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酵母中的氧化还原平衡

阅读：389发布：2020-05-11

IPRDB可以提供酵母中的氧化还原平衡专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在此描述的组合物和方法涉及通过重新工程化Ac-CoA生物合成途径，在具有减弱的甘油生产的厌氧生长酵母中减少氧化还原失衡。，下面是酵母中的氧化还原平衡专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种经修饰的酵母细胞，其包含：用于制备Ac-CoA的减弱的天然生物合成途径，所述天然途径在厌氧条件下利于所述细胞中的氧化还原辅因子失衡；用于制备Ac-CoA的替代性人工途径的引入，与所述天然生物合成途径相比，所述人工途径在厌氧条件下不利于所述细胞中的氧化还原辅因子失衡；和甘油生物合成途径的减弱；其中，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出增加的乙醇生产。

2.如权利要求1所述的经修饰的酵母细胞，其中所述天然Ac-CoA途径的减弱是通过降低醛脱氢酶活性来实现的。

3.如权利要求1或2所述的经修饰的酵母，其中所述天然Ac-CoA途径的减弱是通过降低编码醛脱氢酶的天然基因(ALD2、ALD3、ALD4、ALD5或ALD6)中的一种或多种的表达来实现的。

4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入外源磷酸转酮酶活性和外源磷酸转乙酰酶活性的结果。

5.如权利要求1-4中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因的结果。

6.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述甘油生物合成途径的减弱是GDP1、GDP2、GPP1和/或GPP2的破坏或修饰。

7.如前述权利要求中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞进一步包含增加的乙酰CoA合酶活性。

8.如前述权利要求中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞进一步包含编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的异源基因或编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的过表达的内源基因。

9.如前述权利要求中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞缺乏编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因或具有降低的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性。

10.如前述权利要求中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞缺乏编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因或具有降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性。

11.如前述权利要求中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。

12.一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙醇生产的方法，所述方法包括：减弱用于制备Ac-CoA的酵母细胞天然生物合成途径，所述天然途径在厌氧条件下有助于所述酵母细胞中的氧化还原辅因子失衡；向所述酵母细胞中引入用于制备Ac-CoA的替代性人工途径，与所述天然途径相比，所述人工途径在厌氧条件下不利于所述酵母细胞中的氧化还原辅因子失衡；并减弱所述酵母细胞中的甘油生物合成途径；其中，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出增加的乙醇生产。

13.如权利要求12所述的方法，其中减弱所述天然Ac-CoA途径是通过降低醛脱氢酶活性来进行的。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中减弱所述天然Ac-CoA途径是通过破坏一个或多个天然醛脱氢酶基因来进行的。

15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入外源磷酸转酮酶活性和外源磷酸转乙酰酶活性的结果。

16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因的结果。

17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中减弱所述甘油生物合成途径是通过破坏或修饰GDP1、GDP2、GPP1和/或GPP2来进行的。

18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括增加乙酰CoA合酶活性。

19.如权利要求12-18中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述细胞中引入编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的异源基因或过表达编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的内源基因。

20.如权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述细胞缺乏编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因或具有降低的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性。

21.如权利要求12-20中任一项所述的方法，其中所述细胞缺乏编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因或具有降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性。

22.如权利要求12-21中任一项所述的方法，其中与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少

6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。

23.一种经修饰的酵母细胞，其通过如权利要求12-22中任一项所述的方法生产。

24.一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙醇生产的方法，所述方法包括：在如权利要求1-11或23中任一项所述的经修饰的酵母细胞存在下或者在通过如权利要求12-22中任一项所述的方法产生的经修饰的酵母细胞的存在下，孵育碳水化合物底物，其中与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。

25.一种通过如权利要求24或28所述的方法产生的乙醇。

26.一种经修饰的酵母细胞，其包含来自鬃毛甲烷菌(Methanosaeta concilii)(WP_

013718460)的乙酰CoA合酶或与来自鬃毛甲烷菌的乙酰CoA合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％和甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶。

27.一种用于将乙酸盐转化为Ac-CoA的方法，所述方法包括向所述细胞中引入编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的异源基因，其中所述基因衍生自来自鬃毛甲烷菌(WP_

28.如权利要求27所述的方法，将其与如权利要求12-22或24中任一项所述的方法组合使用。

说明书全文

酵母中的氧化还原平衡

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2016年4月28日提交的美国临时申请USSN 62/328,800的优先权权益，将其以其全文通过引用结合。

技术领域

[0003] 本发明的组合物和方法涉及通过重新工程化Ac-CoA生物合成途径，在具有减弱的甘油生产的厌氧生长酵母中减少氧化还原失衡。所得途径修饰的酵母可用于从含碳水化合物的底物生产乙醇。

背景技术

[0004] 在使用酵母发酵含碳水化合物的水解产物的工业乙醇和生物化学生产中，甘油是主要的低价值副产物。因此，减少甘油生产并将额外的碳引入乙醇或其他有价值的生物化学品中具有经济吸引力。

[0005] 在酵母发酵过程中改善乙醇产量的一种解决方案是灭活编码控制甘油形成的酶的基因。这样的基因是公知的，例如，GPD1和GDP2，它们编码将二羟丙酮磷酸(糖酵解中间产物)转换成甘油磷酸酯(其随后被去磷酸化为甘油)的两种甘油磷酸脱氢酶。已经描述了携带这两个基因的缺失的酵母菌株(参见，例如 S.等人(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]，63:128-32和Ansell,R.等人(1997)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]16:2179-87)。然而，这样的菌株不适合作为工业产乙醇生物体或生物化学生产者，因为它们缺乏在厌氧条件下生长的能力。所谓的“无甘油”酵母菌株无法厌氧生长的潜在生理原因是所谓的氧化还原失衡。

[0006] 虽然通过糖酵解途径将葡萄糖发酵成乙醇是氧化还原平衡的，但是为了生物合成需要(例如，积累生物质)，甘油醛3-磷酸(由NAD+依赖性脱氢酶氧化的中间产物)和乙醛(由NADH依赖性脱氢酶还原的中间产物)之间的一些糖酵解中间产物被取出。取出这样的中间体导致产生过量的NADH并因此导致氧化还原失衡。酵母通常通过用甘油磷酸脱氢酶(其由GPD1和GPD2基因在酵母中编码)再氧化过量的NADH来缓解氧化还原失衡的问题。

[0007] 已经描述了在减少甘油形成的同时解决酵母中氧化还原失衡问题的尝试。例如，可溶的H2O形成NADH氧化酶已被用于降低微需氧生长的酵母中的NADH/NAD+比值(Heux,S等人(2006)Metab.Eng.[代谢工程]8:303-14)。虽然在概念上具有吸引力，但这种方法不适用于在典型工业酵母发酵的完全厌氧条件下生长的酵母。另一种方法基于用糖醇等替代性分子取代甘油的渗透保护功能和氧化还原平衡功能(参见，例如Shen B.等人(1999)Plant Physiol.[植物生理学]121:45-52)。

[0008] 所有上述方法的主要缺点是从乙醇或其他有价值的生物化学品的生产中转化到替代性途径中的碳量大约等于或高于野生型酵母转化到甘油生产中的量，从而否决了原有目标。

发明内容

[0009] 本发明的组合物和方法涉及通过重新工程化Ac-CoA生物合成途径，在具有减弱的甘油生产的厌氧生长酵母中减少氧化还原失衡。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

[0010] 1.在一个方面，提供了经修饰的酵母细胞，所述酵母细胞包含：用于制备Ac-CoA的减弱的天然生物合成途径，所述天然途径在厌氧条件下利于所述细胞中的氧化还原辅因子失衡；用于制备Ac-CoA的替代性人工途径的引入，与所述天然生物合成途径相比，所述人工途径在厌氧条件下不利于所述细胞中的氧化还原辅因子失衡；和甘油生物合成途径的减弱；其中，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出增加的乙醇生产。

[0011] 2.在段落1的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述天然Ac-CoA途径的减弱是通过降低醛脱氢酶活性来实现的。

[0012] 3.在段落1或2的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述天然Ac-CoA途径的减弱是通过降低编码醛脱氢酶的天然基因(ALD2、ALD3、ALD4、ALD5或ALD6)中的一种或多种的表达来实现的。

[0013] 4.在段落1-3中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入外源磷酸转酮酶活性和外源磷酸转乙酰酶活性的结果。

[0014] 5.在段落1-4中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因的结果。

[0015] 6.在段落1-5中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述甘油生物合成途径的减弱是GDP1、GDP2、GPP1和/或GPP2的破坏或修饰。

[0016] 7.在前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含增加的乙酰CoA合酶活性。

[0017] 8.如前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述细胞进一步包含编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的异源基因或编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的过表达的内源基因。

[0018] 9.在前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述细胞缺乏编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因或具有降低的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性。

[0019] 10.在前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述细胞缺乏编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因或具有降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性。

[0020] 11.在前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。

[0021] 12.在另一方面，提供了一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙醇生产的方法，所述方法包括：减弱所述用于制备Ac-CoA的酵母细胞天然生物合成途径，所述天然途径在厌氧条件下有助于所述酵母细胞中的氧化还原辅因子失衡；向所述酵母细胞中引入用于制备Ac-CoA的替代性人工途径，与所述天然途径相比，所述人工途径在厌氧条件下不利于所述酵母细胞中的氧化还原辅因子失衡；并减弱所述酵母细胞中的甘油生物合成途径；其中，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出增加的乙醇生产。

[0022] 13.在段落12的方法的一些实施例中，减弱所述天然Ac-CoA途径是通过降低醛脱氢酶活性来实现的。

[0023] 14.在段落12或13的方法的一些实施例中，减弱所述天然Ac-CoA途径是通过破坏一个或多个天然醛脱氢酶基因来进行的。

[0024] 15.在段落12-14中任一项的方法的实施例中，所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入外源磷酸转酮酶活性和外源磷酸转乙酰酶活性的结果。

[0025] 16.在段落12-15中任一项的方法的一些实施例中，所述用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因的结果。

[0026] 17.在段落12-16中任一项的方法的一些实施例中，减弱所述甘油生物合成途径是通过破坏或修饰GDP1、GDP2、GPP1和/或GPP2来进行的。

[0027] 18.段落12-17中任一项的方法的一些实施例进一步包括增加乙酰CoA合酶活性。

[0028] 19.段落12-18中任一项的方法的一些实施例进一步包括向所述细胞中引入编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的异源基因或过表达编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的内源基因。

[0029] 20.在段落12-19中任一项的方法的一些实施例中，所述细胞缺乏编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因或具有降低的NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性。

[0030] 21.在段落12-20中任一项的方法的一些实施例中，所述细胞缺乏编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因或具有降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性。

[0031] 22.在段落12-21中任一项的方法的一些实施例中，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。

[0032] 23.在另一方面，提供了通过段落12-22中任一项所述的方法产生的经修饰的酵母细胞。

[0033] 24.在另一方面，提供了一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙醇生产的方法，所述方法包括：在段落1-11或23中任一项所述的经修饰的酵母细胞存在下或者在通过段落12-22中任一项的方法产生的经修饰的酵母细胞的存在下孵育碳水化合物底物，其中与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。

[0034] 25.在另一方面，提供了通过段落24或28所述的方法产生的乙醇。

[0035] 26.在另一方面，提供了经修饰的酵母细胞，其包含来自鬃毛甲烷菌(Methanosaeta concilii)(WP_013718460)的乙酰CoA合酶或与来自鬃毛甲烷菌的乙酰CoA合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％和甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶。

[0036] 27.在另一方面，提供了一种用于将乙酸盐转化为Ac-CoA的方法，所述方法包括向所述细胞中引入编码具有乙酰CoA合酶活性的多肽的异源基因，其中所述基因衍生自来自鬃毛甲烷菌(WP_013718460)的乙酰CoA合酶或与来自鬃毛甲烷菌的乙酰CoA合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％和甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶。

[0037] 28.在另一方面，提供了段落27所述的方法，将其与段落12-22或24中任一项的方法组合使用。

附图说明

[0038] 图1是一张图像，其显示在SC ura+(2％葡萄糖，0.67％无氨基酸的酵母氮源，200mg/l尿苷)板(左)和补充有1g/l乙酸钾的相同培养基(右)上划线的、携带ald4、ald5和ald6缺失的FG ura3衍生的菌株的两个分离株的生长。将两个板在30℃孵育约3天。

[0039] 图2是描绘质粒pPATH6(FBA1)的图谱的简图。

[0040] 图3是一张图表，其显示通过工程化菌株ZG1::pPATH6(FBA1)和ZZ::pPATH6(FBA1)以及参考(和比较的野生型)菌株FERMAXTM Gold测量葡萄糖消耗(g/L)的葡萄糖消耗时程实验。

[0041] 图4是一张图表，其显示ZG1::pPATH6(FBA1)、ZZ::pPATH6(FBA1)和FERMAXTM Gold的乙醇生产(g/L)。

[0042] 图5是一张图表，其显示ZG1::pPATH6(FBA1)、ZZ::pPATH6(FBA1)和FERMAXTM Gold的培养物中甘油(g/L)和乙醇(g/L)的发酵滴度的结束。

具体实施方式

[0043] I.引言

[0044] 本发明的组合物和方法涉及通过与先前描述的策略不同的策略在厌氧条件下增加来自酵母发酵的乙醇产量。不是试图减轻由减少或消除作为电子穴(electron sink)的甘油的产生而导致的氧化还原失衡，相反，本策略是为了修饰酵母代谢以减少或消除该氧化还原失衡的根本原因。导致在厌氧发酵酵母中产生氧化还原失衡的一个主要途径是Ac-CoA生物合成途径，其被酵母用于在厌氧条件下制备必需的Ac-CoA前体。在厌氧生长的酵母中，Ac-CoA合成涉及通过NADP+依赖性脱氢酶将乙醛氧化成乙酸，所述乙酸随后通过乙酰CoA合酶被转化为Ac-CoA。转化到该途径中的乙醛不能用于通过醇脱氢酶催化的NADH依赖性还原成乙醇。由于NAD+分子用于氧化糖酵解途径上游的甘油醛3-磷酸，因此乙醛转化为乙酸盐是氧化还原失衡的一个原因。

[0045] 令人惊讶的是，我们发现减弱醛脱氢酶步骤中的天然Ac-CoA途径，并为酵母提供基于磷酸转酮酶的替代性Ac-CoA生物合成途径，足以消除无甘油酵母菌株的大部分厌氧生长能力不足。天然Ac-CoA途径的减弱减少了NADH积累，因为在野生型酵母中通常被取出到该途径中的乙醛可用作醇脱氢酶的底物，所述醇脱氢酶将NADH再循环为其氧化形式NAD+，而基于磷酸转酮酶途径的引入以不依赖于氧化还原的方式恢复从五碳或六碳糖磷酸前体生产Ac-CoA。

[0046] 使用此类工程菌株显著提高了乙醇的产量。具有替代性Ac-CoA生物合成途径的菌株中的产量也得到改善，所述Ac-CoA生物合成途径被修饰为仅具有部分减弱的甘油形成途径；因此，不需要完全消除野生型甘油生物合成途径以实现乙醇生产的益处。

[0047] II.定义

[0048] 在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

[0049] 如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或RNA表达的核酸。

[0050] 如本文所用，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并且是指自然界中发现的基因、蛋白质、菌株和生物化学途径。

[0051] 如本文所用，“基因缺失”是指该基因从宿主细胞的基因组中去除。缺失可以是完全的(意味着整个基因(即至少整个编码序列被去除))或部分的(意味着仅去除了一部分编码序列或调节序列但是阻止了功能性基因产物的产生)。

[0052] 如本文所用，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即生物化学途径)，泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间产物的通量的任何基因或化学操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有降低的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对降低的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间产物相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。

[0053] 如本文所用，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞产生功能性基因产物的基因操作。基因破坏的示例性方法包括完全或部分缺失基因以及在编码或调控序列中制造突变。

[0054] 如本文所用，术语“基因操作”和“基因改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。

[0055] 如本文所用，术语“实质上阻止途径的功能”意指如通过指示途径功能的产品的消耗或产生所测量的，与未经修饰(即野生型)细胞中的相应途径相比，途径的活性降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、％或甚至不可检测。

[0056] 如本文所用，短语“实质上阻止细胞产生功能性基因产物”或类似短语意指如通过指示基因产物功能的消耗或产生所测量的，与未经修饰(即野生型)细胞中的相应基因产物相比，特定基因产物的活性减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或甚至不可检测。如本文所用，短语“实质上不含活性”，实质上阻止或类似短语，意指与未经修饰(即野生型)细胞中的相应活性相比，特定活性降低至少50％、至少60％、至少
70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至不可检测。

[0057] 如本文所用，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。

[0058] 如本文所用，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。

[0059] 如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用用于氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经自然地或通过干预被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰是例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分轭合。该定义中还包括，例如，包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他经修饰的多肽。

[0060] 如本文所用，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。

[0061] 如本文所用，术语“氨基酸序列同一性百分比”或类似术语是指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，具体序列具有与指定参考序列中的氨基酸残基相同的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-80。CLUSTAL W算法的默认参数是：

[0062]

[0063]

[0064] 如本文所用，单数冠词“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此结合。除非另有说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

[0065] EC 酶学委员会

[0066] kDa 千道尔顿

[0067] kb 千碱基

[0068] MW 分子量

[0069] w/v 重量/体积

[0070] w/w 重量/重量

[0071] v/v 体积/体积

[0072] wt％重量百分比

[0073] ℃ 摄氏度

[0074] H2O 水

[0075] H2O2 过氧化氢

[0076] dH2O或DI 去离子水

[0077] dIH2O 去离子水，Milli-Q过滤

[0078] g或gm 克

[0079] μg 微克

[0080] mg 毫克

[0081] kg 千克

[0082] lb 磅

[0083] μL和μl 微升

[0084] mL和ml 毫升

[0085] mm 毫米

[0086] μm 微米

[0087] mol 摩尔

[0088] mmol 毫摩尔

[0089] M 摩尔

[0090] mM 毫摩尔

[0091] μM 微摩尔

[0092] nm 纳米

[0093] U 单位

[0094] ppm 份/百万份

[0095] sec和″ 秒

[0096] min和′ 分钟

[0097] hr和h 小时

[0098] EtOH 乙醇

[0099] eq. 当量

[0100] PCR 聚合酶链式反应

[0101] DNA 脱氧核糖核酸

[0102] Δ 与缺失有关

[0103] bp 碱基对

[0104] III.实施例

[0105] A.经修饰的酵母概述

[0106] 本发明的组合物和方法涉及通过修饰酵母代谢来在厌氧条件下增加来自酵母发酵的乙醇产量，以减少甘油产生并减少和/或消除氧化还原失衡。本发明的组合物和方法包括例如在醛脱氢酶步骤中具有减弱的天然Ac-CoA途径并提供有基于磷酸转酮酶的替代性Ac-CoA生物合成途径的酵母菌株。该基因操作的组合显示出足以消除无甘油酵母菌株的大部分厌氧生长能力不足。天然Ac-CoA途径的减弱减少了NADH积累，因为在野生型酵母中通常被取出到该途径中的乙醛可用作醇脱氢酶的底物，所述醇脱氢酶将NADH再循环为其氧化形式NAD+，而磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶的引入以不依赖于氧化还原的方式恢复从五碳或六碳糖磷酸前体生产Ac-CoA。以下更详细地描述了本发明组合物和方法的关键特征：

[0107] B.酵母中用于制备Ac-CoA的天然生物合成途径的减弱

[0108] 本发明组合物和方法的第一特征是酵母中用于制备Ac-CoA的天然生物合成途径的减弱，所述减弱在厌氧条件下利于细胞中的氧化还原辅因子失衡，并且因此需要产生甘油以恢复氧化还原平衡。在一些实施例中，组合物和方法涉及编码醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)的天然基因(例如ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6)中的一种、几种或所有的破坏。天然酵母Ac-CoA途径(包括醛脱氢酶)在文献中有很好的描述。这些天然基因的缺失已在以下文献中描述：例如，Kozak等人(2014)Metabolic Engineering[代谢工程]21:46-59。由于天然生物合成途径的减弱，通过所述途径的通量减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至全部。本文和文献中描述了用于减弱途径的方法。

[0109] C.用于制造Ac-CoA的替代性人工途径的引入

[0110] 本发明组合物和方法的第二特征是用于制造Ac-CoA的替代性人工途径的引入，所述人工途径在厌氧条件下不利于细胞中的氧化还原辅因子失衡。在组合物和方法的一些实施例中，用于制备Ac-CoA的替代性人工途径是向酵母细胞中引入外源磷酸转酮酶(EC 4.1.2.22)和外源磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)活性的结果。在组合物和方法的特定实施例中，用于制备乙醇的替代性人工途径是引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因的结果。示例性磷酸转酮酶可以从阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_016786789)获得。示例性磷酸转乙酰酶可以从植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_003641060)获得。

[0111] D.甘油天然生物合成途径的减弱

[0112] 在一些情况下，如上所述，可能需要用替代性人工途径替代天然生物合成途径以制备Ac-CoA，而无需其他基因操作。然而，正是由于甘油天然生物合成途径的减弱而导致的氧化还原失衡导致了氧化还原失衡并为这些修饰提供动力。

[0113] 因此，本发明组合物和方法的第三特征是甘油天然生物合成途径的减弱。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是众所周知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一种或多种来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。由于天然生物合成途径的减弱，通过所述途径的通量减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至全部。本文和文献中描述了用于减弱途径的方法。

[0114] E.对酵母的进一步修饰

[0115] 虽然对于本发明的组合物和方法不是关键的，但是经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰CoA合酶(也称为乙酰CoA连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为Ac-CoA。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于乙醇产量的提高。增加乙酰CoA合酶活性可以通过将异源乙酰CoA合酶基因导入细胞、增加内源乙酰CoA合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰CoA合酶可以从鬃毛甲烷菌(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自鬃毛甲烷菌的乙酰CoA合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、和甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。

[0116] 在本发明的组合物和方法的一些实施例中，可能需要将上述修饰与引入编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因相组合。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱组合的此类基因的引入。然而，在本发明组合物和方法的大多数实施例中，不需要引入乙酰化乙醛脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶，因为通过减弱导致氧化还原辅因子失衡的用于制备Ac-CoA的天然生物合成途径消除了对这些活性的需要。因此，本发明的组合物和方法的实施例特意缺失编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。

[0117] 在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞包括编码目的蛋白的任何数目的其他目的基因，所述目的蛋白是例如选择性标记，碳水化合物加工酶，和其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。

[0118] F.使用经修饰的酵母用于增加乙醇生产

[0119] 本发明的组合物和方法的期望结果是，与缺乏所述修饰的可比酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所得酵母展示出增加的乙醇生产。例如，与缺乏所述修饰的相当的酵母细胞相比，使用碳水化合物底物，所述经修饰的酵母细胞可以展示出至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％或甚至至少10％的乙醇生产增加。应当理解，百分比增加是相对的，使得与正常的15％产量相比，增加10％总计为16.5％，而不是25％。经修饰的酵母还可以展示出改变的生长速率或其他表型和/或其他有价值的生物化学物质(除乙醇外)的改变的生产。

[0120] G.用于修饰的酵母

[0121] 酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物。可用于乙醇生产的酵母包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、其他酵母属(Saccharomyces)物种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，例如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶。

[0122] 尽管使用常见的可商购酿酒酵母菌株来举例说明本发明的组合物和方法，但可以在包括用于乙醇生物合成的相应天然基因的任何酵母(包括由于选择或基因操作而包含进一步修饰的酵母，只要此类修饰与本发明的组合物和方法不矛盾)中进行等效修饰并进行测试。

[0123] H.碳水化合物底物和方法

[0124] 从大量碳水化合物底物生产乙醇是众所周知的，对酶和化学条件以及机械方法的无数变化和改进也是如此。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。

[0125] 实例

[0126] 实例1：构建具有Ac-CoA和甘油生物合成缺失的酵母菌株

[0127] 使用标准分子生物学技术使在厌氧生长酵母中控制几乎所有Ac-CoA产生的三个基因(即编码主要醛脱氢酶的ALD4、ALD5和ALD6)和控制甘油产生的两个基因(即GPD1和GPD2)从亲本酵母菌株中缺失。

[0128] 通过顺序地使每个基因缺失，构建了携带Ac-CoA和甘油生物合成途径的部分或基本上完全破坏的五种菌株(表1)。通过使用PCR扩增经修饰的区域并对所得PCR产物进行测序来确认基因型。尽管酵母可能含有编码醛脱氢酶同源物的其他内源基因，但这些基因或者以非常低的水平表达，或者它们编码的酶对乙醛具有非常低的活性，如通过菌株FGAZ的乙酸盐营养缺陷分析所证明的(图1)。因此，出于本文所述的目的，ALD4、ALD5和ALD6的缺失足以产生具有天然Ac-CoA生物合成途径的减弱的菌株。

[0129] 表1.具有Ac-CoA和甘油生物合成基因缺失的菌株

[0130]

[0131]

[0132] 实例2.构建编码替代性Ac-CoA生物合成途径的酵母载体

[0133] 使用标准方法构建质粒载体pPATH6(FBA1)(图2)。所述载体包括三个表达盒，产生替代性Ac-CoA生物合成途径的三种酶：(i)磷酸转酮酶(EC 4.1.2.22)，(ii)磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)和(iii)乙酰CoA合成酶(EC 6.2.1.1)。编码所述三种酶的合成序列基于来自阴道加德纳菌(WP_016786789)的磷酸转酮酶、来自植物乳杆菌(WP_003641060)的磷酸转乙酰酶和来自鬃毛甲烷菌(WP_013718460)的乙酰CoA合酶的蛋白序列。乙酰CoA合酶，虽然严格上讲不是基于磷酸转酮酶的Ac-CoA生物合成途径的一部分，但在辅助作用方面用来确保由乙酰磷酸的化学或酶水解产生的任何乙酸盐被捕获并被转换成Ac-CoA。

[0134] 基于酿酒酵母密码子偏好合成pPATH6(FBA1)中三种途径酶的编码序列。将这些编码序列置于强糖酵解启动子和转录终止子的控制下，所述启动子和终止子通过PCR从酵母基因组DNA扩增。三个表达盒的簇和酵母天然ura3基因(用作选择性标记)的侧翼为酿酒酵母δ-序列的短延伸，以指导酵母基因组中存在的多个δ-序列中的任何一个处的DNA整合(图2)。为了转化酵母，用限制酶SwaI消化pPATH6(FBA1)以切除大肠杆菌中质粒维持所需的序列。通过琼脂糖凝胶电泳纯化来自该消化物的更大(10.5kb)片段，并用于将菌株ZG1和ZZ(实例1)转化为尿嘧啶原养型。将菌株ZG1的转化体命名为ZG1::pPATH6(FBA1)，并将菌株ZZ的转化体命名为ZZ::pPATH6(FBA1)。

[0135] 实例3.测试具有工程化的Ac-CoA和甘油途径的菌株的性能

[0136] 将ZG1和ZZ的随机选择的转化体以及野生型菌株FERMAXTM Gold在含有60g/l葡萄糖、1.7g/l无氨基酸的酵母氮源和硫酸铵、2g/l尿素的培养基(SC6％)中在液体培养物中需氧培养过夜。通过离心收集细胞，用新鲜SC6％培养基洗涤并用于在20ml螺旋盖小瓶中在10ml冰冷SC6％中接种培养物至初始OD600为0.5。将小瓶密封，并将261/2号针头插入盖子中，为发酵过程中产生的CO2提供出口。将发酵在严格厌氧条件(在厌氧罩中)、在32℃下伴随300rpm震荡进行。定期取出培养液样品，无菌过滤并通过HPLC分析。

[0137] 如图3和图4所示，菌株ZG1::pPATH6(FBA1)在18小时内完全消耗葡萄糖并且比野生型菌株(即FERMAXTMGold)多产生约5％的乙醇。请注意，ZG1::pPATH6(FBA1)数据和FERMAXTM Gold数据的数据点和线在图3中重叠。相对于野生型，ZG1::pPATH6(FBA1)中的甘油产生减少约45％(图5)。ZZ1::pPATH6(FBA1)菌株的发酵较慢，但它能够在45至78小时内消耗所有葡萄糖，并且比野生型菌株多产生超过10％的乙醇(图3和图4)。ZZ1::pPATH6(FBA1)产生的甘油可忽略不计(图5)。

[0138] 结果表明，在具有减弱的天然Ac-CoA和甘油途径的菌株中，引入替代性Ac-CoA生物合成途径(pPATH6(FBA1))不仅恢复了在不存在外部添加的乙酸盐的情况下酵母生长的能力，而且与野生型生物体相比，赋予了在葡萄糖基础上以高得多的产量生产乙醇的能力。同时，此类菌株产生的甘油大大减少或基本上不存在。已知具有减弱的甘油途径的野生型酵母生长不良，并且已知具有经破坏的甘油途径的酵母丧失厌氧生长的能力。值得注意的是，尽管甘油途径完全被破坏，菌株ZZ::pPATH6(FBA1)仍保持厌氧生长和将葡萄糖完全转化为乙醇的能力，乙醇产量显著(超过10％)提高。

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