贝类产生和分泌专门的防水生物粘合剂，并且作为防水生物粘合剂 的可能来源已被研究。它们用从贝类的足分泌的足丝牢固地粘合于水下 的表面。每根丝的端部都有含有防水胶的黏着斑，使得该斑可以粘附于 湿的固体表面(Waite，J.H.，Biology Review.58：209-231(1983))。 该黏着牢固并且不溶于水的现象引起了人们对其在生物技术应用上的 潜在用途的关注。贝类黏着蛋白也可以用作医用粘合剂，因为它们对人 体没有毒性，也不会引起免疫原性(Dove et al.，Journal of American Dental Association.112：879(1986))。此外，它们的生物可降解性 也使它们对环境不会造成污染。
足丝可以分为远端部分和近端部分。近端连接贝类足的茎腺(stem gland)，而远端连接黏着斑。黏着斑包括五种不同类型的蛋白：足蛋 白1型(FP-1)至5型(FP-5)(Deming，T.J.，Current Opinion in Chemical Biology.3：100-105(1999))。
所有的贝类黏着蛋白都含有高比例的3，4-二羟基苯-L-丙氨酸 (DOPA)，它来源于酪氨酸残基的羟基化(Waite，J.H.，Biology Review. 58：209-231(1983))。最接近黏着表面的黏着蛋白具有的DOPA残基比 例最高(Waite，J.H.，Integr.Comp.Biol.42：1172-1180)。相 对的，缺乏DOPA的贝类黏着蛋白类似物表现出的黏着能力明显降低(Yu et al.，Journal of American Chemical Society. 121：5825-5826(1999))。事实上，生物化学研究表明DOPA残基能使贝 类黏着蛋白分子通过邻醌的氧化转化彼此交联起来。因此贝类黏着蛋白 的DOPA含量似乎与其黏着能力特异性地相关。
目前由市售可得一种天然提取的贝类黏着蛋白产物Cell-Tak。这 种黏着剂主要包括FP-1型和FP-2型蛋白，还有小部分的FP-3蛋白。 然而，这种天然提取过程十分费力而且效率不高，提取1mg蛋白大约需 要10000只贝(Morgan，D.，The Scientist.4：1-6(1990))。
因此，研究者们力图在例如大肠杆菌(Escherichia coli)或酵母 的表达系统中生产重组贝类黏着蛋白，例如FP-1。然而，以前的研究 由于许多难题而难以表达有功能的和经济的贝类黏着蛋白，所述难题包 括：高度偏爱的氨基酸组成(5种氨基酸类型占据FP-1中总氨基酸的～ 89％)、在贝类和其他表达系统中不同的密码子使用偏好(tRNA应用问 题)以及低蛋白产率(US Patent No.5242808，Filpula et al.， Biotechnol.Prog.6：171-177(1990)，Salemo et al.，Applied Microbiology and Biotechnology 58：209-214(1993)，Kitamura et al.，Journal of polymer Science Part A：Polymer Chemistry， 37：729-736(1999))。

本发明的一个目的是提供一种来源于贝类的新的黏着蛋白基因，并 解决上述的现有技术中的问题。
本发明的另一个目的是提供一种来源于贝类的新的黏着蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种大量生产生物活性形式的贝类黏 着蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供一种重组黏着蛋白，所述重组黏着蛋白 为两种或多种来源于贝类黏着蛋白的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种粘合剂，所述粘合剂含有一种新的 作为活性组分的黏着蛋白。
本发明提供提取自贻贝的新的黏着蛋白和编码该蛋白的多核苷酸。 上述黏着蛋白优选地含有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。上述多核 苷酸一个实例是示于SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组黏着蛋白，其中来源于FP-1的一些氨基酸 序列附加于贝类黏着蛋白的氨基端和/或羧基端，还提供编码该重组黏 着蛋白的多核苷酸。所述重组黏着蛋白的氨基酸序列的实例选自下述序 列所示出的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO： 14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22。编码所述重 组黏着蛋白的核苷酸序列的实例选自下述序列所示出的核苷酸序列： SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。
本发明还提供一种载体，所述载体含有编码黏着蛋白的可操控的核 苷酸序列。
本发明还提供一种转化体，所述转化体含有编码黏着蛋白的可操控 的核苷酸序列。
本发明还提供一种生产黏着蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)构建含有编码黏着蛋白的可操控的核苷酸序列的载体；
(b)通过将所述载体转化至宿主细胞构建转化体；以及
(c)通过培养所述转化体生产重组黏着蛋白。
本发明还提供一种纯化黏着蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)裂解转化体，然后离心分离上清液和沉淀；
(b)通过向沉淀加入酸性有机溶剂而制成悬液；以及
(c)离心所述悬液以分离上清液。
本发明还提供一种粘合剂，所述粘合剂含有一种作为活性组分的黏 着蛋白。
本发明还提供一种调节粘合剂的粘合特性的方法，所述方法包括： 控制作为上述粘合剂活性组分的黏着蛋白的浓度，或用选自氧化剂、填 充剂和表面活性剂的一种或多种物质处理该粘合剂。
本发明还提供一种包被材料，所述包被材料含有一种作为活性组分 的黏着蛋白。

图1为以提取自贻贝的RNA为模板的RT-PCR所获得的MGFP-5 cDNA 片段的电泳图。
图2显示的是通过将MGFP-5 cDNA插入pTrcHis载体而构建pMDG05 载体的过程。
图3显示的是FP-1变体(在此处以后均称为“6×AKPSYPPTYK”)， 其中肽AKPSYPPTYK串联了6次，并且在其合成中使用了寡聚体KD-1、 KD-2、KD-3和KD-4。
图4为显示同时表达6×AKPSYPPTYK和MGFP-5基因的各种组合的 示意图。
图5为显示构建用于产生重组MGFP-51核苷酸序列的pMDG051载体 的流程图。
图6为显示构建用于产生重组MGFP-15核苷酸序列的pMDG150载体 的流程图。
图7为显示构建用于产生重组MGFP-151核苷酸序列的pMDG151载 体的流程图。
图8为显示构建用于产生重组MGFP-151核苷酸序列的pENG151载 体的流程图。
图9为大肠杆菌BL21/pMDG05和大肠杆菌BL21/pTrcHis(用 pTrcHisA转化的大肠杆菌BL21/pTrcHisA)的培养产物的电泳照片。
图10为从大肠杆菌BL21/pMDG05培养溶液中分离的全细胞沉淀 (WC)、可溶性上清部分(I)和不溶性细胞碎片部分(IS)以及阴性 对照(N)的SDS-PAGE的蛋白质免疫印迹照片。
图11为用于纯化来自大肠杆菌BL21/pMDG05的重组MGFP-5蛋白的 亲和色谱组分的SDS-PAGE银染照片。
图12为纯化的重组MGFP-5蛋白的质谱结果。
图13显示的是来源于大肠杆菌BL21/pMDG051的重组MGFP-51蛋白 的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果(A)和蛋白质免疫印迹分析结果(B)。
图14显示的是来源于大肠杆菌BL21/pMDG150的重组MGFP-15蛋白 的SDS-PAGE结果(A)和蛋白质免疫印迹分析结果(B)。
图15显示的是来源于大肠杆菌BL21/pMDG151的重组MGFP-151蛋 白的SDS-PAGE结果(A)和蛋白质免疫印迹分析结果(B)。
图16显示的是在大肠杆菌BL21/pMDG151中表达的重组MGFP-151 蛋白根据乙酸溶液浓度的回收速度。
图17显示的是重组MGFP-151蛋白的色谱组分的SDS-PAGE结果(A) 和蛋白质免疫印迹分析结果(B)。
图18显示的是在将酪氨酸残基修饰为DOPA之后，用重组MGFP-5 和重组MGFP-151蛋白包被载玻片、聚甲基异丁烯酸板和铝板的结果。
图19显示的是BSA、Cell-Tak、重组MGFP-5蛋白和重组MGFP-151 蛋白在酪氨酸被处理后的QCM分析结果。
图20为测量重组黏着蛋白的粘合力的方法的示意图。
图21显示的是重组MGFP-1和重组MGFP-5蛋白在其酪氨酸残基被 修饰后的粘合力。
图22为重组黏着蛋白的细胞粘合性的测量结果。
图23为重组黏着蛋白与果蝇(Drosophila)昆虫S2细胞的细胞黏 着性的测量结果。
图24A至C为用重组MGFP-5和重组MGFP-151蛋白包被基质表面 的照片。A放大2500倍、B放大10000倍、C放大35000倍。

本发明的发明人从一种贝类——贻贝中获得了一种新的黏着蛋白 及其编码基因，并且建立了生产从该基因翻译而来的黏着蛋白的系统。 他们还建立了一种重组黏着蛋白及其生产系统，该重组黏着蛋白为两种 或多种贝类黏着蛋白的融合蛋白。
本发明的黏着蛋白具有可粘附于多种基质(例如玻璃、金属、聚合 物树脂、塑料)、生物细胞膜(原核细胞膜、真核细胞膜和植物细胞壁) 和脂类的特性。
本发明的黏着蛋白与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列有至少50％ 的同源性，优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的同源性； 同时还可包括具有粘合特性(例如与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列 近似的粘合特性)的氨基酸序列，或具有上述序列70％至200％粘合活性 的氨基酸序列。
例如有一种含有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质。一种 含有上述SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的黏着蛋白在此之后被称为 “MGFP-5”(贻贝足蛋白5型)。
编码MGFP-5的核苷酸根据氨基酸密码子的使用情况可被表示为各 种核苷酸序列，例如被表示为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：15的核苷 酸序列。
而且，本发明的黏着蛋白可在其氨基端和/或羧基端进一步包括用 以改进黏着蛋白的物理化学属性的肽。就改进下列属性的目的而言，可 加入上述的肽，这些属性包括例如溶解性、粘合力、交联度以及蛋白表 达、纯化和回收的程度。例如，上述的肽可以是诸如GST的常用报告蛋 白或者是为改善纯化的组氨酸标签。
就纯化黏着蛋白的目的而言，进一步包括肽的形式的一个实例是含 有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的蛋白质。
上述的肽优选含有来源于黏着蛋白的氨基酸序列，更优选含有来源 于贝类黏着蛋白的氨基酸序列。所述肽的一个实例是SEQ ID NO：25 所示的氨基酸序列，该氨基酸序列串联重复1至10次。在本发明的一 个实施方案中，构建了SEQ ID NO：8，其中SEQ ID NO：25所示的氨 基酸序列串联重复6次，并附加于本发明的黏着蛋白的氨基端和/或羧 基端。SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列是FP-1蛋白序列的一部分。
额外附加了SEQ ID NO：25所示序列的重组黏着蛋白的实例是SEQ ID NO：10、12和14所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：10是SEQ ID NO： 25所示序列串联重复6次并附加于SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的氨 基端的序列。SEQ ID NO：12是SEQ ID NO：25所示序列串联重复6次 并附加于SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的羧基端的序列。SEQ ID NO： 14是SEQ ID NO：25所示序列串联重复6次并附加于SEQ ID NO：6所 示氨基酸序列的氨基端和羧基端的序列。
此外，含有SEQ ID NO：10、12和14所示氨基酸序列的重组黏着 蛋白可以额外包括一种肽，其目的在于方便纯化。所述肽可位于重组黏 着蛋白的氨基端和/或羧基端，所述肽的实例为GST和组氨酸标签。含 有SEQ ID NO：18、20或22所示氨基酸序列的重组黏着蛋白为下述形 式：组氨酸标签被分别附加至含有SEQ ID NO：10、12和14所示氨基 酸序列的蛋白的氨基端。
本发明的黏着蛋白可以进一步包括一种1至10个氨基酸的肽，所 述肽在黏着蛋白的克隆过程中插入至蛋白的氨基端、羧基端或其他类型 的连接区域。
本发明的黏着蛋白和重组黏着蛋白可被插入到为表达外源基因而 构建的常用表达载体中，并通过基因工程方法大量生产。上述载体可根 据用于生产蛋白的宿主细胞的类型和特性进行选择，或重新构建。通过 常用方法可以容易地将载体转化至宿主细胞并由转化体生产重组蛋白。 筛选、构建和转化载体以及表达重组蛋白的操作可由本发明领域的普通 技术人员容易地实行，在常用方法中的部分变化也包括于本发明中。
被插入到载体中的编码黏着蛋白的序列为编码本发明的黏着蛋白 或重组黏着蛋白的序列，并优选选自下述核酸：该核酸编码的蛋白与 SEQ ID NO：6、10、12或14所示氨基酸序列有至少50％的同源性、优 选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的同源性；该核酸编码 的蛋白与SEQ ID NO：6、10、12或14所示氨基酸序列有至少50％的同 源性、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的同源性，此 时至少一个选自SEQ ID NO：26至31的序列在核酸的5’和/或3’端串 联重复1至10次；以及该核酸编码的蛋白与SEQ ID NO：6、10、12 或14所示序列有至少50％的同源性、优选至少80％、更优选至少90％、 最优选至少95％的同源性，并在其氨基端额外附加了6个组氨酸残基。 更优选地，可将含有选自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19 和21的序列的多核苷酸插入到载体中。
在本发明的一个实施方案中，将MGFP-5序列克隆至pGEM-T载体中， 并将SEQ ID NO：7所示的序列(6×AKPSYPPTYK，它是SEQ ID NO：25 所示的氨基酸序列的6个串联重复)克隆至pUC18中。然后将MGFP-5 序列克隆至pTrcHisA载体中以构建pMDG05载体(图4)。此外，为构 建可表达具有下表1所示结构的重组蛋白的载体，将MGFP-5序列和SEQ ID NO：7序列克隆至pTrcHisA载体中以构建pMDG150、pMDG051和 pMDG151载体(图7至9)。
(表1)
  杂合黏着蛋白  结构(5’至3’)   载体   MGFP-15  6×AKPSYPPTYK-MGFP-5   pMDG150   MGFP-51  MGFP-5-6×AKPSYPPTYK   pMDG051   MGFP-151  6×AKPSYPPTYK-MGFP-5-6×  AKPSYPPTYK   pMDG151   pENG151
上述pTrcHisA载体是一种公知载体，它含有trc启动子，这使得 它可以通过用IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导而表达外源蛋 白，并且它在外源基因的5’端还含有用于亲和色谱蛋白纯化的6组氨酸 序列，从而方便了蛋白的纯化。在本发明中，pMDG05载体保藏于位于 韩国大田市儒城区鱼隐洞的韩国生物学资源中心的韩国典型培养物保 藏中心(KCTC)，保藏日期为2002年6月20日，保藏号为KCTC10291BP。 pENG151载体的保藏日期为2005年1月19日，保藏号为KCTC10766BP。
黏着蛋白和重组黏着蛋白的表达载体可被转化至宿主细胞中以构 建转化体，所述宿主细胞选自原核生物、真核生物和真核生物来源的细 胞。原核生物选自大肠杆菌和芽胞杆菌属(Bacillus)，真核生物选自 酵母、昆虫、动物和植物，真核来源的细胞为植物细胞、昆虫细胞和植 物，但不限于上述例子。
作为一个实施方案，将pMDG05、pMDG150、pMDG051和pMDG151载 体分别转化至大肠杆菌BL21中，构建大肠杆菌BL21/pMDG05、大肠杆 菌BL21/pMDG150、大肠杆菌BL21/pMDG051和大肠杆菌BL21/pMDG151。 上述四种转化体可在典型的LB培养基上培养，并可加入IPTG诱导蛋白 表达。表达重组蛋白的优选方法是在LB培养基(5g/L酵母提取物、10g/L 蛋白胨、10g/L NaCl)中培养，并在培养液在600nm的光密度达到0.6 至0.9时加入0.1至10mM的IPTG，然后培养2至12小时。
按上述方法表达的重组蛋白在转化体中表达为水溶形式和/或不可 溶形式，因此其分离和纯化取决于其表达方式。当它以水溶形式表达时， 可通过将裂解细胞上清液走填充有亲和树脂(如镍树脂)的色谱柱的方 式纯化重组蛋白。当它以不可溶形式表达时，可用酸性有机溶剂(优选 pH为3至6的有机溶液)悬浮裂解细胞沉淀、离心悬液以分离上层溶 液的方式纯化重组蛋白。酸性有机溶剂的实例为乙酸、柠檬酸和乳酸， 但不限于这几种。使用的乙酸可为5至30(v/v)％，优选地将细胞沉淀 溶于20至30(v/v)％的乙酸溶液中。经过酸性有机溶有剂处理获得的上 层溶液可进一步经过凝胶过滤色谱以进一步纯化重组蛋白。
通过本发明的方法可获得2-3mg/L的纯度至少为95％的重组黏着蛋 白MGFP-5和大约5mg/L的纯度至少为95％的MGFP-151。尽管MGFP-5 和MGFP-151表现出同等水平的粘合力，然而MGFP-151的溶解度明显高 于MGFP-5，因此MGFP-151更容易以浓缩形式获得。具体而言，MGFP-5 溶于5％乙酸溶液可达到约1mg/mL的浓度，而MGFP-151溶于水可达到 约110mg/mL的浓度，溶于5％乙酸溶液可达到约220mg/mL的浓度。黏 着蛋白的溶解度与其在高度浓缩形式下存留的能力直接相关，因此溶解 度越高，就越容易制成具有较高工业应用潜能的高度浓缩形式。从这个 角度，可以说黏着蛋白MGFP-151比MGFP-5更实用。
通过本发明的表达过程获得的黏着蛋白和重组黏着蛋白具有粘合 活性，可以用作粘合剂。可以通过将蛋白中的酪氨酸残基修饰为3，4- 二羟基苯-L-丙氨酸(DOPA)的实验来确定黏着活性。因此，本发明的 黏着蛋白不仅可用作多种基质的粘合剂，并且由于它对人体无害，还可 用作生物粘合剂。
本发明还提供一种含有黏着蛋白作为活性组分的粘合剂。所述黏着 蛋白可为其中5至100％的酪氨酸残基被修饰为DOPA的形式，并且所述 粘合剂还可含有将蛋白中的酪氨酸残基修饰为DOPA的物质。上述物质 的一个典型实例为酪氨酸酶，但不仅限于此。
上述粘合剂还可含有以重量计0.5至90％的赋形剂，所述赋形剂通 常包含于生物粘合剂中或为可药用的。赋形剂的实例包括但不限于：表 面活性剂、氧化剂和填充剂(参见美国专利申请公布No.2003-65060 和美国专利No.5,015,677)。所述表面活性剂可为阳离子型、阴离子 型、非离子型和两性离子型，其实例为十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺 酸钠。所述氧化剂可以选自酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶、戊二醛、甲醛、 双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯、3，3’-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯、O2、 Fe3+、H2O2和IO4-(参见：Macromolecules 1998，31，4739-4745)， 所述填充剂可以选自胶原、透明质酸、硫酸软骨素(condroitan sulfate)、弹性蛋白、层粘连蛋白、酪蛋白、羟磷灰石、清蛋白、纤 连蛋白和抗坏血酸(hybrin)。
本发明的粘合剂可以用于粘合或固定玻璃、塑料、聚合物树脂或生 物样品，具体的使用方式和用量、配方和其他事项可参照市售的 Cell-Tak(BD Biosciences，Two Oak Park，Bedford，MA，USA)。 例如本发明的粘合剂可为可溶性、水溶性或不溶性的制剂，所使用的量 可为0.01至100μg/cm2基质，但不限于此。此外，使用方式遵循粘合 剂使用的常规方式，典型方式为包被。
上述生物样品指的是任何分类为生物有机体的动物或植物以及来 源于这类动物或植物的任何部分。例如，它指的是细胞、组织、器官、 RNA、DNA、蛋白、肽、多核苷酸、激素和化合物，但不仅限于此。
本发明的粘合剂的应用实例包括但不限于下述的：(1)水(淡水或 咸水)下基质的粘合；(2)矫形外科处理，例如骨骼、韧带、肌腱、半 月板和肌肉的处理以及人工材料的植入；(3)穿孔、裂伤、切口的处理， 以及眼科粘附，例如角膜植入或人工角膜植入；(4)牙科粘附，例如使 固位体、桥体或冠体保持在合适位置，固定松动牙齿、修复坏牙以及使 填充剂保持在合适位置；(5)外科处理，例如血管的粘附、细胞组织的 粘附、人工材料的植入以及伤口的闭合；(6)植物粘附，例如移植部分 的粘合和伤口愈合；(7)药物、激素、生物因子、药物疗法、生理或代 谢监测设备、抗生素和细胞移植(参见美国专利No.5,015,677)。
本发明还提供一种通过用选自表面活性剂、氧化剂和填充剂的物质 处理或控制作为粘合剂活性组分的黏着蛋白的浓度(参见美国专利 No.5,015,677)调整上述粘合剂的粘合力的方法。所述表面活性剂、氧 化剂和填充剂与上述的相同。
本发明还提供一种包被试剂，所述包被试剂含有上述作为活性组分 的黏着蛋白。由于本发明的黏着蛋白具有粘合玻璃、塑料、聚合物树脂 或生物样品的特性，所以它不仅可用作这些基质的包被试剂，并且由于 该黏着蛋白是防水性和斥水性的，它还可用于包被水下使用的基质表面 以防止所述基质的氧化。应用包被试剂的一个实例是包被船的电动螺旋 桨以防止被腐蚀，但不限于此。上述的包被试剂可以仅含有一种黏着蛋 白，还可含有公知的粘合剂、除本发明的黏着蛋白以外的黏着蛋白、公 知的包被试剂中所含有的树脂、有机溶剂、表面活性剂、防腐剂或色素。 其它组分的含量可以根据包被试剂组分和制剂的种类在通常可接受的 范围内作适当的调整。当含有其它组分时，作为活性组分的黏着蛋白以 维持粘合活性的水平包含于包被制剂中，例如以以重量计0.1至80％的 水平包含于包被试剂中。
本发明的包被试剂可被加工为霜剂、气溶胶(喷雾剂)、固体、流 体或乳化剂的形式，但不限于上述制剂形式。
下面描述的是本发明的实施方案，下述实施方案仅仅是为了说明本 发明，而本发明并不限于下述实施方案。
在下文中，用于克隆MGFP-5基因的贝类为贻贝。
实施例1：MGFP-5基因的克隆
为克隆MGFP-5，分别合成了SEQ ID NO：1所示的引物 (5’-ggcctgcagcagttctgaagaatacaaggg-3’)和SEQ ID NO：2所示的引 物(gtagatctatacgccggaccagtgaacag)。使用贝类cDNA文库进行30个 循环的PCR，获得243bp的PCR产物(图1)。将上述PCR产物克隆至 pGEM-T载体(Promega)中。
为获得MGFP-5的上游信号序列，用贝类(贻贝)cDNA文库进行了 巢式PCR。使用的引物是ZAP载体的T3启动子引物(SEQ ID NO：32) 和SEQ ID NO：3所示的引物(5’-cttgtattttccgctgttttt-3’)。通过 PCR获得了约300bp的扩增产物并将其克隆至pGEM-T载体中。
为获得MGFP-5的C端多腺苷酸尾部区域，使用SEQ ID NO：4 (5’-aaaaacagcggaaaatacaag-3’)和T7启动子引物(SEQ ID NO：33) 进行了巢式PCR。获得了350bp的扩增产物并将其克隆至pGEM-T载体 中。
对由上述方法获得的MGFP-5 cDNA的核苷酸序列进行了分析，不含 分泌信号序列的MGFP-5核苷酸序列示于SEQ ID NO：5，其编码的氨基 酸序列示于SEQ ID NO：6。
实施例2：用于通过基因工程生产MGFP-5的载体的构建
使用限制性酶切位点Pst I和EcoR I分离出pGEM-T载体中的 MGFP-5 cDNA，然后将其插入至被限制性内切酶Pst I和EcoR I切割的 pTrcHisA载体(Invitrogen，USA)中，以构建pMDG05(4630bp)。 pMDG05载体保藏于位于韩国大田市儒城区鱼隐洞的韩国生物学资源中 心的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏日期2002年6月20日， 保藏号为KCTC 10291BP。
pMDG05载体含有适用于在大肠杆菌中表达的trc启动子，使得可 用IPTG(Sigma，USA)诱导表达。它在MGFP-5基因的5’端还含有6个 组氨酸残基，使其适于蛋白分离和亲和色谱纯化。
实施例3：来源于FP-1的肽(6×AKPSYPPTYK)的构建
根据FP-1的氨基酸序列(Genbank No.Q27409或S23760)，构建 了FP-1衍生物，其中SEQ ID NO：25所示的肽“AKPSYPPTYK”串联重 复6次(被称为“6×AKPSYPPTYK”)。
也就是说，分别合成了图3中描述的KD-1至KD-4，然后退火以合 成编码6×AKPSYPPTYK(SEQ ID NO：8)的FP-1变体(SEQ ID NO：7)。 另外，在6×AKPSYPPTYK的5’端按5’至3’方向放置了EcoR I和Nhe I 限制性酶切位点，在3’端放置了BamH I限制性酶切位点(图3)。使用 Nhe I和BamH I限制性酶切位点将6×AKPSYPPTYK插入到pUC18载体中 以构建pAD501载体(M.Kitamura，1999，Journal of Polymer Science Part A：Polymer Chemistry 37，729-736)。
在图3中，在多核苷酸的BamH I位点的5’侧插入了“ACTAT”以保 留ORF。
实施例4：FP-1与MGFP-5重组杂合体的构建
在此处以后的下文中，MGFP-5被称为“MGFP-5”，实施例3中的6 ×AKPSYPPTYK附加于MGFP-5的N端的杂合体被称为“MGFP-15”，6× AKPSYPPTYK附加于MGFP-5的C端的杂合体被称为“MGFP-51”，6× AKPSYPPTYK附加于MGFP-5的两端的杂合体被称为“MGFP-151”(参见 上文表1)。
构建了SEQ ID NO：10所示的MGFP-15、SEQ ID NO：12所示的MGFP-51 和SEQ ID NO：14所示的MGFP-151这三种杂合体，根据实验设计，它 们包括5’端的组氨酸标签(6×His)和其它氨基酸残基以及6× AKPSYPPTYK和MGFP-5之间的氨基酸残基。
为分别表达MGFP-5、MGFP-15、MGFP-51和MGFP-151这些杂合体， 将SEQ ID NO：15、17、19和21中所示的结构插入到载体中分别构建 了图4中的pMDG05、pMDG150、pMDG051和pMDG151。在上述4种载体 中，用可被IPTG(Sigma，US)诱导的trc启动子控制表达，在每种重 组构建体的5’区域有6个组氨酸残基，3’端有翻译终止密码子(TAA)。
每种载体的构建方法如下：
使用SEQ ID NO：1和2所示的引物对，对实施例2的pMDG05载体 中的MGFP-5的核苷酸序列进行PCR，然后将产物用限制性内切酶Pst I和EcoR I进行切割，再将切割产物插入到已被同样的酶切割过的 pTrcHisA载体(Invitrogen，USA)中，以构建pTEMP150(4630bp)。 并且，使用SEQ ID NO：23(5’-GGT ACC CGA ATT C GA ATT CGC TAA ACC G-3’)和24(5’-GGT CGA CTC  AAG CTT ATC ATT TGT AAG TCG-3’)所 示的引物对，对实施例2的pAD501载体中的6×AKPSYPPTYK进行扩增， 然后将产物用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行切割。再将切割产物 插入到已被EcoR I和Hind III切割过的pTEMP150载体(Invitrogen， USA)中，以构建pMDG051(图5)。
通过用Nhe I和BamH I限制性内切酶处理以分离pAD501载体中的 6×AKPSYPPTYK，并将其插入到已用同样的酶处理过的pMDG05载体中， 以构建pMDG150(图6)。
通过用Nhe I和BamH I限制性内切酶处理以分离pAD501载体中的 6×AKPSYPPTYK，并将其插入到已用同样的酶处理过的pTrcHisA载体 (Invitrogen，USA)中，以构建pTEMP1(4523bp)。然后用SEQ ID NO： 1和2所示的引物对，对pMDG05载体中的MGFP-5核苷酸序列进行扩增， 然后将产物用限制性内切酶Pst I和EcoR I进行切割，再将切割产物插 入到已被同样的酶处理过的pTEMP1载体(Invitrogen，USA)中，以构 建pTEMP2(4741bp)。并且，使用SEQ ID NO：23和24所示的引物对， 对pAD501载体中的6×AKPSYPPTYK进行扩增，然后将产物用限制性内 切酶EcoR I和Hind III进行切割。再将切割产物插入到已被EcoR I和 Hind III切割过的pTEMP2载体(Invitrogen，USA)中，以构建pMDG151 (4927bp)(图7)。
并且，为高水平地表达MGFP-151核苷酸，用SEQ ID NO：34(5’-CCT AA C ATA TGG GGG TTC TCA TCA TC-3’)和SEQ ID NO：35(5’-ATC CGC CAA AAC AGC C AA GCT T-3’)所示的引物，从pMDG151载体中扩增出 MGFP-151核苷酸。使用Nde I和Hind III限制性内切酶将扩增产物插入 到pET 22b(+)载体(Novagen，EMB Bioscience，Inc.441 Charmany Dr. Madison，WI 53719 USA)中，以构建pENG151载体(图8)。将pENG151 载体转化至大肠杆菌中并保藏于韩国生物学资源中心的韩国典型培养 物保藏中心(KCTC)，保藏日期为2005年1月19日，保藏号为KCTC 10766BP。
实施例5：生产MGFP-5和杂合体的转化体的构建
用CaCl2缓冲液制备了用于克隆的大肠杆菌Top10 (F-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)Ф80lacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Strr)endA1 nup， Invitrogen)和用于蛋白表达的大肠杆菌BL21(F-ompThsdSB(rB-mB-) gal dc)的感受态细胞。通过热击法(42℃放置2分钟)完成实施例4 中的pMDG05、pMDG051、pMDG150和pMDG151的各种载体的转化。然后 通过使用氨苄青霉素(Sigma)的筛选过程分别获得下述转化体：大肠 杆菌Top10/pMDG05、大肠杆菌Top10/pMDG051、大肠杆菌 Top10/pMDG150、大肠杆菌Top10/pMDG151、大肠杆菌BL21/pMDG05、 大肠杆菌BL21/pMDG051、大肠杆菌BL21/pMDG150和大肠杆菌 BL21/pMDG151。
实施例6：来源于大肠杆菌BL21/pMDG05的MGFP-5的表达和纯化
6-1.大肠杆菌BL21/pMDG05的培养
在LB培养基中(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl) 培养大肠杆菌BL21/pMDG05，并在培养液在600nm的光密度达到0.7至 0.8时加入IPTG至终浓度为1mM，以诱导重组黏着蛋白MGFP-5的表达。 此时，将在50mL灭菌试管中的10mL LB培养基(加入了500μg氨苄青 霉素)中培养了12小时的培养液接种到含有100mL培养基的500mL锥 形瓶中。将大肠杆菌BL21/pMDG05培养液以18000g离心4至10分钟而 获得细胞沉淀，并将其存于-80℃。
6-2.MGFP-5表达的确认
将细胞沉淀重悬于100μl的SDS-PAGE缓冲液(0.5M Tris-HCl、 pH6.8、10％甘油、5％SDS、5％β-巯基乙醇、0.25％溴酚蓝)中，100 ℃煮沸5分钟变性。为进行SDS-PAGE分析，将样品在15％SDS聚丙烯酰 胺凝胶上电泳，然后用考马斯亮蓝染色(Bio-Rad)或用银染色(Bio-Rad， USA)检测蛋白条带。为进行蛋白免疫印迹分析，将样品在15％SDS聚丙 烯酰胺凝胶上电泳后，以15V将样品转移到硝酸纤维素膜上。用单克隆 抗组氨酸配基抗体(R & D Systems，USA)和显色反应检测转移到硝酸纤 维素膜上的MGFP-5蛋白。
图9为大肠杆菌BL21/pMDG05和大肠杆菌BL21/pTrcHis(用 pTrcHisA转化的大肠杆菌BL21/pTrcHisA)的培养产物的电泳照片，其 中MW为分子量标记，N为对照组，WC为大肠杆菌BL21/pMDG05的培养 产物。图9确认了大肠杆菌BL21/pMDG05中的MGFP-5蛋白的表达。
为确认重组MGFP-5在细胞样品中的表达形式，对每种通过裂解细 胞沉淀获得的细胞碎片和可溶上清液以及细胞沉淀都进行了SDS-PAGE 和蛋白免疫印迹分析。
也就是说，将每1克大肠杆菌BL21/pMDG05的细胞沉淀重悬于5mL 缓冲溶液B(8M尿素、10mM Tris-Cl、100mM磷酸钠、pH8.0)中，在 室温下温和振荡1小时以裂解细胞。裂解物以14000rpm离心20分钟以 获得可溶的上清液和不溶的细胞碎片。
图10为从大肠杆菌BL21/pMDG05培养溶液中分离的细胞沉淀(WC)、 可溶的上清(I)和不溶的细胞碎片(IS)以及阴性对照(N)的SDS-PAGE 分析的蛋白质免疫印迹照片。图10显示在可溶的上清液部分中检测到 高水平的MGFP-5蛋白，表明它在细胞中以可溶形式表达。
6-3.重组MGFP-5蛋白的纯化
为分离和纯化在大肠杆菌BL21/pMDG05细胞中以可溶形式表达的 重组MGFP-5，应用pMDG05载体中含有的组氨酸亲和配基进行了亲和色 谱。
使用Acta Prime纯化系统(Amersham Bioscience)在室温下、以 每分钟1ml的流速进行固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化。使用被0.1M NiSO4(Samchun Chemicals)充满的10ml Ni-NTATM Agarose(Qiagen) 作为树脂，在变性条件下进行分离。在用树脂装好柱之后，用缓冲液(8M 尿素、10mM Tris-Cl、100mM磷酸钠、pH8.0)平衡。然后将可溶的上 清部分上柱，然后用缓冲液A(8M尿素、10mM Tris-Cl、100mM磷酸钠、 pH6.3)和缓冲液B(8M尿素、10mM Tris-Cl、100mM磷酸钠、pH5.9) 洗脱该柱。用洗脱缓冲液(8M尿素、10mM Tris-Cl、100mM磷酸钠、pH4.5) 洗脱重组MGFP-5蛋白，收集所有洗脱组分并在4℃对5％乙酸透析 (Spectra/Por分子多孔膜试管，Spectrum Laboratories，USA)。
图11为在纯化来自大肠杆菌BL21/pMDG05的重组MGFP-5蛋白过程 中的亲和色谱组分样品的SDS-PAGE银染照片。M为分子量标记，泳道1 为可溶的上清液部分上柱时被吸附的组分，泳道2为洗柱步骤时获得的 洗脱组分，泳道3为用洗脱缓冲液分离出的洗脱组分。图11显示重组 体以高纯度水平被纯化。
6-4.MGFP-5重组蛋白的分析
使用PerSeptive Voyager DE仪器(Perkin-Elmer)进行了 MALDI-TOF(基质辅助激光解吸离子化飞行时间)质谱分析。
将30％乙腈和0.1％三氟乙酸中的芥子酸作为基质溶液。将上文6-3 部分中获得的重组MGFP-5蛋白用基质溶液以1∶25稀释，然后将1μl 样品点样于金板上并用真空泵蒸发。在正离子模式下以下述设置获得质 谱：加速电压为25000V，栅极电压为70至80％，导线电压为0.3％，延 迟时间为200至500ns，N2激光功率为1600至1900(任意单位)。使 用[M+H]+为66.431和[M+2H]2+为33.216的BSA进行内部校准。
图12为MGFP-5重组蛋白的质谱分析结果。
实施例7：来源于大肠杆菌BL21/pMDG051的MGFP-51的表达和纯 化
培养大肠杆菌BL21/pMDG051并用与实施例6中相同的方法获得细 胞沉淀、细胞碎片和可溶的上清部分。然后对上述每种样品进行 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析。
图13显示的是来源于大肠杆菌BL21/pMDG051的重组MGFP-51蛋白 表达的SDS-PAGE分析结果(A)和蛋白质免疫印迹分析结果(B)的照 片。W为细胞沉淀，S为可溶的上清部分，IS为不溶的细胞碎片。图13 显示重组MGFP-51蛋白以可溶和不溶两种形式在细胞中表达。
实施例8：来源于大肠杆菌BL21/pMDG150的MGFP-15的表达和纯 化
培养大肠杆菌BL21/pMDG150并用与实施例6中相同的方法获得细 胞沉淀、细胞碎片和可溶的上清部分。然后对上述每种样品进行 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析。
图14显示的是来源于大肠杆菌BL21/pMDG150的重组MGFP-15蛋白 表达的SDS-PAGE分析结果(A)和蛋白质免疫印迹分析结果(B)的照 片。M为分子量标记，W为细胞沉淀，S为可溶的上清部分，IS为不溶 的细胞碎片。图13显示重组MGFP-15蛋白以可溶和不溶两种形式在细 胞中表达。
实施例9：来源于大肠杆菌BL21/pMDG151的MGFP-151的表达和纯 化
9-1.MGFP-151的表达
培养大肠杆菌BL21/pMDG151并用与实施例6中相同的方法获得细 胞沉淀、细胞碎片和可溶的上清部分。然后对上述每种样品进行 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析。
图15显示的是来源于大肠杆菌BL21/pMDG151的重组MGFP-151蛋 白表达的SDS-PAGE分析结果(A)和蛋白质免疫印迹分析结果(B)的 照片。W为细胞沉淀，S为可溶的上清部分，IS为不溶的细胞碎片。图 15显示重组MGFP-151蛋白以可溶和不溶两种形式在细胞中表达。
9-2.重组MGFP-151蛋白的纯化I
将每克细胞沉淀重悬于5ml裂解缓冲液(10mM Tris-Cl、100mM磷 酸钠、pH8.0)中，然后在20000PSI(Constant systems，Low March， UK)下裂解细胞。将细胞裂解物以18000g、4℃离心20分钟以收集细 胞碎片。将每克细胞重量的细胞碎片分别重悬于20ml的5、10、15、 20、25、30、22、24、26和28(v/v)％的乙酸溶液中，并在相同条件下 离心。将上清液制备为色谱样品。
用Sephacryl S-300 HR(Pharmacia)填充40cm×2.6cm的柱，并 用5％乙酸平衡。然后装2ml的样品，并以重悬每个样品的乙酸的浓度 洗脱样品，以收集洗脱组分。每种浓度的乙酸洗脱组分中的MGFP-151 的纯化程度通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色来确定 (图16)。图16显示在乙酸浓度为20-30(v/v)％时重组MGFP-151被洗 脱。特别确定出稀释于25％乙酸溶液中结果最佳：纯度为74％并且产率 为45％。
9-3.重组MGFP-151蛋白的纯化II
将每克细胞沉淀重悬于5ml裂解缓冲液(10mM Tris-Cl、100mM磷 酸钠、pH8.0)中，然后在20000PSI(Constant systems，Low March， UK)下裂解细胞。将细胞裂解物以18000g、4℃离心20分钟以收集细 胞碎片。将每克细胞重量的细胞碎片重悬于20ml的25％乙酸溶液中， 并在相同条件下离心。在上清液被冻干后，将沉淀溶于2ml的5％乙酸 中并制备为色谱样品。
用Sephacryl S-300 HR(Pharmacia)填充40cm×2.6cm的柱，并 用5％乙酸平衡。然后装2ml的样品，用5(v/v)％的乙酸洗脱样品并收集 洗脱组分I和II。洗脱组分I和II中的MGFP-151的纯化程度通过SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色来确定(图17)。图17显示的 是MGFP-151重组蛋白的色谱组分的SDS-PAGE分析结果(A)和蛋白质 免疫印迹分析结果(B)的照片。可用色谱法分离出纯度为95.8％的重 组MGFP-151蛋白。
通过MALDI-TOF质谱分析确认了所纯化的MGFP-151蛋白与最初设 计的MGFP-151肽相同。
实施例10：黏着蛋白的酪氨酸残基的修饰
将实施例6-9中纯化的MGFP-5、MGFP-51、MGFP-15和MGFP-151 黏着蛋白分别溶于含25mM抗坏血酸的5％乙酸缓冲液中，使其浓度为 1.44mg/ml。然后加入50μg/ml的酪氨酸酶，然后于25℃振荡6小时。 在此过程中，黏着蛋白的酪氨酸残基被修饰为DOPA。另外，用牛血清 清蛋白(BSA)作为阴性对照，用由贝类黏着蛋白FP1和FP2组成的市 售产品Cell-TakTM(BD Bioscience，Two Oak Park，Belford，MA，USA) 作为阳性对照。
实施例11：重组MGFP-5和MGFP-151蛋白包被不同表面的能力的 鉴定
测量了重组MGFP-5和MGFP-151蛋白包被载玻片、聚甲基异丁烯酸 板和铝板的表面的能力。每种材料的表面都用水洗几遍清洁后用氮气干 燥。在每种表面上点一滴5μl的1.44mg/ml的蛋白溶液，并在25℃保 持12小时。干燥后，每一表面用双蒸水振荡2小时以彻底洗涤，用真 空泵蒸发残留在每一表面上的水。干燥后用考马斯亮蓝染色使包被在表 面上的蛋白可视化。该结果显示于图18。
图18显示的是在将酪氨酸残基修饰为DOPA之后，用重组MGFP-5 和MGFP-151蛋白包被载玻片、聚甲基异丁烯酸板和铝板的表面的结果。 即使在重组MGFP-5和MGFP-151蛋白的酪氨酸残基被修饰之前，它们也 能黏着于玻璃、聚甲基异丁烯酸和铝上，并且当酪氨酸残基被修饰为 DOPA时，发现其粘合力提高了很多。
实施例12：使用QCM(石英晶体微天平)测量重组黏着蛋白的吸附
所用的石英晶体(Seiko EG & G)为涂金的AT切型石英，直径5mm， 基础共振频率为9MHz。将一滴5μl 1.44mg/ml的每一种蛋白溶液(BSA， Cell-TaK，重组MGFP-5蛋白和重组MGFP-151蛋白)置于石英晶体的金 表面上，在25℃恒温水浴中保持1小时。在将其从水浴中取出并干燥 后，将金表面在双蒸水中振荡1小时以充分洗涤，用真空泵蒸发残留在 石英晶体上的水。将干燥的石英晶体连接到EQCM控制器(QCA917；Seiko EG & G)上并测量共振频率的变化。由于石英晶体共振频率的降低与吸 附于其表面的质量的增加成函数关系(G.Sauerbrey，1959，Z.Phys， 155，206)，因此用等式1(M.Thomson，1991，Analyst，116，881-889) 和共振频率的变化值计算质量的增加。
(等式1)

在上述等式中，Δ质量为质量变化量，Δ频率为共振频率变化量， μq为AT切型晶体常数(2.947×1.011g/cm/sec2)，ρq为石英晶体密 度(2.648g/cm3)，Fq2为参照频率(9.00MHz)，A为石英晶体表面积 (0.196cm2)。
图19为酪氨酸被处理的BSA、Cell-Tak、重组MGFP-5蛋白和重组 MGFP-151蛋白的QCM分析结果，它以频率变化量的方式显示了在金表 面上的吸附水平。在图19中，酪氨酸被修饰的重组MGFP-151蛋白表现 出最大的频率变化量，表明吸附在石英晶体的金表面上的质量最大。虽 然被吸附的Cell-TakTM的量比BSA的大，但其粘合力比重组MGFP-5蛋 白低得多。重组MGFP-151蛋白的质量变化量为36％，重组MGFP-5蛋白 的为23.2％，而Cell-Tak的为10％或更少。
实施例13：使用AFM(原子力显微术)测量重组黏着蛋白的粘合力
使用AFM(SPA400；Seiko Instruments)获得了力-距离曲线，并 根据Ducker等人的技术选择AFM悬臂(W.Ducker，Nature，1991，353， 239-241)(图20)。本实验所用的悬臂为Olympus氧化物锐化 (oxide-sharpened)的氮化硅探针(Veeco & Seiko Instruments)， 弹性常数为0.57或11N/m。将直径20μm的玻璃珠(Park Science) 用环氧树脂(Vantico)粘附于悬臂的尖端，并室温保持24小时。将粘 附有玻璃珠的AFM悬臂安装在AFM上，并将玻璃珠在10μl的经酪氨酸 酶处理过的蛋白溶液(1.44mg/ml BSA、Cell-TakTM、MGFP-1或MGFP-5) (MGFP-5或MGFP-151)中浸没10分钟。使玻璃珠与干净的玻璃表面相 接触，并获得力-距离曲线。(力-距离曲线测量的一个循环所需要的时 间为5秒。插入)
图21显示的是酪氨酸被修饰的重组MGFP-151和MGFP-5蛋白的粘 合力。重组贝类黏着蛋白MGFP-5和MGFP-151的平均值分别为540nN 和500nN，这表明有强的粘合力，然而Cell-Tak的相应值为250nN，BSA 为约30nN。该结果显示经酪氨酸酶处理过的重组贝类黏着蛋白具有强 的粘合能力。
实施例14：细胞粘合特性的测量
使用了果蝇S2细胞(Invitrogen)。
S2细胞在27℃、M3培养基(Shields和Sang M3昆虫培养基，Sigma， St.Louis，MO)中生长，所述M3培养基含10％IMS(昆虫培养基添加 剂)、1％抗生素-抗真菌剂(Invitrogen)和3μl/ml的潮霉素。将由 实施例10制备的经过酪氨酸酶处理的重组MGFP-5蛋白、重组MGFP-151 蛋白、Cell-Tak和BSA滴在无菌载玻片(20mm×20mm，Marienfeld， Germany)上，在层流通风橱内25℃培养30分钟然后用PBS洗两遍。 洗涤后，将被包被的载玻片浸于含浓度为4×106细胞/ml、存活率为95％ 的S2细胞的100mm细胞培养皿中。在27℃培养1小时至7天后，用PBS 洗去未粘附的细胞，使用锥虫蓝染色法检测细胞存活率和所黏着蛋白的 位置。
结果发现S2细胞粘附于重组MGFP-5和MGFP-151蛋白所包被的位 置，并且所粘附的S2细胞可以存活7天或更长时间(图22和23)。
实施例15：MGFP-5和MGFP-151的化学粘合稳定性的检测
将重组蛋白MGFP-5和MGFP-151在玻璃上分别点样，将Cell-Tak 作为对照。干燥后，将玻璃浸于由5％乙酸、25％甲醇和70％水组成的溶 液中，85℃加热20分钟。结果发现：对于包被于玻璃或丙烯酸板表面 的黏着蛋白而言，在高温和溶剂条件下MGFP-5与基质分离而MGFP-151 继续粘附其上。
并且将每一个上述样品包被于玻璃或丙烯酸板上并通过SEM测量 了粘合稳定性。
图24A至C为用重组MGFP-5和MGFP-151蛋白包被基质表面的照 片。A放大2500倍、B放大10000倍、C放大35000倍。观察发现被 MGFP-151包被的表面是光滑的，而被MGFP-5包被的表面有一点粗糙。 上述差别被认为是交联度不同导致的结果。
[序列表说明]
SEQ ID NO：1至4为引物序列。
SEQ ID NO：5为从贻贝中分离的MGFP-5蛋白的cDNA序列。
SEQ ID NO：6为从贻贝中分离的MGFP-5蛋白的蛋白序列。
SEQ ID NO：7为从紫贻贝(Mytilus edulis)中分离的MGFP-5蛋 白的部分序列的6个串联重复的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8为从紫贻贝中分离的MGFP-5蛋白的部分序列的6个 串联重复的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为编码由FP-1和MGFP-5构建的重组黏着蛋白MGFP-15 的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10为由FP-1和MGFP-5构建的重组黏着蛋白MGFP-15 的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为编码由FP-1和MGFP-5构建的重组黏着蛋白 MGFP-015的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12为由FP-1和MGFP-5构建的重组黏着蛋白MGFP-015 的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13为编码由FP-1和MGFP-5构建的重组黏着蛋白 MGFP-151的核苷酸序列。
SEQ ID NO：14为由FP-1和MGFP-5构建的重组黏着蛋白MGFP-151 的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15为插入到pMDG05载体中用于表达MGFP-5的构建体 的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16为由插入到pMDG05载体中用于表达MGFP-5的构建 体表达的黏着蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17为插入到pMDG150载体中用于表达MGFP-15的构建 体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18为由插入到pMDG150载体中用于表达MGFP-15的构 建体表达的黏着蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19为插入到pMDG051载体中用于表达MGFP-51的构建 体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20为由插入到pMDG051载体中用于表达MGFP-51的构 建体表达的黏着蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21为插入到pMDG151载体中用于表达MGFP-151的构 建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22为由插入到pMDG151载体中用于表达MGFP-151的 构建体表达的黏着蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23至24为引物序列。
SEQ ID NO：25为FP-1的部分序列。
SEQ ID NO：26至31为编码FP-1的部分序列AKPSYPPTYK的核苷 酸序列。
SEQ ID NO：32为T3启动子的引物序列。
SEQ ID NO：33为T7启动子的引物序列。
SEQ ID NO：34至35为引物序列。
序列表
<110>POSCO
POSTECH Foundation
<120>贝类生物粘合剂
<130>opp20050258kr
<150>US 60/556,805
<151>2004-03-26
<160>35
<170>Kopatentln 1.71
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ggcctgcagc agttctgaag aatacaaggg                          30
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
gtagatctat acgccggacc agtgaacag                           29
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cttgtatttt ccgctgtttt t                                   21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
aaaaacagcg gaaaatacaa  g                                               21
<210>5
<211>228
<212>DNA
<213>贻贝
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(228)
<223>贻贝足蛋白-5 cDNA
<400>5
agt tct gaa gaa tac aaa ggt ggt tat tac cca ggc aat act tac cac          48
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His
  1               5                  10                  15
tat cat tca ggt ggt agt tat cac gga tcc ggc tat cat gga gga tat          96
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
             20                  25                  30
aag gga aag tat tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa          144
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
         35                  40                  45
aac agc gga aaa tac aag tat ctg aag aaa gct aga aaa tac cat aga          192
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
     50                  55                  60
aag ggt tac aag aag tat tat gga ggt ggt agc agt                          228
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
 65                  70                  75
<210>6
<211>76
<212>PRT
<213>贻贝
<400>6
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His
  1               5                  10                  15
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
             20                  25                  30
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
         35                  40                  45
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
     50                  55                  60
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
 65                  70                  75
<210>7
<211>180
<212>DNA
<213>紫贻贝
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(180)
<223>来源于紫贻贝足蛋白-1的重复6次序列
<400>7
gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca          48
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
  1               5                  10                  15
ccg act tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa          96
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
             20                  25                  30
ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc          144
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
         35                  40                  45
tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa                          180
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
     50                  55                  60
<210>8
<211>60
<212>PRT
<213>紫贻贝
<400>8
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
  1               5                  10                  15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
             20                  25                  30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
         35                  40                  45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
     50                  55                  60
<210>9
<211>411
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>生物黏着蛋白(MGFP-150)编码序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<223>生物黏着蛋白(MGFP-150)
<400>9
gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca          48
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
  1               5                  10                  15
ccg act tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa          96
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
             20                  25                  30
ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc          144
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
         35                  40                  45
tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa agt tct gaa gaa          192
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
     50                  55                  60
tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt          240
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
 65                  70                  75                  80
ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat          288
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
                 85                  90                  95
tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa          336
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
             100                105                 110
tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag          384
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
        115                 120                 125
aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc                                  411
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe
    130                 135
<210>10
<211>137
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
  1               5                  10                  15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
             20                  25                  30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
         35                  40                  45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
     50                  55                  60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
 65                  70                  75                  80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
                 85                  90                  95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
            100                 105                 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
        115                 120                 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe
    130                 135
<210>11
<211>411
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>生物黏着蛋白(MGFP-051)编码序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(411)
<223>生物黏着蛋白(MGFP-051)
<400>11
agt tct gaa gaa tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac          48
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His
  1               5                  10                  15
tat cat tca ggt ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat          96
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
             20                  25                  30
aag gga aag tat tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa          144
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
         35                  40                  45
aac agc gga aaa tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga          192
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
     50                  55                  60
aag ggt tac aag aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg          240
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro
 65                  70                  75                  80
tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat          288
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
                 85                  90                  95
aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac          336
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
            100                 105                 110
ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct          384
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
        115                 120                 125
aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa                                      411
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
    130                 135
<210>12
<211>137
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His
  1               5                  10                  15
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
             20                  25                  30
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
         35                  40                  45
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
     50                  55                  60
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro
 65                  70                  75                  80
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
                     85              90                  95
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
            100                 105                 110
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
        115                 120                 125
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
    130                 135
<210>13
<211>591
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>生物黏着蛋白(MGFP-151)编码序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(591)
<223>生物黏着蛋白(MGFP-151)
<400>13
gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca          48
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
  1               5                  10                  15
ccg act tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa          96
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
             20                  25                  30
ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc          144
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
         35                  40                  45
tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa agt tct gaa gaa          192
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
     50                  55                  60
tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt          240
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
 65                  70                  75                  80
ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat          288
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
                 85                  90                  95
tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa         336
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
            100                 105                 110
tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag         384
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
        115                 120                 125
aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg tct tac ccg ccg         432
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
    130                 135                 140
acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat aag gct aaa cct         480
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
145                 150                 155                 160
agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac ccg ccg act tac         528
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
                165                 170                 175
aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct aaa ccg agt tac         576
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
            180                 185                 190
ccc ccg act tac aaa                                                     591
Pro Pro Thr Tyr Lys
        195
<210>14
<211>197
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
  1               5                  10                  15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
             20                  25                  30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
         35                  40                  45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
     50                  55                  60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
 65                  70                  75                  80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
                 85                  90                  95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
            100                 105                 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
        115                 120                 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
    130                 135                 140
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
                165                 170                 175
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
            180                 185                 190
Pro Pro Thr Tyr Lys
        195
<210>15
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在pMDG05载体中表达生物黏着蛋白(MGFP-5)的构建体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(351)
<223>在pMDG05载体中表达的生物黏着重组蛋白
<400>15
atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act          48
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
  1               5                  10                  15
ggt gga cag caa atg ggt cgg act ctg tac gac gat gac gat aag gat          96
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
             20                  25                  30
cga tgg gga tcc gag ctc gag atc tgc agc agt tct gaa gaa tac aag          144
Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys
         35                  40                  45
ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt ggt agt          192
Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser
     50                  55                  60
tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat tac gga          240
Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa tac aag         288
Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys
                 85                  90                  95
tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag aag tat         336
Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr
            100                 105                 110
tat gga ggt agc agt    taa                                              354
Tyr Gly Gly Ser Ser
        115
<210>16
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<400>16
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
  1               5                  10                  15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
             20                  25                  30
Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys
         35                  40                  45
Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser
     50                  55                  60
Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys
                 85                  90                  95
Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Gly Ser Ser
        115
<210>17
<211>456
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在pMDG150载体中表达生物黏着蛋白(MGFP-150)的构建体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(453)
<223>在pMDG150载体中表达的生物黏着重组蛋白
<400>17
atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc gct aaa          48
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys
  1               5                  10                  15
ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act          96
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
             20                  25                  30
tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct          144
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
         35                  40                  45
tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag          192
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
     50                  55                  60
gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa ggc tgc agt tct gaa gaa          240
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu
 65                  70                  75                  80
tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt          288
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
                     85              90                  95
ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat          336
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
            100                 105                 110
tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa          384
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
        115                 120                 125
tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag          432
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
    130                 135                 140
aag tat tat gga ggt agc agt        taa                                   456
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser
145                 150
<210>18
<211>151
<212>PRT
<213>人工序列
<400>18
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys
  1               5                  10                  15
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
             20                  25                  30
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
         35                  40                  45
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
     50                  55                  60
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu
 65                  70                  75                  80
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
                 85                  90                  95
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
        115                 120                 125
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
    130                 135                 140
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser
145                 150
<210>19
<211>540
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在pMDG051载体中表达生物黏着蛋白(MGFP-051)的构建体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(537)
<223>在pMDG051载体中表达的生物黏着重组蛋白
<400>19
atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act          48
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
  1               5                  10                  15
ggt gga cag caa atg ggt cgg act ctg tac gac gat gac gat aag gat          96
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
             20                  25                  30
cga tgg gga tcc gag ctc gag atc tgc agc agt tct gaa gaa tac aag          144
Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys
         35                  40                  45
ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt ggt agt         192
Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser
     50                  55                  60
tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat tac gga         240
Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa tac aag         288
Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys
                 85                  90                  95
tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag aag tat         336
Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr
            100                 105                 110
tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac         384
Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
        115                 120                 125
aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat aag gct aaa cct agc tat         432
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
    130                 135                 140
cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca         480
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
145                 150                 155                 160
aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg         528
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
                165                 170                 175
act tac aaa       taa       540
Thr Tyr Lys
<210>20
<211>179
<212>PRT
<213>人工序列
<400>20
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
  1               5                  10                  15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
             20                  25                  30
Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys
         35                  40                  45
Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser
     50                  55                  60
Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys
                     85              90                  95
Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
        115                 120                 125
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
    130                 135                 140
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
145                 150                 155                 160
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
                    165             170                 175
Thr Tyr Lys
<210>21
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在pMDG151载体中表达生物黏着蛋白(MGFP-151)的构建体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(639)
<223>在pMDG151载体中表达的生物黏着重组蛋白
<400>21
atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc gct aaa          48
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys
  1               5                  10                  15
ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act          96
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
             20                  25                  30
tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct          144
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
         35                  40                  45
tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag         192
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
     50                  55                  60
gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa ggc tgc agt tct gaa gaa         240
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu
 65                  70                  75                  80
tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt         288
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
                 85                  90                  95
ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat         336
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
            100                 105                 110
tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa         384
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
        115                 120                 125
tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag         432
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
    130                 135                 140
aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg tct tac ccg ccg         480
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
145                 150                 155                 160
acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat aag gct aaa cct         528
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
                165                 170                 175
agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac ccg ccg act tac         576
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
            180                 185                 190
aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct aaa ccg agt tac         624
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
        195                 200                 205
ccc ccg act tac aaa t aa                                                642
Pro Pro Thr Tyr Lys
    210
<210>22
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys
  1               5                  10                  15
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
             20                  25                  30
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
         35                  40                  45
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
     50                  55                  60
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu
 65                  70                  75                  80
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly
                 85                  90                  95
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
            100                 105                 110
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
        115                 120                 125
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
    130                 135                 140
Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
145                 150                 155                 160
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
                165                 170                 175
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
            180                 185                 190
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
        195                 200                 205
Pro Pro Thr Tyr Lys
    210
<210>23
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggtacccgaa ttcgaattcg ctaaaccg                          28
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
ggtcgactca agcttatcat ttgtaagtcg                          30
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>紫贻贝
<400>25
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
  1               5                  10
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>紫贻贝
<400>26
gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa                          30
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>紫贻贝
<400>27
gcaaaaccct cgtacccacc gacttataag                          30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>紫贻贝
<400>28
gctaaaccta gctatccacc tacgtacaaa                          30
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>紫贻贝
<400>29
gctaaaccgt cttacccgcc gacttacaaa                          30
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>紫贻贝
<400>30
gcaaaaccgt cctaccctcc gacctataag                          30
<210>31
<211>30
<212>DNA
<213>紫贻贝
<400>31
gctaaaccga gttacccccc gacttacaaa                          30
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
aattaaccct cactaaaggg                                     20
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
gtaatacgac tcactatagg gc                                  22
<210>34
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
cctaacatat gggggttctc atcatc                            26
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
atccgccaaa acagccaagc tt                                22