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产油微生物润滑剂

阅读：1045发布：2021-03-03

IPRDB可以提供产油微生物润滑剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供具有延迟释放的润滑的钻井流体，这些钻井流体包含一种钻井泥浆和一种产油微生物细胞；使用和制备这样的钻井流体的方法；以及包含这样的钻井流体的钻机。本发明还提供包含一种产油微生物细胞的润滑剂。这些润滑剂的用途包括金属加工和极压应用。，下面是产油微生物润滑剂专利的具体信息内容。

1.一种用于在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑的钻井流体，该流体包含：a)一种钻井泥浆和

b)一种产油微生物细胞；

所述钻井流体能在钻井期间提供增加的润滑性和以下中的一种或多种：i)对钻柱的转矩的至少5％减小；

ii)钻进速度的至少5％增加；或

iii)阻力的至少5％减小。

2.根据权利要求1所述的钻井流体，其中该流体能在至少5、15、30、45或60分钟时段期间提供增加的润滑性。

3.根据权利要求1或2所述的钻井流体，其中该流体能提供转矩的至少25％、30％、

35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％减小。

4.根据权利要求3所述的钻井流体，其中该流体能提供转矩的至少60％、65％、70％或

75％减小。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的钻井流体，其中该流体能提供钻进速度的至少

5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％增加。

6.根据权利要求1到4中任一项所述的钻井流体，其中该流体能提供阻力的至少5％、

10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％减小。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％或更少。

8.根据权利要求1到6中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的10％或更少。

9.根据权利要求1到6中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的6％或更少。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞包含一种微藻细胞，该微藻细胞含有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％油。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞包含一种完整细胞。

12.根据权利要求1到10中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞包含一种裂解细胞。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞包含一种产油细菌、酵母或微藻。

14.根据权利要求1到11中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞得自一种异养产油微藻。

15.根据权利要求1到13中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞得自用来自玉米、高粱、甘蔗、甜菜或糖蜜的糖作为碳源培养的微藻。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞得自在蔗糖上培养的微藻。

17.根据权利要求1到16中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞得自拟小球藻属、原壁藻属或小球藻属。

18.根据权利要求1到17中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞得自莫氏原壁藻。

19.根据权利要求1到18中任一项所述的钻井流体，其中该微生物细胞包含一种产油微藻，该产油微藻的脂肪酸谱为至少60％C18:1；或至少50％组合总量的C10、C12和C14；

或至少70％组合总量的C16:0和C18:1。

20.根据权利要求1到19中任一项所述的钻井流体，其中该钻井泥浆是一种水基泥浆、一种合成基泥浆或一种油基泥浆。

21.根据权利要求1到20中任一项所述的钻井流体，其进一步包含一种或多种选自下组的添加剂，该组由以下各项组成：泡沫体、聚合物颗粒、热固性聚合物颗粒和纳米复合粒子。

22.一种在钻井作业中钻井眼的方法，该方法包含使根据权利要求1到21中任一项所述的钻井流体通过该井眼循环。

23.根据权利要求22所述的方法，其中该钻井作业是一种陆基或一种近海钻井作业。

24.根据权利要求22到23中任一项所述的方法，其中该钻井作业选自下组，该组由以下各项组成：完井作业、防砂作业、修井作业和水力压裂作业。

25.根据权利要求22到24中任一项所述的方法，其中该井眼是一个垂直或水平井眼。

26.一种钻机，其含有根据权利要求1到21中任一项所述的钻井流体。

27.根据权利要求26所述的钻机，其中该流体位于一个钻井管或泥浆罐中。

28.一种制备用于在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑的钻井流体的方法，该方法包含将一种钻井泥浆与一种产油微生物细胞混合以形成一种钻井流体，该钻井流体能在钻井期间增加润滑性并实现以下中的一种或多种：i)对钻头的转矩的至少5％减小；

ii)钻进速度的至少5％增加；或

iii)阻力的至少5％减小。

29.根据权利要求28所述的方法，其中该钻井流体能提供钻进速度的至少5％、10％、

15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％增加。

30.根据权利要求28到29中任一项所述的方法，其中该钻井流体能提供阻力的至少

5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％减小。

31.根据权利要求28到30中任一项所述的方法，其中该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或3％或更少。

32.根据权利要求28到31中任一项所述的方法，其中该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的10％或更少。

33.根据权利要求28到31中任一项所述的方法，其中该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的6％或更少。

34.根据权利要求28到33中任一项所述的方法，其中该微生物细胞是一种微藻细胞，该微藻细胞含有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％油。

35.根据权利要求28到34中任一项所述的方法，其中该微生物细胞包含一种完整细胞。

36.根据权利要求28到34中任一项所述的方法，其中该微生物细胞包含一种裂解细胞。

37.根据权利要求28到36中任一项所述的方法，其中该微生物细胞包含一种产油细菌、酵母或微藻。

38.根据权利要求28到37中任一项所述的方法，其中该微生物细胞得自一种异养产油微藻。

39.根据权利要求28到38中任一项所述的方法，其中该微生物细胞得自用来自玉米、高粱、甘蔗、甜菜或糖蜜的糖作为碳源培养的微藻。

40.根据权利要求28到39中任一项所述的方法，其中该微生物细胞得自在蔗糖上培养的微藻。

41.根据权利要求28到40中任一项所述的方法，其中该微生物细胞得自拟小球藻属、原壁藻属或小球藻属。

42.根据权利要求28到41中任一项所述的方法，其中该微生物细胞得自莫氏原壁藻。

43.根据权利要求28到42中任一项所述的方法，其中该微生物细胞包含一种产油微藻，该产油微藻的脂肪酸谱为至少60％C18:1；或至少50％组合总量的C10、C12和C14；或至少70％组合总量的C16:0和C18:1。

44.根据权利要求28到43中任一项所述的方法，其中该钻井泥浆是一种水基泥浆、一种合成基泥浆或一种油基泥浆。

45.根据权利要求44所述的方法，其中该泥浆包含一种水基泥浆。

46.一种包含产油微生物细胞的润滑剂，该细胞含有以细胞干重计至少45％油。

47.根据权利要求46所述的润滑剂，其中该细胞含有以细胞干重计至少50％、55％、

60％、65％、70％、75％或80％油。

48.根据权利要求46到47中任一项所述的润滑剂，其中该润滑剂能提供转矩的至少

25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％减小。

49.根据权利要求46到48中任一项所述的润滑剂，其中该润滑剂能提供转矩的至少

60％、65％、70％或75％减小。

50.根据权利要求46到49中任一项所述的润滑剂，其中该流体能提供钻进速度的至少

5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％增加。

51.根据权利要求46到50中任一项所述的润滑剂，其中该流体能提供阻力的至少

5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％减小。

52.根据权利要求46到51中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞包含一种完整细胞。

53.根据权利要求46到51中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞包含一种裂解细胞。

54.根据权利要求46到53中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞包含一种产油细菌、酵母或微藻。

55.根据权利要求46到54中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞得自一种异养产油微藻。

56.根据权利要求46到55中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞得自用来自玉米、高粱、甘蔗、甜菜或糖蜜的糖作为碳源培养的微藻。

57.根据权利要求46到55中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞得自在蔗糖上培养的微藻。

58.根据权利要求46到57中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞得自拟小球藻属、原壁藻属或小球藻属。

59.根据权利要求46到58中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞得自莫氏原壁藻。

60.根据权利要求46到59中任一项所述的润滑剂，其中该微生物细胞包含一种产油微藻，该产油微藻的脂肪酸谱为至少60％C18:1；或至少50％组合总量的C10、C12和C14；或至少70％组合总量的C16:0和C18:1。

61.根据权利要求46到60中任一项所述的润滑剂，其中该润滑剂是一种极压润滑剂。

62.一种金属加工流体，其包含根据权利要求46到61中任一项所述的润滑剂。

63.根据权利要求62所述的金属加工流体，其中该润滑剂的量按体积计为该金属加工流体的90％、80％、70％、60％、50％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％或更少。

64.根据权利要求62到63中任一项所述的金属加工流体，其中该金属加工流体包含一种不溶性油、可溶油、半合成或合成金属加工流体。

65.根据权利要求62到64中任一项所述的金属加工流体，其进一步包含以下中的一种或多种：表面活性剂、乳化剂、消泡剂、碱性贮存物、抗雾剂、缓蚀剂、杀生物剂、极压添加剂、偶合剂、增稠剂、螯合剂、润滑剂、保湿剂、气味剂或染料。

66.根据权利要求65所述的金属加工流体，其中该表面活性剂包含一种醚、烷氧基化壬基酚、或其混合物。

67.根据权利要求65到66中任一项所述的金属加工流体，其中该乳化剂包含一种六氢苯甲酸、环烷酸盐、磺酸盐、皂、酰胺、非离子乙氧基化物、一种两性物、或其混合物。

68.根据权利要求65到67中任一项所述的金属加工流体，其中该消泡剂包含一种硅酮、蜡、亚硝酸钙、乙酸盐、或其混合物。

69.根据权利要求65到68中任一项所述的金属加工流体，其中该碱性贮存物包含一种烷醇胺、一种碱金属类氢氧化物、或其混合物。

70.根据权利要求65到69中任一项所述的金属加工流体，其中该抗雾剂包含一种聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚氧化乙烯、或其混合物。

71.根据权利要求65到70中任一项所述的金属加工流体，其中该缓蚀剂包含一种胺羧酸盐、胺二羧酸盐、硼酰胺、芳基磺酰胺基酸、硼酸钠、钼酸钠、偏硅酸钠、琥珀酸衍生物、甲苯基三唑、苯并三唑、苯并噻唑、噻二唑、二乙醇胺、三乙醇胺、亚硝酸盐、氯酚、甲酚、甲醛福尔马林、碘、磷酸盐、有机汞制剂、酚、季铵化合物、羟胺、S-三嗪化合物、三-羟甲基硝基甲烷、或其混合物。

72.根据权利要求65到71中任一项所述的金属加工流体，其中该杀生物剂包含一种三嗪、硝基吗啉、聚合季铵化合物、溴腈、酚、卤代氨基甲酸酯、异噻唑酮、或其混合物。

73.根据权利要求65到72中任一项所述的金属加工流体，其中该极压添加剂包含一种硫化烃、硫化脂肪酸酯、氯化石蜡、氯化酸、氯化酯、磷酸酯、或其混合物。

74.根据权利要求65到73中任一项所述的金属加工流体，其中该偶合剂包含一种醇、醚、二醇醚、己二醇、或其混合物。

75.根据权利要求65到74中任一项所述的金属加工流体，其中该增稠剂包含一种聚醚、一种聚乙烯醇、或其混合物。

76.根据权利要求65到75中任一项所述的金属加工流体，其中该螯合剂包含EDTA钠、一种膦酸盐、葡糖酸盐、或其混合物。

77.根据权利要求65到76中任一项所述的金属加工流体，其中该润滑剂包含一种芳香族油、酯、环烷油、石蜡油、聚醚二醇、酯、脂肪酸酯、二醇酯、嵌段共聚物、或其混合物。

78.根据权利要求65到77中任一项所述的金属加工流体，其中该保湿剂包含一种聚合醚、一种酯、或其混合物。

79.根据权利要求65到78中任一项所述的金属加工流体，其中该气味剂包含一种醛。

80.根据权利要求65到79中任一项所述的金属加工流体，其中该染料包含一种偶氮染料、一种荧光黄、或其混合物。

81.一种微型隧道钻探机(MTBM)，其包含根据权利要求46到60中任一项所述的润滑剂。

说明书全文

产油微生物润滑剂

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请案根据35U.S.C.119(e)要求2013年3月8日申请的美国临时专利申请案第61/775,416号、2013年4月30日申请的第61/817,793号、2013年5月31日申请的第61/829,889号、2013年6月28日申请的第61/841,212号、2013年9月19日申请的第61/879,676号、2013年12月10日申请的第61/914,336号和2014年1月10日申请的第
61/926,036号的权益。出于所有目的将这些申请的每一篇通过引用以其全文结合在此。
[0003] 背景
[0004] 在对一个工件使用切割工具时，该工具与该工件之间的摩擦可引起该工具的磨损，妨碍切割过程，导致减慢制造周期，并对该工件的质量和修整造成负面影响。通常使用润滑剂来克服这些不希望的影响。在选择适当的润滑剂时，需要考虑该润滑剂与该工具和该工件二者的相容性以及该润滑剂在该切割过程的条件下有效作用。还必须考虑该润滑剂在其使用和处置中的环境影响，以及使用该润滑剂对工人健康的影响。
[0005] 在地层中钻井时，钻井流体部分地用于冷却并润滑钻头。钻头经常遇到增加的井下摩擦，该摩擦是因井下压力变化、地层的地质组成变化和钻井方向的变化(尤其在钻一个水平井时)而产生。摩擦增加可导致钻进速度下降并且可限制该钻头以一定准确度和效率到达其目标目的地的能力。例如，增加该钻头的旋转转矩以解决增加的摩擦变化可导致该钻头从其计划中的钻井路径螺旋前进，并且还可引起管道屈曲(螺旋状和窦状二者)。摩擦增加还可加快钻头磨损，从而产生停工时间以及昂贵的设备修理和更换费用。因此，钻井流体向钻头提供润滑性所需的性能要求随着钻井时程而增加。
[0006] 然而，目前用于在侧向井中减小井下摩擦的方法一般涉及反应性添加作用广泛的润滑剂产品，这些产品可对流体系统的流变学造成不良影响，或可随时间而消散或降格。用于水基泥浆的润滑性添加剂的范围从液体润滑剂(例如，生物柴油、脂肪酸酯、聚α-烯烃)到机械润滑剂(例如，玻璃珠粒、共聚物珠粒、石墨)。添加润滑剂的浓缩“丸剂”往往会随时间而失效(例如，由于稀释、粘到岩屑上、损失到地层中)。机械润滑剂可有效减小摩擦，但在使用泥浆脉冲遥测系统用于随钻测量(MWD)工具时，如果这些润滑剂堵塞了MWD阀，那么也可产生数据传输问题。另外，珠粒的回收和再利用也可成为问题，特别是其在使用中破损的情况下。
[0007] 概述
[0008] 在一个方面中，提供一种钻井流体用于在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑，该钻井流体包含：
[0009] a)一种钻井泥浆和
[0010] b)一种产油微生物细胞；
[0011] 所述钻井流体能在钻井期间提供增加的润滑性和以下中的一种或多种：
[0012] i)对钻柱的转矩的至少5％减小，例如至少10％、15％、20％、25％减小；
[0013] ii)钻进速度的至少5％增加；或
[0014] iii)阻力的至少5％减小。
[0015] 在一个方面中，提供一种钻井流体用于在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑，该钻井流体包含：
[0016] a)一种钻井泥浆和
[0017] b)一种产油微生物细胞；
[0018] 所述钻井流体能在钻井期间提供增加的润滑性和以下中的一种或多种：
[0019] i)对钻头的转矩的至少5％减小，例如至少10％、15％、20％、25％减小；
[0020] ii)钻进速度的至少5％增加；或
[0021] iii)阻力的至少5％减小。
[0022] 在一个方面中，提供一种钻井流体用于在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑，该钻井流体包含一种钻井泥浆和一种产油微生物细胞。在各个实施例中，该钻井流体能在钻井期间提供或在钻井期间提供增加的润滑性以及对钻头的转矩的至少5％减小，例如至少10％、15％、20％、25％减小。
[0023] 在一些实施例中，该钻井流体在至少5、15、30、45或60分钟时段期间能提供或提供增加的润滑性。
[0024] 在一些实施例中，该钻井流体能提供或提供转矩的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％减小。
[0025] 在一些实施例中，该钻井流体能提供或提供转矩的至少60％、65％、70％或75％减小。
[0026] 在一个方面中，提供一种制备一种用于在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑的钻井流体的方法，该方法包含混合一种钻井泥浆与一种产油微生物细胞以形成一种钻井流体，该钻井流体能在钻井期间增加润滑性并实现以下中的一种或多种：
[0027] i)对钻头的转矩的至少5％减小，例如至少10％、15％、20％、25％减小；
[0028] ii)钻进速度的至少5％增加；或
[0029] iii)阻力的至少5％减小。
[0030] 在一个方面中，提供一种在钻井作业中向钻头提供延迟释放的润滑的方法，该方法包含混合一种钻井泥浆与一种产油微生物细胞以形成一种钻井流体，其能在钻井期间增加润滑性并将钻头处的转矩减小至少20％。
[0031] 在一个方面中，提供一种在钻井作业中钻井眼的方法，该方法包含使本文中提供的一种钻井流体通过该井眼循环。
[0032] 在一些实施例中，该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％或更少。
[0033] 在一些实施例中，该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的10％或更少。
[0034] 在一些实施例中，该微生物细胞的量按体积计为该钻井流体的6％或更少。
[0035] 在一些实施例中，该微生物细胞包含一种微藻细胞，其含有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％油。
[0036] 在一些实施例中，该微生物细胞包含一种完整细胞。
[0037] 在一些实施例中，该微生物细胞包含一种裂解细胞。在一些实施例中，从该裂解细胞提取该油以得到一种脱脂细胞。在一些实施例中，这些裂解的脱脂细胞含有少于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％油。在一些实施例中，将这些裂解的脱脂细胞与完整细胞混合。在一些实施例中，提供一种钻井流体，其包含裂解的脱脂细胞与完整细胞的一种混合物。在一些实施例中，裂解的脱脂细胞在该混合物中以重量计的量小于完整细胞的量。在一些实施例中，该混合物中裂解的脱脂细胞对完整细胞的重量比不大于1:30、1:25、1:201:10、1:9、1:8:1、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1。
在其他实施例中，裂解的脱脂细胞在该混合物中以重量计的量大于完整细胞的量。在其他实施例中，该混合物中裂解的脱脂细胞对完整细胞的重量比为至少20:1、10:1、9:1、8:1、
7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1。
[0038] 在一些实施例中，该微生物细胞包含一种产油细菌、酵母或微藻。
[0039] 在一些实施例中，该微生物细胞得自一种异养产油微藻。
[0040] 在一些实施例中，该微生物细胞得自用来自玉米、高粱、甘蔗、甜菜或糖蜜的糖作为碳源培养的微藻。
[0041] 在一些实施例中，该微生物细胞得自在蔗糖上培养的微藻。
[0042] 在一些实施例中，该微生物细胞得自拟小球藻属(Parachlorella)、原壁藻属(Prototheca)或小球藻属(Chlorella)。
[0043] 在一些实施例中，该微生物细胞得自莫氏原壁藻(Prototheca moriformis)。
[0044] 在一些实施例中，该微生物细胞是一种产油微藻，其脂肪酸谱为至少60％C18:1；或至少50％组合总量的C10、C12和C14；或至少70％组合总量的C16:0和C18:1。
[0045] 在一些实施例中，该钻井泥浆是一种水基泥浆、一种合成基泥浆或一种油基泥浆。
[0046] 在一些实施例中，该钻井作业是一种陆基或一种近海钻井作业。
[0047] 在一些实施例中，该钻井作业选自下组，该组由以下各项组成：完井作业、防砂作业、修井作业和水力压裂作业。
[0048] 在一些实施例中，该井眼是一个垂直、水平或偏斜井眼。在一些实施例中，该井眼是一个垂直或水平井眼。
[0049] 在一个方面中，提供一种钻机，其含有一种本文所提供的钻井流体。
[0050] 在一些实施例中，该钻井流体位于一个钻井管或泥浆罐中。
[0051] 在一些实施例中，润滑剂包含一种产油微生物细胞，并且该细胞含有以细胞干重计至少45％油。在一些实施例中，该细胞含有或包含以细胞干重计至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％油。
[0052] 在一些实施例中，该润滑剂能提供或提供转矩的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％减小。在一些实施例中，该润滑剂能提供转矩的至少60％、65％、70％或75％减小。
[0053] 在一些实施例中，该润滑剂能提供或提供钻进速度的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％增加。在一些实施例中，该润滑剂能提供钻进速度的至少
20％增加。
[0054] 在一些实施例中，该润滑剂能提供或至少提供阻力的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％减小。在一些实施例中，该润滑剂能提供阻力的至少32％减小。
[0055] 在一些实施例中，该微生物细胞包含一种完整细胞。在一些实施例中，该微生物细胞包含一种裂解细胞。在一些实施例中，该微生物细胞包含一种产油细菌、酵母或微藻。在一些实施例中，该微生物细胞得自一种异养产油微藻。在一些实施例中，该微生物细胞得自用来自玉米、高粱、甘蔗、甜菜或糖蜜的糖作为碳源培养的微藻。在一些实施例中，该微生物细胞得自在蔗糖上培养的微藻。
[0056] 在一些实施例中，该微生物细胞得自拟小球藻属、原壁藻属或小球藻属。在一些实施例中，该微生物细胞得自莫氏原壁藻。
[0057] 在一些实施例中，这些细胞呈粉末形式。这些细胞粉末可呈干粉形式。
[0058] 在一些实施例中，提供一种生物可降解的润滑剂或钻井流体。
[0059] 在一些实施例中，该微生物细胞含有或包含一种产油微藻，其脂肪酸谱为至少60％C18:1；或至少50％组合总量的C10、C12和C14；或至少70％组合总量的C16:0和C18:1。
[0060] 在一些实施例中，本文所提供的该微生物油是一种包含C29和C28固醇的微藻油，其中C28固醇的量大于C29固醇。
[0061] 在一些实施例中，本文所提供的该微生物油是一种包含以下中的一种或多种的微藻油：至少10％麦角固醇；麦角固醇和β-谷固醇，其中麦角固醇对β-谷固醇的比率大于25:1；麦角固醇和菜籽固醇；麦角固醇、菜籽固醇和多孔固醇，并且其中该油任选地不含β-谷固醇、菜油固醇和豆固醇中的一种或多种。
[0062] 在一些实施例中，该润滑剂是一种极压润滑剂。
[0063] 在一些实施例中，提供一种金属加工流体，其包含一种本文所提供的润滑剂。
[0064] 在一些实施例中，该润滑剂的量按体积计为该流体的90％、80％、70％、60％、50％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％或更少。
[0065] 在一些实施例中，该金属加工流体是一种不溶性油、可溶油、半合成或合成金属加工流体。
[0066] 在一些实施例中，该金属加工流体进一步包含以下中的一种或多种：一种表面活性剂、乳化剂、消泡剂、碱性贮存物、抗雾剂、缓蚀剂、杀生物剂、极压添加剂、偶合剂、增稠剂、螯合剂、润滑剂、保湿剂、气味剂或染料。
[0067] 在一些实施例中，该表面活性剂包含一种醚、烷氧基化壬基酚或其混合物。在一些实施例中，该乳化剂包含一种六氢苯甲酸、环烷酸盐、磺酸盐、皂、酰胺、非离子乙氧基化物、两性物，或其混合物。在一些实施例中，该消泡剂包含一种硅酮、蜡、亚硝酸钙、乙酸盐或其混合物。在一些实施例中，该碱性贮存物包含一种烷醇胺、碱金属氢氧化物或其混合物。在一些实施例中，该抗雾剂包含一种聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚氧化乙烯或其混合物。在一些实施例中，该缓蚀剂包含一种胺羧酸盐、胺二羧酸盐、硼酰胺、芳基磺酰胺基酸、硼酸钠、钼酸钠、偏硅酸钠、琥珀酸衍生物、甲苯基三唑、苯并三唑、苯并噻唑、噻二唑、二乙醇胺、三乙醇胺、亚硝酸盐、氯酚、甲酚、甲醛福尔马林、碘、磷酸盐、有机汞制剂、酚、季铵化合物、羟胺、S-三嗪化合物、三羟甲基硝基甲烷或其混合物。在一些实施例中，该杀生物剂包含一种三嗪、硝基吗啉、聚合季铵化合物、溴腈、酚、卤代氨基甲酸酯、异噻唑酮或其混合物。在一些实施例中，该极压添加剂包含一种硫化烃、硫化脂肪酸酯、氯化石蜡、氯化酸、氯化酯、磷酸酯或其混合物。在一些实施例中，该偶合剂包含一种醇、醚、二醇醚、己二醇或其混合物。在一些实施例中，该增稠剂包含一种聚醚、聚乙烯醇或其混合物。在一些实施例中，该螯合剂包含EDTA钠、膦酸盐、葡糖酸盐或其混合物。在一些实施例中，该润滑剂包含一种芳香族油、酯、环烷油、石蜡油、聚醚二醇、酯、脂肪酸酯、二醇酯、嵌段共聚物或其混合物。在一些实施例中，该保湿剂包含一种聚合醚、酯或其混合物。在一些实施例中，该气味剂包含一种醛。在一些实施例中，该染料包含一种偶氮染料、荧光黄或其混合物。
[0068] 在一些实施例中，本文提供的包封油的细胞的平均直径为约5至10微米。
[0069] 在一些实施例中，使用本文提供的该润滑剂(例如包被细胞)作为非开挖隧道作业中的一种润滑剂。对于在拥挤区域(例如在道路和城市街道下)、或在松软土壤、环境敏感或污染区域中或在过水道口附近中安装地下设施(例如下水道、水、气、电和电信设施)，需要非开挖隧道方法，其中明挖沟槽的挖掘、管道安装和后续回填不便或困难。
[0070] 在一些实施例中，本文提供的润滑用于一种微型隧道作业中。在一些实施例中，提供一种微型隧道钻探机(MTBM)，其包含一种本文提供的润滑剂。在一些实施例中，该润滑剂用于润滑泥土与切割轮之间或泥土与管道区段之间的界面。
[0071] 在微型隧道中，准备一个入口坑来接受可操纵的MTBM，其朝向受料坑水平前进。该MTBM通常钻挖直径在1到10英尺范围内、更一般为1到3英尺的隧道。由于这种小直径，MTBM是通过遥控来引导并且遵循射出的激光束。该MTBM容纳一个切割轮和任选地一个与顶进框啮合的循轨组件。这些要安装的管道定位于该切割轮后或该循轨组件(在存在时)后。这个组合件是通过安装在该顶进框上的液压千斤顶来推动。将浆液进料和排放管线连接到该MTBM以容许移除岩屑。在一些实施例中，该浆液包含一种本文提供的润滑剂以润滑该切割轮。在一些实施例中，该浆液进一步包含膨润土。
[0072] 所用该切割轮的直径通常略大于管道的直径以产生过切，在这些管道周围得到一个环形空间。这一空间在这些管道前进时减小这些管道上的摩擦力。来自该MTBM的润滑剂可被注入该环形空间中以进一步减小该管道/管柱上的摩擦力，并减小使该管道/管柱前进所需的顶进力。典型润滑剂包括膨润土，并且还可使用化学聚合物。在一些实施例中，提供一种润滑剂，其包含膨润土和一种本文提供的包封油的细胞。一旦已安装这些管道，可立即用水泥浆填充该环形空间。
[0073] 在一些实施例中，一种含有本文提供的润滑剂的浆液用于在其接触泥土并相对于泥土移动时润滑钻井组合件，平衡挖掘带来的泥土压力，相对于泥土形成滤饼以限制失液，促进从井/隧道移除岩屑，和/或在该浆液从井/隧道循环到分离设备时促进固体组份与液体组份分离以供再循环。在一些实施例中，该浆液的液体组份是水。在一些实施例中，该水的pH介于8.0与10之间。在一些实施例中，该浆液含有膨润土、膨润土盐或二者的一种组合。在一些实施例中，该浆液含有钠蒙脱石。含有膨润土的浆液在用于如ASTM D-2487所定义的细粒含量为50％或更少的砂质或粗粒土壤中时尤其有益，而在细粒含量大于50％时建议使用非膨润土基浆液。在一些实施例中，该浆液实质上不含膨润土。在一些实施例中，该浆液含有聚合物和/或惰性固体。
[0074] 在一些实施例中，本文提供的钻井流体含有包封于微生物细胞中的油，其中这些油是在微生物细胞暴露于有利于细胞裂解的条件中时释放。所述条件包括温度、压力、剪切和摩擦；在不存在裂解条件时，这些细胞通过泥浆系统再循环。因此这些细胞能释放其细胞内容物并将润滑油直接输送到需要润滑的区域。在适当的时间和地点精确输送润滑剂使该润滑剂的效率最大化并使浪费最小化。在一些实施例中，这些包封油的细胞含有一个富含多糖的壳。在一些实施例中，通过该润滑剂提供的对钻柱的摩擦的减小容许改良钻头的方向控制并容许钻出更清洁并且更笔直的孔。摩擦的降低还容许钻头钻得更远更快，同时减少卡管情况、工具维修和间隔变化。
[0075] 附图简述
[0076] 图1说明含有来自株系A和B的油的水基泥浆的随时间而变的润滑性系数并且与含有工业润滑剂的泥浆相比。
[0077] 图2说明含有来自株系A和B的裂解或完整细胞的水基泥浆的随时间而变的润滑性系数并且与含有工业润滑剂的泥浆相比。
[0078] 图3说明含有来自株系A和B的裂解或完整细胞的合成基泥浆的随时间而变的润滑性系数并且与含有工业润滑剂的泥浆相比。
[0079] 图4说明含有来自株系A和B的裂解或完整细胞的盐水基泥浆的随时间而变的润滑性系数并且与含有工业润滑剂的泥浆相比。
[0080] 图5说明从培养液分离或经进一步滚筒干燥的株系B细胞的细胞裂解。
[0081] 图6说明一次现场试验的钻井路径，使用含有来自株系A的完整微藻细胞的水基泥浆与仅使用水基泥浆相比。
[0082] 图7说明当在对应于曲线的45和60度部分的1,110-1170和1,285-1,330英尺(测量距离)起钻时，利用含有来自株系A的完整细胞的水基泥浆提供的钻底外壳组合件随钻头高度(ft)而变的大钩悬重(磅)并且与单独的水基泥浆相比。
[0083] 图8说明在曲线的60度部分处的阻力测量。
[0084] 图9说明在包封油存在和不存在下使钻柱和底孔组合件旋转所需的旋转转矩。
[0085] 图10说明在包封油存在和不存在下在侧向钻井时观察到的钻进速度。
[0086] 图11说明包封油与底孔组合件和地层的相互作用。11A)添加包封油并在整个钻井流体系统中循环。11B)在适当刺激(高摩擦、剪切、极压等)下，含油细胞破裂并释放油。11C)以高效浓度输送油以润滑并涂布所需位置。11D)未破裂细胞在整个系统中再循环。
[0087] 图12说明在增加的压力下，基于微藻和酵母株系在水中的游离油释放的细胞裂解百分比。
[0088] 图13说明与一种石油基润滑剂(Stabil润滑剂(Stabil Lube))相比，在含有微藻或酵母细胞或游离油的水中观察到的转矩的减小。具体实施方案
[0089] 定义
[0090] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员一般所理解的含义。如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有归属于它们的含义。
[0091] “底孔组合件”或“BHA”是指附接到钻井管的钻柱部分，包括钻头以及一或多个钻铤和部分帮助向该钻头提供重量的相关组合件。
[0092] “生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以含有细胞和/或胞内内容物以及胞外物质，包括，但不限于由细胞分泌的化合物。从发酵培养液分离的生物质可包括用于使这些细胞生长的养分和原料。
[0093] “桥堵材料”是添加到一种流体中以防止或减少该流体穿过具有大于1毫达西的孔隙的地质地层的损失的材料。
[0094] “生物反应器”和“发酵器”意指一个外壳或部分外壳，例如一个发酵罐或器皿，其中培养细胞，通常悬浮培养。
[0095] “纤维素材料”包括纤维素的消化产物，包括葡萄糖和木糖以及任选地其他化合物，例如二糖、寡糖、木素、糠醛和其他化合物。纤维素材料来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木屑、锯末和柳枝稷。
[0096] “培养(Cultivated)”和其变体(例如“培养(cultured)”和“发酵”)是指通过使用选择和/或受控的条件有意培养一种或多种细胞的生长(细胞大小、细胞内容物和/或细胞活性的增加)和/或繁殖(细胞数通过有丝分裂而增加)。生长和繁殖二者的组合称为增殖。选择和/或受控的条件的实例包括使用确定成分培养基(具有已知特征如pH、离子强度、和碳源)、指定的温度、氧张力、二氧化碳水平、和在生物反应器中生长。培养不指微生物在自然界中或在没有人类干预下的生长或增殖；例如，最终变成化石以产生地质原油的生物的天然生长不是培养。
[0097] “干重”和“细胞干重”表示在相对缺水的条件下测定的重量。例如，在提到产油酵母生物质包含以干重计的指定百分比的一种特定组份时意指，该百分比是基于该生物质在移除实质上全部水后的重量来计算。
[0098] “外源基因”是一种编码一种已引入(“转化”)一种细胞中的RNA和/或蛋白质的表达的核酸。转化的细胞可以称作重组细胞，可以向其中导入额外的外源基因。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的种类(因而是异源的)，或来自相同的种类(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括占据细胞基因组中不同位置或处于不同控制的同源基因，相对于该基因的内源拷贝而言。外源基因可以在细胞中以多于一个拷贝存在。一个外源基因可作为一个插入基因组中的插入物或作为一个附加型分子维持在一个细胞中。
[0099] “固定碳源”是一种或多种含碳分子，通常为一种有机分子，其在环境温度和压力下以固体或液体形式存于一种培养基中，并且可被其中培养的微生物利用。
[0100] “失液控制剂”是添加到一种流体以防止或减少该流体中的液体组份穿过具有小于1毫达西的孔隙的地质地层而损失的材料。
[0101] “生长”表示单个细胞的细胞尺寸、总细胞含量和/或细胞质量或重量的增加，包括由于固定碳源转化成细胞内油所致的细胞增重。
[0102] “匀浆”是以物理方式破裂的生物质。
[0103] “一种养分的限制性浓度”是一种培养物中的一种化合物限制所培养生物体的繁殖的浓度。“养分的非限制性浓度”是在给定培养时间期间支持最大繁殖的浓度。因此，在给定培养时间期间产生的细胞数目在限制性浓度的养分存在下比养分为非限制性时低。在某养分以高于支持最大繁殖的浓度存在时，将这种养分称作在培养物中“过量”。
[0104] “脂质”是可溶性于非极性溶剂(如醚和氯仿)中并且相对或完全不可溶于水中的一类分子。脂质分子具有这些性质是因为其主要是由在自然界中疏水的长烃链组成。脂质的实例包括脂肪酸(饱和和不饱和)；甘油酯或甘油(如单酰甘油、二酰甘油、甘油三酯或中性脂肪和磷酸甘油酯或甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂、固醇脂质包括胆固醇和类固醇激素，异戊烯醇脂质包括类萜、脂肪醇、蜡、和聚酮)；和复杂脂质衍生物(连接糖的脂质、或糖脂、和连接蛋白质的脂质)。“脂肪”或“甘油三酯油”是一个称为“三酰甘油”的脂质亚群。脂肪酸常规上是通过列举碳原子数和由一个冒号隔开的双键数的记法来命名。例如，油酸可以被称之为C18:1并且癸酸可以被称之为C10:0。如在此使用的，术语“三酰基甘油酯”和“甘油三酯”是可互换的。
[0105] “润滑性”是指一种润滑剂减小作用于一个钻头或钻柱的摩擦力(例如转矩和阻力)的能力。一种润滑剂的润滑性是通过其摩擦系数来测量，该系数定义为移动一个物体所需的力对垂直施加在该物体上的力的比率。低摩擦系数对应于高润滑性。
[0106] “裂解物”是含有裂解细胞内容物的溶液。
[0107] “裂解”是一种生物体的质膜和任选地细胞壁的破裂，该破裂足以释放至少一些细胞内内容物，通常是通过破坏细胞完整性的机械、病毒或渗透机制来破裂。
[0108] “裂解”是破裂一种生物体或细胞的细胞膜和任选地细胞壁，该破裂足以释放至少一些细胞内内容物。
[0109] “微生物(Microorganism)”和“微生物(microbe)”是微观单细胞生物体。
[0110] “泥浆”或“钻井流体”是一般术语，用于指一种用于钻井作业的流体。钻井流体通常执行多种功能，包括冷却并润滑钻头和钻柱，将岩屑从钻头运送到表面，和控制井下压力以防止井喷。钻井流体的实例包括水基钻井流体和非水基系统，例如油基和合成基钻井流体。
[0111] “油”意指由生物体(包括产油酵母、植物和/或动物)产生的任何三酰甘油(或甘油三酯油)。为了区别于“脂肪”，除非另外说明，“油”是指在普通的室温和压力下通常为液体的脂质。例如，“油”包括源自植物的植物油或种子油，包括但不限于源自以下的油：大豆、油菜籽、芸苔、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、向日葵、棉籽、萼距花、花生、亚麻荠(camelina sativa)、芥子、腰果、燕麦、白羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡、亚麻籽、榛子、大戟、南瓜籽、芫荽、山茶、芝麻、红花、稻、油桐树、可可、干椰子肉、罂粟、蓖麻籽、美洲山核桃、好好霸树、麻风树、澳洲坚果、巴西坚果和鳄梨，以及其组合。
[0112] “产油微生物(microorganism)”、“产油微生物(microbe)”和“产油微生物细胞”是指一种产生以细胞干重计至少20％脂质的微生物或细胞。这些微生物包括野生型、经遗传改造的或突变的微生物。在具体实施例中，该微生物产生具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％或更多脂质的细胞。“产油酵母”意指可自然积累占其细胞干重超过20％的脂质的酵母，并且属于真菌的双核亚界(Dikarya subkingdom)。产油酵母包括诸如以下等生物体：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)和斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)。
[0113] “多糖”或“聚糖”是由糖苷键连接在一起的单糖构成的糖。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖。纤维素可以通过酶解聚以产生单糖如木糖和葡萄糖，以及较大的二糖和寡糖。
[0114] “主要包封的”意指，超过50％的一种所提到的组份(例如藻油)隔离在一种或多种产油微生物细胞中。
[0115] “ppb”是指磅/桶。1ppb相当于1克材料/350mL基液。
[0116] “大部分完整的细胞”和“大部分完整的生物质”意指一个包含超过50％完整细胞的细胞群。“完整的”在这里表示包围细胞的细胞内组分的细胞膜和/或细胞壁的物理连续性没有以任何方式被破坏，以至于将释放细胞的细胞内组分到超过培养物中的细胞膜的渗透性的程度。
[0117] “大部分裂解”意指一个细胞群，其中超过50％的细胞已破裂，使得该细胞的细胞内内容物不再完全封闭在细胞膜内。
[0118] “脂肪酸谱”是油的甘油三酯中脂肪酰基的分布，不涉及对甘油骨架的附接。脂肪酸谱通常是通过转化成脂肪酸甲酯(FAME)，随后进行气相色谱(GC)分析与火焰离子化检测(FID)来确定。脂肪酸谱可表示为由一种脂肪酸的曲线下面积测定的总脂肪酸信号中该脂肪酸的一或多个百分比。FAME-GC-FID测量值近似为这些脂肪酸的重量百分比。“sn-2谱”是在油中的三酰甘油的sn-2位置发现的脂肪酸的分布。“区域特异性谱”是甘油三酯的分布，涉及附接到甘油骨架的酰基的定位，不涉及立体特异性。换句话说，区域特异性谱描述在sn-1/3对sn-2处的酰基附接。因此，在区域特异性谱中，POS(棕榈酸酯-油酸酯-硬脂酸酯)和SOP(硬脂酸酯-油酸酯-棕榈酸酯)经相同处理。“立体特异性谱”描述在sn-1、sn-2和sn-3处的酰基附接。除非另有指示，否则甘油三酯(例如SOP和POS)会被视为等效。“TAG谱”是在甘油三酯中发现的脂肪酸的分布，涉及与甘油骨架的连接，但不涉及这些连接的区域特异性。因此，在TAG谱中，油中的SSO百分比是SSO与SOS的总和，而在区域特异性谱中，SSO百分比的计算不包括该油中的SOS物质。与FAME-GC-FID分析的重量百分比相比，甘油三酯的百分比通常是以摩尔百分比给出；也就是一种给定TAG分子在一个TAG混合物中的百分比。
[0119] “增殖”表示生长和繁殖两者的组合。
[0120] “繁殖”表示通过有丝分裂或其他细胞分裂的细胞数目的增加。
[0121] “可再生柴油”是通过脂质氢化和脱氧所产生的链烷(如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0)的混合物。
[0122] “废生物质”和其变体(例如“脱脂质粉”和“脱脂生物质”)是在已从其提取或分离油(包括脂质)和/或其他组份后的微生物生物质；例如，通过使用机械(即通过一个挤压机来施加)或溶剂提取或二者来进行。所述脱脂质粉的油/脂质的量与从微生物生物质提取或分离油/脂质之前相比有所降低，但通常含有一些油/脂质。
[0123] “超声波处理”是通过使用声波能量破坏生物材料(如细胞)的过程。
[0124] “粘度改性剂”是一种改变一种流体的流变性质的试剂。一种流体的粘度是一种流体的流动阻力的量度。该粘度改性剂用于增加或减小一种用于油田化学应用中的流体的粘度。
[0125] 关于体积比的“V/V”或“v/v”表示组合物中的一种物质的体积与该组合物的体积之比。例如，在提到包含5％v/v酵母油的一种组合物时意指，该组合物体积的5％由油组3 3
成(例如，体积为100mm的所述组合物将含有5mm 油)，并且该组合物体积的其余部分(例
3
如，在该实例中，95mm)由其他成份组成。
[0126] 在提到一种物质的浓度时，“W/V”或“w/v”意指的克数。
[0127] 关于重量比的“W/W”或“w/w”表示组合物中的一种物质的重量与该组合物的重量之比。例如，在提到包含5％w/w产油酵母生物质的一种组合物时意指，该组合物重量的5％是由产油酵母生物质组成(例如，具有100mg重量的所述组合物将含有5mg产油酵母生物质)，并且该组合物重量的其余部分(例如，在该实例中，95mg)由其他成份组成。
[0128] 产油微生物和异养培养条件
[0129] 用于制备三酰甘油混合物的三酰甘油可得自任一产生具有C18:1或饱和C:4-C24脂肪酸的三酰甘油的生物体。微生物的烃产生综述于以引用方式并入本文中的以下文献中：梅茨格(Metzger)等人，应用微生物学与生物技术(Appl Microbiol Biotechnol)(2005)66:486-496和美国能源部水生物种计划回顾：来自藻类的生物柴油(A Look Back at the U.S.Department of Energy’s Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae)，NREL/TP-580-24190，约翰西恩(John Sheehan)、特里杜那海(Terri Dunahay)、约翰伯纳曼(John Benemann)和保罗罗斯勒(Paul Roessler)(1998)。
[0130] 用于制备三酰甘油混合物的三酰甘油可得自产生具有C18:1或饱和C4-C24脂肪酸的的三酰甘油的任一生物体。微生物的烃产生综述于以引用方式并入本文中的以下文献中：梅茨格等人，应用微生物学与生物技术(2005)66:486-496和美国能源部水生物种计划回顾：来自藻类的生物柴油，NREL/TP-580-24190，约翰西恩、特里杜那海、约翰伯纳曼和保罗罗斯勒(1998)。
[0131] 在具体实施例中，该微生物在收获时产生具有至少约40％至60％或更多(包括大于70％)脂质的细胞用于油提取。对于多种应用，异养生长(基于糖或在光不存在下一种除二氧化碳以外的碳源)或可经改造以异养生长的生物体可用于本文提供的方法和钻井流体中。参见PCT公开案第2010/063031号；第2010/063032号；第2008/151149号，其各自是全文以引用方式并入本文中。
[0132] 天然的和经遗传改造的微藻是适合作为适用于本文所提供方法和材料中的C18:1或饱和C4-C24三酰甘油来源的微生物。因此，在各个实施例中，自其获得三酰甘油的微生物是一种微藻。微藻的属和种的实例包括但不限于下文表1中的微藻属和种。
[0133] 表1.微藻
[0134]
[0135]
[0136]
[0137] 这些微生物可经遗传改造以代谢诸如蔗糖或木糖等替代性糖源和/或产生经改变的脂肪酸谱。如果该微生物可异养生长，那么其可为一种是一种容许性或专性异养生物的生物体。在一个具体实施例中，该生物体是莫氏原壁藻，一种专性异养产油微藻。在另一个具体实施例中，该莫氏原壁藻已经遗传改造以代谢蔗糖或木糖。
[0138] 在各个实施例中，该微生物是小球藻属物种的生物体。在一些实施例中，该微藻是原壳小球藻、髓圆形小球藻、微小小球藻、祖芬氏小球藻(Chlorella zofinienesi)、黄绿小球藻、柯氏小球藻、耐热性小球藻、淡褐小球藻空泡变种小球藻、微小小球藻近似种或浮水小球藻。小球藻是单细胞绿藻属，属于绿藻门(Chlorophyta)。它的形状是球形，直径大约2到10μm，并且没有鞭毛。一些小球藻物种为天然异养的。
[0139] 小球藻(例如原壳小球藻、微小小球藻或浮水小球藻)可经遗传改造以表达一或多个异源性基因(“转基因”)。在例如小球藻中表达转基因的实例可参见文献(例如，参见PCT专利公开案第2010/063031号、第2010/063032号和第2008/151149号；当前微生物学第35卷(1997)，第356-362页；生物工程学报(Sheng Wu GongCheng Xue Bao.)，2000年7 月；16(4):443-6；当 前 微 生 物 学 第 38卷(1999)，第
335-341页；应用微生物学与生物技术(2006)72:197–205；海洋生物技术(Marine Biotechnology)4,63-73,2002；当前遗传学(Current Genetics)39:5,365-370(2001)；
植 物 细 胞 报 告 (Plant Cell Reports)18:9,778-780,(1999)；植 物 生 物 学(Biologia Plantarium)42(2):209-216,(1999)；植 物 病 理 学 杂 志 (Plant Pathol.J)21(1):13-20,(2005)，并且所述参考文献教示用于在所述生物体中引入并表达所关注基因的各种方法和材料。其他产生脂质的微藻也可经改造，包括原核微藻(参见卡尔朔伊尔(Kalscheuer)等人，应用微生物学和生物技术，第52卷，第4期/1999年10月)。
[0140] 对于本文所列举的藻类物种应注意，藻类物种的分类学在不断变化。因此，属、物种和株系将可能随时间流逝而改变其名称。如果可能的话，提供备选株系名称。然而，预期属和物种命名的当前状态将随时间而变，并且不管其最终命名是什么，本发明将维持其与该株系的关联性。一个当前实例是将原壳小球藻重新命名为原壳异养小球藻(Auxenochlorella protothecoides)。出于本发明的目的，应将其作为相同生物体来处理。
[0141] 原壁藻属是一种单细胞微藻属，人们认为其是小球藻的一种非光合突变体。尽管小球藻可通过光合作用获得能量，但原壁藻属的物种是专性异养生物。原壁藻属的形状为球形，直径为约2到15微米，并且无鞭毛。在各个实施例中，用于生成三酰甘油的微藻选自以下原壁藻属物种：圆形原壁藻、波多黎各原壁藻、莫氏原壁藻、魏氏原壁藻和饶氏原壁藻。
[0142] 除了原壁藻和小球藻以外，可使用其他微藻作为三酰甘油来源。在不同优选实施例中，该微藻选自来自以下属和物种中的任一者的属或物种：凯氏拟小球藻、拜氏拟小球藻、富油新绿藻、多核片球藻、朱红片球藻、气生片球藻、片球藻属或微红栅藻。
[0143] 在一些情形中，根据以上方法产生的油是使用微藻宿主细胞制造。如上所述，微藻可属于(但不限于)绿藻门，四胞藻纲(Trebouxiophyceae)，小球藻目(Chlorellale)，小球藻科(Chlorellaceae)或绿藻纲(Chlorophyceae)。已发现，基于固醇谱，共球藻纲微藻可以与植物油区别开。发现原壳小球藻产生的油可产生固醇，在通过GC-MS检测时，这些固醇似乎为菜籽固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇和β-谷固醇。然而，人们相信小球藻产生的所有固醇都具有C24β立体化学。因此，人们相信，检测为菜油固醇、豆固醇和β-谷固醇的分子实际上分别为22,23-二氢菜籽固醇、多孔固醇和穿贝海绵甾醇。因此，上述微藻产生的油与植物油的不同之处可在于，存在具有C24β立体化学的固醇以及所存在的固醇中不存在C24α立体化学。例如，所产生的油可含有22,23-二氢菜籽固醇同时无菜油固醇；含穿贝海绵甾醇，同时无β-谷固醇，和/或含有多孔固醇，同时无豆固醇。或者或另外，这
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些油可含有大量Δ-多孔固醇。
[0144] 在其他实施例中，本文提供的这些油并非植物油。植物油是从植物和植物种子中提取的油。植物油基于其油含量而有别于在此提供的非植物油。可以采用分析油含量的多种方法来确定油的来源或确定在此提供的油是否掺杂有一种不同(例如，植物)来源的油。可以基于这些分析方法中的一种或组合来进行该确定。这些测试包括但不限于对以下各项中一种或多种的分析：游离脂肪酸、脂肪酸谱、总三酰甘油含量、二酰基甘油含量、过氧化值、光谱特性(例如，紫外吸收)、固醇谱、甾醇降解产物、抗氧化剂(例如，生育酚)、色素(例如，叶绿素)、d13C值和感官分析(例如，味道、气味和口感)。许多此类测试已针对商业油标准化，如针对食用脂肪和油的食品规范标准。
[0145] 在一些实施例中，本文所提供油的油内容物以占总固醇的百分比计包含低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的24-乙基胆甾-5-烯-3-醇。在一些实施例中，该24-乙基胆甾-5-烯-3-醇是穿贝海绵甾醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内容物包含，以占总固醇的百分比计，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的穿贝海绵甾醇。
[0146] 在一些实施例中，本文所提供油的油内容物以占总固醇的百分比计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的24-甲基胆甾-5-烯-3-醇。在一些实施例中，该24-甲基胆甾-5-烯-3-醇是22,23-二氢菜籽固醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内容物包含，以占总固醇的百分比计，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或
10％的22,23-二氢菜籽固醇。
[0147] 在一些实施例中，本文所提供油的油内容物以占总固醇的百分比计含有低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的5,22-胆甾二烯-24-乙基-3-醇。在一些实施例中，该5,22-胆甾二烯-24-乙基-3-醇是多孔甾醇。在一些实施例中，在此提供的油的油内容物包含，以占总固醇的百分比计，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或
10％的多孔甾醇。
[0148] 在一些实施例中，本文所提供油的油内容物含有麦角固醇或菜籽固醇或二者的组合。在一些实施例中，油内容物含有，以占总固醇的百分比计，至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、或65％的麦角固醇。在一些实施例中，油内容物含有，以占总固醇的百分比计，至少25％的麦角固醇。在一些实施例中，油内容物含有，以占总固醇的百分比计，至少40％的麦角固醇。在一些实施例中，油内容物含有，以占总固醇的百分比计，至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、或65％的麦角固醇和菜籽固醇的组合。
[0149] 在一些实施例中，该油内容物以占总固醇的百分比计含有至少1％、2％、3％、4％或5％的菜籽固醇。在一些实施例中，油内容物含有，以占总固醇的百分比计，小于10％、9％、8％、7％、6％、或5％的菜籽固醇。
[0150] 在一些实施例中，麦角固醇对菜籽固醇的比率为至少5:1、10:1、15:1或20:1。
[0151] 在一些实施例中，该油内容物以占总固醇的百分比计含有至少5％、10％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％麦角固醇和低于20％、15％、10％、5％、
4％、3％、2％或1％的β-谷固醇。在一些实施例中，该油内容物以占总固醇的百分比计含有至少25％麦角固醇和低于5％β-谷固醇。在一些实施例中，油内容物进一步包含菜籽固醇。
[0152] 固醇含有27到29个碳原子(C27到C29)并且发现于所有真核生物中。动物仅产生C27固醇，因为他们缺乏进一步修饰C27固醇以产生C28和C29固醇的能力。然而，植物能够合成C28和C29固醇，并且C28/C29植物固醇通常被称为植物甾醇。一种给定植物的固醇谱具有高C29固醇，并且植物中的主要固醇通常为C29固醇β-谷固醇和豆固醇。相比之下，非植物生物的固醇谱含有更大百分比的C27和C28固醇。例如，真菌和许多微藻中的固醇主要是C28固醇。植物中的固醇谱并且特别是C29固醇相比C28固醇的突出优势已被用来确定土壤样品中植物和海洋物质的比例(Huang、Wen-Yen、Meinschein W.G.,“作为生态指示的固醇(Sterols as ecological indicators)”；地球化学与宇宙化学学报(Geochimica et Cosmochimia Acta.)，第43卷，第739-745页)。
[0153] 在一些实施例中，本文所提供微藻油中的主要固醇是除了β-谷固醇和豆固醇以外的固醇。在微藻油的一些实施例中，C29固醇以重量计占总固醇含量的小于50％、40％、30％、20％、10％、或5％。
[0154] 在一些实施例中，本文所提供微藻油所含的C28固醇多于C29固醇。在微藻油的一些实施例中，C28固醇以重量计占总固醇含量的大于50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在一些实施例中，C28固醇是麦角固醇。在一些实施例中，C28固醇是菜籽固醇。
[0155] 除了微藻以外，产油酵母可积累占其细胞干重多于20％的脂质并因此是甘油三酯的可用来源。产油酵母的实例包括但不限于表2中所列示的产油酵母。
[0156] 表2.产油酵母.
[0157]
[0158]
[0159] 产油微生物的实例包括真菌，例如表3中所列示的真菌。
[0160] 表3.产油真菌.
[0161]
[0162] 在一个实施例中，用于产生用于本文所提供钻井流体中的三酰甘油的微生物是一种真菌。适宜真菌的实例(例如，高山被孢霉、卷枝毛霉和棕曲霉)包括那些已显示适于进行遗传操纵者，如文献中所述(例如，参见微生物学(Microbiology)，7月；153(Pt.7):2013-25(2007)；分子遗传学和基因组学(Mol Genet Genomics)，6月；271(5):595-602(2004)；当前遗传学(Curr Genet)，3月；21(3):215-23(1992)；当前微生物学，30(2):83-86(1995)；樱(Sakuradani)，NISR研究资助计划(NISR Research Grant)，“可用的产生脂质的微生物的代谢工程研究(Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms)”(2004)；和PCT/JP2004/012021)。
[0163] 在其他实施例中，一种产生甘油三酯的微生物是产油细菌。产油细菌是可以积累超过其20％干细胞重量作为脂质的细菌。用于本发明方法中的产油细菌的物种包括红球菌属(Rhodococcus)的物种，例如浊红球菌(Rhodococcus opacus)和红球菌物种。培养产油细菌(例如浊红球菌)的方法为业内已知(参见沃尔特曼(Waltermann)等人，(2000)微生物学，146:1143-1149)。
[0164] 可培养这些产油微生物来产生甘油三酯。这类培养通常首先以小规模来实施，并且最初至少在起始微生物可生长的条件下进行。用于烃产生目的的培养优先以大规模并且在异养条件下实施。优选地，一种固定碳源(例如葡萄糖或蔗糖)过量存在。如果需要或者有益，还可在部分或全部时间中将该培养物暴露于光。
[0165] 微藻和大多数其他产油微生物可在液体培养基中培养。该培养物可含于一种生物反应器内。任选地，该生物反应器不容许光进入。或者，微藻可在光生物反应器中培养，这些光生物反应器含有一种固定碳源和/或二氧化碳并且容许光撞击这些细胞。对于可利用光作为能源的微藻细胞，即使在一种这些细胞运送并利用(即混合营养生长)的固定碳源存在下，与在黑暗中培养那些细胞相比，将那些细胞暴露于光仍会加速生长。可操纵培养条件参数以优化总油产量、所产生烃物质的组合和/或一种特定烃物质的产量。在一些情况下，优选地在黑暗中培养细胞，例如在使用不容许光撞击绝大部分(或任何)培养物的极大(40,000升和更高)发酵器时。
[0166] 培养基通常含有诸如以下等组份：一种固定氮源、痕量元素、任选地一种用于维持pH的缓冲液和磷酸盐。尤其对于海水微藻，除了一种固定碳源(例如乙酸盐或葡萄糖)以外的组份可包括盐，例如氯化钠。痕量元素的实例包括锌、硼、钴、酮、锰和钼，其呈例如ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O的相应形式。还可操纵其他培养参数，例如培养基的pH、痕量元素的身份和浓度以及其他培养基成份。
[0167] 对于能在一种固定碳源上生长的生物体，该固定碳源可为例如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、甘油半乳糖苷、葡糖醛酸和/或乙酸盐。可将一种或多种外源提供的固定碳源以至少约50μM到至少500mM的浓度，以及在该范围内的多种量(即，100μM、500μM、5mM、50mM)供应到培养基。
[0168] 一些微藻物种可通过利用一种固定碳源(例如葡萄糖或乙酸盐)在无光下生长。这种生长被称为异养生长。例如，对于原壳小球藻，异养生长可产生大量生物质并积累高脂质含量。因此，微生物的光合生长和繁殖的一种替代形式是在其中一种固定碳源为生长和脂质积累提供能量的条件下使用微生物的异养生长和繁殖。在一些实施例中，该固定碳能源包含纤维素材料，包括解聚纤维素材料、一种5碳糖或一种6碳糖。
[0169] 已报道用于原壳小球藻的生长和繁殖以提高以干重百分比计的油水平的方法(例如，参见苗(Miao)和吴(Wu)，生物技术杂志(J.Biotechnology)，2004,11:85-93；和苗和吴，生物资源技术(Biosource Technology)(2006)97:841-846，报道获得占细胞干重55％的油的方法)。
[0170] 以引用方式并入本文中的PCT公开案WO2008/151149阐述用于诸如小球藻等的微藻的优选生长条件。多个小球藻物种和一个物种内的多个株系可在甘油存在下生长。上文所提到的专利申请案阐述纳入使用甘油进行多个微藻属的发酵的培养参数。多个小球藻物种和株系不仅基于纯化的试剂级甘油，还基于来自生物柴油转酯作用的酸化和未酸化甘油副产物极佳地增殖。在一些情况下，微藻(例如小球藻株系)经历在甘油存在下比在葡萄糖存在下更快的细胞分裂。在这些情况下，二阶段生长过程可改良细胞产生脂质的效率，其中首先向细胞饲喂甘油以增加细胞密度，然后饲喂葡萄糖以积累脂质。
[0171] 用于在异养生长条件下培养微藻的其他原料包括甘油与葡萄糖的混合物、葡萄糖与木糖的混合物、果糖与葡萄糖的混合物、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、乙酸盐和糖蜜。其他适宜原料包括与解聚酶组合的玉米秸秆、甜菜浆和柳枝稷。在各个实施例中，使用一种可在异养培养条件下利用蔗糖作为碳源的微生物来生成微生物生物质。以引用方式并入本文中的PCT公开案第2012/106560号、第2011/150410号、第2011/150411号、第2010/063032号和第2008/151149号阐述已经遗传改造以利用蔗糖作为碳源的重组生物体，包括但不限于原壁藻和小球藻微藻。在各个实施例中，在培养基中培养能在异养条件下利用蔗糖作为碳源的这些或其他生物体，其中该蔗糖是以含蔗糖粗材料的形式来提供，包括但不限于甘蔗汁(例如，稠甘蔗汁)和甜菜汁。
[0172] 对于脂质和油产生，通常大量发酵细胞(包括重组细胞)。培养可在较大液体体积中进行，例如在作为一个实例的悬浮培养中。其他实例包括以细胞的小型培养开始，其扩展成大型生物质，与细胞生长和繁殖以及脂质(油)产生组合。可使用生物反应器或钢发酵器来容纳较大培养体积。对于这些发酵，使用光合生长条件是不可能的或至少不实用并且无效，因此异养生长条件可以是优选的。
[0173] 在一个发酵器中用于异养生长条件的适宜培养用养分来源包括诸如以下中的一种或多种的原料：一种固定碳源，例如葡萄糖、玉米淀粉、解聚纤维素材料、蔗糖、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清、糖蜜或诸如此类；一种氮源，例如蛋白质、大豆粉、玉米浸泡液、氨(纯净或呈盐形式)、硝酸酯或硝酸盐；以及一种磷源，例如磷酸盐。另外，一个用于异养生长条件的发酵器容许控制培养条件，例如温度、pH、氧张力和二氧化碳水平。任选地，可将如氧或氮等气态组份鼓泡通过一种液体培养物。其他淀粉(葡萄糖)来源包括小麦、马铃薯、稻和高粱。其他碳源包括诸如以下等工艺流：技术级甘油、黑液和诸如乙酸盐等有机酸以及糖蜜。碳源也可以作为混合物如蔗糖和解聚甜菜浆的混合物提供。
[0174] 可使用一个用于异养生长条件的发酵器以容许细胞经历其生理周期的各个时期。作为一个实例，可将产生脂质的细胞的一个接种物引入一种培养基中，之后是一个延滞阶段(延滞期)，然后这些细胞开始繁殖。在延迟期后，繁殖速率稳步增加并且进入对数阶段或指数阶段。指数阶段之后转而是繁殖变慢，原因在于养分(如氮)减少、有毒物质增加和密度感知机制。在这种变慢后，繁殖停止，并且细胞进入静止阶段或稳定生长状态，这取决于提供给细胞的特定环境。
[0175] 在一种异养培养方法中，使用解聚纤维素生物质作为原料来培养微生物。与可用于培养微生物的其他原料(例如玉米淀粉或来自甘蔗或甜菜的蔗糖)相反，纤维素生物质(解聚的或其他形式的)并不适合于人类消耗。纤维素生物质(例如，秸秆，例如玉米秸秆)便宜且易于获得。
[0176] 适宜的纤维素材料包括草本和木本能量作物以及农业作物的残余物，即通常不与主要食物或纤维产物一起从田间移除的植物部分，主要是茎和叶。实例包括农业废弃物如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括茎、叶、玉米皮、和玉米芯)、麦秸、稻草、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮；林业废弃物如硬木和软木间伐材(thinnings)、和来自木材操作的硬木和软木残余物；木材废弃物如锯木厂废弃物(木屑、锯屑)和纸浆厂废弃物；城市废弃物如市政固体废弃物的纸部分、城市木质废弃物和城市绿色废弃物如市政碎草(grass clipping)；和木结构废弃物。额外纤维素包括专用的纤维素作物如柳枝稷、杂交杨木、和芒草、纤维用甘蔗、和纤维用高粱。从这类材料产生的5碳糖包括木糖。
[0177] 一些微生物能够处理纤维素物质并直接利用纤维素物质作为碳源。然而，纤维素材料可能需要处理以增加可及表面积，或使纤维素首先分解成为一种作为碳源用于微生物利用的制剂。以引用方式并入本文中的PCT专利公开案第2010/120939号、第2010/063032号、第2010/063031号和第PCT 2008/151149号阐述多种处理纤维素以使其适合在微生物发酵中用作碳源的方法。
[0178] 可采用生物反应器实施异养生长和繁殖方法。可以理解的是，当在此所述的异养生长和繁殖方法中使用固定碳源时，在光合生长方法中使细胞能够利用光的措施是不必要的。
[0179] 在某些实施例中，以混合营养方式培养该产油微生物。混合营养生长涉及使用光和固定碳源二者作为能源来培养细胞。混合营养生长可在一个光生物反应器中实施。微藻可在由不同类型的透明或半透明材料制成的封闭光生物反应器中生长并维持。所述材料可包括 外壳、玻璃外壳、由诸如聚乙烯等物质制成的包、透明或半透明管道和其他材料。微藻可在开放光生物反应器中生长并维持，例如跑道式养殖池(raceway pond)、沉降池和其他非封闭容器。下文关于可用于混合营养生长条件的光生物反应器的讨论也适用于光合生长条件。
[0180] 可根据本文所提供方法使用的微生物可发现于整个世界范围内的多个位置和环境中。由于其与其他物种隔离以及其所得的进化趋异，可能需要以实验方式确定用于最优生长和从微生物的任何特定物种生成油和/或脂质的特定生长培养基。在一些情况下，微生物的某些菌株可能在特定生长培养上不能生长，原因在于存在一些抑制性组分或不存在特定微生物菌株要求的一些必需营养。业内已知多种方法用于培养众多种微藻物种以积累以细胞干重的百分比计高水平的脂质，并且用于确定用于任何所关注物种的最优生长条件的方法也为业内已知。
[0181] 固体和液体生长培养基一般可从众多种来源获得，并且用于制备适用于众多种微生物株系的特定培养基的说明书可在线查找例如utex.org/，该网站的藻类培养物保藏由德克萨斯州大学奥斯汀分校(University of Texas at Austin，UTEX)维护。例如，多种淡水和盐水培养基包括那些表4中所示者。
[0182] 表4.藻类培养基
[0183]淡水培养基 盐水培养基
1/2CHEV硅藻培养基 1％F/2
1/3CHEV硅藻培养基 1/2加富海水培养基
1/5CHEV硅藻培养基 1/2Erdschreiber培养基
[0184]淡水培养基 盐水培养基
1:1DYIII/PEA+Gr+ 1/2土壤+海水培养基
2/3CHEV硅藻培养基 1/3土壤+海水培养基
2X CHEV硅藻培养基 1/4ERD
Ag硅藻培养基 1/4土壤+海水培养基
Allen培养基 1/5土壤+海水培养基
BG11-1培养基 2/3加富海水培养基
Bold 1NV培养基 20％Allen+80％ERD
Bold 3N培养基 2X Erdschreiber培养基
葡萄藻属(Botryococcus)培养基 2X土壤+海水培养基
Bristol培养基 5％F/2培养基
CHEV硅藻培养基 5/3土壤+海水琼脂培养基
Chu氏培养基 人工海水培养基
CR1硅藻培养基 BG11-1+.36％NaCl培养基
CR1+硅藻培养基 BG11-1+1％NaCl培养基
CR1-S硅藻培养基 Bold 1NV:Erdshreiber(1:1)
蓝色藻属(Cyanidium)培养基 Bold 4NV:Erdshreiber(1:1)
蓝藻培养基 Bristol-NaCl培养基
鼓藻(Desmid)培养基 粗枝藻目(Dasycladales)海水培养基
DYIII培养基 加富海水培养基
眼虫藻培养基 Erdschreiber培养基
HEPES培养基 ES/10加富海水培养基
J培养基 ES/2加富海水培养基
麦芽培养基 ES/4加富海水培养基
MES培养基 F/2培养基
改良的Bold 3N培养基 F/2+NH4
改良的COMBO培养基 LDM培养基
N/20培养基 改良的2X CHEV
棕鞭藻培养基 改良的2X CHEV+土壤
P49培养基 改良的人工海水培养基
波利妥麦拉藻(Polytomella)培养基 改良的CHEV
蛋白眎(Proteose)培养基 紫球藻(Porphridium)培养基
雪藻(Snow Algae)培养基 土壤+海水培养基
土壤提取物培养基 SS硅藻培养基
土壤水：BAR培养基
土壤水：GR-培养基
[0185]淡水培养基 盐水培养基
土壤水：GR-/NH4培养基
土壤水：GR+培养基
土壤水：GR+/NH4培养基
土壤水：PEA培养基
土壤水：泥炭培养基
土壤水：VT培养基
螺旋藻属(Spirulina)培养基
Tap培养基
共球藻属(Trebouxia)培养基
Volvocacean培养基
Volvocacean-3N培养基
团藻属(Volvox)培养基
团藻属-右旋糖培养基
Waris培养基
Waris+土壤提取物培养基
[0186] 一种适于培养原壳小球藻的培养基包含蛋白眎培养基。此培养基适合无菌培养物，1L体积的该培养基(pH值约6.8)可以通过向1升Bristol培养基中添加1g蛋白胨来制备。Bristol培养基包含在水溶液中的2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、1.29mM KH2PO4、以及1.43mM NaCl。对于1.5％琼脂培养基，可以将15g琼脂添加至1L这种溶液。将溶液盖好并高压灭菌，并且随后使用之前贮存在冷藏温度。
[0187] 用于本文所提供方法的其他适宜培养基可通过咨询上文所确定的URL或通过咨询维持微生物培养物的其他组织来容易地确定，如SAG，哥根廷大学(University of )(哥根廷，德国)的藻种保存库(Culture Collection of Algae)；CCAP，由苏格兰海洋科学协会(Scottish Association for Marine Science)(苏格兰，英国)管理的藻类和原生动物培养物保存库；以及CCALA，植物学研究院(Institute of Botany)(特热邦，捷克共和国)的藻类实验室培养物保存库。
[0188] 可以调节处理条件以提高细胞中脂质的重量百分比。例如，在某些实施例中，将一种微生物(例如，一种微藻)在限制性浓度的一种或多种养分(例如氮和/或磷和/或硫)存在下培养，同时提供过量的固定碳能量(例如葡萄糖)。氮限制作用倾向于增加微生物脂质产量超过其中过量提供氮的培养物中的微生物脂质产量。在特定实施例中，脂质产率增加至少约10％到100％到多达500％或更多。可以将微生物在限制量的养分存在的情况下培养持续总培养时间的一部分或持续整个时间。在特定的实施例中，在总培养时间期间，养分浓度在限制性浓度和非限制性浓度之间循环至少2次。在一个实施例中，用于这些方法中的微生物生物质的C10-C14含量占该生物质中脂质含量的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％或至少70％。在另一个方面中，该微生物生物质的饱和脂质含量占该微生物生物质中脂质的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。
[0189] 为增加以细胞干重百分比计的脂质，可在用于一种产生脂质的微生物(例如，一种微藻)的原料中采用乙酸盐。乙酸盐直接饲喂到起始脂肪酸合成的代谢点(即，乙酰基-CoA)中；由此在培养物中提供乙酸盐，可增加脂肪酸产量。一般来说，将该微生物在足量乙酸盐存在下培养，以特别相对于在乙酸盐不存在下的微生物脂质(例如，脂肪酸)产率，增加微生物脂质产率和/或微生物脂肪酸产率。供给的乙酸盐对于在此提供的产生微藻生物质的方法是一种有用的组分，该微藻生物质具有占细胞干重的高比例的脂质。
[0190] 在稳定生长状态下，细胞积累油(脂质)但是不发生细胞分裂。在一个实施例中，生长状态是通过向这些细胞持续提供初始生长培养基中除了一种固定氮源以外的所有组份来维持。通过饲喂除了一种固定氮源以外最初向这些细胞提供的所有养分来培养微藻细胞，例如通过将这些细胞饲喂延长时间段，可产生高细胞干重百分比的脂质。在一些实施例中，可以远低于在起始发酵中最初提供的浓度提供除了一种固定碳源以外的养分(例如痕量金属、磷酸盐和其他组份)，以避免向这些细胞“过度饲喂”这些细胞将不会利用的养分，由此降低成本。
[0191] 在其他实施例中，可通过在所有固定氮都已消耗后，在延长时间段(例如至少8到16天或更久)中将一种固定碳源饲喂给这些细胞来生成高脂质(油)生物质。在一些实施方案中，允许细胞在固定碳源的存在并且缺乏固定氮源下积累油超过30天。优选地，使用本文所述并且业内已知的条件生长的微生物包含在以细胞干重计至少约10％脂质到以细胞干重计约75％脂质范围内的脂质。所述富油生物质可在钻井流体中直接用作一种失液控制剂，但通常将使用在已从微生物提取脂质后剩余的废生物质作为该失液控制剂。
[0192] 另一种容许细胞积累高细胞干重百分比的脂质的工具涉及原料选择。多个小球藻物种和一个小球藻物种内的多个株系当在生物柴油甘油副产物存在下培养时，积累比当在等浓度纯试剂级甘油存在下培养时更高的细胞干重百分比的脂质。类似地，当在等浓度(重量百分比)的甘油与葡萄糖的混合物存在下培养时，小球藻可积累比当在仅葡萄糖存在下培养时更高的细胞干重百分比的脂质比。
[0193] 容许细胞积累高细胞干重百分比的脂质的另一种工具涉及原料选择以及添加某些原料的定时。例如，当在第一时间段中将甘油添加到培养物中，之后添加葡萄糖并继续培养第二时间段时，小球藻可积累比当在开始发酵时一起添加等量的甘油和葡萄糖时更高的细胞干重百分比的脂质。参见PCT公开案第2008/151149号，其是以引用方式并入本文中。
[0194] 甘油三酯可通过以足以提取油的压力机械压制从产油微生物分离。在各个实施例中，该压制步骤将涉及使产油微生物经历至少10,000psi的压力。在各个实施例中，该压制步骤涉及在第一时间段中施加压力，然后在第二时间段中施加更高压力。这个过程可重复一或多次(“振荡压力”)。在各个实施例中，在该压制步骤期间控制产油微生物的水分含量。在各个实施例中，将水分控制在0.1重量％到3重量％范围内。
[0195] 通常使用挤压机(螺杆压机)从大豆和含油种子机械提取油。一般来说，挤压机的主要区段包括进料口、旋转进料机螺杆、笼或桶、蜗杆轴和油底壳。该挤压机是一个连续笼式压机，其中通过一个连续旋转蜗杆轴来发展压力。通过抵靠可调扼流圈工作的蜗杆的作用在该笼或桶中积累约10,000-20,000磅/平方英寸的极高压，该扼流圈限制压饼(废生物质)从该桶末端排出。在各个实施例中，适于使用来自以下制造商的螺杆压机：安德森国际公司(Anderson International Corp.)(克利夫兰，俄亥俄州)、阿罗克(Alloco)(圣达菲，阿根廷)、迪斯美罗斯唐斯(De Smet Rosedowns)(亨伯赛德，英国)、杜普斯公司(The Dupps Co.)(日耳曼敦，俄亥俄州)、特克诺集团(Grupo Tecnal)(圣保罗，巴西)、英斯塔普罗(Insta Pro)(得梅因，爱荷华州)、法国榨油厂(French Oil Mill)(皮克瓦，俄亥俄州)、汉堡弗鲁顿博格(Harburg Freudenberger)(原克虏伯提取技术(Krupp Extraktionstechnik))(汉堡，德国)、赖纳茨机械制造(Maschinenfabrik Reinartz)(诺伊斯，德国)、尚恩咨询(Shann Consulting)(新南威尔士，澳大利亚)和SKET(马德堡，德国)。
[0196] 钻井流体、生产流体和泵送服务流体
[0197] 由于包封提供的保护，可将本文所提供包封油主动添加到钻井流体系统(例如水基系统)中，其中其通过该系统循环直到满足破裂包封并释放油润滑剂的条件。
[0198] 本文所提供流体包括水性和非水性钻井流体以及其他充分相关的流体，包括彼等用于产生油或天然气，用于完井作业、防砂作业、修井作业以及用于泵送服务(例如固井、水力压裂和酸化)者。在一个实施例中，流体包括一种失液控制剂，其为来自一种产油微生物的生物质。在一个实施例中，该生物质包含具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％油的完整、裂解或部分裂解细胞。在另一个实施例中，该生物质是从其移除油的废生物质。例如，可通过干燥并压制并任选地用己烷或其他适宜溶剂进行溶剂提取的工艺来移除该油。在一个具体实施例中，将该生物质干燥到小于6重量％水分，之后施加压力以释放超过25％的脂质。或者，这些细胞可为完整的，在某些情况下，其在用于一种钻井流体中时可赋予改良的失液控制。一般来说，该钻井流体可含有约0.1重量％到约20重量％的所述生物质，但在各个实施例中，这个量可介于以下范围内：约0.1重量％到约10重量％的所述生物质；约0.1重量％到约5重量％的所述生物质；约0.5重量％到约
4重量％的所述生物质；和约1重量％到约4重量％的所述生物质。
[0199] 在各个实施例中，该流体包含一种失液控制剂，其并非源自产油微生物生物质。适宜失液控制剂可包括但不限于非改性淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、非改性纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚阴离子纤维素。
[0200] 该流体可包括一种水性或非水性溶剂。该流体还可任选地包括一种或多种其他组份，使得该流体作为以下来作业：钻井流体、钻井完井流体、修井液、解卡液、固井液、储层流体、生产液、压裂液或完井液。
[0201] 在各个实施例中，该流体是一种钻井流体并且所添加的来自产油微生物的生物质用于帮助运送岩屑，润滑并保护钻头，支撑井眼壁，向钻头下方的地层输送液压能量，和/或在停止钻井时使岩屑悬挂在环形套管中。
[0202] 在用于一种钻井流体中时，该生物质可作业以封闭该地层中的孔隙，并形成滤饼或促进滤饼形成。
[0203] 在各个实施例中，该流体是一种生产液并且该生物质用于抑制腐蚀，分离烃与水，抑制污垢、石蜡或腐蚀(例如，金属氧化物)形成，或促进从该井产生油或天然气。在一个实施例中，使用该生物质刺激该井中微生物的甲烷生成。该生物质可提供养分和/或结合抑制剂，以增加该井中天然气的产量。在这个实施例中，该井可为一个具有甲烷生成能力的煤层。例如，参见美国专利申请案第2004/0033557号、第2012/0021495号、第2011/0284215号、第US2010/0248322号、第2010/0248321号、第2010/0035309号和第2007/0248531号。
[0204] 在各个实施例中，该流体包含一种增粘剂。适宜增粘剂包括但不限于一种选自下组的藻酸盐聚合物，该组由以下各项组成：藻酸钠、藻酸钙钠、藻酸钙铵、藻酸铵、藻酸钾、丙二醇藻酸盐和其混合物。其他适宜增粘剂包括有机膨润土、聚丙烯酰胺、黄原胶以及黄原胶与纤维素衍生物的混合物，包括那些其中黄原胶对纤维素衍生物的重量比在约80:20到约20:80范围内者，并且其中该纤维素衍生物选自下组，该组由以下各项组成：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和其混合物。其他适宜增粘剂包括通过细菌、真菌或其他微生物对一种适宜底物的作用产生的一种生物聚合物。
[0205] 也可使用一种皂粘土与添加剂的混合物作为增粘剂。用于所述混合物中的添加剂可包含例如：(a)一种选自下组的非离子型水溶型多糖，该组由以下各项组成：一种非离子型水溶性纤维素衍生物和一种非离子型水溶性瓜尔胶衍生物；(b)一种选自下组的阴离子型水溶性多糖，该组由以下各项组成：一种羧甲基纤维素和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)多糖或其一种组合；(c)一种中间分子量聚二醇，即选自下组，该组由以下各项组成：聚乙二醇、聚丙二醇和聚(烷二醇)，平均分子量为约600到约30,000；以及(5)其相容性混合物。可将这些混合物的组份个别添加到该流体以增强其低剪切速率粘度。
[0206] 在一些实施例中，该钻井流体包含一种或多种选自下组的添加剂，该组由以下各项组成：泡沫体、聚合物颗粒、热固性聚合物颗粒和纳米复合粒子。
[0207] 可使用泡沫体作为用于产生或维持一个井眼的钻井流体和其他流体的添加剂。泡沫体可在流体前部浓缩并用作失液控制剂和/或桥堵剂以沿一个井眼的侧壁建立孔隙网络的内部密封。人们相信，泡沫体在密封这些在钻一个井眼时遇到的孔隙和间隙的过程期间变形。可用于本发明方法中的泡沫体通常为50-100μM、25-100μM、25-50μM、5-50、5-25μM、7-15μM或约10μM。
[0208] 在一个实施例中，一种钻井流体包含泡沫体、其中尚未提取油的微生物生物质(未经提取的微生物生物质)、废生物质或泡沫体、未经提取的微生物生物质与废生物质的一种组合。
[0209] 如果使用一种泡沫体，那么该泡沫体的平均直径可为5到50微米并且可占该流体的0.001质量％到5质量％。
[0210] 含有聚合物颗粒添加剂的钻井流体的使用在油和天然气井的建井、钻井、完井和压裂模拟中具有多种应用。这些颗粒一般为球形固体，并且比重为1.06。这些颗粒的使用提供若干优势，例如增强机械润滑，减少设备磨损，并且帮助在滑动期间的方向变化。这些颗粒一般可抵抗>25,000psi流体静力学的变形载荷，并且其即使在钻井环境中在高于450°F的温度下也显示极佳的抗性和热稳定性。根据一个特定钻井作业的要求，这些颗粒还可以细或粗等级来制造。
[0211] 聚合物颗粒易于通过一个泥浆混合料斗机添加到钻井流体中。在用于控制转矩和3
阻力时，这些珠粒可以2-8ppb(5.71-22.87千克/m)的浓度施加。对于绳索作业中的定位
3
和下套管，可将这些聚合物珠粒添加到8-12ppb(22.87-34.31千克/m)的浓度。
[0212] 在一些实施例中，该钻井流体包含一种热固性聚合物颗粒，例如那些揭示于US8,088,718中者。在一些实施例中，该钻井流体包含一种纳米复合粒子，例如那些揭示于US 2005/0272611中者。在一些实施例中，该钻井流体包含一种共聚物珠粒，例如可自阿尔派专用化学(Alpine Specialty Chemicals)(休斯顿，德克萨斯州)购得的阿尔派钻井珠粒。
[0213] 可用于钻井应用中的其他添加剂的实例包括但不限于：碱度剂、缓蚀剂、消泡剂、分散剂、乳化剂、失液控制剂、用于气基流体的发泡剂、用于缓蚀剂的中间体、润滑剂、雾化剂、除氧剂、亚硫酸氢盐清除剂、杀生物剂、阻垢剂、除垢剂、页岩抑制剂、溶剂、专用表面活性剂、热稳定剂、增粘剂和净水剂。
[0214] 本文所揭示的添加剂(例如包括聚合和玻璃珠粒添加剂)可有助于从微生物细胞破裂并释放油。在所述情况下，添加剂与细胞同时作用以向钻头提供延迟释放的润滑。尽管不打算受限于以下机制，在一个方面中本申请案涉及一种压敏性润滑剂，其借助将该油包封于一种细胞中来容许一种润滑油的延时释放。在一种钻井流体中使用该润滑剂时的情况下，触发释放该油的压力是由钻柱和/或钻头来提供。该油仅在存在足够井下压力和/或摩擦时释放。所述压力和摩擦是由钻柱和/或钻头在其与井地层的相互作用中提供，例如在其沿井眼(具体来说在该井眼的非垂直部分中)拖拉时或在该钻柱/钻头在钻井期间的旋转运动期间提供。
[0215] 要与本文所提供的产油细胞和油组合使用的添加剂和润滑剂包括市售润滑剂。这些润滑剂可与产油细胞和这些细胞产生的油掺和。这些市售润滑剂包括那些由以下公司销售者：贝克休斯(Baker Hughes)(RHEO-LOGIC、MAGMA-TEQ、CARBO-DRILL、MPRESS、PERFORMAX、PERFLEX、TERRA-MAX、PYRO-DRILL、MAX-BRIDGE、CHEK-LOSS、LC-LUBE、MIL-CARB、SOLUFLAKE、FLOW-CARB、X-LINK交联组合物和SOLU-SQUEEZE LCM)、哈利伯顿(Haliburton)(BAROID、BOREMAX、PERFORMADRIL、SHALEDRIL、SUPER-SAT 和BaraECD) 和 斯 伦 贝 谢(Schlumberger)(DRILPLEX、DURATHERM、ENVIROTHERM NT、GLYDRIL、K-MAG、KLA-SHIELD、SAGDRIL、ULTRADRIL、ECOGREEN、MEGADRIL、NOVAPLUS、PARADRIL、PARALAND、PARATHERM、RHADIANT、VERSACLEAN、VERSADRIL和WARP流体)。
[0216] 在各个实施例中，该流体包含一种密度调节剂，也称为增重剂或增重添加剂。适宜密度调节剂包括但不限于重晶石、赤铁矿、氧化锰、碳酸钙、碳酸铁、氧化铁、硫化铅、陨铁和钛铁矿。
[0217] 在各个实施例中，该流体包含一种乳化剂。适宜乳化剂可为非离子型，包括乙氧基化烷基酚和乙氧基化直链醇；或阴离子型，包括烷基芳基磺酸盐、醇醚磺酸盐、烷基胺磺酸盐、石油磺酸盐和磷酸酯。
[0218] 在各个实施例中，该流体包含一种润滑剂。非限制性适宜润滑剂可包括脂肪酸、浮油、磺酸化洗涤剂、磷酸酯、烷醇酰胺、沥青磺酸盐、石墨和玻璃珠粒。
[0219] 该流体可为一种低剪切速率粘度如用布氏粘度计(Brookfield viscometer)以0.5rpm所测量为至少20,000厘泊的钻井流体。在一些实施例中，该低剪切速率粘度为至少约40,000厘泊。
[0220] 添加到流体的生物质可在使用前经化学修饰。化学修饰涉及共价键的形成或断裂。例如，生物质可通过转酯作用、皂化、交联或水解来进行化学修饰。该生物质可经一种或多种反应性物质处理以附接所需部分。这些部分可为疏水、亲水、两性、离子性或两性离子性。例如，该生物质可经阴离子化(例如，羧甲基化)或乙酰化。用于来自产油微生物的生物质的共价修饰(包括羧甲基化和乙酰化)的方法揭示于2012年3月26日申请的美国临时专利申请案第61/615,832号“藻类塑料和吸收剂(Algal Plastics and Absorbants)”中，其相关部分是以引用方式并入本文中。美国专利第3,795,670号阐述一种乙酰化工艺，其可用于通过与乙酸酐反应来增加生物质的疏水性。生物质的羧甲基化可通过用一氯代乙酸处理来执行。例如，参见美国专利第3,284,441号、美国专利第2,639,239号、第3,723,413号、第3,345,358号、第4,689,408号、第6,765,042号和第7,485,719号，其揭示用于阴离子化和/或交联的方法。
[0221] 该流体可包括一种或多种添加剂，例如膨润土、黄原胶、瓜尔胶、淀粉、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚阴离子纤维素、杀生物剂、pH调节剂、聚丙烯酰胺、除氧剂、硫化氢清除剂、发泡剂、破乳剂、缓蚀剂、粘土控制剂、分散剂、絮凝剂、减磨剂、桥堵剂、润滑剂、增粘剂、盐、表面活性剂、酸、失液控制添加剂、气体、乳化剂、密度调节剂、柴油燃料和泡沫体。
[0222] 可将流体混合或剪切适当次数以获得均匀混合物。
[0223] 可使流体在测试或使用前经历陈化。陈化可在从静态到动态变化并且从环境(20℃-25℃)到高度升温(>250℃)变化的条件下进行。
[0224] 可根据流体对剪切的反应将这些流体描述为牛顿型或非牛顿型。一种牛顿型流体的剪切应力与剪切速率成比例。对于非牛顿型流体，粘度随剪切速率增加而降低。非牛顿型流体特性，即假塑性特性是指一种钻井流体可能需要的一般类型的剪切稀化。已发展出若干种该领域中已知的数学模型来阐述非牛顿型流体的剪切应力/剪切速率关系。这些模型(包括宾汉塑性流模型(Bingham plastic model)、幂次律模型(Power Law model)和赫巴模型(Herschel-Buckley Model)阐述于以下文献中：“钻井流体加工手册(The Drilling Fluids Processing Handbook)，美国机械工程师协会(American Society of Mechanical Engineers)的泥浆振动筛委员会(Shale Shaker Committee)编辑，海湾职业出版社(Gulf Professional Publishing)，2004”。另外，参见参考手册，包括可从贝克休斯获得的“钻井流体参考手册(Drilling Fluids Reference Manual)，2006”。
[0225] 实例
[0226] 实例1
[0227] 金属-金属润滑性测试是使用热轧实验室调配钻井流体来实施。这些钻井流体是通过将一种水基、合成基或油基泥浆与微藻细胞和/或从这些细胞提取的游离油混合来制备。将这些钻井流体在大气压和标准温度(对于油基泥浆150°F，对于水基泥浆和合成基泥浆120°F)下热轧16小时。
[0228] 这些泥浆是使用表5-7中提供的配方来制备。株系A是通过经典诱变从UTEX 1435获得并针对高油产量加以筛选。株系B也是通过经典诱变从UTEX 1435获得并且针对高油产量加以筛选，并根据WO 2010/063031进一步经转化以表达一种酵母蔗糖转化酶。来自株系A和B的油的脂肪酸谱在表5中给出。
[0229] 表5.来自株系A和B的油的脂肪酸谱
[0230]脂肪酸 株系A株系B
C10:0 0.0 0.0
C12:0 0.1 0.0
C14:0 2.3 0.7
C16:0 27.5 13.2
C18:0 2.03 5.2
C18:1 59.0 71.8
C18:2 6.2 6.4
C18:3 0.2 0.1
C20:0 0.2 0.4
[0231] 将这些株系在异养条件下培养，例如那些阐述于WO2008/151149、WO2010/063031、WO2010/063032、WO2011/150411和WO2013/158938中者。在培养后，使用一个滚筒干燥器干燥来自对应于不同发酵运行的批料的培养液。所得固体生物质显示于下表6中，并且根据株系(A或B)以及(若适用)批号(1-4)加以标识。A2是通过以下方式来制备：取滚筒干燥的生物质并在去离子水中再悬浮到20％固体，用一个匀浆器在1250巴下处理两次，并冷冻干燥。
[0232] 表6.生物质
[0233]生物质 处理
A1 滚筒干燥
[0234]A2 滚筒干燥并匀浆(2x)
A3 滚筒干燥
A4 滚筒干燥
B 滚筒干燥
[0235] 含有3体积％或6体积％该生物质的水基、合成基或盐水基泥浆是如表7-10中所述来制备。
[0236] 表7.泥浆A：水基钻井流体
[0237]
[0238] 表8.泥浆B：合成基钻井流体
[0239]
[0240] 表9.泥浆C：盐水基钻井流体
[0241]
[0242]
[0243] 表10.泥浆D：水基钻井流体
[0244]
[0245] 金属-金属润滑性系数(摩擦系数)是使用一个Fann EP/润滑性测试器型号21200来测定。在这个测试中，在两个硬化钢表面(一个块与一个旋转环)之间以60RPM施加150英寸-磅的力，且在表11-15中所指示的时间点读取读数。
[0246] 表11.使用水基钻井泥浆的金属-金属润滑性
[0247]
[0248] 表12.使用水基钻井泥浆的金属-金属润滑性(在热轧后立即进行测量)
[0249]
[0250] 表13.使用水基钻井泥浆的金属-金属润滑性
[0251]
[0252] 表14.使用合成基钻井泥浆的金属-金属润滑性
[0253]样品 1Min. 3Min. 5Min. 10Min. 30Min. 60Min.
泥浆B 0.13 0.13 0.13
泥浆B+3％生物质A1 0.19 0.14 0.13 0.11 0.11 0.11
泥浆B+3％生物质A2 0.10 0.09 0.10 0.10 0.10 0.10
泥浆B+3％生物质A5 0.12 0.11 0.10 0.08 0.08 0.12
泥浆B+来自株系A的油 0.11 0.10 0.10 0.09 0.10 0.09
[0254] 表15.使用盐水基钻井泥浆的金属-金属润滑性(在热轧后立即进行测量)
[0255]样品 1Min. 3Min. 5Min. 10Min. 30Min. 60Min.
泥浆C 0.24 0.23 0.22 0.20 0.19
泥浆C+来自株系A的油 0.22 0.20 0.18 0.16 0.15
泥浆C+3％生物质A1 0.25 0.23 0.22 0.21 0.19 0.16
泥浆C+3％生物质A2 0.19 0.25 0.10 0.07 0.06 0.05
泥浆C+3％生物质B 0.24 0.22 0.21 0.21 0.19
[0256] 该钻井流体的润滑性在添加生物质或油时的变化可在表16中表示为转矩的减小百分比(润滑性的差对不含微藻细胞/微藻油的泥浆的润滑性的比率)。
[0257] 表16.在60分钟时的转矩减小百分比
[0258]
[0259] 如图2中所示,与完整或裂解细胞调配在一起的水基泥浆显示润滑性系数随时间而减小。基于润滑性系数的减小，因使用完整或裂解细胞所得的转矩减小据估计为57-77％。发现含有完整细胞的合成基泥浆可如图3中所示显示减小润滑性系数的趋势，对应于约8-15％转矩减小。发现含有裂解细胞的合成基泥浆可具有较低润滑性系数(0.1)，对应于约23％的转矩减小。在盐水基泥浆中，与裂解细胞一起调配显示润滑性系数随时间的最大减小，对应于约67％的转矩减小，如图4中所示。
[0260] 将含有来自株系A和B的油的泥浆的润滑性系数与含有市售极压润滑剂DFL(倚科能源(EcoGlobal))或贝克休斯Mil润滑剂(Baker Hughes Mil-Lube，一种植物油润滑剂)的泥浆相比较。如在图1和表17中可见，发现由于在泥浆中添加来自株系A和B的油所致的润滑性系数的减小和相关转矩减小与市售润滑剂相当。
[0261] 表17.转矩减小百分比
[0262]
[0263] 实例2
[0264] 极压润滑性测试是使用Fann EP/润滑性测试器模号21200来执行，结果在表18中给出。观察到在添加3％来自株系B的生物质后，膜强度显著增加。
[0265] 表18.极压测试
[0266]
[0267] 实例3
[0268] 使用一个匀浆器在500巴压力(7,252psi)下裂解从培养液分离或滚筒干燥的来自株系B的细胞，以测定压力对细胞破裂的效应。如在表19和图5中所见，约45％的细胞在这个压力下裂解，在滚筒干燥的生物质中见到更多裂解。
[0269] 表19.在500巴下的裂解百分比
[0270]菌株 培养液 滚筒干燥
B 28 45
[0271] 实例4
[0272] 实施一个使用含有来自株系A的微藻细胞的水基泥浆的现场试验，以评价增加钻进速度和减小钻头阻力的效率。这些水基泥浆是使用表20中提供的配方来制备。
[0273] 表20.水基钻井泥浆配方
[0274]
[0275] *ppb＝磅/桶(pounds per barrel)
[0276] 在这个试验中使用黄原胶作为流变学对照。淀粉是一种品质失液添加剂并且用于该试验中，以结合黄原胶提供极佳低端流变学增强。采用戊二醛作为一种杀生物剂。添加聚阴离子纤维素(PAC)用于粘度和过滤控制。添加苛性钠以控制碱度，同时使用苏打灰来降低硬度以容许诸如PAC等钙敏感材料有效发挥作用。用苏打灰将钙控制在100-200ppm之间，并用苛性钠将pf(即，碱度的测量值)控制在0.5-1.0之间。
[0277] 在俄克拉荷马州哈尔莱特的卡图萨测试设施(Catoosa Testing Facility)钻探具有表21-22中提供的主要系统参数的井，其中在1300英尺总垂直距离(TVD)的土壤构造由一个页岩层组成。
[0278] 表21.系统性质
[0279]特性 参数 单位
表面密度 8.6-8.8 Ppg
[0280]低剪切速率粘度(LSRV) 4,000-8,000 cPs
屈服点(YP) 8-14 磅/100ft2
6θ(应变孔) 8-10 Rpm
3θ(应变孔) 8-10 Rpm
10Sec Gel 6-10 磅/100ft2
10Min Gel 8-14 磅/100ft2
API失液(30min) >10.0 cc
[0281] 表22.钻井参数
[0282]孔径 8.5英寸
起始深度：(MD) 500英尺
间隔TD：(MD) 1,900英尺
间隔长度 1,400英尺
估计的所生成冲刷： 1.0体积％
末层套管I.D.： 9.625英寸
末层套管鞋：(MD) 500英尺
新表面体积： 350桶
推进体积： 0桶
裸眼井体积： 99桶
钻屑控制效率： 90.0％
抽吸时的最大钻屑： 5.0％
流速： 10BPM
环形套管中的最大钻屑： 8.0体积％
所用稀释液体积： 188桶
所容许的最大钻井速率： 120英尺/小时
套管和裸眼井体积： 136桶
总间隔体积： 575桶
[0283] 为测量使用完整微藻细胞对钻头的钻进速度(ROP)的效应，通过以下方式产生井：钻一个垂直的8.5英寸直径的孔到750英尺测量深度(MD)的造斜点(KOP)，然后以10°/100英尺钻一条曲线，在+/-1650英尺MD实现90°，如图6中所示(使用一个作业的1.5度弯壳马达和一个GX-30CDX三牙轮钻头(贝克休斯))。在到达进入油层点后，通过旋转侧向钻180英尺。然后将完整微藻细胞添加到用于该钻头的水基泥浆中并将其孵育1或2小时，之后沿一个侧向截面继续钻井。在一个连接到一个钻油平台上的一个顶驱的NOV Totco系统上收集数据。
[0284] 使用完整细胞似乎可在孵育2小时后将钻进速度增加20％，如表23中所示。在孵育1小时时段后钻进速度无变化，并且这证实了循环时间和剪切是激活润滑性(例如，减弱细胞以使得能破裂)所必需的。这个现场试验显示，使用完整细胞缩短钻井时间或增加钻井距离。
[0285] 表23.平均钻进速度(ROP)的增加百分比
[0286]
[0287] 为测量使用完整微藻细胞对钻头遇到的阻力的效应，将底孔组合件(BHA)从上文所提到的挖掘的井中拉出并沿曲线的45度和60度部分无旋转拖拉(图7和8)。这些钻机仅经水基泥浆处理或经水基泥浆与完整微藻细胞的组合处理。在一个连接到一个钻油平台上的一个顶驱的NOV Totco系统上收集数据。平均来说，大钩悬重减少27％，并且在包封油存在下最大减少50％。
[0288] 因将完整微藻细胞添加到水基泥浆所致的阻力变化表示于表24中。该阻力变化是通过以下方式来计算：取仅使用泥浆时的阻力与使用具有完整微藻细胞的泥浆时的阻力的差值，然后用该差值除以仅使用泥浆时的阻力。取这些比率的平均值以达到在该曲线的45度和60度两部分的阻力减少百分比。
[0289] 表24.阻力减少百分比
[0290]
[0291] 如图7和8中所说明，将完整微藻细胞添加到水基泥浆显示大钩悬重(磅)随钻头高度而减小。基于大钩悬重的该减小，使用具有完整微藻细胞的泥浆系统导致：(1)在该曲线的45度区段中阻力减小24％；以及(2)在该曲线的60度区段中阻力减小32％。
[0292] 该顶驱的旋转转矩是在产物不存在下在旋转钻井之前通过在脱离井底旋转的同时分析平均转矩来测量。在添加包封油后，在起钻的相同点处测量旋转转矩。由于为了测量起钻而将泵关闭，基于在泵运行时读取的三个单独读数应用校正因子。平均来说，在相同测量距离(MD)处，在泵运行时旋转钻柱和底孔组合件(BHA)所需的旋转转矩比泵关闭时低约250ft*磅，这可能是因为在泵运行时钻头椎体的旋转使得整个BHA更易于旋转，或是因为循环促进了岩屑的移除。在包封油存在下，旋转转矩减小多达45％(图9)。
[0293] 在包封油存在和不存在下，以40-45RPM的旋转且以15,000磅的钻压执行侧向钻井。在添加包封油并孵育2小时后，钻进速度(ROP)增加约20％(图10)。
[0294] 实例5
[0295] 制备或获得下表25中的株系和润滑剂，并使其经历实例6和7中所述的测试。
[0296] 表25.生物质/润滑剂
[0297]
[0298] 株系C是从经经典诱变用于较高油产量的UTEX 1435获得，并且经以下质粒pSZ2533(SEQ ID NO:1)进一步转化，用于产生具有高油酸和低亚油酸谱的三酰甘油。该构建体断裂FATA1等位基因的单一拷贝，同时表达一种酿酒酵母蔗糖转化酶并过表达一种莫氏原壁藻KASII基因(PmKASII)。该构建体pSZ2533FATA13’::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmUAPA1:PmKASII-CvNR::FATA15’中的相关限制位点是以小写、粗体和加下划线来指示，并且分别是5’-3’BspQ 1、Kpn I、Asc I、Mfe I、EcoRV、SpeI、AscI、ClaI、Sac I、BspQ I。BspQI位点划定转化DNA的5’和3’末端的界限。粗体小写序列表示FATA13’基因组DNA，其允许靶向在FATA1基因座通过同源重组整合。驱动酵母蔗糖转化酶基因的表达的莱茵衣藻(C.reinhardtii)β-微管蛋白启动子是由加框文本来指示。转化酶的起始密码子ATG和终止子TGA由大写粗斜体指示，而编码区由小写斜体指示。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR在由加框斜体文本指示的莫氏原壁藻UAPA1启动子之后由小写加下划线文本指示。PmKASII的起始密码子ATG和终止子TGA密码子由大写粗斜体指示，而编码区的其余部分由粗斜体指示。原壳小球藻S106硬脂酰基-ACP脱饱和酶转运肽位于起始密码子ATG与Asc I位点之间。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR仍在由粗体小写文本指示的FATA15’基因组区域之后由小写加下划线文本指示。
[0299] 含于pSZ2533中的转化DNA的核苷酸序列：
[0300]ctttcttgcgctatg
acacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagt-cacaacccgcaaac
gcag
cagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagaggaacgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccattagcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacagcctaggagatctcttaaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacg
ctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaa
（SEQ ID NO:1）
[0301] 株系D是从经诱变用于较高油产量的UTEX 1435获得，并且经一种质粒进一步转化以断裂硬脂酰基-ACP脱饱和酶位点，之后进一步诱变。该质粒是根据WO2008/151149、WO2010/063031、WO2010/063032、WO2011/150411和WO2013/158938中所述的方法和序列来构建，并且包含一种驱动酿酒酵母蔗糖转化酶基因的表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子和一个原壳小球藻Ef13’UTR，以及一种驱动与来自莫氏原壁藻脂肪酸脱饱和酶的转运肽融合的来自赖特萼距花（Cuphea.Wrightii）的外源酰基-ACP硫酯酶的莫氏原壁藻内源AMT3启动子和一个普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR。
[0302] 株系E是一种从德克萨斯州大学藻种保存库（奥斯汀，德克萨斯州，美国）获得的原壳小球藻（UTEX 250）株系。
[0303] 在一种富养分复杂种子培养基（表26）中在30℃和200rpm下培养产油酵母的一个株系粘红酵母（株系G）和非产油酵母的一个株系酿酒酵母（株系F）。用1.0-1.5mL冷藏保存细胞（细胞库）接种含有50-60mL种子培养基的初代250-mL烧瓶。在OD（A600）>3下，使用初代烧瓶培养物来接种含有60-300mL种子培养基的继代烧瓶到0.1-0.2的初始OD。视需要通过将充分生长的接种物培养物（OD>3）以OD0.1-0.2继代培养到种子培养基中来繁殖酵母株系。对于生产发酵，将种子培养物培养到OD>3并且种子接种物体积(还称为接种后体积)通常为发酵起始体积的10％。通过两个种子烧瓶阶段(初代->继代->生产发酵-AIV)繁殖酿酒酵母株系，以制备用于生产发酵罐的接种物。通过四个种子培养阶段(初代->继代->第3阶段->第4阶段->生产发酵)繁殖粘红酵母株系，以制备用于生产发酵罐的接种物。
[0304] 将粘红酵母和酿酒酵母培养物在15L实验室级发酵罐中在一种富养分确定成份培养基(表26和表27)中培养。在30℃温度、pH 5和>30％空气饱和的溶解氧(DO)下控制这些发酵。以1.4体积空气/体积培养基对这些发酵进行通气，并视需要自动控制400-1000rpm的搅动以控制DO。使用一种13％(w/w)氢氧化钾溶液来控制pH。按需求向这些培养物进给一种71％(w/w干固体)玉米糖浆溶液，以将培养液中的残余葡萄糖浓度维持在0与20g/L之间。在培养约4天后收获酿酒酵母培养物并且消耗320-460克葡萄糖/升接种后体积(g/L-AIV)。在培养约3天后收获含有33％油的粘红酵母培养物并且消耗
230–260克葡萄糖/升接种后体积(g/L-AIV)。在培养6-7天后收获含有44％油的粘红酵母培养物并且消耗420-450克葡萄糖/升接种后体积(g/L-AIV)。
[0305] 表26.用于培养酵母株系的种子培养基的组成.
[0306] 通过在高压釜中在>121℃下灭菌>20分钟或通过一个无菌0.2微米膜过滤器来制备培养基。
[0307]
[0308] *单独灭菌并无菌组合以实现最终浓度
[0309] 表27.用于培养酵母株系的生产发酵培养基的组成.
[0310] 通过在高压釜中在>121℃下灭菌>20分钟或通过一个无菌0.2微米膜过滤器来制备培养基。
[0311]
[0312]
[0313] *单独灭菌并无菌组合以实现最终浓度
[0314] 实例6
[0315] 先前实例中的生物质的破裂强度是通过比较油含量增加的细胞随压力而变的所释放游离油的量来测定。将干燥的生物质悬浮于去离子水中到10％总固体，如在一个Mettler Toledo水分分析仪上通过将1g液体添加到一个经配衡玻璃滤纸上并在100℃下干燥来测量。通过一个Niro Panda实验室级匀浆器单元在所指示压力(0、500和750巴)下加工该悬浮液，并收集以供游离油分析。通过以下方式从该裂解培养液提取游离油：将0.5g样品稀释到3mL去离子H2O中，之后与1:2己烷与异丙醇溶液温和混合30秒，并在
12,000rpm下离心5分钟。用一个移液管将含有该油的己烷层转移到一个预先称重的铝盘上并在一个通风橱中使其蒸发60分钟。对该盘中干燥的油称重并通过用游离油除以如通过酸水解和气相色谱所测定的可得总油来测定每一样品的裂解％。结果归纳于图12中。
[0316] 实例7
[0317] 将水中的添加剂的量正规化为含有55％脂质含量的株系A。将添加剂(图13)混合于水中达到3重量％(对于固体样品，其对于株系A为2体积％总油)和2体积％(对于液体样品)的最终浓度。使用一个Hamilton Beach混合器将悬浮液在低剪切下混合3分钟，然后转移到一个OFI润滑表(型号112-00)的样杯中。对于润滑性系数测试，在两个硬化钢表面(一个块与一个以60RPM旋转的环)之间施加150英寸-磅的力(相当于中间液上5,000到10,000PSI压力)。然后相对于基液自该表读数计算转矩减小％，如设备手册中所述。结果示于图13中。
[0318] 应理解，本文所述的实例和实施例仅用于说明性目的，并且所属领域技术人员将想到基于这些实例和实施例的各种修改或改变，并且这些修改或改变要包括在本申请案的精神和范围内以及所附权利要求书的范畴内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请案都是全文以引用方式并入本文中。
[0319] 非正式序列表
[0320] SEQ ID NO:1
[0321] 含于pSZ2533中的转化DNA的核苷酸序列：
[0322]ctttcttgcgctatg
acacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgtttcagt-cacaacccgcaaac
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ctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaa
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