，来源于硝酸盐还原或直接来源于铵摄入的铵优先在根中被同化，然后以有机形式转运到茎干(Xu等，2012)。为了应付土壤中变化的硝酸盐浓度，植物根已经发育了至少三个硝酸盐摄入系统、两个高亲和力转运系统(HATS)和一个低‐64亲和力转运系统(LATS)，负责获取硝酸盐(Crawford和Glass，1998)。组成型HATS(cHATS)和硝酸盐诱导性HATS(iHATS)运作在饱和在0.2‐0.5mM范围内的外部介质中低硝酸盐浓度时摄入硝酸盐。相比之下，LATS起作用在较高的外部硝酸盐
68浓度进行硝酸盐获取。经由LATS和HATS的摄入分别由属于NRT1和NRT2家族的硝酸盐转运蛋白介导(Forde，2000；Miller等，2007)。根部摄入通过联系表达和硝酸盐摄入活性与植物的N状态的负反馈进行调节(Miller等，2007)。几种不同的N代谢物(包括谷氨酰胺)已经被提议为N状态的细胞感受器(Fan等，2006；Miller等，2008)，并且一个膜型具有根液泡硝酸盐作为反馈信号，由于这些储池(pools)随着植物N状态而增加。

[0007] 尽管高等植物具有利用有机N的能力，但是认为NO3‐和NH4是根获取N的主要来源。植物在其对这两种来源的N的相对适应性上十分不同。尽管NH4应该是优选的N源，‐由于其代谢比NO3 代谢需要更少的能量，当提供NH4作为唯一的N源时，仅有少数物种实际上表现良好。后者中有北方针叶树(boreal conifers)、杜鹃科(ericaceous)物种、一些蔬菜类农作物和水稻(Oryza sativa L.)。与这些物种相比，大部分农业物种有时表现出对‐
NH4的严重毒性症状，由此，在这些物种中观察到在NO3 上的良好生长。然而，当同时提供‐
两种N源时，与在单独的NH4或NO3 上生长相比，生长和产量通常都显著提高(Kronzucker等，1999)。

[0008] 因此，供养了几乎50％的世界人口的主要农作物水稻与其他农作物植物不同，在于其能够专门在作为唯一N源的NH4上生长。水稻传统上在灌水无氧土壤条件下培育，其中铵是主要的N源。然而，水稻根部专门的通气组织细胞可以从茎干到根转运氧并将其释8
放到根围(rhizosphere)，在此处可以发生细菌将铵转化为硝酸盐(硝化作用)。水浸稻根围中的硝化作用可以导致25‐40％的总农作物N以硝酸盐的形式被摄入，主要通过高亲
9 +
和力转运系统(HATS)摄入。硝酸盐的摄入通过共转运质子(H)而介导，所述质子可以由+ 10
质膜H‐ATP酶从细胞中排出。水稻中硝酸盐摄入和易位(translocation)的分子机制还未得到充分理解。由于估测稻田根围中的硝酸盐浓度低于10μΜ(Kirk和Kronzucker，
2005)，NRT2家族成员在水稻硝酸盐摄入中起主要作用(Araki和Hasegawa，2006；Yan等，
2011)。另外，水稻根具有丰富的用于将氧转运到根围的通气组织，导致根表面上的细菌的铵硝化作用(Kirk，2003；Li等，2008)。因此，在湿地条件下生长的水稻根摄入的总N的多至40％可能是以硝酸盐的形式存在，并且摄入率可能比得上铵的摄入率(Kronzucker等，
2000；Kirk和Kronzucker，2005)。

[0009] 电生理和分子研究都已经表明通过HATS和LATS二者的硝酸盐摄入是由质子/硝酸盐共转运蛋白介导的主动过程(Zhou等，2000；Miller等，2007)。在拟南芥(Arabidopsis)基因组中，存在至少53个和7个分别属于NRT1和NRT2家族的成员(Miller等，2007；Tsay等，2007)。一些拟南芥NRT1和NRT2家族成员已经表征了其在硝酸盐摄入和长距离转运中的功能。AtNRT1.1(CHL1)描述为起多种作用的转受体(transceptor)，其作为双重亲和力硝酸盐转运蛋白和外部硝酸盐供应浓度的感受器(Liu和Tsay，2003；
Ho等，2009；Gojon等，2011)，以及低硝酸盐浓度的生长素转运的感受器(Krouk等，2010)。
相比之下，AtNRT1.2(NTL1)是组成型表达的低亲和力硝酸盐转运蛋白(Huang等，1999)。
AtNRT1.4是叶柄表达的硝酸盐转运蛋白，并且在调节叶片硝酸盐稳态和叶片发育中起重要作用(Chiu等，2004)。AtNRT1.5在邻近木质部的根中柱鞘细胞中表达，并且负责将硝酸盐运载到木质部中用于根‐到‐茎干的硝酸盐转运(Lin等，2008)。AtNRT1.6仅在生殖组织中表达，并且参与将来自母体组织的硝酸盐递送到早期发育的胚(Almagro等，2008)。
AtNRT1.7在韧皮部运载硝酸盐过程中起作用，以允许从老叶中运出并且运到嫩叶中，这表明硝酸盐的从源‐到‐汇的再动员(source‐to‐sink remobilization)是由韧皮部介导的(Fan等，2009)。AtNRT1.8主要在维管系统中的木质部薄壁组织细胞中表达，并且在从木质部汁液中取回硝酸盐中起作用(Li等，2010)。AtNRT1.9促使硝酸盐运载到根韧皮部中，增强在根中的向下转运，并且其敲除增加硝酸盐根到茎干木质部的转运(Wang和Tsay，
2011)。

[0010] 在拟南芥的7个NRT2家族成员中，AtNRT2.1与AtNRT2.2二者都已经被表征为iHATS的贡献者(Filleur等，2001)。另外，在拟南芥中，NRT2.1的转运活性需要第二辅助蛋白NAR2.1(或NRT3.1)(Okamoto等，2006；Orsel等，2006；Yong等，2010)。与敲除其配偶体AtNRT2.1(atnrt2.1突变体)相比，敲除AtNAR2.1(atnar2.1突变体)在低硝酸盐浓度的硝酸盐摄入和生长两方面都具有更严重的影响，这表明AtNAR2.1的其他功能(Orsel等，2006)。有趣的是，AtNRT2.7特异性表达在生殖器官的液泡膜中，并且控制种子中的硝酸盐含量(Chopin等，2007)。近来，已经发现AtNRT2.4是在侧根表皮中和在茎干韧皮部中或邻近茎干韧皮部表达的一种高亲和力质膜硝酸盐转运蛋白(Kiba等，2012)。AtNRT2.4参与根‐ ‐
在非常低的外部浓度对NO3 的摄入和茎干将NO3 运载到韧皮部中，并且在N饥饿下是重要的(Kiba等，2012)。

[0011] 在水稻基因组中，已经鉴定了五个NRT2基因(Araki和Hasegawa，2006；Cai等，2008；Feng等，2011)。OsNRT2.1和OsNRT2.2共有相同的编码区序列，具有不同的5'‐和
3'‐不转录区(UTRs)，并且与其他单子叶植物的NRT2基因具有高相似性，而OsNRT2.3和OsNRT2.4与拟南芥NRT2基因更密切相关。OsNRT2.3mRNA实际上剪接成两个基因产物，即OsNRT2.3a(AK109776)和OsNRT2.3b(AK072215)，它们推定的氨基酸序列具有94.2％的相似性(Feng等，2011，Yan等，2011)。OsNRT2.3a主要在根中表达，并且这种模式通过硝酸盐供应而增强，而OsNRT2.3b在根中弱表达，在茎干中相对丰富，N形式和浓度对转录物的量没有影响(Feng等，2011，Feng 2012)。

[0012] CN101392257显示在水稻和非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞中的OsNRT2.3a和b的表达分析，并且提到OsNRT2.3基因在植物中的过量表达。CN101392257没有公开OsNRT2.3a和OsNRT2.3b在水稻中的分开表达，其也没有显示在除N源利用显著不同的水稻之外的植物中的表达OsNRT2.3b能够具有有益的作用。

[0013] 有需要提供更加营养有效的农作物植物基因型，以确保用于全球食品安全的可维持的农作物生产，并减少矿物肥料输入的成本和消极的环境影响，诸如空气和水质量和生物多样性的丧失。本发明目的在于解决这一需求。

[0014] 发明概述

[0015] 水稻转运蛋白OsNRT2.3具有两种剪接形式。一些硝酸盐转运蛋白需要两种基因行使功能；第二小得多的成分(OsNAR21)是转运蛋白正确靶向质膜所需要的。这两种剪接形式中的一种，OsNRT2.3a，需要该第二成分行使功能，而另一种形式，OsNRT2.3b，不需要。我们已经首次证明了非洲爪蟾属卵母细胞中两种硝酸盐转运蛋白的表达表明只有OsNRT2.3b在蛋白的细胞质面上具有pH‐敏感性调节位点。该pH感应位点通过在pH感应基序中的组氨酸氨基酸残基的定向诱变(H167R)而得以证实。在水稻中，OsNRT2.3b更加特异性地位于维管组织中，特别是韧皮部中。因此，我们提议该蛋白特异性参与植物内的长距离转运，并且韧皮部在整个植物的pH调节中是重要的。

[0016] 我们已经使用强的非特异性组成型启动子(35S和泛素)在几种不同的中国水稻栽培种(cultivar)中单独地过量表达了OsNRT2.3a/b基因和OsNRT2.3b的H167R突变形式。我们已经表明，只有过量表达OsNRT2.3b的植物表现出许多改善的生长和氮利用效率，由于在这些过量表达OsNRT2.3b的植物中硝酸盐和铵摄入都得到了增加，因此，该表型是令人惊讶的。相对于对照或过量表达OsNRT2.3a的植物，过量表达OsNRT2.3b的植物表现出较少的光呼吸作用，并且通常具有更好的pH调节(铁和磷酸盐含量)。通过联系植物的pH状态与硝酸盐供应，OsNRT2.3b的pH感应基序对于水稻中这些作用是重要的。

[0017] 我们还令人惊讶地表明，当在不同于水稻的植物中转基因表达时，尽管这些植物，如拟南芥、小麦和烟草，在其氮源利用方面根本不同，OsNRT2.3b是有功能的。

[0018] 从下述公开内容可以看出，本发明具有几个方面。在一些方面中，本发明涉及方法、应用和植物，其中具体放弃(disclaimed)水稻。在其他方面中，本发明涉及方法、应用和植物，其中OsNRT2.3b核酸的表达由韧皮部特异性启动子调节。在其他方面中，本发明涉及方法、应用和植物，其不转基因表达包含SEQ ID No.2的核酸序列或其功能变体。

[0019] 因此，在第一方面，本发明涉及用于提高生长、产量、氮转运、NUE、氮获取、减少光呼吸作用、增加细胞内CO2水平、增加光合效率、病原体抗性、存活和维持/改善pH稳态中的一种或多种的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物。

[0020] 在第二方面，本发明涉及用于提高植物的生长、产量、氮利用效率、氮转运、氮胁迫耐受性、病原体抗性、存活和/或氮获取中的一种或多种的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作连接的SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物定义，则所述植物不是水稻。

[0021] 在第三方面，本发明涉及表达引入到植物中的核酸构建体的转基因植物，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1中定义，则所述植物不是水稻。

[0022] 在另一方面，本发明涉及用于调节pH稳态的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物。

[0023] 在另一方面，本发明涉及用于减少植物中的酸化作用的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物。

[0024] 在另一方面，本发明涉及用于改变植物中硝酸盐转运和pH稳态的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述核酸包含在pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)中的突变。

[0025] 在另一方面，本发明涉及含有pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)的包含SEQ ID No.1的核酸、或其功能变体、部分或同源物在调节植物中的pH、改变硝酸盐转运和pH稳态中的应用。

[0026] 在另一方面，本发明涉及用于提高植物的生长、产量、氮利用效率、氮转运、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮获取中的一种或多种的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0027] 在另一方面，本发明涉及用于制备具有提高的生长、产量、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率的转基因植物的方法，所述方法包括：

[0028] a)在植物或植物细胞中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0029] 在另一方面，本发明涉及在植物中表达核酸构建体的转基因植物，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达核酸序列SEQ ID No.2。

[0030] 在另一方面，本发明涉及表达核酸构建体的转基因植物和相关的方法，所述核酸构建体包含与韧皮部特异性启动子可操作的连接的SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物。

[0031] 在下述非限制性附图中进一步描述本发明。

[0032] 附图

[0033] 图1.OsNRT2.3a和OsNRT2.3b过量表达植株的日本晴(Nipponbare)表型。

[0034] (a)在水稻土中的T2水稻植株在营养体期(60天)。(b)在繁殖期(120天)。(c)使用特异性引物的RT‐PCR。(d)用单抗体进行的蛋白质印迹以鉴定蛋白表达。(e)在野生型和b‐S6中原位杂交中的RNA，具有阴性探针对照，p：韧皮部，x：木质部；e：表皮细胞；m：叶肉细胞。横截面是(a)中植物距离第一片叶片的末梢5‐6cm的叶片切片。刻度条＝
10μm。

[0035] 图2.T2OsNRT2.3b过量表达株系的田间实验。

[0036] (a)在浙江大学常兴实验站，OsNRT2.3b过量表达株系b‐U1、b‐U2、b‐S2和b‐S6在不同的N肥施用率的生长(2010年5月‐10月，图片拍摄于2010年9月16日)。N施用在每种图片的左侧角用在田地中间给出的中文标记显示。(b)"a"条件的植物谷物产量。(c)"a"条件的NUE。(d)大规模实验，每种类型1280棵秧苗转移到水稻土中。(e)"d"条件的谷物产量。(f)"d"条件的NUE。NUE：氮利用效率＝g‐谷物产量/g‐施用的肥料N。数值是平均数±S.E(n＝3)。*是高于通过ANOVA估算的表示在以相同的N肥施用率的转基因株系与WT之间的显著水平(*p<0.05)的条。

[0037] 图3.在2.5mM NO3‐或NH4+条件，OsNRT2.3b过量表达对根 15NO3‐和15NH4+流入、木‐ + 15质部NO3 和NH4、木质部pH、韧皮部pH酸化的作用。(a)在硝酸盐或铵条件下的 N流入速‐ +
率。(b)24小时在硝酸盐或铵条件下的木质部NO3 和NH4。(c)在硝酸盐或铵条件下的木质
16
部树液pH。(d)在硝酸盐或铵条件下的韧皮部pH酸化，韧皮部树液通过EDTA‐Na2 收集。
(e)在硝酸盐或铵条件下的韧皮部pH酸化，韧皮部树液由昆虫收集。数值为平均数±S.E(n＝5)。*是高于通过ANOVA估算的表示在以相同的处理的转基因株系与WT之间的显著水平(*p<0.05)的条。在a‐d中条从左至右为：WT，b‐U1，b‐U2，b‐S2，b‐S6。

[0038] 图4.OsNRT2.3b过量表达在pH 4和6对不同形式的N流入的作用。条从左至右为：WT，b‐U1，b‐U2，b‐S2，b‐S6。

[0039] (a)在NH415NO3供应下的15N流入。(b)在15NH4NO3供应下的15N流入。(c)在15NH415NO315
供应下的 N流入。数值为平均数±S.E(n＝5)。a，b，c字母是高于通过ANOVA估算的表示在以相同的处理的转基因株系与WT之间的显著水平(p<0.05)的条。

[0040] 图5.在爪蟾卵母细胞中对OsNRT2.3b的功能分析。

[0041] (a)来自用1mM硝酸盐处理(阴影条)和pH 8.0盐水(灰色条)洗涤的OsNRT2.3b注射的卵母细胞的细胞质pH双筒pH电极的记录。(b)表达OsNRT2.3b的H167R突变体的卵母细胞对1mM硝酸盐(阴影条)的膜电势。(c)注射了水、OsNRT2.3b mRNAs及其H167R15
突变体的卵母细胞的 N‐硝酸盐摄入。(d)注射了水和OsNRT2.3b mRNAs的卵母细胞在不
15
同外部pH下过夜的 N‐硝酸盐摄入。数值为平均数±S.E(n＝15)。细胞在温育实验后通过电生理检测是存活的。*是高于通过ANOVA估测的表示显著水平(*p<0.05)的条。

[0042] 图6.与野生型(wt)比较，过量表达OsNRT2.3b的三株拟南芥株系的植物鲜重(A)和根长度(B)组织硝酸盐累积(C)数据。对根/茎干(shoot)，(C)中条从左至右为：23b.1，23b.2，23b.3，WT。

[0043] 图7.过量表达OsNRT2.3b的烟草植物和WT植物的比较：表型分析。在装满沙的盆中T1OsNRT2.3b过量表达株系的生长差异。WT：烟草(Nicotiana tabacum)栽培种89，T1代在补充10mM硝酸盐的完全Hoagland营养液中生长2个月。

[0044] 图8.过量表达OsNRT2.3b的烟草植物和WT植物的比较：表达分析。A)OsNRT2.3b过量表达株系的Southern印迹，Kpn I、HindIII消化的T1代烟草DNA和Hyb探针用于杂交。Ld：标记，P：阳性对照，b‐20是阴性对照。B)OsNRT2.3b过量表达株系的RT‐PCR，T1代cDNA和OsNRT2.3b特异性引物用于PCR。

[0045] 图9.在装满沙的盆中生长的过量表达OsNRT2.3b的烟草株系的生物量和NUE。WT：烟草栽培种89，T1代在补充10mM硝酸盐的完全Hoagland营养液中生长2个月。NUE＝生物量/总N施用。

[0046] 图10.OsNRT2.3a/b(SEQ ID No.2和1，肽OsNRT2.3a/b为SEQ ID No.3和4)的基因结构。OsNRT2.3基因组DNA序列的分析预测OsNRT2.3b的内含子位于距离翻译起始的ATG的+190bp至+280bp。对于OsNRT2.3a，5'‐UTR是42bp，3'‐UTR是249bp，对于OsNRT2.3b，5'‐UTR是223bp，3'‐UTR是316bp。F意指OsNRT2.3b的特异性正向引物，R是OsNRT2.3b的反向引物(reward primer)。

[0047] 图11.在海南日本晴(Nipponbare)栽培种背景下的T2OsNRT2.3b过量表达植物。a：T2日本晴转基因植物生长在海南省南京农业大学的乐东实验站(2009年12月‐2010年4月)。在施肥前的土壤营养状态为总氮(N)1.0±0.2mg/g，总磷(P)0.4±0.1mg/g，总钾(K)39.5±2.3mg/g，0.5mM NaHCO3可萃取的P(Olsen P)23.1±4.1mg/kg，土壤pH
4.4±0.5(取样数为6)。该图片的日期是2010年2月28日，并且植物从萌发开始在75kg N/ha N条件下生长75天。b:植物圆锥花序；c:花序长度；d，e:一级和二级花序的数目；
f:谷物产量。数值为平均数±S.E(n＝10)，*表示用单向ANOVA分析在WT与过量表达植物之间在5％水平的差异显著性。条从左至右为：WT，a‐U1，a‐U2，b‐U1，b‐U2，b‐S2，b‐S6。

[0048] 图12.在WYJ7栽培种背景下的OsNRT2.3b过量表达株系的表型。a:2010年在南京进行的盆实验。与野生型(WT:WYJ7)相比较，396‐2，369‐1，366‐1和342‐1的T1株系过量表达OsNRT2.3b。种子在5月20日萌发，并且在收获之前在10月20日拍摄照片；b:T1秧苗的Southern印迹。然后，将396‐2，369‐1，366‐1和342‐1株系重命名为396，369，366和342，用于T2田间实验；c:用于引物进行的RT‐PCR，对该PCR设置26个循环。d:在浙江大学实验站使用110和220kg N/ha两个施用水平的T2田间实验(2011年5月‐2011年10月)。种子在2011年5月5日进行萌发，然后在6月5日将100棵秧苗移到水稻土中，
5排*20棵植物，随机排列。如图2所示施肥。在收获前在10月10日拍照。施肥前的土壤营养状态为：总氮(N)1.68±0.21mg/g，总磷(P)0.48±0.18mg/g，总钾(K)46.47±2.85mg/g，0.5mM NaHCO3‐可萃取的P 38±2.1mg/kg，土壤pH 6.43±0.28(n＝6)；e和f:谷物产量和NUE。数值为平均数±S.E(n＝3)，*表示用单向ANOVA分析在WT与过量表达植物之间在5％水平的差异显著性。条从左至右为：WYT，396，369，366，342。

[0049] 图13.在YF47栽培种背景下OsNRT2.3b过量表达的作用。a:YF47(野生型)和过量表达NRT2.3b的转基因植物(YF/NRT2.3b(O))在浙江大学海南实验站田间追踪的植物生长表现(2011年12月‐2012年4月)。种子在12月10日进行萌发，在收获前15天，即4月1日拍照；b:YF47(野生型)和转基因植物中NRT2.3b转录物水平的RT‐PCR分析。c:转基因植物的Southern印迹分析；d:YF47和转基因植物的每株植物的谷物产量。
数值是平均数±S.E(n＝50)。施肥前的土壤营养状态为：总氮(N)1.5±0.2mg/g，总磷(P)0.3±0.1mg/g，总钾(K)3.5±0.3mg/g，0.5mM NaHCO3‐可萃取的P 24.1±4.7mg/kg，土壤pH 6.45±0.47(n＝9)。从左至右：WYJ，296，269，266，342。

[0050] 图14.在日本晴栽培种背景下OsNRT2.3b过量表达株系的T5表型。a:T5日本晴转基因植物b‐S2和b‐S6在海南省南京农业大学乐东实验站生长(2011年12月‐2012年4月)，300粒种子在12月10日进行萌发。在1月5日将200棵秧苗移到水稻田中。在收获前在4月13日拍照。实验田尺寸为20m x 25m，在移水稻秧苗前对稻田施加60kg P/ha和110kg K/ha肥料。对该稻田使用两种N肥水平110和220kg N/ha。第一次N肥在12月28日移植前作为总N处理的20％施用。作为总量的40％的第二次施用在1月12日进行。最后的施用在1月20日进行。b:谷物产量。

[0051] 图15.日本晴(♀)×b‐S6T5(♂)的F2代表型。

[0052] 图16.在盆实验生长末期，OsNRT2.3b过量表达植物与WT之间的表型差异。该盆实验如表1所述进行，并且在移植后76天(a)；84天(b)；88天(c)；98天(d)；120天(e)和140天(f)记录生长。分别在120和140天测量WT、b‐S2和b‐S6的谷物产量(g)、总N(h)和NUtE＝谷物重量/总N(i)。数值是平均数±S.E(n＝10)，*表示用单向ANOVA分析在WT与过量表达植物之间在5％水平上的差异显著性。仅对WT和b‐S6拍照，原因在于这两种植物与所有三种植物相比在图片上容易区分。因此，黑布用作背景，并且分离WT和b‐S6与b‐S2，其在盆中布的后面。

[0053] 图17.从稻褐飞虱(Brown Plant Hopper)(Nilapavata lugens)取样韧皮部树液的方法。水稻秧苗水培法在1.25mM NH4NO3中生长8周，然后转移进行N处理(N:2.5mM ‐ ‐NO3 ；A:2.5mM NH4 )。每棵植物放置在具有IRRI营养液的250ml烧瓶中，六棵植物保持在昆虫笼中，在26℃，16小时光照期间。在N处理开始时，将七至十只稻褐飞虱成虫转移到每棵植物上。在N处理24小时、48小时收集由该昆虫分泌的水稻韧皮部蜜汁。韧皮部树液
22
pH用pH选择性微电极进行测量；a:硝酸盐条件下的韧皮部pH；b:铵条件下的韧皮部pH。
数值是平均数±S.E(n＝10)，*表示用单向ANOVA分析在WT与b‐S6之间在5％水平的差异显著性。

[0054] 图18.72小时N处理后OsNRT2.3b过量表达株系b‐S6和WT中根部质外体pH。水稻秧苗在含有1.25mM NH4NO3的完全营养液中生长4周，然后转移进行N处理(N:2.5mM ‐ +
NO3 ；A:2.5mM NH4)72小时。a:水稻根的质外体pH。72小时N处理后，在放置到琼脂上之
17
前，通过在0.2mM CaSO4中浸没一分钟而清洗植物根部。将完整的植物放置在琼脂(0.9g/
17
l，含有pH指示剂(0.03g/L溴甲酚紫 ))上。在11:00‐11:30am，初始pH为5.2‐5.3，根
3
保持在暗处，用湿纸组织覆盖，并且放置在0.5x12x12cmPlexiglas平板下，在与pH指示剂琼脂接触2‐4小时后拍照；b:在移出根后显示质外体pH的琼脂模式；c:在N处理过程中水培生长培养基的长期pH变化。

[0055] 图19.在1.25mM NH4NO3水培培养基中生长的过量表达OsNRT2.3b的T2日本晴水稻中的总叶P和Fe。总P和Fe通过ICP分析测量。将0.05g干燥粉碎的植物材料粉末用5ml 98％H2SO4和3ml 30％过氧化氢消化。冷却后，将消化的样品用蒸馏水稀释至100ml。
使用ICP‐OES(Perkin Elmer Optima 2000DV)测量溶液中的离子浓度。数值为平均数±S.E(n＝4)，*表示用单向ANOVA分析在WT与过量表达植物之间在5％水平的差异显著性。对于P和Fe，条从左至右为：WT，b‐U1，b‐U2，b‐S2，b‐S6。

[0056] 图20.与WT相比，在过量表达OsNRT2.3b的植物中的总光合作用、细胞内CO2浓度41
和光呼吸作用。如之前所述，使用Li‐Cor 6400红外气体分析仪测量净光合作用、细胞内CO2浓度和光呼吸作用。a:总光合作用通过净光合作用乘以测量的叶片面积而计算；b:
22
细胞内CO2浓度；c:按照Kebeish等，2007 的补充图4，在关灯后100‐200秒的稳定记录阶段的CO2PIB记录过程中达到净暗呼吸(Rn)。数值为平均数±S.E(n＝4)，*表示用单向ANOVA分析在WT与过量表达植物之间在5％水平的差异显著性。

[0057] 图21.OsNRT2.3b H167R突变体在日本晴中的过量表达。a:在盆实验中的过量表达OsNRT2.3b H167R突变体的株系OvH1、OvH2和WT的F1代植物(2012年5月‐2012年9月)，所有的种植系统与表1相同。照片拍摄于9月10日；b:谷物重量。数值为平均数±S.E(n＝60)；c:用与OsNRT2.3b相同的引物的RT‐PCR，其覆盖了突变位点；d:southern印迹。

[0058] 图22.注射了水或OsNRT2.3b mRNA的卵母细胞的15N‐NH4+摄入。在ND96溶液中15 15
加入0.5mM N‐NH4Cl(原子％ N 98％)，并将卵母细胞温育过夜(16小时)。数值是平均数±S.E(n＝15)。

[0059] 图23.图2a和图2d所示的实验的田间设计。T2田间实验在浙江大学的常兴实验站进行。对于图2a，将植物移到具有四个N施用水平的右侧区域：没有氮，75kg N/ha，150kg N/ha和300kg N/ha；对于图2d，将植物移到具有75kg N/ha供应的左侧区域。每个实验区域的尺寸为20m x 30m，并且在转移水稻秧苗之前向稻田施用60kg P/ha和110kg K/ha肥料；b:在每个区域中的N处理；c:图2a中植物的排列，与d具有相同的行和植物间距；d:图2d中的植物排列。所有的田间实验都是用随机排列的三次重复进行。

[0060] 图24.显示具有在OsNRT2.3b中鉴定的pH‐感应基序的推定的NRT2硝酸盐转运蛋白的表。

[0061] *关于OsNRT2.3直向同源物的最佳候选物

[0062] 用于检索的数据库：来自phytozome 9的Blast序列检索http://www.phytozome.net/

[0063] 小麦数据库：

[0064] http：//www.cerealsdb.uk.net/CerealsDB/Documents/DOC_search_reads.php[0065] 大麦数据库：http：//webblast.ipk-gatersleben.de/barley/

[0066] 使用下述鉴定的膜蛋白阴离子交换基序(含有pH感应器)：

[0067] http：//www.bioinf.manchester.ac.uk/cgi-

[0068] bin/dbbrowser/fingerPRiNTScan/FPScan fam.cgi

[0069] 图25.过量表达OsNRT2.3b将提高韧皮部pH平衡。WT，野生型水稻植物；b‐S6，OsNRT2.3b过量表达株系；H167R，OsNRT2.3b H167R过量表达株系。韧皮部pH通过pH选择性电极测量。韧皮部树液通过稻褐飞虱(Nilapavata lugens)方法收集。水稻秧苗水培法在1.25mM NH4NO3中生长8周，然后转移进行N处理(N:2.5mM NO3‐；A:2.5mM NH4+)。每棵植物放置在具有IRRI营养液的250ml烧瓶中，六棵植物保持在昆虫笼中，在26℃，16小时光照期间。在N处理开始时，将七至十只稻褐飞虱成虫转移到每棵植物上。在N处理开始后24小时收集由该昆虫分泌的水稻韧皮部蜜汁。结果表明在不同N处理下WT和H167R株系的韧皮部pH是相同的模式，而b‐S6在硝酸盐处理下更接近7，在两种N条件下更接近中性。

[0070] 图26.转基因植物的存活数据。

[0071] 图27.小麦OsNRT2.3b转基因株系的生物量。

[0072] 图28.在低和高N施用时小麦OsNRT2.3b转基因株系的生长。

[0073] 详述

[0074] 现在将进一步描述本发明。在下述段落中，更详细地定义本发明的不同方面。这样定义的每个方面可以与任意一个或多个其他方面组合，除非明确相反指示。具体地，显示为优选的或有利的任何特征可以与任意一种或多种显示为优选或有利的其他特征组合。

[0075] 除非另外指明，本发明的实施将使用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学的常规技术和重组DNA技术、生物信息学，这些在本领域的技术内。所述技术在参考文献中充分解释。

[0076] 用于本文时，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链的或双链的。所述核酸或多核苷酸包括，但不限于，结构基因的编码序列，反义序列，和不编码mRNAs或蛋白产物的非编码调节序列。这些术语还包括基因。术语“基因”或“基因序列”广泛用来指与生物功能相关的DNA核酸。由此，基因可以如基因组序列一样包含内含子和外显子，或者可以如cDNAs一样仅包含编码序列，和/或可以包含与调节序列组合的cDNAs。

[0077] 术语“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的任意长度的多聚体形式的氨基酸。

[0078] 为了本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组的”意指，例如，关于核酸序列，表达盒，包含所述核酸序列的基因构建体或载体或转化了本发明所述的核酸序列、表达盒或载体的生物体，所有这些构建都是通过重组方法实现，其中

[0079] (a)编码用于本发明的方法的蛋白的核酸序列，或

[0080] (b)与本发明所述的核酸序列可操作的连接的基因控制序列，例如，启动子，或[0081] (c)a)和b)不是位于其天然遗传环境中，或者已经通过重组方法修饰，例如，采取一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒置或插入的形式进行修饰是可行的。天然遗传环境理解为意指原始植物中的天然基因组或染色体基因座或在基因组文库中的存在。在基因组文库的情形中，优选地至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。所述环境至少在一侧侧翼连接核酸序列，并且具有至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、更优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒‐‐‐‐例如，核酸序列的天然启动子与相应的编码用于本发明的方法的多肽的核酸序列的天然存在的组合，如上文定义‐‐‐‐当该表达盒通过非天然的、合成(“人工”)方法(诸如例如，诱变处理)进行修饰时，变成转基因表达盒。例如，适当的方法记述在US 5,565,350或WO 00/15815中，二者通过引用结合于此。

[0082] 由此，用于本发明目的的转基因植物理解为意指，如上述，用于本发明的方法的核酸不位于其在所述植物基因组中的天然基因座上，所述核酸可能是同源或异源表达。然而，如提及的，转基因还意指，尽管本发明不同实施方案所述的核酸位于其在植物基因组中的天然位置上，但是所述序列相对于天然序列已经进行了修饰，和/或天然序列的调节序列已被修饰。转基因优选地理解为意指本发明所述的核酸在基因组中的非天然基因座的表达，即，发生所述核酸的同源性表达，或优选异源性表达。

[0083] 本发明的方面涉及重组DNA技术，并且排除仅是基于通过传统培育方法产生植物的实施方案。

[0084] 按照本发明的方面表达的OsNRT2.3b肽显示在SEQ ID No.3中。按照本发明的方面，核酸序列SEQ ID No.1(OsNRT2.3b)编码多肽SEQ ID No.3(OsNRT2.3b)。核酸序列SEQ ID No.2(OsNRT2.3a)编码多肽SEQ ID No.4(OsNRT2.3a)。构建体包含SEQ ID No.67，其对应于本发明的所有实施方案和方面所述的登记号为AK072215的OsNRT2.3b。当提及编码OsNRT2.3a的核酸时，这也涉及本发明的所有实施方案和方面所述的SEQ ID No.68所示的登记号为AK0109776的OsNRT2.3a。

[0085] 本发明人已经在大量的田间实验中证明了在不同水稻栽培种中过量表达OsNRT2.3b增加谷物产量多至40％，并且改善在低和高N输入下的NUE。在过量表达OsNRT2.3b的水稻中，光呼吸基因表达减少，这表明改善的光合效率是提高的产量表型的组成部分。有趣的是，与野生型(WT)相比，在转录和蛋白水平上证实的(图1c，d)OsNRT2.3b过量表达株系表现出更多的生长(图1a，b，图11)。过量表达株系的生物量和花序尺寸大于WT(图11，表2‐3)。一级和二级花序尺寸增加，由此每个花序上种子总数大于WT(图
11，表2)。相比之下，即使在转化的株系中OsNRT2.3a mRNA和蛋白增加，但是，OsNRT2.3a过量表达植物没有显示出与WT的明显区别(图1c，d，图11)。

[0086] 过量表达OsNRT2.3b还改善pH稳态，这导致增加的总N摄入、茎干P和Fe积累。这些结果证明将N摄入与pH稳态和光合作用联系在一起是改善NUE和产量的主要考虑。

[0087] 因此，本发明人已经证明了，当在植物中表达时，是OsNRT2.3b而不是OsNRT2.3a可以用来改善生长、产量和氮利用效率和其他特征。因此，在一些方面中，本发明涉及表达包含SEQ ID No.1(OsNRT2.3b)定义的核酸、其功能变体、部分或同源物的核酸序列的转基因植物，但是其中所述植物不表达包含SEQ ID No.2(OsNRT2.3a)定义的核酸的核酸序列，并且涉及相关的方法和应用。具体地，本发明因此涉及用于增加生长、产量、氮转运、病原体抗性、NUE和/或氮获取的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1(OsNRT2.3b)定义的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不表达包含SEQ ID No.2(OsNRT2.3a)的核酸序列。

[0088] 本发明具有另一个方面。如上文提及，水稻在其氮代谢方面不同于所有其他的主要农作物。令人惊讶地，本发明人已经表明表达来自水稻(与所有其他主要农作物相比，能‐够在NH4上茂盛生长的植物)的OsNRT2.3b当在利用NO3 作为其氮源的其他植物物种中表达时是有活性的。此外，在其他植物中表达OsNRT2.3b不仅在水稻中还在其他植物中产生有益的表型，表现出改善的生长、产量和氮利用效率。因此，来自水稻的OsNRT2.3b可以用在本发明所述的用于改善植物的生长、产量、病原体抗体和氮利用效率的方法中。例如，在烟草中或在小麦中过量表达OsNRT2.3b增加生物量，如实施例所示。

[0089] 因此，本发明还涉及在植物中表达与调节序列可操作的连接的下述核酸序列的转基因植物，所述核酸序列包含SEQ ID No.1定义的核酸、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列是如SEQ ID No.1所定义或其功能变体或部分，所述植物不是水稻，以及涉及相关的方法和应用。在一个实施方案中，本发明还涉及在植物中表达与调节序列可操作的连接的下述核酸序列的转基因植物，所述核酸序列包含SEQ ID No.1定义的核酸、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。相关的方法是用于增加植物的生长、产量、NUE、氮获取、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮转运的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1定义的核酸、其功能变体、部分或同源物的核酸序列，其中所述核酸序列是如SEQ ID No.1所定义或其功能变体或部分，则所述植物不是水稻。在优选的实施方案中，本发明涉及用于增加不是水稻的植物的生长、产量、NUE、氮获取、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮转运的方法，所述方法包括在所述植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1、其功能变体或部分定义的核酸的核酸序列。

[0090] 在另一个方面中，本发明涉及用于增加植物的生长、产量、NUE、氮获取、病原体抗性、氮胁迫耐受性和/或氮转运的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1或如SEQ ID No.1定义的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0091] 因此，在一个方面中，本发明涉及用于增加植物生长的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1中定义，则所述植物不是水稻。

[0092] 在另一方面中，本发明涉及用于增加植物产量的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1中定义，则所述植物不是水稻。

[0093] 术语“产量”包括下述非限制性特征列表中的一种或多种：早开花时间，生物量(植物生物量(根和/或茎干生物量)或种子/谷物生物量)，种子/谷物产量，种子/谷物活力和萌发效率，种子/谷物尺寸，谷物的淀粉含量，早期活力，绿色指数(greenness index)，增加的生长率，延迟的绿色组织衰老。术语“产量”通常意指可测的经济价值的产生，典型地与指定的农作物、某个地区和一定的时间期间相关。单个植物部分基于其数量、尺寸和/或重量而直接对产量做贡献。实际产量是每平方米农作物每年的产量，其通过总产量(包括收获的和估计的产量)除以种植的平方米数来确定。

[0094] 由此，按照本发明，产量包括下述中的一种或多种，并且可以通过评估下述中的一种或多种而测量：每棵植物增加的种子产量，增加的种子饱满度，增加的饱满种子数目，增加的收获指数，增加的活力/萌发率，增加的种子/蒴果/盆/谷物的数量或尺寸，增加的生长或增加的分枝，例如，具有更多分枝的花簇，增加的生物量或谷物饱满性。优选地，增加的产量包括增加的谷物/种子/蒴果/盆数目，增加的生物量，增加的生长，增加的花器数目和/或花增加的分枝。产量增加是相对于对照植物而言的。

[0095] 例如，与对照植物相比，产量增加2％，3％，4％，5％‐50％或更多，例如，增加至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。

[0096] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的NUE的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的NUE的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0097] 在一个实施方案中，所述方法改善在高N输入条件下的NUE。在另一个实施方案中，所述方法改善在低N输入条件下的NUE。

[0098] NUE可以定义为土壤中每单位可用的N(包括在土壤中存在的残余的N和肥料)的谷物产量。植物的总N利用效率包括摄入和利用效率，并且可以计算为UpE。

[0099] 例如，与对照植物相比，NUE增加5％‐50％或更多，例如，增加10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。

[0100] 在另一方面中，本发明涉及用于增加植物的氮获取的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。在另一方面中，本发明涉及用于增加植物的氮获取的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0101] 例如，与对照植物相比，氮获取增加10％‐50％或更多，例如，增加10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。

[0102] 在本文所述的用于提高NUE、生长、产量、氮获取和/或硝酸盐转运的多种方法的一个实施方案中，所述特征在胁迫条件下，例如，在氮胁迫下而被提高。

[0103] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0104] 在另一方面中，本发明涉及用于增加植物的氮转运的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。在另一方面中，本发明涉及用于增加植物的氮转运的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0105] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的病原体抗性和/或存活的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的病原体抗体和/或存活的方法，所述方法包括在植物中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0106] 例如，所述病原体可以是镰刀菌枯萎病(Fusarium wilt)。技术人员已知的其他病原体也在本发明的范围之内。

[0107] 术语“调节元件”、“调节序列”、“控制序列”和“启动子”在本文中互换使用，并且应该在广义上理解为指能够影响与其连接的序列的表达的调节性核酸序列。术语“启动子”典型地是指位于基因转录起始的上游的核酸控制序列，并且其参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合，由此指导可操作的连接的核酸的转录。前述术语包括来源于经典真核基因组基因的转录调节序列(包括准确的转录起始所需要的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)和响应发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在该情形中，其可以包括‐35盒序列和/或‐10盒转录调节序列。术语“调节元件”还包括赋予、激活或增强细胞、组织或器官中的核酸分子表达的合成的融合分子或衍生物。此外，术语“调节元件”包括下游转录终止子序列。转录终止子是在转录过程中标记基因组DNA中的基因或操纵子末端的一段核酸序列。用在用于表达植物基因的构建体中的转录终止子在本领域中是公知的。

[0108] 在一个实施方案中，本文所述的构建体具有启动子和终止子序列。

[0109] “植物启动子”包含调节元件，其介导编码序列片段在植物细胞中的表达。因此，植物启动子不必是植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，来源于攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”还可以来源于植物细胞，例如，来源于用本发明的方法和本文所述的待表达的核酸序列转化的植物。这还适用于其他“植物”调节信号，诸如“植物”终止子。用于本发明的方法的核苷酸序列上游的启动子可以在不干扰所述启动子、开放阅读框(ORF)或3'‐调节区(如终止子或其他远离ORF的3'调节区)的功能性或活性的前提下通过一个或多个核苷酸置换、插入和/或缺失进行修饰。此外，可以通过修饰其序列来增加启动子的活性，或者用活性更强的启动子、甚至是来源于异源生物体的启动子完全替换所述启动子。
对于在植物中表达，如前文所述，核酸分子必须可操作的连接或包含适当的启动子，所述启动子在正确的时间点并且以需要的空间表达模式表达基因。术语“可操作的连接”用在本文中是指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以使启动子序列能够起始所述目的基因的转录。

[0110] 按照本发明的方面可以选择下述启动子。该列表不是限制性的。

[0111] “组成型启动子”是指在大部分而不必要是全部生长和发育阶段并且在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官中是转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括，但不限于，肌动蛋白，HMGP，CaMV19S，GOS2，水稻亲环蛋白，玉米H3组蛋白，紫花苜蓿H3组蛋白，34S FMV，核酮糖二磷酸羧化酶‐加氧酶小亚基，OCS，SAD1，SAD2，nos，V‐ATP酶，超级启动子，G‐盒蛋白和合成的启动子。

[0112] “强启动子”是指引起基因增加或过量表达的启动子。强启动子的实例包括，但不限于，CaMV‐35S，CaMV‐35Sω，拟南芥泛素UBQ1，水稻泛素，肌动蛋白，或玉米醇脱氢酶1启动子(Adh‐1)。

[0113] 在优选的实施方案中，所述启动子是组成型启动子，其为强启动子，并且指导与其可操作的连接的目的基因的过量表达。优选的启动子是CaMV‐35S，CaMV‐35Sω和拟南芥泛素UBQ1。

[0114] 术语“增加的表达”或“过量表达”用在本文中意指附加于对照(例如，野生型)表达水平之外的任意表达形式。

[0115] 在一个实施方案中，启动子是韧皮部特异性启动子。韧皮部特异性表达对于OsNRT2.3b的功能可能是重要的，原因在于维管组织对于pH调节是重要的，并且近来已经表明在植物中发生韧皮部的硝酸盐转运，并且可能是向茎干递送氮的重要途径。

[0116] 例如，韧皮部特异性启动子来自RSS1P，来源于水稻蔗糖合酶基因(对应于SEQ ID No.5或其功能变体或部分，见Saha等)。其他韧皮部特异性启动子在本领域中是已知的。

[0117] 按照本发明的多个方面，与对照植物相比，生长、产量、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮利用效率提高。对照植物是没有转化包含SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物的核酸构建体的植物，优选是野生型植物。对照植物优选与转基因植物是同一物种的。此外，对照植物可以包含遗传修饰，包括其他转基因的表达。

[0118] 按照本发明的各个方面使用的术语“增加”、“改善”或“增强”可以互换。与对照植物相比，生长、产量、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率增加约5‐50％，例如，至少5％，6％，7％，8％，9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％，30％，35％，40％，45％或50％以上。优选地，生长通过测量下胚轴或茎长度进行检测。在一个实施方案中，产量提高至少40％。

[0119] 包含SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物的核酸构建体还可以包含促进转化体的选择的选择性标记，如赋予抗生素(例如，卡那霉素)抗性的标记。

[0120] 在另一方面中，本发明涉及用于制备具有提高的产量、生长、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮利用效率的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。在另一方面中，本发明涉及用于制备具有提高的产量、生长、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物，其中所述植物不是水稻。

[0121] 所述方法还包括由步骤a)后的植物或植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物，并且获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物表现出提高的产量、生长、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率。

[0122] 在上述这些明确排除水稻的方法的一个实施方案中，所述核酸序列包含或由SEQ ID No.1或其功能变体或部分组成。

[0123] 因此，按照本发明的各个方面，将SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物引入到植物中并且作为转基因表达。所述核酸序列通过称为转化的方法被引入到所述植物中。术语“引入”或“转化”在本文中引用时包括将外源多核苷酸转移到宿主细胞中，而与用于转移的方法无关。能够后续克隆繁殖的植物组织(不管是通过器官发生还是通过胚胎发生)可以用本发明的遗传构建体转化，并且由其产生完整的植物。所选的具体的组织随可用于且最适合被转化的特定物种的克隆繁殖系统而不同。示例性的组织靶标包括叶盘，花粉，胚，子叶，下胚轴，雌配子体，愈伤组织，存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋芽，和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以被瞬时或稳定地引入到宿主细胞中，并且可以保持不整合，例如，保持为质粒。备选地，其可以整合到宿主基因组中。然后，可以用得到的转化植物细胞以本领域技术人员已知的方式再生转基因植物。

[0124] 将外源基因转移到植物的基因组中称为转化。现在在多种物种中的植物的转化是常规技术。有利地，一些转化方法中的任一种都可以用于将目的基因引入到稳定的祖细胞中。关于转化和从植物组织或植物细胞再生植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体，电穿孔，增加游离DNA摄入的化学品，将DNA直接注射到植物中，粒子枪轰击，使用病毒或花粉转化和显微注射。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法，原生质体电穿孔，向植物材料的显微注射，DNA或RNA‐包被的粒子轰击，用(非整合的)病毒感染等。转基因植物，包括转基因农作物植物，优选通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化产生。

[0125] 为了选择转化的植物，通常将在转化中得到的植物材料进行选择条件，从而能够区分转化的植物和未转化的植物。例如，可以种植以上述方式得到的种子，初始生长期后，通过喷雾进行适当的选择进一步的可能性在于：用适当的选择试剂将种子(如果合适，在灭菌后)生长在琼脂板上，从而仅有转化的种子可以长成植株。备选地，筛选转化的植物是否存在选择标记，诸如上述的那些。在DNA转移和再生后，还可以评价推定的转化植物，例如使用Southern分析来评价目的基因是否存在、拷贝数和/或基因组组织。备选地或另外地，新引入的DNA的表达水平可以利用Northern和/或Western分析进行监测，这两种技术都是本领域普通技术人员公知的。

[0126] 所产生的转化植物可以通过多种方式进行繁殖，诸如通过克隆繁殖或经典的培育技术进行繁殖。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交，并选择纯合第二代(或T2)转化体，然后，T2植物可以通过经典培育技术进一步繁殖。所产生的转化的生物体可以采取多种形式。例如，它们可以是转化的细胞和未转化的细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，转化包含表达盒的所有细胞)；转化的和未转化的组织的嫁接(例如，在植物中，嫁接到未转化的幼枝上的转化的根茎)。

[0127] 本文所述的本发明的多个方面明确延伸到通过本文所述的任一种方法产生、获得或可通过本文所述的任一种方法获得的任意植物细胞或任意植物，并且延伸到其所有植物部分和繁殖体，除非另外指明。例如，在上述某些方面中，水稻被特别排除。由此，所述方法排除这样的实施方案：其中在水稻中表达包含或由SEQ ID No.1组成的核酸或其功能部分或变体。本发明进一步延伸涵盖通过任一前述方法产生的一级转化或转染细胞、组织、器官或完整植株的子代，唯一的要求是所述子代表现出与以本发明所述的方法由母本产生的那些相同的基因型和/或表型特征。

[0128] 本发明各个方面的植物特征在于其表现出提高的生长、产量、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率。

[0129] 本发明还延伸至上述本发明的植物的可收获的(harvestable)部分，诸如，但不限于，种子，叶，果实，花，茎，根，根状茎，块茎和球茎。本发明还涉及来源于、优选直接来源于所述植物的可收获的部分的产物，诸如干丸剂或粉剂，油，脂肪和脂肪酸，淀粉或蛋白。

[0130] 本发明还涉及包含SEQ ID No.1的序列、其功能变体、部分或同源物在提高植物的生长、产量、NUE、氮获取、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮转运中的应用，其中如果所述SEQ包含SEQ ID No.1，则所述植物不是水稻。此外，本发明还涉及包含SEQ ID No.1的序列、其功能变体、部分或同源物在提高植物的生长、产量、NUE、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮转运中的应用，其中所述植物不是水稻。

[0131] 本发明还涉及包含与韧皮部特异性启动子(例如，包含SEQ ID No.5的核酸)可操作的连接的核酸序列SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物的核酸构建体。还提供所述构建体在本文所述的方法中的应用。

[0132] 还提供表达包含与韧皮部特异性启动子可操作的连接的核酸序列SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物的核酸构建体的分离的细胞，优选植物细胞或根癌土壤杆菌细胞。在另一方面中，本发明涉及表达包含与组成型启动子可操作的连接的核酸序列SEQ ID No.1、其功能变体、部分或同源物的核酸构建体的分离的细胞，优选植物细胞或根癌土壤杆菌细胞。此外，本发明还涉及包含表达本发明的核酸构建体的分离的植物细胞或根癌土壤杆菌细胞的培养基。

[0133] 除非明确地否认水稻，在本文中所述的本发明各个方面所述的转基因植物可以是提供用于本文所述的实施方案的任意单子叶植物或双子叶植物。

[0134] 双子叶植物可以选自包括但不限于下述的科：紫莞科(Asteraceae)，十字花科(Brassicaceae)(例如，欧洲油菜(Brassica napus))，藜科(Chenopodiaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)，Aesalpiniaceae，含羞草科(Mimosaceae)，Papilionaceae或Fabaceae)，锦葵科(Malvaceae)，蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，植物可以选自莴苣(lettuce)，向日葵(sunflower)，拟南芥(Arabidopsis)，花椰菜(broccoli)，菠菜(spinach)，西瓜(water melon)，南瓜(squash)，卷心菜(cabbage)，番茄(tomato)，马铃薯(potato)，薯蓣(yam)，辣椒(capsicum)，烟草(tobacco)，棉花(cotton)，秋葵(okra)，苹果(apple)，玫瑰(rose)，草莓(strawberry)，紫花苜蓿(alfalfa)，豆(bean)，大豆(soybean)，蚕豆(field(fava)bean)，豌豆(pea)，兵豆(lentil)，花生(peanut)，鹰嘴豆(chickpea)，杏(apricots)，梨(pears)，桃(peach)，葡萄藤(grape vine)或柑桔属(citrus)物种。在一个实施方案中，所述植物是油菜(oilseed rape)。

[0135] 还包括生物燃料和生物能农作物，如油菜/菜籽油(canola)，甘蔗(sugar cane)，甜高粱(sweet sorghum)，柳枝稷(Panicum virgatum)(switchgrass)，亚麻子(linseed)，羽扇豆(lupin)和柳树(willow)，白杨(poplar)，白杨杂交种(poplar hybrids)，芒草(Miscanthus)或裸子植物(gymnosperms)，诸如火炬松(loblolly pine)。还包括用于下述的农作物：青贮饲料(玉米)，牧草或草料(草，苜蓿(clover)，sanfoin，紫花苜蓿)，纤维(例如，棉花，亚麻)，建筑材料(例如，松树(pine)，橡树(oak))，纸浆(例如，白杨)，化学工业原料(例如，高芥子酸油菜，亚麻子)和用于环境设施目的(例如，用于高尔夫球场的草皮草)，用于公共和私人花园的观赏植物(例如，金鱼草(snapdragon)，矮牵牛花(petunia)，玫瑰(roses)，天竺葵(geranium)，烟草物种(Nicotiana sp.))和用于家庭的植物和切花(非洲堇(African violets)，秋海棠属(Begonias)，菊花(chrysanthemums)，天竺葵，彩叶吊兰(Coleus spider plants)，龙血树属(Dracaena)，橡胶树(rubber plant))。

[0136] 例如，单子叶植物可以选自下述科：紫莞科，石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，植物可以是谷物农作物，如小麦，大麦，玉米，燕麦(oat)，高粱(sorghum)，黑麦(rye)，粟(millet)，荞麦(buckwheat)，草皮草(turf grass)，意大利黑麦草(Italian rye grass)，甘蔗(sugarcane)或羊茅属(Festuca)物种，或是农作物，如洋葱(onion)，韭葱(leek)，薯蓣属或香蕉(banana)。在上述方法和植物的一个实施方案中，所述植物不是水稻。

[0137] 优选地，所述植物是农作物植物。农作物植物意指以商业规模种植用于人或动物消费或使用的任意植物。

[0138] 最优选的植物是玉米，小麦，油菜，高粱，大豆，马铃薯，烟草番茄，烟草，葡萄，大麦，豌豆，豆，蚕豆，莴苣，棉花，甘蔗，甜菜，花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物(brassicas)或白杨。

[0139] 在一个实施方案中，所述植物是小麦。在一个实施方案中，所述植物是烟草。优选地，所述启动子是本文所述的韧皮部特异性启动子。

[0140] 术语“植物”用在本文中包括完整的植物，植物的祖先和子代和植物部分，包括种子，果实，茎干(shoots)，茎(stem)，叶，根(包括块茎)，花和组织与器官，其中前述的每一种都包含目的基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、混悬培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样地，其中前述中的每一种都包含目的基因/核酸。

[0141] 通过上述用于制备转基因植物的方法得到或可通过上述方法得到的植物或其部分也在本发明的范围内。

[0142] 在另一方面中，本发明涉及在植物中表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物的转基因植物，其中如果所述核酸序列如SEQ ID No.1所定义，则所述植物不是水稻。因此，本发明这一方面排除表达包含或由SEQ ID No.1组成的核酸的转基因水稻。在一个实施方案中，还排除能够在NH4作为唯一氮源上生长的其他植物。

[0143] 在另一方面中，本发明涉及在植物中表达包含与韧皮部特异性启动子可操作的连接的SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物的转基因植物。所述植物可以是任意的单子叶或双子叶植物，包括水稻。在一个实施方案中，所述植物不是水稻。

[0144] 在另一方面中，本发明涉及在植物中表达与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列、其功能变体、部分或同源物的转基因植物，其中所述植物不是水稻。在一个实施方案中，所述转基因植物表达包含或由SEQ ID No.1组成的核酸序列。

[0145] 植物特征在于，其表现出提高的产量、生长、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性、病原体抗性和/或氮利用效率。

[0146] 术语“核酸序列的功能变体”关于SEQ ID No.1或另一序列用在本文中是指保留完全非变异序列的生物学功能(例如，当在转基因植物中表达时赋予提高的生长或产量)的变体基因序列或基因序列的部分。功能变体还包括目的基因具有不影响功能的序列改变的变体，例如，在非保守残基中的改变。还包括与本文所示的野生型序列相比基本上相同(即，仅具有一些序列变异，例如，在非保守残基形式中的变异)并且有生物学活性的变体。

[0147] 因此，在范围内特别包括本文关于SEQ ID No.1或另一序列所用的核酸序列的功能部分，其保留完全非变异序列的生物学功能，例如，当在转基因植物中表达时，赋予提高的生长或产量。

[0148] 因此，应该理解，如本领域技术人员应该理解的，本发明的方面，包括所述方法和应用，不仅涵盖包含或由SEQ ID No.1组成的核酸序列，而且涵盖SEQ ID No.1不影响所产生的蛋白的生物学活性和功能的功能变体或部分。核酸序列中在给定位点导致产生不同的氨基酸但是不影响所编码的多肽的功能特性的变化在本领域中是公知的。例如，关于氨基酸丙氨酸(疏水氨基酸)的密码子可以被编码另一种疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性更强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，还可以预期导致一个带负电荷的残基置换另一个(如天冬氨酸置换谷氨酸)或一个带正电荷的残基置换另一个(如赖氨酸置换精氨酸)的变化产生功能等价的产物。导致多肽分子的N端和C端部分变化的核苷酸变化不会预期改变所述多肽的活性。每种提议的修饰充分在本领域的常规技术内，确定所编码的产物的生物学活性的保留也充分在本领域的常规技术内。

[0149] SEQ ID No.1的功能变体与SEQ ID NO:1所示的氨基酸具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的整体序列同一性。SEQ ID NO.3的功能变体与SEQ ID NO.3所示的氨基酸具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或
99％的整体序列同一性。功能变体保留pH感应基序。

[0150] SEQ ID No.1的功能同源物是编码NRT2.3b肽的核酸，换言之，其以与SEQ ID No.1相同的方式具有生物学活性，例如，其赋予提高的产量或生长。术语功能同源物包括其他植物物种中的OsNRT2.3b直向同源物。

[0151] 在增加的优先性次序上，OsNRT2.3b多肽的同源物与SEQ ID No:3所示的氨基酸具有至少25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，
54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，
69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，
84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或
99％的整体序列同一性。优选地，整体序列同一性是90％，91％，92％，93％，94％，95％，
96％，97％，98％或99％。在另一个实施方案中，在增加的优先性次序上，OsNRT2.3b核酸序列与SEQ ID No:1所示的核酸具有至少25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，
33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，
48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，
63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，
78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的整体序列同一性。优选地，整体序列同一性是
90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。整体序列同一性使用本领域已知的整体比对算法，诸如程序GAP中的Needleman Wunsch算法(GCG Wisconsin Package，Accelrys)来确定。

[0152] 优选地，OsNRT2.3b同源物/直向同源物在细胞质一侧具有pH感应基序VYEAIHKI。在一个实施方案中，OsNRT2.3b多肽的同源物与SEQ ID No:3所示的氨基酸具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的整体序列同一性，并且包含pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)。所述同源物的功能变体或部分，例如如SEQ ID No.6‐15所示，也包括在本发明的范围内。

[0153] 图24显示具有OsNRT2.3b中鉴定的pH感应基序的同源物/直向同源物。由此，按照本发明的各个方面所用的优选的直向同源性基因或肽选自图24中列出的直向同源物，包括大麦、玉米、大豆、短柄草属(Brachypodium)(SEQ ID Nos.6‐15)和小麦。与SEQ ID NO.6‐15列出的序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的这些序列的变体也在本发明的范围之内。

[0154] 适当的同源物或直向同源物可以通过序列比较和鉴定保守结构域进行鉴定。同源物或直向同源物的功能可以如本文所述进行鉴定，由此，当在植物中表达时，技术人员能够证实功能。

[0155] 例如，按照本发明的各个方面，通过重组方法，编码内源性NRT2.3肽的核酸可以在本文定义的任意植物中表达，除非另外指明。如上文所述，在本发明的某些方面中，特别是当核酸构建体包含或由SEQ ID No.1组成时，所述植物不是水稻。例如，水稻OsNRT2.3b可以在水稻中表达，小麦NRT2.3b可以在小麦中表达。

[0156] 在另一个实施方案中，利用重组方法，对第一植物物种是内源性的编码植物NRT2.3b的核酸可以在第二植物中表达。例如，来自另一种植物的OsNRT2.3b同源物可以在水稻中表达。

[0157] 在本发明的各个方面的一个优选的实施方案中，包含SEQ ID No.1或其功能变体的OsNRT2.3b在不是水稻的另一种植物中表达。本发明人已经令人惊讶地表明，表达OsNRT2.3b确实在利用不同N源的其他植物中导致有益的表型。例如，表达可以是在本文所述的单子叶或双子叶植物中。在一个实施方案中，所述植物是小麦或烟草。

[0158] 因此，本发明特别涉及用于提高生长、产量、氮转运、NUE、氮获取中的一种或多种，减少光呼吸，增加细胞内CO2水平，提高光合效率，病原体抗性和保持/改善pH稳态的方法，所述方法包括在不是水稻的另一种植物中引入并表达包含SEQ ID No.1或其功能变体的核酸序列。表达包含SEQ ID No.1或其功能变体、部分的核酸序列的转基因非水稻植物也包括在本发明的范围内，例如，小麦或烟草。

[0159] 植物及其内源性NRT2.3b可以选自任何植物，诸如选自本文列出的科或物种。

[0160] 拟南芥与OsNRT2.3不具有紧密相关性，最紧密的是AtNRT2.5，但是这不具有相似的pH‐感应基序。改善与OsNRT2.3b相关的NUE的关键方面是硝酸盐转运功能的pH敏感性。OsNRT2.3b中的细胞质pH感应基序(OsNRT2.3a中不存在)提供了氮营养与pH调节之间的关联性。因此，pH感应基序的存在对于其他物种中的同源物/直向同源物是重要的。

[0161] 因此，OsNRT2.3b的同源物/直向同源物可以通过存在细胞质pH感应基序而被鉴定。在一个方面中，本发明涉及用于鉴定其他物种中的OsNRT2.3b的同源物/直向同源物的方法，所述方法包括鉴定包含细胞质pH感应基序的肽。

[0162] 如在实施例中所阐释的，当在水稻中过量表达OsNRT2.3b时，在分别用硝酸盐和铵处理的WT中，木质部pH为7和7.3，而在OsNRT2.3b过量表达株系中为7.5和7.6‐7.8，显著高于WT。24小时N处理后，采集韧皮部树液。测量韧皮部树液pH，并且在OsNRT2.3b过量表达株系中发现较轻的酸化。WT和过量表达株系之间的差别在硝酸盐条件下为约0.2个pH单位，在铵条件下为约0.1个pH单位。在硝酸盐供应下从24到48小时处理，WT韧皮部pH从7.8降至6.1，b‐S6从6.7降至6.0；而在铵处理条件下从24到48小时，WT韧皮部pH从7.4降至6.3，b‐S6从6.6降至5.9。在硝酸盐供应下WT与b‐S6之间的差别在24小时显著高，而到48小时没有发现显著差异。在铵供应下，尽管WT树液中的pH高于b‐S6中pH，但是差异不显著。在硝酸盐条件下WT韧皮部pH的酸化约为1.7个pH单位，而在b‐S6植物中其仅为0.7个pH单位。到48小时，调节采集的韧皮部pH树液至WT和b‐S6
17
植物给出更相似的数值(图17b)。此外，在不同N处理72小时后，用溴甲酚紫指示剂检测WT和b‐S6根中根部质外体pH。相对于WT，过量表达株系b‐S6在硝酸盐条件下表现出碱化作用，在铵条件下表现出酸化作用，而在相同的时间量程中水培培养基中的pH在WT与b‐S6之间没有表现出显著性差异(图18c)，原因在于大体积溶液足够多足以缓冲根表面发生的任何pH变化。

[0163] 公知用于植物的N供应形式影响植物pH平衡24。铵的同化作用每NH4+产生至少+ ‐ ‐4 ‐一个H；而NO3 同化作用每NO3 产生几乎一个OH 。以维持细胞质pH所需要的过量产生+ ‐ + 4,10
的H或OH 以需要能量的步骤(例如，质膜H泵出ATP酶)从细胞中输出。我们比较
了来自重新供应硝酸盐或铵的N‐饥饿水稻植株的韧皮部树液的pH。硝酸盐和铵供应使WT和转基因植物的韧皮部pH酸化(图3d，e)。有趣的是，当与WT相比时，在四株转基因株系中，韧皮部的酸化显著更低(图3d，e)，尽管在韧皮部中可能检测不到硝酸盐浓度的显著差异(数据未显示)。这些数据表明，转基因植物能够更好地调节韧皮部pH。此外，WT和转基因之间的韧皮部pH差异(图17a，b)可能解释在OsNRT2.3b过量表达植株叶中增加的P
25
和Fe积聚(图19)。较酸的韧皮部树液(图17)有益于P和Fe向叶片的易位。与增强
的N获取一起，这也是植物生长和产量提高的重要因素。

[0164] 已经报道胞质pH酸化使卵母细胞中的水通道蛋白的转运失活26。此外，由于硝酸27 4,28
盐同化作用依赖于光呼吸，因此，硝酸盐、铵的同化作用与光呼吸之间的关系与苹果酸
29
盐在细胞质和叶绿体之间的穿梭紧密偶联，从而平衡pH 。

[0165] 在植物中，pH的调节是多种原因引起的需要。最基本的原因是水被自发地电离，而结果质子不能完全从给定的溶液中去除。与其他离子不同，质子可以在特定的化学反应中被消耗或产生，结果营养的种类决定质子可能在什么程度上成为生物体的问题，或者甚至是危害。由于pH影响植物组织和细胞以及细胞内区室中的广泛种类的过程，并且同时H+活性可能被相同的过程改变，因此，对于任意情形，准确的调节性决定因素和因果关系是很难分析的(在给定的时刻)。逆转pH波动的能力以及获得其的程度和速度限定了pH调节的质量。

[0166] 由于质子‐偶联的转运系统介导这些细胞过程，稳定维持细胞质pH对于营养物和二级代谢物的细胞摄入和存储的供能是重要的。细胞区室与外部环境之间的pH梯度为这些重要的过程提供能源。因此，与混合的硝酸盐和铵氮供应相关的改善的pH稳态增强多种关键的细胞过程。

[0167] 我们已经表明，OsNRT2.3b包含在质膜的细胞质一侧上的pH感应基序，其在OsNRT2.3a中在胞质一侧不存在。在OsNRT2.3b朝向质膜的胞质一侧的组氨酸残基167周围的pH‐感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)是阴离子交换剂家族的特征，其存在于多种不同的生物体中，包括哺乳动物，并且因此可以是更一般的生物学显著性。如在实施例中证明的，我们已经表明，单个氨基酸突变(H167R)后，甚至在重复的硝酸盐处理循环后，OsNRT2.3b失去其胞质pH调节的功能(图5b)。

[0168] OsNRT2.3b感应基序调节植物的胞质pH。

[0169] 我们还已经表明，通过将植物的pH状态与硝酸盐供应相联系，OsNRT2.3b的pH感应基序在水稻中对于这些作用是重要的。

[0170] 在另一方面中，因此，本发明涉及用于调节pH稳态的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列。在一个实施方案中，所述植物不是水稻。

[0171] 在另一方面中，本发明涉及用于减少植物中的酸化作用的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列。在一个方面中，所述植物不是水稻。

[0172] 酸化作用可以被减少至少约0.1个pH单位，例如，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8以上。

[0173] 在另一方面中，本发明涉及用于改变植物中的硝酸盐转运和pH稳态的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述核酸包含在pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)中的突变。所述突变使得该pH感应基序没有功能。

[0174] 如本文其他地方所述，所述调节序列可以似乎本文所述的组成型启动子或是组织特异性启动子。在一个实施方案中，所述启动子是本文所述的韧皮部特异性启动子。

[0175] 术语植物还在本文其他地方定义。优选地，所述植物是农作物植物。最优选的植物是玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、烟草、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。在一个实施方案中，所述植物不是水稻。

[0176] 本发明还涉及包含SEQ ID No.1的核酸、其功能变体、部分或同源物(其编码包含pH感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)的SEQ ID No 3、其功能变体、部分或同源物)在调节转基因植物中的pH中的应用。

[0177] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物生长的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0178] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的氮利用效率的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0179] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物产量的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0180] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物中硝酸盐转运的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0181] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物氮获取的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0182] 在本文所述的用于提高NUE、生长、产量、氮获取和/或硝酸盐转运的多种方法的一个实施方案中，所述特征在胁迫条件下，例如在氮胁迫条件下被提高。

[0183] 因此，在另一方面中，本发明涉及用于赋予植物对氮胁迫的耐受性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0184] 因此，在另一方面中，本发明涉及用于赋予植物病原体抗性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调节序列可操作的连接的包含SEQ ID No.1的核酸序列，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。如果所述植物是水稻，那么所述病原体可以是镰刀菌枯萎病、叶枯病(Leaf blight)和条锈病(Stripe rust)。

[0185] 按照上述方法，上述方法和植物所述的调节序列如本文所述，并且因此可以是本文所述的组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。在一个实施方案中，所述启动子是本文所述的韧皮部特异性启动子。由于维管组织对于pH调节是重要的，并且最近已经表明在植物中发生韧皮部的硝酸盐转运，并且可以是向茎干递送氮的重要途径，因此，韧皮部‐特异性表达对于OsNRT2.3b的功能是重要的。

[0186] 术语植物还如本文其他地方所定义。优选地，所述植物是农作物植物。最优选的植物是玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。在一个实施方案中，所述植物不是水稻。

[0187] 在另一方面中，本发明涉及用于提高植物的氮利用、产量、NUE、氮效率、氮胁迫耐受性、病原体抗性、氮获取和/或硝酸盐转运的方法，所述方法包括在植物中引入并表达包含核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列包含与韧皮部特异性启动子可操作的连接的SEQ ID No.1、其功能部分或变体。术语植物也如本文其他地方定义。优选地，所述植物是农作物植物。最优选的植物是玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。在一个实施方案中，所述植物不是水稻。

[0188] 在另一方面中，本发明涉及用于制备具有提高的产量、生长和/或氮利用效率的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列的核酸构建体，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达包含SEQ ID No.2的核酸序列。

[0189] 所述方法还包括步骤a)后从所述植物或植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1，并且从所述转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物表现出提高的产量、生长和/或氮利用效率。这些方法如本文其他地方所述进行。

[0190] 通过上述用于制备转基因植物的方法获得的或可通过通过上述用于制备转基因植物的方法获得的植物或其部分也在本发明的范围内。

[0191] 在另一方面中，本发明涉及在植物中表达包含与调节序列可操作的连接的SEQ ID No.1中定义的核酸序列的核酸构建体的转基因植物，其中所述调节序列是组成型启动子或韧皮部特异性启动子，并且其中所述植物不过量表达核酸序列SEQ ID No.2。

[0192] 可以按照本发明的这些方法使用的植物在本文其他地方特别列出，但是也包括水稻。优选地，所述植物是本文其他地方定义的农作物植物或生物燃料植物。

[0193] 最优选的植物是水稻、玉米、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔属植物或白杨。

[0194] 在一个实施方案中，所述植物是小麦，并且所述启动子是本文所述的韧皮部特异性启动子。在一个实施方案中，所述植物是烟草，并且所述启动子是本文所述的韧皮部特异性启动子。

[0195] 所述植物特征在于其表现出提高的产量、生长、氮转运、氮获取、氮胁迫耐受性和/或氮利用效率。

[0196] 审阅从本文和后附的权利要求书所提供的完整的公开内容应该理解本发明的其他目的和优点。

[0197] 尽管前述公开内容提供了本发明范围内涵盖的主题(包括制备和使用本发明的方法及其最佳方式)的一般描述，但是提供下述实施例，以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并且提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员应该理解这些实施例的细节不应该视为是对本发明的限制，本发明的范围应该从本公开内容所附的权利要求书及其等价物来理解。考虑本公开内容，本领域技术人员应该明白本发明的多个其他方面和实施方案。这些实施例的细节不应该视为是限制。

[0198] 本说明书中提及的所有文件，包括参考文献到基因或蛋白序列的数据库，都通过引用完全结合在本文中。

[0199] “和/或”用在本文中应该理解为两个指定的特征或组分中每一个的具体公开，其具有或不具有另外一个。例如，“A和/或B”应该理解为下述中每一个的具体公开：(i)A，(ii)B和(iii)A与B，正如同每一个在本文中单独所述一样。

[0200] 除非上下文另外指明，上述特征的描述和定义不限于本发明的任何具体方面或实施方案，并且同等适用于其所述的所有方面和实施方案。实施例

[0201] 在下述非限制性实施例中进一步描述本发明。

[0202] 1.在水稻中表达OsNRT2.3a和OsNRT2.3b

[0203] 材料和方法

[0204] 过量表达载体的构建和转基因植物

[0205] 通过基因特异性引物扩增OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的开放阅读框。片段用限制性33
酶处理，插入到载体中，并且在转化之前测序。用土壤杆菌介导的方法转化水稻(Oryza sativa)胚愈伤组织。获得一个拷贝插入的T0植株，生长产生T1植株。采用纯合的T1植株产生T2代。两个T2OsNRT2.3a过量表达植物株系a‐U1和a‐U2和四个T2OsNRT2.3b过量表达植物株系b‐U1、b‐U2、b‐S2和b‐S6用于进一步的实验。在浙江大学常兴实验站以如0，75，150和300kg N/ha的尿素水平的四个N施用N进行T2田间实验(2010年
5月‐10月)。种子在5月5日萌发，并且在6月5日将每种类型的秧苗以25cm(行间距)x 20cm(植株间距)种植3行和33棵植株。植株按地块种植(图23a，b)，对于每种N施用顺序随机。对于75kg N/ha的大规模实验，植株以10行x 128棵植株移植(图23d)。对于所有的田间实验使用三次重复，并且地块最终在10月10日收获。该实验站的土壤营养状况为：总氮(N):1.00±0.18mg/g，总磷(P)0.38±0.08mg/g，总钾(K)39±2.3mg/g，Olsen P(0.5mM NaHCO3‐可萃取的P)23±4.1mg/kg，土壤pH为6.3±0.47(n＝6)。在转移水稻秧苗之前，向水稻田施加60kg P(作为Ca(H2PO4)2)/ha和110kg K(作为K2SO4)/ha肥料。在
6月3日在转移前进行第一次N施用，并且将20％总N肥混合到土壤中。在6月12日进行的第二次施用为40％，此时为水稻分蘖阶段(tilling stage)的开始。在6月20日进行的最后施用为40％。在常兴，水稻生长期对于WT，a‐U1和a‐U2株系为120±3天，对于b‐U1、b‐U2、b‐S2和b‐S6株系，在0‐75kg N/ha水平为130±2天，在150kg N/ha水平为
135±2天，在300kg N/ha水平为140±2天。在收获时测量谷物产量，并且NUE定义为谷
15 34
物产量/所施用的肥料N。对于 N摄入，除非另外指明，如前所述，在具有1.25mM NH4NO3作为N供应的pH 5.5的IRRI培养基中使用木质部和韧皮部树液收集实验、水培生长条件。
提取根RNA进行RT‐PCR分析。

[0206] 抗体产生和蛋白质印迹

[0207] 通过下述引物：F:GGAATTCTCACACCCCGGCCGG(SEQ ID No.17)，R:CGGGATCCATGTGGGGC GGCATGCTC(SEQ ID No.18)，从 OsNRT2.3a(AK109776) 和OsNRT2.3b(AK072215)的质粒中扩增OsNRT2.3a/b基因的完整cDNA序列。所述质粒由Dr.Kikuchi(KOME)馈赠。将PCR片段亚克隆到细菌表达载体pGSX(Amersham)的BamH I
35
和EcoR I位点。纯化氨基酸产物，并且合成其单克隆抗体。所述单克隆抗体选自针对OsNRT2.3a(516aa)或OsNRT2.3b(486aa)蛋白的192个单个的细胞特异性反应。从根提取
10,14
质膜蛋白，并且如前所述进行蛋白质印迹，并重复两次。

[0208] RNA原位杂交

[0209] 如前所述36进行RNA原位杂交。对于OsNRT2.3b探针，结合位点位于OsNRT2.3b特异性的5'UTR中，其序列为CGATGGTTGGGTGCGGCGAGA(SEQ ID No.19)。无义序列为GCTACCAACCCACGCCGCTCT(SEQ ID No.20)。所有探针在5'端用DIG标记。

[0210] 根15N累积的确定

[0211] 将WT和过量表达植株的水稻秧苗在温室中在含有1.25mM NH4NO3的IRRI营养液中生长两个月，然后N缺乏3天。将植株用0.1mM CaSO4润洗1分钟，然后转移到含有15 15 15 15 15
1.25mM Ca( NO3)2(原子％ N:99.27％)或( NH4)2SO4(原子％ N:95.7％)或 NH4NO3(原
15 15 15 15 15 15
子％ N:45％)或NH4 NO3(原子％ N:45.25％)或 NH4 NO3(原子％ N:95.5％)的溶液中5分钟，最后再用0.1mM CaSO4润洗1分钟。在最后转移到CaSO4中后立即将根与茎干分离，在液N中冷冻。碾磨后，将整分的粉末在70℃干燥至恒重。将每种样品的10mg粉末用MAT253‐Flash EA1112‐MS系统(Thermo Fisher Scientific，Inc.，美国)进行分析。整个实验重复两次，并且每次具有五次重复。

[0212] 木质部和韧皮部树液收集

[0213] 将水稻秧苗在1.25mM NH4NO3中生长8周，然后转移进行N处理(硝酸盐:1.25mM Ca(NO3)2；铵:1.25mM(NH4)2SO4)24小时，然后在根上方4cm切割。N溶液以下用于木质部树34 16
液收集和上部用于韧皮部树液收集。

[0214] 对于韧皮部树液收集，简言之，将每棵茎干放在50ml玻璃管中，其中具有用石蜡膜封住的15ml 25mM EDTA‐Na2。将茎干穿过石蜡膜插入，并且收集韧皮部树液24小时。使用pH计(模式868，Thermo Orion，美国)和通过计算在韧皮部树液收集期开始和结束时样品的pH差别来测量韧皮部pH变化。该使用用5份重复的样品进行，并且重复两次。

[0215] 还使用与上述相同的植株用昆虫喂饲法收集韧皮部树液。每棵植株放置在装有IRRI营养液的250ml瓶中，六棵植株保持在26C和16小时光照期间的昆虫笼子中。在N处理开始时，将七至十只成虫稻褐飞虱成虫转移到每棵植株上。在N处理持续24小时、48小时收集由该昆虫分泌的水稻韧皮部蜜汁(图17)。

[0216] 卵母细胞制备，mRNA注射，15N摄入和电生理学

[0217] 卵母细胞制备，mRNA注射，15N‐硝酸盐摄入和电生理学如前所述37‐39。0.5mM在15 15 15 38
ND96中的Na N‐NO3或 N‐NH4Cl用于 N摄入实验16小时。用pH选择性微电极法测
18
量胞质pH 。

[0218] OsNRT2.3b的单位点突变和mRNA合成

[0219] 利用PCR方法产生OsNRT2.3b的点突变(H167R)。点突变体通过PCR处理，OsNRT2.3b的两个片段具有在引物中的突变位点和新的限制性位点。pT7Ts中的OsNRT2.3b cDNA用作DNA模板，并且将第一PCR片段(H167RB)亚克隆到pT7Ts的HindIII和XbaI中。
新质粒和第二PCR片段(H167R)通过Csp45I和Xba I消化，并且连接成具有H167R位点突变的OsNRT2.3b cDNA(pH167R)的最终质粒。pH167R的mRNA合成如上文所述。

[0220] RNA制备和DNA微阵列杂交

[0221] 在8月1日10:00am，即，所有植物最大的分蘖阶段，从常兴实验站的田间收获来自150Kg N/ha处理的WT(日本晴)、a‐U1和b‐S6苗每一个的三个重复。收获后将采集用于RNA提取的茎干组织样品在液氮中在‐80℃急速冷冻。RNA提取、与Affymetrix水稻40
基因芯片阵列(Santa Clara，CA，USA)杂交、数据分析和注解如之前的报告所述。

[0222] 定量实时RT‐PCR

[0223] 使用TRIzol试剂，按照供应商的使用说明(Invitrogen Life Technologies，13
Carlsbad，CA，美国) ，从三个生物学代表物，具体地是从WT和转基因植株的根和茎干分离总RNA。

[0224] 气体交换和照射后CO2爆发测量

[0225] 在微阵列取样的同一天，在常兴实验田在150Kg N/ha处理的植株中用Li‐Cor6400便携式光合作用开放系统从9:00h至15:00h测量旗叶的光饱和光合作用的速率。测量过程中，叶温度保持在27.0±0.1℃，光合质子流强度(PPFD)为1500μmol质‐2 ‐1 41子m .s ，如之前所述。比色杯中的环境CO2浓度(Ca‐c)调节为大气CO2浓度(Ca)‐1
(417±1.0μmol CO2mol )，并且相对湿度保持在20％。在平衡至稳定状态(10min)后记
22
录数据。标记测量的叶，并且基于所标记的区域计算叶面积。如前所述，在光呼吸条件‐2 ‐1 ‐1
(饱和PPFD为1,500μmol质子m .s ，Ca‐c CO2浓度为100μmol CO2mol ，相对湿度为60％‐70％)下测量该标记的叶的照射后CO2爆发(PIB)。

[0226] 结果

[0227] 过量表达OsNRT2.3b提高水稻生长

[0228] 我们利用泛素或35S启动子通过土壤杆菌介导的转化产生过量表达OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的水稻(Oryza sativa L ssp.Japonica，cv.日本晴)植株(图1a，b)。过量表达株系对于OsNRT2.3a命名为a‐U1和a‐U2，对于OsNRT2.3b命名为b‐U1，b‐U2，b‐S2和b‐S6，分别具有一个拷贝的插入物。有趣的是，与野生型(WT)相比，在转录物和蛋白水平上(图1cd)都得到证实的OsNRT2.3b过量表达株系表现出更多的生长(图1a，b)。过量表达株系的生物量和圆锥花序尺寸大于WT(图11；表2‐3)。一级和二级花轴尺寸增加，因此每个圆锥花序的种子总数大于WT(图11，表2)。相比之下，尽管在转化的株系中OsNRT2.3a mRNA和蛋白增加(图1c，d，图11)，但是OsNRT2.3a过量表达植株没有表现出与WT的明显区别。原位杂交结果表明，当与野生型比较时，b‐S6叶中的OsNRT2.3b mRNA在表皮、韧皮部和叶肉细胞中表达(图1e)。此外，当在其他高产量和高NUE水稻栽培种，即，来自中国南方的WYJ7和来自中国北方的YF47中过量表达OsNRT2.3b时，其谷物产量和NUE(谷物产量除以施用的N肥)也显著提高(图12，13)。

[0229] 过量表达株系的田间试验表明在亚热带和热带气候在一定范围的N施肥比率下增加的谷物产量和NUE。

[0230] 受OsNRT2.3b过量表达植株在水培法和土壤盆中的强表型鼓舞，我们在4个田间试验中种植了所选的日本晴、WYJ7和YF47转基因株系及其野生型，以评价其在不同肥料N比率下的表现。

[0231] 四个日本晴T2转基因株系和WT以四个水平的N肥施用种植在位于亚热带气候区的常兴的水稻田(土壤pH 6.3)中(图2)。与WT相比，在所有的N施用水平上，转基因株系的生物量、每个圆锥花序的种子数、成熟度、谷物产量和NUE显著提高(图2a‐c，表5)。谷物产量的平均增加在75kg N/ha 33％至300kg N/ha 25％的范围内。补充有150kg N/ha的过量表达株系的谷物产量比施肥300kg N/ha的WT产量高6％‐13％(图2b)。显著地，表现最好的转基因株系b‐S6在75kg N/ha产生与WT在300kg N/ha相似的谷物产量(图
2b，表5)。与WT中的55g/g N相比，OsNRT2.3b过量表达株系的NUE在75kg N/ha施用水平达到68‐79g/g N(图2c)。在补充有75kg N/ha的大规模田间实验中，株系b‐U2的产量和NUE比WT高30.5％；而对于株系b‐S6，数值甚至高至40.5％(图2d,e,f)。

[0232] 在第二田间试验中，b‐S2和b‐S6的T5代种植在热带海南(图14a)。同样获得谷物产量和NUE的显著提高。在110kg N/ha供应中发现转基因株系与日本晴WT之间最大的差异(图14b)。此外，b‐S6T5植株与WT杂交证实b‐S6表型完全由OsNRT2.3b过量表达贡献，原因在于，在F2代植株中，aa基因型回复到WT，并且AA基因型如b‐S6(图15)。

[0233] 第三田间试验在常兴检测具有三种N施用(110和220kg N/ha)的在WYJ7背景下的OsNRT2.3b过量表达株系。在四个转化的株系(T2代)中，谷物产量在110kg N/ha比野生型大35‐51％，在220kg N/ha高38‐42％。平均来说，NUE比WT高43％(图12f)。

[0234] 第四田间试验在海南检测YF47栽培种背景的OsNRT2.3b过量表达(图15)。与用其他两种背景获得的结果相似，在YF47中过量表达OsNRT2.3b在一般N肥供应(150kg/ha)下产生比WT多的生物量和39％更多的谷物产量(图13a，d)。综合来看，OsNRT2.3b过量表达在不同栽培种背景、气候和N施用比率下对谷物产量和NUE产生一致的影响。

[0235] 在日本晴背景下，与WT相比，OsNRT2.3b过量表达导致开花在150kg/ha延迟15±2天，在300kg/ha延迟20±2天(图2a，d，图16，表1)。在这些植株的盆实验中，在萌发后120天，b‐S2和b‐S6的谷物产量比WT高37％和40％(图16g)。在140天，b‐S2和b‐S6的谷物产量比WT高55％和49％(图16g)。与前120天的数据相比，多20天仅使其产量增加18％和9％。明显地，OsNRT2.3b过量表达对谷物产量的最大贡献发生在120天时。此外，20天的生长延迟没有显著增加OsNRT2.3b过量表达植物的总N摄入(图16h)。然而，20天的延迟增加生物量的比率和N向谷物的转移(表3‐4)，并使N利用(同化)效率(NUtE)从120天的33g‐谷物/g‐N(与WT没有显著区别)增加到140天的39.1‐40.2g‐谷物/g‐N(相对于WT，对于b‐S2和b‐S6是显著增加的)(图16i)。事实上，相对于WT，在WYJ7和YF47背景下过量表达OsNRT2.3b没有开花延迟。

[0236] OsNRT2.3b过量表达增加氮流入、向茎干的转运、木质部pH、木质部pH稳态、叶中P和Fe的积聚。

[0237] 我们测量了OsNRT2.3b过量表达对在pH 6水培生长的四棵日本晴转化的株系中15
的 N‐硝酸盐流入的影响(图3a)。与WT相比，硝酸盐流入在所有转基因株系中显著增加(图3a)，这证明了在这些植物中增加的OsNRT2.3b活性。相比之下，OsNRT2.3b过量表达
15
对短期 N‐铵摄入没有显著影响(图3a)。

[0238] 在硝酸盐供应下，与WT相比，在b‐U1、b‐U2、b‐S2和b‐S6的木质部中检测到更多的硝酸盐和较少的铵(图3b)。在分别用硝酸盐和铵处理的WT中，木质部pH为7和7.3，而在OsNRT2.3b过量表达株系中，其为7.5和7.6‐7.8，显著高于WT。24h N处理后，
16
收集韧皮部树液。使用EDTA‐Na2收集法测量韧皮部树液pH，并且在OsNRT2.3b过量表达株系中发现较少的酸化。WT与过量表达株系之间的差别在硝酸盐条件下为约0.2个pH单位，在铵条件下为约0.1个pH单位。为了使用不同方法检验韧皮部pH，从韧皮部喂饲的昆虫收集树液(在图9中所述)。在硝酸盐供应24至48h处理时，WT韧皮部pH从7.8降至6.1，b‐S6从6.7降至6.0(图9a)；而在铵处理时，从24至48h，WT韧皮部pH从7.4降至6.3，b‐S6从6.6降至5.9(图9b)。在硝酸盐供应下，WT与b‐S6之间的差别在24小时显著高，然而，到48小时没有发现显著性差别。在铵供应时，尽管WT树液中的pH高于b‐S6，但是差别不显著(图9b)。硝酸盐条件下WT韧皮部pH的酸化为约1.7个pH单位，然而，在b‐S6植株中其仅为0.7个pH单位(图3e)。到48小时时，调节收集的韧皮部pH树液，以使WT和b‐S6植株给出更相似的数值(图9b)。此外，在不同N处理后72小时，用
17
溴甲酚紫指示剂检测WT和b‐S6根中根部质外体pH。相对于WT，过量表达株系b‐S6在硝酸盐条件下表现出碱化作用，在铵条件下表现出酸化作用(图18a，b)，而水培培养基的pH在相同的时间量程中在WT与b‐S6之间没有表现出显著性差异(图18c)，原因在于大体积溶液足够多足以缓冲根表面发生的任何pH变化。

[0239] 还测量了在硝酸铵供应下植株的总P和Fe。与WT相比，在过量表达株系的叶中总P和Fe都增加了(图19)，特别对于总Fe，其比WT多3‐6倍。

[0240] OsNRT2.3b过量表达增加在pH 4和6在铵和硝酸盐混合供应下的总N摄入。

[0241] 在pH 4和6对N‐饥饿的植株重新供应NH415NO3或 15NH4NO3或 15NH415NO35分钟来测量根的N摄入(图4)。这些结果清楚表明，对于WT和所有OsNRT2.3b转基因株系，随着pH15 ‐ 15 + 15
增加，NO3 流入减少，NH4和总 N显著增加(比较图4a，b，c)。在pH 4和6，OsNRT2.3b
15
过量表达株系表现出更多的 NH4NO3和总N摄入。在田间实验中，土壤pH在4.4‐6.4的范围内(图1，2，13‐14)，田间种植的转基因株系的表型可以由这些植物的提高的总N获取(硝酸盐和铵)进行解释。

[0242] 由胞质pH调节的OsNRT2.3b转运功能

[0243] 由于OsNRT2.3b的过量表达对水稻的NUE和生长具有这样的主要影响，并且这种影响与植物pH稳态相关，因此，我们在分子水平上更详细地研究了转运蛋白功能。在异源表达实验中，在表达OsNRT2.3b的爪蟾卵母细胞的膜电势中由硝酸盐引发的变化不能响应后续的硝酸盐处理(图5a)。卵母细胞需要在硝酸盐处理之间休眠至少30分钟，以恢复电响应，或者其可以在用pH 8.0的盐水洗涤后立即响应硝酸盐(图5a)。双筒pH电极测量显示0.2个pH的胞质pH酸化防止OsNRT2.3b注射的卵母细胞的第二硝酸盐响应(图5a)。与针对外部硝酸盐处理的膜电势改变相比，观察到胞质pH响应的略微的延迟(图5a)。其
18,19
他作者阐述了这种对膜电势响应的胞质pH延迟。

[0244] 使用软件包预测了OsNRT2.3b共有的跨膜(TM)二级结构。14个软件包预测OsNRT2.3具有11个TM，N端在胞质一侧，并且前5个TM记述在下表中。在表格和附图中都预测H 167氨基酸位于胞质一侧，其显示单位点诱变靶标被环绕在下述预测的二级结构中，该二级结构由http://bioinfo.si.hirosaki‐u.ac.jp/～ConPred2/.预测。pH‐感应基序VYEAIHKI在胞质一侧上的残基167周围。

[0245] 有趣的是，预测的OsNRT2.3b蛋白结构的生物信息学分析揭示pH‐感应基序20
VYEAIHKI 在OsNRT2.3b朝向质膜的胞质一侧的组氨酸(H)残基周围。单位点突变(H167R)后，甚至在重复的硝酸盐处理循环后，OsNRT2.3b失去这种胞质pH调节的功能(图5b)。结果表明，内源性卵母细胞细胞pH稳定机制能够使胞质pH恢复到OsNRT2.3b转运活性的阈值之上。由于OsNRT2.3b的H167R和野生型形式的比较显示突变导致多得多的硝酸积聚
15
(图5c)，因此，将卵母细胞在 N‐硝酸盐中温育仅4个小时时，胞质pH对硝酸盐转运的调节作用是明显的。然而，8小时温育后，两种形式的转运蛋白的活性之间的差别已经消失；
这表明在较长时间的温育后，卵母细胞中的硝酸盐积聚已经达到最大。

[0246] 减少的光呼吸基因表达和光呼吸

[0247] 已知一些基因与植物光呼吸活性特异性相关21。微阵列和验证性qPCRs显示这样一种表达模式：当与WT和具有增加的OsNRT2.3a转录体的株系比较时，在过量表达OsNRT2.3b的水稻中的光呼吸被改变。

[0248] 与WT相比，b‐S2和b‐S6中的总光合作用增加，但是b‐U1和b‐U2没有显著增加。然而，与WT相比，在所有过量表达株系中，细胞内CO2浓度增加，光呼吸速率降低(图22
20)。转基因植物中减少的光呼吸和提高的光合作用可以产生更多的生物量。这些数据表明在过量表达OsNRT2.3b的植物中提高的光合作用效率有助于强表型。

[0249] 讨论

[0250] OsNRT2.3b的pH感应活性转换是提供关于转基因植物表型的解释的关键因素之一，原因在于将OsNRT2.3b H167R突变体转化到日本晴植株中没有增加高度、产量，没有延迟繁殖期(图21)。在残基167周围的pH‐感应基序VYEAIHKI(SEQ ID No.16)是阴离子交换剂家族的特征，其存在于多种不同的生物体中，包括哺乳动物，并且因此可以有更常见20
的生物学意义。提高外部pH减少表达OsNRT2.3b的卵母细胞中的硝酸盐积聚(图5d)，
14
这支持OsNRT2.3b是质子‐硝酸盐共转运蛋白的观点。提高外部pH减少质子梯度驱动的硝酸盐转运，但是另一方面，其通过使胞质更碱性而恢复OsNRT2.3b的硝酸盐转运功能。
两种作用通过pH改变发生，但是每种作用发生在质膜的不同侧。在植物中(In planta)，硝酸盐和铵的同时流入与OsNRT2.3b感应基序的胞质pH调节作用相反。硝酸盐进入细胞的
23
质子‐共转运机制提供胞质酸化，而铵转运可以引起碱化作用，这可以增强质子‐偶联的硝酸盐转运。在铵和硝酸盐转运之间对维持胞质pH的这种短期的协同作用可以解释当对
15
植株供应混合的N源时测量到的 N‐铵摄入的增加(图4)，排除在卵母细胞中OsNRT2.3b
13
蛋白本身可能吸收铵的可能性(图22)。在WT植株中，OsNRT2.3b表达低，并且主要位于叶而不是根的韧皮部中(图1d)。具有由强启动子驱动的OsNRT2.3b过量表达的转基因植物具有更普遍的组织表达(图1d)。通过在根细胞中更普遍地过量表达pH感应转运蛋白OsNRT2.3b而提高铵与硝酸盐转运之间的协同性。

[0251] 公知用于植物的N供应形式影响植物的pH平衡24。铵的同化作用每个NH4+产生+ ‐ ‐4 ‐至少一个H；而NO3 同化每个NO3 产生几乎一个OH 。超过维持细胞质pH的需要的量产+ ‐ + 4,10
生的H或OH 以需要能量的步骤(例如，质膜H泵出ATP酶)从细胞中输出。在WT植
物中OsNRT2.3b的维管特异性的表达表明在植物中长距离转运的可能的特异性作用。为了检测这一观点，我们比较了来自重新供应硝酸盐或铵的N‐饥饿水稻植株的韧皮部树液的pH。硝酸盐和铵供应使WT和转基因植物的韧皮部pH酸化(图3d，e)。有趣的是，当与WT相比时，在四株转基因株系中，韧皮部的酸化显著更低(图3d，e)，尽管在韧皮部中可能检测不到硝酸盐浓度的显著差异(数据未显示)。这些数据表明，转基因植物能够更好地调节韧皮部pH，这表明这是改善的NUE的重要因素。此外，WT和转基因之间的韧皮部pH差异(图17a，b)可能解释在OsNRT2.3b过量表达植株叶中增加的P和Fe积聚(图19)。较酸
25
的韧皮部树液(图17)有益于P和Fe向叶片的转运。与增强的N获取一起，这也是植物生长和产量提高的重要因素。

[0252] 已经报道胞质pH酸化使卵母细胞中的水通道蛋白的转运失活26。如这些和其他作26
者所讨论的，其提议胞质pH可能是植株中水通道蛋白和硝酸盐转运的关键调节。此外，
27 4,28
由于硝酸盐同化作用依赖于光呼吸，因此，硝酸盐、铵的同化作用与光呼吸之间的关系
29
与苹果酸盐在细胞质和叶绿体之间的穿梭紧密偶联，从而平衡pH 。

[0253] 公知多种重要的农作物特征，如NUE，是复杂的多基因特征4。然而，一些报道表明30‐32
改变单个转基因的表达能够显著改善农作物NUE 。OsNRT2.3b转化植株在不同田间条件下明显增强的表现表明通过单转基因方法改善水稻NUE的前景。pH平衡与NUE的偶联可能对农作物具有更普遍的相关性，并且提供了一种有希望的改善NUE的方式。

[0254] 2.在拟南芥中表达OsNRT2.3b

[0255] 我们已经获得的关于35S‐驱动的OsNRT2.3b在拟南芥中的表达的数据。用标准的花‐浸渍土壤杆菌介导的转化技术(Clough&Bent 1998)转化拟南芥植物。在培养皿生长实验中，对拟南芥植物供应0.2或6mM硝酸盐供应物。检测三棵独立的过量表达OsNRT2.3b的拟南芥植物的株系(使用RT‐PCR在mRNA水平上检验)，并与野生型对照植物比较(见图6)。图6中的数据表明，相对于野生型植物，在6mM硝酸盐上生长的三棵独立的过量表达水稻转运蛋白的拟南芥株系具有显著更多的茎干生物量(图A)，并且在0.2mM供应上具有较短的根(图B)。此外，这些株系中的两棵积聚更多的组织硝酸盐。

[0256] 这些植株生长为在琼脂培养皿上的非常简单的培养系统，植物的营养添加在琼脂上(详细见Orsel等2006)。我们将在水培培养和土壤盆中重复这些实验，以确定并比较野生型和过量表达OsNRT2.3b的株系之间的NUE。在培养皿和水培实验中使用富含15N的硝酸盐，以测量并比较野生型和过量表达株系之间的硝酸盐流入(方法见Orsel等2006)。植株将在混合的氮供应中生长并比较，所述混合的氮供应包括硝酸铵或硝酸盐作为唯一的氮源。

[0257] 3.在烟草中表达OsNRT2.3b

[0258] 方法和材料：

[0259] 过量表达载体的构建和转基因植物

[0260] 通过基因特异性引物(表1)扩增OsNRT2.3b的开放阅读框。片段用限制性酶处理，插入到载体中，并且在转化之前测序。用土壤杆菌介导的方法(Ai等2009)转化烟草栽培种89胚愈伤组织。获得一个拷贝插入的T0植株，生长产生T1植株(图1)。采用纯合的T1植株产生T2。

[0261] Southern‐印迹

[0262] 通过按照之前所述的步骤(Jia等，2011)通过Southern‐印迹分析确定具有OsNRT2.3a基因敲低的独立的转基因株系，即，r1和r2。

[0263] 半定量RT‐PCR

[0264] 用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从100mg植物材料中分离总RNA。通过UV分光光度法(Eppendorf，Biophotometer，德国)确定总RNA浓度。将来自每种样品的2μg总RNA用作第一链cDNA合成的模板，其使用M‐MLV反转录酶(Fermentas，Foster City，CA，USA)按照供应商手册进行。对靶基因，使用以下所示的特异性引物使用Taq DNA聚合酶(Fermentas，Foster City，CA，USA)进行PCR扩增。

[0265] 4.在小麦中表达OsNRT2.3b

[0266] NRT2.3b的位于韧皮部的表达，和最近的发现：显著量的硝酸盐在韧皮部中转运，例如，Fan等2009(之前通常认为硝酸盐在木质部中从根转运到茎干中)，连同韧皮部在pH稳态中的重要作用，表明OsNRT2.3b的韧皮部特异性的表达可能对于所报道的结果(例如，改善的NUE)是重要的。由于这些原因，我们使用泛素和韧皮部特异性启动子在小麦中驱动OsNRT2.3b的表达。如图27和28所示，使用泛素启动子进行转化。35S‐OsNRT2.3b载体的构建记述在水稻转化中，并且如所述(Cao等)，通过颗粒轰击由敏感品种Yangmai158不成熟的胚培养的愈伤组织产生小麦。与wt植株相比，转基因植株表现出提高的产量。参见图27和28。

[0267] 5.转基因水稻的病原体抗性

[0268] 在海南的田间试验中分析上述产生的表达OsNRT2.3b的转基因水稻植株的病原体抗性。海南的主要水稻病害是镰刀菌枯萎病、叶枯病和条锈病。对每块田，由收获时水稻植株数/1月初转移的水稻植株计数存活率。与野生型植株相比，转基因植株表现出更好的存活率(图26)。

[0269] 用于OsNRT2.3b基因的RT‐PCR的引物

[0270] 基因引物

[0271] OsNRT2.3b(AKO72215)

[0272] F：5'-CGTTCGCCGTGTT-3'(SEQ ID No.21)

[0273] R：5'-TCGAAGCGGTCGTAG AAG-3'(SEQ ID No.22)

[0274] 肌动蛋白

[0275] F：5'-TTATGGTTGGGATGGGACA-3'(SEQ ID No.23)

[0276] R：5'-AGCACGGCTTGAATAGCG-3'(SEQ ID No.24)

[0277] 用于过量表达构建体的引物

[0278]

[0279] 用于将OsNRT2基因和OsNAR2基因亚克隆到pT7Ts中的引物

[0280]

[0281] 用于OsNRT2.3b的H167R位点突变体的引物

[0282]

[0283] aATT和ATC的产物是相同的氨基酸，即，异亮氨酸。

[0284] 用于OsNRT2.3基因的RT‐PCR的引物

[0285]

[0286] 表1.图16的盆实验中在OsNRT2.3b过量表达植株和日本晴野生型之间的生长期差别

[0287]

[0288] 注：土壤盆实验在南京农业大学的实验农场中以十次重复进行(数据显示在图SF9中)。酸性土壤(pH 6.0，土壤:水＝1:1)采集自农场。在每个含有15kg添加了2.25g N的晾干的土壤的盆中种植属于两个独立的株系的一棵野生型、b‐S2和b‐S6植株(n＝10)。在移植前将盆中的土壤浸泡1天，并且水保持5‐10cm深，直至收获前15天。当盆中的大部分圆锥花序表现出完全失去绿色时，记录成熟度。当WT植株成熟时，收获五个重复盆的植物样品，并且当b‐S2和b‐S6植株成熟时，收获另五个重复盆的植物样品。将植株挖出，并分离成植物性生物量和谷物。所有的植株样品在70℃烘干，称重并且碾磨成粉末，然后二次取样用于N确定。通过标准的macro‐Kjeldahl方法确定植物组织和种子的N浓度。

[0289] 表2.图16的盆实验中OsNRT2.3b过量表达植株和WT的农艺特征。

[0290]

[0291] 注：数值为平均数±S.E(n＝10)，小写字母表示用单向ANOVA分析5％水平的差异显著性。

[0292] 表3.在图16盆实验中OsNRT2.3b过量表达对植物生物量转移和积聚的影响。

[0293]

[0294] 注：1)数值为平均数±S.E(n＝10)，小写字母(a，b)表示与WT相比5％水平的差异显著性；2)盆实验按表1所述进行；干物质易位计算为eD‐(fD‐fGD)；干物质转运效率计算为(eD‐(fD‐fGD))/eD；干物质转运的贡献计算为(eD‐(fD‐fGD))/fGD。

[0295] 表4.图18的盆实验中OsNRT2.3b过量表达对植物氮转运和积聚的影响。

[0296]

[0297] 注：1)数值为平均数±S.E(n＝10)，小写字母(a，b)表示与WT相比5％水平的差异显著性；2)盆实验按表1所述进行；3).氮易位计算为eN‐(fN‐fGN)；氮转运效率计算为eN‐(fN‐fGN)/eN；氮易位贡献计算为eN‐(fN‐fGN)/fGN；

[0298] 表5.图2a的田间实验中OsNRT2.3b过量表达植株和WT的农艺学特征。

[0299]

[0300]

[0301] 注：对来自每次处理的每次重复的十棵植株用于该农艺分析和三次重复。数值为平均数±S.E(n＝30)。小写字母(a，b)表示与WT相比5％水平的差异显著性。

[0302] 序列表

[0303] SEQ ID No.1OsNRT2.3b核酸序列，登记号:AK072215最长的ORF，参见http：//cdna01.dna.affrc.go.ip/cDNA/report/KOME AKO72215.ktml

[0304] ATGGAGGCTAAGCCGGT

[0305] GGCGATGGAGGTGGAGGGGGTCGAGGCGGCGGGGGGCAAGCCGCGGTTCAGGATGCCGGTGGACTCCGACCTCAAGGCGACGGAGTTCTGGCTCTTCTCCTTCGCGAGGCCACACATGGCCTCCTTCCACATGGCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCGTGTCCACGTTCGCCGTGTTCGCGCGTCTGGCCATGGGCACGGCGTGCGACCTGGTCGGGCCCAGGCTGGCCTCCGCGTCTCTGATCCTCCTCACCACACCGGCGGTGTACTGCTCCTCCATCATCCAGTCCCCGTCGGGGTACCTCCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCATCTCGCTGGCGTCGTTCGTGTCGGCGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCGGCCCCCAAAGTGGGGCTGGCCAACGGCGTGGCCGGCGGCTGGGGCAACCTCGGCGGCGGCGCCGTCCAGCTGCTCATGCCGCTCGTGTACGAGGCCATCCACAAGATCGGTAGCACGCCGTTCACGGCGTGGCGCATCGCCTTCTTCATCCCGGGCCTGATGCAGACGTTCTCGGCCATCGCCGTGCTGGCGTTCGGGCAGGACATGCCCGGCGGCAACTACGGGAAGCTCCACAAGACTGGCGACATGCACAAGGACAGCTTCGGCAACGTGCTGCGCCACGCCCTCACCAACTACCGCGGCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGCTACAGCTTCGGCGTCGAGCTCACCATCGACAACGTCGTGCACCAGTACTTCTACGACCGCTTCGACGTCAACCTCCAGACCGCCGGGCTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCATCTCCCGCCCCGGCGGCGGGCTACTCTCCGACTGGCTCTCCAGCCGGTACGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGGCTGTGGACTGTGCAGACCATCGGCGGCGTCCTCTGCGTGGTGCTCGGAATCGTCGACTTCTCCTTCGCCGCGTCCGTCGCCGTGATGGTGCTCTTCTCCTTCTTCGTCCAGGCCGCGTGCGGGCTCACCTTCGGCATCGTGCCGTTCGTGTCGCGGAGGTCGCTGGGGCTCATCTCCGGGATGACCGGCGGCGGGGGCAACGTGGGCGCCGTGCTGACGCAGTACATCTTCTTCCACGGCACAAAGTACAAGACGGAGACCGGGATCAAGTACATGGGGCTCATGATCATCGCGTGCACGCTGCCCGTCATGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGCTCGTAGGCCCGAGGAAGGGGGCCACGGCGGAGGAGTACTACAGCCGGGAGTGGTCGGATCACGAGCGCGAGAAGGGTTTCAACGCGGCCAGCGTGCGGTTCGCGGAGAACAGCGTGCGCGAGGGCGGGAGGTCGTCGGCGAATGGCGGACAGCCCAGGCACACCGTCCCCGTCGACGCGTCGCCGGCCGGGGTGTGA

[0306] SEQ ID No.2 OsNRT2.3a核酸序列，登记号：AK109776最长的ORF

[0307] ATGGAGGCTAAGCCGGTG

[0308] GCGATGGAGGTGGAGGGGGTCGAGGCGGCGGGGGGCAAGCCGCGGTTCAGGATGCCGGTGGACTCCGACCTCAAGGCGACGGAGTTCTGGCTCTTCTCCTTCGCGAGGCCACACATGGCCTCCTTCCACATGGCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCGTGTCCACGTTCGCCGCGCCGCCGCTGCTGCCGCTCATCCGCGACACCCTCGGGCTCACGGCCACGGACATCGGCAACGCCGGGATCGCGTCCGTGTCGGGCGCCGTGTTCGCGCGTCTGGCCATGGGCACGGCGTGCGACCTGGTCGGGCCCAGGCTGGCCTCCGCGTCTCTGATCCTCCTCACCACACCGGCGGTGTACTGCTCCTCCATCATCCAGTCCCCGTCGGGGTACCTCCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCATCTCGCTGGCGTCGTTCGTGTCGGCGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCGGCCCCCAAAGTGGGGCTGGCCAACGGCGTGGCCGGCGGCTGGGGCAACCTCGGCGGCGGCGCCGTCCAGCTGCTCATGCCGCTCGTGTACGAGGCCATCCACAAGATCGGTAGCACGCCGTTCACGGCGTGGCGCATCGCCTTCTTCATCCCGGGCCTGATGCAGACGTTCTCGGCCATCGCCGTGCTGGCGTTCGGGCAGGACATGCCCGGCGGCAACTACGGGAAGCTCCACAAGACTGGCGACATGCACAAGGACAGCTTCGGCAACGTGCTGCGCCACGCCCTCACCAACTACCGCGGCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGCTACAGCTTCGGCGTCGAGCTCACCATCGACAACGTCGTGCACCAGTACTTCTACGACCGCTTCGACGTCAACCTCCAGACCGCCGGGCTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCATCTCCCGCCCCGGCGGCGGGCTACTCTCCGACTGGCTCTCCAGCCGGTACGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGGCTGTGGACTGTGCAGACCATCGGCGGCGTCCTCTGCGTGGTGCTCGGAATCGTCGACTTCTCCTTCGCCGCGTCCGTCGCCGTGATGGTGCTCTTCTCCTTCTTCGTCCAGGCCGCGTGCGGGCTCACCTTCGGCATCGTGCCGTTCGTGTCGCGGAGGTCGCTGGGGCTCATCTCCGGGATGACCGGCGGCGGGGGCAACGTGGGCGCCGTGCTGACGCAGTACATCTTCTTCCACGGCACAAAGTACAAGACGGAGACCGGGATCAAGTACATGGGGCTCATGATCATCGCGTGCACGCTGCCCGTCATGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGCTCGTAGGCCCGAGGAAGGGGGCCACGGCGGAGGAGTACTACAGCCGGGAGTGGTCGGATCACGAGCGCGAGAAGGGTTTCAACGCGGCCAGCGTGCGGTTCGCGGAGAACAGCGTGCGCGAGGGCGGGAGGTCGTCGGCGAATGGCGGACAGCCCAGGCACACCGTCCCCGTCGACGCGTCGCCGGCCGGGGTGTGA

[0309] SEQ ID No.3 OsNRT2.3b氨基酸序列(最长的ORF)

[0310] MEAKPVAMEVEGVEAAGGKPRFRMPVDSDLKATEFWLFSFARPHMASFHMAWFSFFCCFVSTFAVFARLAMGTACDLVGPRLASASLILLTTPAVYCSSIIQSPSGYLLVRFFTGISLASFVSAQFWMSSMFSAPKVGLANGVAGGWGNLGGGAVQLLMPLVYEAIHKIGSTPFTAWRIA FFIPGLMQTFSAIAVLAFGQDMPGGNYGKLHKTGDMHKDSFGNVLRHALTNYRGWILALTYGYSFGVELTIDNVVHQYFYDRFDVNLQTAGLIAASFGMANIISRPGGGLLSDWLSSRYGMRGRLWGLWTVQTIGGVLCVVLGIVDFSFAASVAVMVLFSFFVQAACGLTFGIVPFVSRRSLGLISGMTGGGGNVGAVLTQYIFFHGTKYKTETGIKYMGLMIIACTLPVMLIYFPQWGGMLVGPRKGATAEEYYSREWSDHEREKGFNAASVRFAENSVREGGRSSANGGQPRHTVPVDASPAGV

[0311] SEQ ID No.4 OsNRT2.3a氨基酸序列

[0312] MEAKPVAMEVEGVEAAGGKPRFRMPVDSDLKATEFWLFSFARPHMASFHMAWFSFFCCFVSTFAAPPLLPLIRDTLGLTATDIGNAGIASVSGAVFARLAMGTACDLVGPRLASASLILLTTPAVYCSSIIQSPSGYLLVRFFTGISLASFVSAQFWMSSMFSAPKVGLANGVAGGWGNLGGGAVQLLMPLVYEAIHKIGSTPFTAWRIAFFIPGLMQTFSAIAVLAFGQDMPGGNYGKLHKTGDMHKDSFGNVLRHALTNYRGWILALTYGYSFGVELTIDNVVHQYFYDRFDVNLQTAGLIAASFGMANIISRPGGGLLSDWLSSRYGMRGRLWGLWTVQTIGGVLCVVLGIVDFSFAASVAVMVLFSFFVQAACGLTFGIVPFVSRRSLGLISGMTGGGGNVGAVLTQYIFFHGTKYKTETGIKYMGLMIIACTLPVMLIYFPQWGGMLVGPRKGATAEEYYSREWSDHEREKGFNAASVRFAENSVREGGRSSANGGQPRHTVPVDASPAGV

[0313] SEQ ID No.5韧皮部启动子序列

[0314]

[0315] SEQ ID No.6玉米(Zea mays)Id No.GRMZM2G455124*核酸序列

[0316] ATGGCGGAGGGGGAGTTCAAGCCCGCGGCGATGCAGGTGGAGGCTCCTGCCGAGGCGGCGGCGGCGCCGTCCAAGCCGCGGTTCAGGATGCCCGTCGACTCCGACAACAAGGCCACCGAGTTCTGGCTCTTCTCCTTCGCGAGGCCGCACATGAGCGCCTTCCACATGTCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCCTCTCCACCTTCGCGGCGCCGCCGCTGCTCCCGCTCATCCGGGACACGCTGGGGCTCACGGCCACGGACATCGGCAACGCCGGGATCGCCTCCGTGTCCGGCGCGGTCTTCGCGCGCGTGGCCATGGGCACGGCGTGCGACCTGGTGGGCCCGCGCCTGGCGTCCGCGGCCATCATACTCCTCACCACGCCCGCCGTCTACTACTCCGCCGTCATCGACTCCGCCTCGTCCTACCTGCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCTTCTCGCTCGCGTCCTTCGTGTCCACGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCGCCGCCCAAGGTGGGGCTGGCCAACGGCGTCGCCGGGGGGTGGGGCAACCTCGGCGGCGGCGCCGTGCAGCTCATCATGCCGCTCGTGTTCGAGGCCATCCGCAAGGCCGGGGCCACGCCGTTCACGGCGTGGCGCGTCGCCTTCTTCGTCCCGGGCCTGCTGCAGACGCTGTCGGCCGTCGCCGTGCTGGCGTTCGGCCAGGACATGCCCGACGGCAACTACCGCAAGCTGCACAGGTCCGGCGACATGCACAAGGACAGCTTCGGCAACGTGCTCCGCCACGCCGTCACCAACTACCGCGCCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGATACTGCTTCGGCGTGGAGCTCGCCGTGGACAACATCGTCGCGCAGTACTTCTACGACCGCTTCGGCGTCAAGCTCAGCACCGCCGGCTTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCGTCTCCCGCCCCGGCGGCGGCCTCCTGTCGGACTGGCTCTCCAGCCGCTTCGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGCCTGTGGGTGGTGCAGACCATCGGGGGCGTCCTCTGCGTCGTGCTCGGCGCCGTCGACTACTCCTTCGCCGCGTCCGTGGCCGTCATGATACTCTTCTCCATGTTCGTGCAGGCGGCCTGCGGGCTCACCTTTGGCATCGTCCCGTTCGTCTCCCGAAGGTCGCTGGGGCTCATCTCCGGCATGACCGGCGGCGGCGGCAACGTGGGCGCCGTGCTCACGCAGCTCATCTTCTTCCACGGATCCAAGTACAAGACGGAGACGGGGATCAAGTACATGGGGTTCATGATCATCGCCTGCACGTTGCCCATCACGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGTTCCTGGGGCCGCGGCCCGGGGCGACGGCGGAGGACTACTACAACCGGGAGTGGACAGCGCACGAGTGCGACAAGGGTTTCAACACCGCGAGCGTACGCTTTGCGGAGAACAGCGTGCGGGAAGGGGGACGCTCGGGCAGCCAGTCCAAGCACACTACTGTGCCCGTCGAGTCCTCGCCGGCCGACGTGTGA

[0317] SEQ ID No.7玉米(Zea mays)Id No.GRMZM2G455124*氨基酸序列

[0318] MAEGEFKPAAMQVEAPAEAAAAPSKPRFRMPVDSDNKATEFWLFSFARPHMSAFHMSWFSFFCCFLSTFAAPPLLPLIRDTLGLTATDIGNAGIASVSGAVFARVAMGTACDLVGPRLASAAIILLTTPAVYYSAVIDSASSYLLVRFFTGFSLASFVSTQFWMSSMFSPPKVGLANGVAGGWGNLGGGAVQLIMPLVFEAIRKAGATPFTAWRVAFFVPGLLQTLSAVAVLAFGQDMPDGNYRKLHRSGDMHKDSFGNVLRHAVTNYRAWILALTYGYCFGVELAVDNIVAQYFYDRFGVKLSTAGFIAASFGMANIVSRPGGGLLSDWLSSRFGMRGRLWGLWVVQTGGVLCVVLGAVDYSFAASVAVMILFSMFVQAACGLTFGIVPFVSRRSLGLISGMTGGGGNVGAVLTQLIFFHGSKYKTETGIKYMGFMIIACTLPITLIYFPQWGGMFLGPRPGATAEDYYNREWTAHECDKGFNTASVRFAENSVREGGRSGSQSKHTTVPVESSPADV

[0319] SEQ ID No.8大豆(Glycine max)Id No.Glyma13g39850核酸序列

[0320] TCACACTTTCTTCCTTAATTTTCTAGCTCTTGCTACGTACTTGAATTCAATTAGTTATTAATGGCTGAGATTGAGGGTTCTCCCGGAAGCTCCATGCATGGAGTAACAGGAAGAGAACAAACATTTGTAGCCTCAGTTGCTTCTCCAATTGTCCCTACAGACACCACAGCCAAATTTGCTCTCCCAGTGGATTCAGAACACAAGGCCAAGGTTTTCAAACTCTTCTCCCTGGCCAATCCCCACATGAGAACCTTCCACCTTTCTTGGATCTCCTTCTTCACCTGCTTCGTCTCGACATTCGCAGCAGCACCTCTTGTGCCCATCATCCGCGACAACCTTAACCTCACCAAAAGCGACATTGGAAACGCCGGGGTTGCTTCTGTCTCCGGAAGCATCTTCTCAAGGCTCGCAATGGGTGCAGTCTGTGACATGTTGGGTCCACGCTATGGCTGCGCCTTCCTCATCATGCTTTCGGCCCCTACGGTGTTCTGCATGTCCTTTGTGAAAGATGCTGCGGGGTACATAGCGGTTCGGTTCTTGATTGGGTTCTCGTTGGCGACGTTTGTGTCGTGCCAGTACTGGATGAGCACGATGTTCAACAGTAAGATTATAGGGCTTGCGAATGGGACTGCTGCGGGGTGGGGGAACATGGGTGGTGGAGCCACTCAGCTCATAATGCCTTTGGTGTATGAGCTTATCAGAAGAGCTGGGGCTACTCCCTTCACTGCTTGGAGGATTGCCTTCTTTGTTCCGGGTTTCATGCATGTCATCATGGGGATTCTTGTCCTCACTCTAGGCCAGGACTTGCCTGATGGAAACCTCGGGGCCTTGCGGAAGAAGGGTGATGTAGCTAAAGACAAGTTTTCCAAGGTGCTATGGTATGCCATAACAAATTACAGGACATGGATTTTTGCTCTCCTCTATGGGTACTCCATGGGAGTTGAATTAACAACTGACAATGTCATTGCTGAGTATTTCTATGACAGATTTAATCTCAAGCTACACACTGCTGGAATCATTGCTGCTTCATTTGGAATGGCAAACTTAGTTGCTCGACCTTTTGGTGGATATGCTTCAGATGTTGCAGCCAGGCTGTTTGGCATGAGGGGAAGACTCTGGACCCTTTGGATCCTCCAAACCTTAGGAGGGGTTTTCTGTATTTGGCTTGGCCGTGCCAATTCTCTTCCTATTGCTGTATTGGCCATGATCCTGTTCTCTATAGGAGCTCAAGCTGCATGTGGTGCAACTTTTGGCATCATTCCTTTCATCTCAAGAAGGTCTTTGGGGATCATATCAGGTCTAACTGGTGCAGGTGGAAACTTTGGGTCTGGCCTCACCCAATTGGTCTTCTTTTCAACCTCCAAATTCTCTACTGCCACAGGTCTCTCCTTGATGGGTGTAATGATAGTGGCTTGCACTCTACCAGTGAGTGTTGTTCACTTCCCACAGTGGGGTAGCATGTTTCTACCACCCTCAAAAGATGTCAGCAAATCCACTGAAGAATTCTATTACACCTCTGAATGGAATGAGGAAGAGAAGCAGAAGGGTTTGCACCAGCAAAGTCTCAAATTTGCTGAGAATAGCCGATCTGAGAGAGGAAAGCGAGTGGCTTCAGCACCAACACCTCCAAATGCAACTCCCACTCATGTCTAGCCATAGCACTTCAATCAAAGAAGATCATGAAACATAATTACTGAGCAGTATTGGGAATGAAGAACCATGAGTTGAAGAATTTTCTAATAAGAAATCTTGTAACATGTAGACATAGAATGTTCTGGTTCTGGTTTGCGTGTGGTGTAAGAGTTGTCTACTTGTGGTAAGTCATAAGTATCATAATCAGTATGTCAATGCAGATCTTGATGCTGAGTATCAATAGTATCAAAAAAAAAA

[0321] SEQ ID No.9大豆(Glycine max)Id No.Glyma13g39850氨基酸序列

[0322] MAEIEGSPGSSMHGVTGREQTFVASVASPIVPTDTTAKFALPVDSEHKAKVFKLFSLANPHMRTFHLSWISFFTCFVSTFAAAPLVPIIRDNLNLTKSDIGNAGVASVSGSIFSRLAMGAVCDMLGPRYGCAFLIMLSAPTVFCMSFVKDAAGYIAVRFLIGFSLATFVSCQYWMSTMFNSKIIGLANGTAAGWGNMGGGATQLIMPLVYELIRRAGATPFTAWRIAFFVPGFMHVIMGILVLTLGQDLPDGNLGALRKKGDVAKDKFSKVLWYAITNYRTWIFALLYGYSMGVELTTDNVIAEYFYDRFNLKLHTAGIIAASFGMANLVARPFGGYASDVAARLFGMRGRLWTLWILQTLGGVFCIWLGRANSLPIAVLAMILFSIGAQAACGATFGIIPFISRRSLGIISGLTGAGGNFGSGLTQLVFFSTSKFSTATGLSLMGVMIVACTLPVSVVHFPQWGSMFLPPSKDVSKSTEEFYYTSEWNEEEKQKGLHQQSLKFAENSRSERGKRVASAPTPPNATPTHV[0323] SEQ ID No.10大豆(Glycine max)Id No.Glyma12g30050核酸序列

[0324]

[0325] SEQ ID No.11大豆(Glycine max)ID No.Glyma12g30050氨基酸序列

[0326]

[0327] SEQ ID No.12大麦(Hordeum vulgare)Id No.MLOC_75087.1核酸序列

[0328] CCACGCGTCCGCTCATTGCATACGAGGTTGCCAACACTACACAGGTGTAGCAGCAGCCAAGGCAGCTGGTGAGATGGAGGGGGAGTCCAAGCCGGCGGCGATGGGGGTGCAGGCGGCGCCCAAGGGCAAGTTCAGGATACCGGTGGACTCGGACAACAAGGCCACCGAGTTCTGGCTTTTCTCGTTCGTGAGGCCGCACATGAGCGCCTTCCACCTCTCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCGTCTCCACCTTCGCCGCGCCGCCCCTCCTGCCGCTCATCCGGGACAACCTCGGCCTCACGGGCAAGGACATCGGCAACGCCGGCATCGCGTCCGTGTCCGGCGCCGTGTTCGCGCGTCTCGCCATGGGCACGGCCTGCGACCTGGTCGGGCCCCGCCTGGCGTCCGCGGCCATCATACTGCTCACCACCCCCGCGGTGTACTGCTCCGCCATCATCGAGTCCGCCTCGTCGTTCCTGCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCTTCTCGCTCGCCTCCTTCGTGTCGACGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCTTCGCCCAAGGTGGGGCTGGCCAATGGCGTCGCCGGCGGCTGGGGCAACCTGGGCGGGGGCGCCGTGCAGCTCCTCATGCCGCTCGTGTTCGAGGCCGTCCGCAAGATCGGCAGCACGGATTTCATCGCGTGGCGCGTCGCCTTCTTCATCCCGGGCGTCATGCAGACGTTCTCGGCCATCGCCGTGCTGGCGTTCGGGCAGGACATGCCGGACGGCAACTACCGTAAGCTGCACAAGAGCGGGGAGATGCACAAGGACAGCTTCGGCAACGTGCTGCGCCACGCGGTCACGAACTACCGCGCCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGCTACTCCTTCGGCGTGGAGCTCGCCGTGGACAACATCGTCGCGCAGTACTTCTACGACCGCTTCGACGTCAACCTCCACACGGCCGGGCTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCATCTCCCGCCCGGGCGGCGGGCTCATGTCCGACTGGCTCTCCGACCGGTTCGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGGCTGTGGGTCGTGCAGACCATCGGCGGCATCCTCTGCATCGTGCTCGGCATCGTCGACTACTCGTTCGGCGCGTCGGTGGCCGTCATGATCCTCTTCTCCTTCTTCGTGCAGGCGGCGTGCGGGCTCACGTTCGGCATCGTGCCGTTCGTGTCGCGGAGGTCGCTGGGGCTCATCTCCGGAATGACCGGCGGCGGCGGCAACGTGGGGGCCGTGCTGACGCAGGTCATCTTCTTCCGCGGCACCAAGTACAAGACGGAGACGGGGATCATGTACATGGGGCTGATGATCCTGGCATGCACGCTGCCCATCACGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGTTCGTCGGGCCGCGGAAAGGGGCGACGGCGGAGGAGTACTACAGCAAGGAGTGGACCGAGGAGGAGCGTGCCAAGGGGTACAGCGCCGCGACCGAGCGTTTCGCGGAGAACAGCGTGCGCGAGGGCGGGCGGAGGGCGGCGTCGGGCAGCCAGTCAAGGCACACCGTCCCCGTCGACGGCTCGCCGGCCGACGTGTGAGGTCCGAAGAGCTCCCCGTACTACGTGGTCCACGGGTGCAATGGGGGAATACGATCGCGTCGCACGGCCGCCCGGGTTTGGGCCGTCTTCCGTGCACATACGTAGTACTACGAACGCACGCACGCACGCCGGCTTTGTGCTGCTTCTAGTACTGTACGTACGTTTGGGTTTGGTGTGCTCGCTTACCTTAATACTGCTCCGCATGTTGATGTTTATATGCTCCCTTGTGAAATACAGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAA

[0329] SEQ ID No.13大麦(Hordeum vulgare)Id No.MLOC_75087.1氨基酸序列

[0330] MEGESKPAAMGVQAAPKGKFRIPVDSDNKATEFWLFSFVRPHMSAFHLSWFSFFCCFVSTFAAPPLLPLIRDNLGLTGKDIGNAGIASVSGAVFARLAMGTACDLVGPRLASAAIILLTTPAVYCSAIIESASSFLLVRFFTGFSLASFVSTQFWMSSMFSSPKVGLANGVAGGWGNLGGGAVQLLMPLVFEAVRKIGSTDFIAWRVAFFIPGVMQTFSAIAVLAFGQDMPDGNYRKLHKSGEMHKDSFGNVLRHAVTNYRAWILALTYGYSFGVELAVDNIVAQYFYDRFDVNLHTAGLIAASFGMANIISRPGGGLMSDWLSDRFGMRGRLWGLWVVQTIGGILCIVLGIVDYSFGASVAVMILFSFFVQAACGLTFGIVPFVSRRSLGLISGMTGGGGNVGAVLTQVIFFRGTKYKTETGIMYMGLMILACTLPITLIYFPQWGGMFVGPRKGATAEEYYSKEWTEEERAKGYSAATERFAENSVREGGRRAASGSQSRHTVPVDGSPADV

[0331] SEQ ID No.14紫短柄草(Brachypodium distachyon)Id No.Bradi2g47640核酸序列

[0332] ATGGGGGGGGAGTCGAAGCCGGCGGCGATGGATGTGGAGGCGCCGTCCAAGGCCAAGTTCAGGATCCCCGTGGACTCCGACAACAAGGCGACGGAGTTCTGGCTCTTCTCCTTCGCGCGGCCGCACATGAGCGCGTTCCACCTGTCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCGTGTCCACCTTCGCGGCGCCGCCGCTGCTGCCGCTCATCCGGGACAATCTGGGGCTCACGGCCAAGGACATCGGCAACGCCGGGATCGCGTCGGTGTCGGGCGCCGTGTTCGCGCGTCTCGCCATGGGCACGGCCTGCGACCTGGTCGGCCCCCGCCTGGCGTCCGCGGCCATCATACTGCTCACCACCCCGGCGGTGTACTGCTCGGCCATCATCGACTCGGCGTCGTCGTTCCTGCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCTTCTCCCTGGCCTCCTTCGTGTCCACGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCCTCGCCCAAGGTGGGTCTGGCCAACGGCGTGGCCGGGGGCTGGGGCAACCTCGGCGGCGGCGCCGTGCAGCTGATCATGCCGCTGGTGTTCGAGGTCGTGCGCAAGATCGGGAGCACGCGGTTCACGGCGTGGCGCGTGGCCTFCTTCATCCCGGGCGTCATGCAGACGTTCTCGGCCATCGCCGTGCTGGCGTTCGGGCAGGACATGCCGGACGGCAACTACCACAAGCTGCACAAGACCGGGGAGATGCACAGGGACAGCTTCCGCAACGTGCTGCGCCACGCGGTCACCAACTACCGCGCCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGCTACTGCTTCGGCGTGGAGCTCGCCGTGGACAACATCGTGGCGCAGTACTTCTACGACCGCTTCGGCGTCAACCTCCACACGGCGGGGCTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCGTCTCGCGCCCGGGCGGCGGGCTCATGTCCGACTGGCTCTCGGCCCGGTTCGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGCCTGTGGGTCGTGCAGACCATCGGCGGCGTCCTCTGCGTGGTGCTCGGCGTGGTGGACTACTCCTTCGGCGCGTCCGTGGCAGTCATGATACTCTTCTCCCTGTTCGTGCAGGCCGCGTGCGGGCTCACCTTCGGCATCGTGCCGTTCGTGTCGCGGAGGTCGCTGGGGCTCATCTCTGGCATGACCGGCGGCGGGGGAAATGTGGGCGCCGTGCTGACGCAGGTCATCTTCTTCCACGGGTCCAGGTACAAGACGGAGACGGGGATCATGTACATGGGGGTCATGATCATCGCGTGCACGCTGCCCATCACGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGTTCACCGGGCCGCGGCCGGGGGCCACGGCGGAGGAGTATTACAGCTCGGAGTGGACCGAGGAGGAGCGGAAGAAAGGGTACAACGCCGCGACAGAGCGTTTCGCGGAGAACAGCCTGCGCGAGGGAGGGCGGAGGGCCGCGTCGGGCAGCCAGTCCAAGCATACCGTCCCCGTGGACGGATCACCGCCGGCCGACGTGTGAAGAAAATCCCATAGACCATAGTGTACGTTTCGTATGTCTCGCGTCTATAACGAGTCATACGGTCGCCACGGTCGCCGGTCTCGTTACGTGCGTTGGCTTTTTTATGTGTTGTACCTTTTGGCTTTTGGTGCTCCTTTGTCTTGTTGCTGTAAAAGGTTGTCAAATACTCCACTTTTCTTTTCCGCAGACGTGAAATACTTCTGTAGGTGTACGTCACTGAAAGGAAACTGTTCATATGGCATCCACATACAAAACCATGTTTTCTTATATTGCTAGTATATTCGTTTTTCTTATTTCGACGAAACTAGCATTCCGCGTCTATTATTATTCGTAAGATACTTCCGATCGAAAA

[0333] SEQ ID No.15紫短柄草(Brachypodium distachyon)Id No.Bradi2g47640氨基酸序列

[0334] MGGESKPAAMDVEAPSKAKFRIPVDSDNKATEFWLFSFARPHMSAFHLSWFSFFCCFVSTFAAPPLLPLIRDNLGLTAKDIGNAGIASVSGAVFARLAMGTACDLVGPRLASAAIILLTTPAVYCSAIIDSASSFLLVRFFTGFSLASFVSTQFWMSSMFSSPKVGLANGVAGGWGNLGGGAVQLIMPLVFEVVRKIGSTRFTAWRVAFFIPGVMQTFSAIAVLAFGQDMPDGNYHKLHKTGEMHRDSFRNVLRHAVTNYRAWILALTYGYCFGVELAVDNIVAQYFYDRFG

[0335] VNLHTAGLIAASFGMANIVSRPGGGLMSDWLSARFGMRGRLWGLWVVQTIGGVLCVVLGVVDYSFGASVAVMILFSLFVQAACGLTFGIVPFVSRRSLGLISGMTGGGGNVGAVLTQVIFFHGSRYKTETGIMYMGVMIIACTLPITLIYFPQWGGMFTGPRPGATAEEYYSSEWTEEERKKGYNAATERFAENSLREGGRRAASGSQSKHTVPVDGSPPADV[0336] SEQ ID No.67OsNRT2.3b核酸序列，登记号：AK072215下划线字母是最长的ORF[0337] GAGCGCCGGCCTCCCACCGGTCGCGTAAGATCACGCCCGAAATCTTTATTCATTTTCTCTCCACCGGTTGCCCTCTCGCCGCACCCAACCATCGCGCCACGCCGCGCCGCGCTGCCGGAGCCGCGCTTTCCGCTATGCTATAAGAGCTGACGCGCAGGGCACAGCGGATGTACGTACACACAGTCACTAGCTAAGCTGCTAGCCTTGCTACCACGTGTTGGAGATGGAGGCTAAGCCGGTGGCGATGGAGGTGGAGGGGGTCGAGGCGGCGGGGGGCAAGCCGCGGTTCAGGATGCCGGTGGACTCCGACCTCAAGGCGACGGAGTTCTGGCTCTTCTCCTTCGCGAGGCCACACATGGCCTCCTTCCACATGGCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCGTGTCCACGTTCGCCGTGTTCGCGCGTCTGGCCATGGGCACGGCGTGCGACCTGGTCGGGCCCAGGCTGGCCTCCGCGTCTCTGATCCTCCTCACCACACCGGCGGTGTACTGCTCCTCCATCATCCAGTCCCCGTCGGGGTACCTCCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCATCTCGCTGGCGTCGTTCGTGTCGGCGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCGGCCCCCAAAGTGGGGCTGGCCAACGGCGTGGCCGGCGGCTGGGGCAACCTCGGCGGCGGCGCCGTCCAGCTGCTCATGCCGCTCGTGTACGAGGCCATCCACAAGATCGGTAGCACGCCGTTCACGGCGTGGCGCATCGCCTTCTTCATCCCGGGCCTGATGCAGACGTTCTCGGCCATCGCCGTGCTGGCGTTCGGGCAGGACATGCCCGGCGGCAACTACGGGAAGCTCCACAAGACTGGCGACATGCACAAGGACAGCTTCGGCAACGTGCTGCGCCACGCCCTCACCAACTACCGCGGCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGCTACAGCTTCGGCGTCGAGCTCACCATCGACAACGTCGTGCACCAGTACTTCTACGACCGCTTCGACGTCAACCTCCAGACCGCCGGGCTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCATCTCCCGCCCCGGCGGCGGGCTACTCTCCGACTGGCTCTCCAGCCGGTACGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGGCTGTGGACTGTGCAGACCATCGGCGGCGTCCTCTGCGTGGTGCTCGGAATCGTCGACTTCTCCTTCGCCGCGTCCGTCGCCGTGATGGTGCTCTTCTCCTTCTTCGTCCAGGCCGCGTGCGGGCTCACCTTCGGCATCGTGCCGTTCGTGTCGCGGAGGTCGCTGGGGCTCATCTCCGGGATGACCGGCGGCGGGGGCAACGTGGGCGCCGTGCTGACGCAGTACATCTTCTTCCACGGCACAAAGTACAAGACGGAGACCGGGATCAAGTACATGGGGCTCATGATCATCGCGTGCACGCTGCCCGTCATGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGCTCGTAGGCCCGAGGAAGGGGGCCACGGCGGAGGAGTACTACAGCCGGGAGTGGTCGGATCACGAGCGCGAGAAGGGTTTCAACGCGGCCAGCGTGCGGTTCGCGGAGAACAGCGTGCGCGAGGGCGGGAGGTCGTCGGCGAATGGCGGACAGCCCAGGCACACCGTCCCCGTCGACGCGTCGCCGGCCGGGGTGTGAAGAATGCCACGGACAATAAGGTCGCGGTTGTAGTACAACTGTACAAATTGATGGTACGTGTCGTTTGACCGCGCGCGCGCACAGTGTGGGTCGTGGCCTCGTGGGCTTAGTGGAGTACAGTGAGGGGTGTACGTGTGTCGTGGCGCGCGCGGTCACCTCGGTGGCCTTGGGATTGGGGGGGCACTATACGCTAGTACTCCAGATATATACGGGTTTGATTTACTTCTGTGGATCGGCGCTTGTTGGTGGTTTGCTCCCTGTGGTTTTTGTGATGGTAATCATACTCATACTCAAACAGTCAAAACTTTTTGATGCG

[0338] SEQ ID No.68 OsNRT2.3a核酸序列，登记号：AK109776下划线字母是最长的ORF[0339] AGTCACTAGCTAAGCTGCTAGCCTTGCTACCACGTGTTGGAGATGGAGGCTAAGCCGGTGGCGATGGAGGTGGAGGGGGTCGAGGCGGCGGGGGGCAAGCCGCGGTTCAGGATGCCGGTGGACTCCGACCTCAAGGCGACGGAGTTCTGGCTCTTCTCCTTCGCGAGGCCACACATGGCCTCCTTCCACATGGCGTGGTTCTCCTTCTTCTGCTGCTTCGTGTCCACGTTCGCCGCGCCGCCGCTGCTGCCGCTCATCCGCGACACCCTCGGGCTCACGGCCACGGACATCGGCAACGCCGGGATCGCGTCCGTGTCGGGCGCCGTGTTCGCGCGTCTGGCCATGGGCACGGCGTGCGACCTGGTCGGGCCCAGGCTGGCCTCCGCGTCTCTGATCCTCCTCACCACACCGGCGGTGTACTGCTCCTCCATCATCCAGTCCCCGTCGGGGTACCTCCTCGTGCGCTTCTTCACGGGCATCTCGCTGGCGTCGTTCGTGTCGGCGCAGTTCTGGATGAGCTCCATGTTCTCGGCCCCCAAAGTGGGGCTGGCCAACGGCGTGGCCGGCGGCTGGGGCAACCTCGGCGGCGGCGCCGTCCAGCTGCTCATGCCGCTCGTGTACGAGGCCATCCACAAGATCGGTAGCACGCCGTTCACGGCGTGGCGCATCGCCTTCTTCATCCCGGGCCTGATGCAGACGTTCTCGGCCATCGCCGTGCTGGCGTTCGGGCAGGACATGCCCGGCGGCAACTACGGGAAGCTCCACAAGACTGGCGACATGCACAAGGACAGCTTCGGCAACGTGCTGCGCCACGCCCTCACCAACTACCGCGGCTGGATCCTGGCGCTCACCTACGGCTACAGCTTCGGCGTCGAGCTCACCATCGACAACGTCGTGCACCAGTACTTCTACGACCGCTTCGACGTCAACCTCCAGACCGCCGGGCTCATCGCCGCCAGCTTCGGGATGGCCAACATCATCTCCCGCCCCGGCGGCGGGCTACTCTCCGACTGGCTCTCCAGCCGGTACGGCATGCGCGGCAGGCTGTGGGGGCTGTGGACTGTGCAGACCATCGGCGGCGTCCTCTGCGTGGTGCTCGGAATCGTCGACTTCTCCTTCGCCGCGTCCGTCGCCGTGATGGTGCTCTTCTCCTTCTTCGTCCAGGCCGCGTGCGGGCTCACCTTCGGCATCGTGCCGTTCGTGTCGCGGAGGTCGCTGGGGCTCATCTCCGGGATGACCGGCGGCGGGGGCAACGTGGGCGCCGTGCTGACGCAGTACATCTTCTTCCACGGCACAAAGTACAAGACGGAGACCGGGATCAAGTACATGGGGCTCATGATCATCGCGTGCACGCTGCCCGTCATGCTCATCTACTTCCCGCAGTGGGGCGGCATGCTCGTAGGCCCGAGGAAGGGGGCCACGGCGGAGGAGTACTACAGCCGGGAGTGGTCGGATCACGAGCGCGAGAAGGGTTTCAACGCGGCCAGCGTGCGGTTCGCGGAGAACAGCGTGCGCGAGGGCGGGAGGTCGTCGGCGAATGGCGGACAGCCCAGGCACACCGTCCCCGTCGACGCGTCGCCGGCCGGGGTGTGAAGAATGCCACGGACAATAAGGTCGCGGTTGTAGTACAACTGTACAAATTGATGGTACGTGTCGTTTGACCGCGCGCGCGCACAGTGTGGGTCGTGGCCTCGTGGGCTTAGTGGAGTACAGTGAGGGGTGTACGTGTGTCGTGGCGCGCGCGGTCACCTCGGTGGCCTTGGGATTGGGGGGGCACTATACGCTAGTACTCCAGATATATACGGGTTTGATTTACTTCTGTGGATCGGCGCTTGTTGGTGGTTTGCTCCCTGTGGTTTTTGTGATGGTAATCATACTCATACTCAAACAGTC

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有机植物肥-专利编号CN101891531A	2020-05-13	503
儿童植物沐浴液-专利编号CN110917076A	2020-05-13	1111
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