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电极催化剂和酶电极

阅读：200发布：2021-02-25

IPRDB可以提供电极催化剂和酶电极专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供含有电子传递效率高的氧化酶的新型电极催化剂，以及使用该电极催化剂的酶电极。电极催化剂含有CueO。酶电极具有碳多孔体、以及担载在上述碳多孔体表面的含有CueO的电极催化剂。CueO优选是来自大肠杆菌的CueO。构成酶电极的碳多孔体优选是炭黑凝胶。另外，酶电极还可以具有促进上述碳多孔体-上述CeuO之间的电子授受的介体。，下面是电极催化剂和酶电极专利的具体信息内容。

权利要求

1.含有来自大肠杆菌的CueO的电极催化剂。

2.一种酶电极，具有：

碳多孔体；以及

担载在所述碳多孔体表面的、含有来自大肠杆菌的CueO的电极催化剂。

3.根据权利要求2所述的酶电极，所述碳多孔体是满足以下的(I)和(II)的条件的炭黑凝胶：(I)用CuKα线在扫描区域2θ＝0.5～10°中未看到X射线衍射峰；

(II)在由吸附脱附等温线计算出的细孔径分布中，在分布峰顶的细孔径值d处于2nm以上且不足10nm的范围的情况下，在相对于上述细孔径值d为d±2nm的细孔径区域中，含有总细孔容量的60％以上，在分布峰顶的细孔径值D处于10nm～50nm的范围的情况下，在相对于上述细孔径值D为(0.75×D)～(1.25×D)nm的细孔径区域中，含有总细孔容量的60％以上。

4.根据权利要求2或3所述的酶电极，不具有介体，所述介体为促进所述碳多孔体-所述CueO之间的电子授受的介体。

说明书全文

电极催化剂和酶电极

技术领域

[0001] 本发明涉及电极催化剂和酶电极，更详细地说，涉及作为生物传感器、燃料电池等各种电化学器件的电极使用的酶电极，以及在酶电极中使用的电极催化剂。

背景技术

[0002] 酶是使生物体内的化学反应(代谢)进行的生物体催化剂，以蛋白质为基本结构。酶也有的仅由蛋白质构成，但大多数酶为了发挥酶活性或者提高酶活性，需要除蛋白质之外的成分(辅因子)。

[0003] 酶有下述(1)、(2)等特征：

[0004] (1)在接近常温、常压的温和条件下显示催化作用；

[0005] (2)同时具有只对特定的底物(通过酶而受到作用的物质)发挥作用的“底物特异性”，以及对特定的化学反应显示催化作用、并不引起副反应的“反应特异性”。

[0006] 在酶中，将催化生物体内的氧化还原的酶称为“氧化还原酶(oxidoreductase)”。另外，将以氧作为电子受体而使底物氧化的酶特别地称为“氧化酶(oxidase)”，将使底物还原的酶特别地称为“还原酶(reductase)”。如果在电极表面固定某种氧化还原酶，则可以通过酶的催化作用而在电极上选择性地只进行特定的氧化还原反应，从而通过电极将氧化还原反应所产生的物质转换成电信号。将这样的电极称为“酶电极”，可以在各种生物传感器、燃料电池等的电极中使用。

[0007] 为了使用酶作为电极催化剂，必须将酶固定在适当的载体表面。但是，因为酶一般是水溶性的，所以在使用中存在酶容易流出等问题。

[0008] 另外，酶具有与底物特异性地结合、接受催化作用的部位(活性中心)。因为很多时候活性中心被埋在具有复杂的立体结构的蛋白质的内部深处，所以难以与电极之间直接进行电子授受。在这样的情况下，通常要并用侵入到酶的活性部位、与酶进行电子迁移、再将电子运送到电极的低分子物质。这样的低分子物质被称为“介体”。但是，因为酶/介体之间的电子移动速度依赖于各自的分子运动，所以未必充分，有可能成为限制酶电极的电流密度的主要原因。

[0009] 因此，为了解决该问题，一直以来人们提出了各种方案。

[0010] 例如，专利文献1公开了一种含氮碳系复合材料，该复合材料具有多孔体，所述多孔体含有由碳原子和氮原子形成骨架的含氮碳系材料，并且该复合材料还具有担载在上述多孔体上的氧化还原酶。

[0011] 上述文献中还记载了下述要点(1)、和(2)：

[0012] 要点(1)因为含氮碳系材料在细孔表面存在极性位点，所以如果在其上担载氧化还原酶，则会与蛋白质表面的亲水基团之间生成氢键等新的结合，从而蛋白质与载体的结合被加强；

[0013] 要点(2)作为担载在载体上的氧化还原酶，可列举漆酶、心肌黄酶、脂肪氧合酰胺脱氢酶(Lipoxyamide dehydrogenase)、醇脱氢酶、葡萄糖氧化酶(包括以其它糖为底物的氧化酶)、葡萄糖脱氢酶(包括以其它糖为底物的脱氢酶)。

[0014] 另外，专利文献2公开了一种酶电极，该酶电极具有导电性部件、酶、第1和第2介体，第1介体和第2介体通过载体固定在导电性部件上，并且第1介体与第2介体氧化还原电位彼此不同。

[0015] 上述文献中还记载了下述要点(1)、(2)和(3)：

[0016] 要点(1)通过采用这样的构成，可以提高导电性部件的单位实效表面积的酶担载密度；

[0017] 要点(2)除可以进行与酶之间的高速的电子移动的第1介体之外，可以通过进一步使用在第1介体与导电性部件之间进行电荷传递的第2介体，从而与酶进行高速电子移动；

[0018] 要点(3)作为酶，可列举葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、胆红素氧化酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱氢酶、氨基酸脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、NADH-细胞色素b5还原酶、NADPH-皮质铁氧还蛋白还原酶、细胞色素b5还原酶、皮质铁氧还蛋白还原酶、硝酸还原酶。

[0019] 专利文献1：特开2005-343775号公报

[0020] 专利文献2：特开2006-058289号公报

发明内容

[0021] 氧化还原酶一般除了与底物结合的活性中心之外，具有用于进行与活性中心之间的电子授受的部位(电子传递门)。因为在生物体内对酶的电子传递通常是介由介体来进行的，所以酶的电子传递门多埋在蛋白质的口袋内部。如果将这种状态的酶固定在电极表面，则电子传递门与电极表面的距离无论如何也会增大。由于电子移动速度的常用对数与距离成比例地减慢，故而现有已知的酶得不到高电子传递效率。

[0022] 为了解决该问题，正如专利文献2所公开的那样，人们考虑了并用介体。但是，仅仅通过并用介体的方法，电子传递效率的提高有限。另外，目前没有报道适用于能够得到充分量的电流密度的酶电极的酶的例子。

[0023] 本发明要解决的课题是，提供含有电子传导效率高的氧化酶的新型电极催化剂、以及使用该电极催化剂的酶电极。

[0024] 为了解决上述课题，本发明所涉及的电极催化剂含有CueO。

[0025] 另外，本发明所涉及的酶电极具有：碳多孔体；以及担载在上述碳多孔体表面的、含有CueO的电极催化剂。

[0026] 当将作为多铜氧化酶的的一种的CueO作为酶电极用的催化剂使用时，则可得到高于以往的氧化还原酶的电流密度。

[0027] 认为这是由于以下原因。

[0028] (1)因为CueO的酶分子中，催化氧化反应的活性中心与电子传递门分离，所以即使将酶固定在电极固体表面上也可以同时完成催化反应和电子传递。

[0029] (2)因为CueO中电子传递门更接近分子表面，所以在固定于固体表面的状态下，电子传递门与电极的距离减小，故而电子移动的效率提高。

[0030] 由于以上那样的原因，本发明的电极催化剂电子传递效率优异，并可以得到高于以往的氧化还原酶的电流密度。即，固定了本发明的电极催化剂的酶电极，电极催化剂的单位固定化量所得的电流值较大，即使在有限的面积上固定电极催化剂的情况下，也可以得到高电流值。具体地说，可以得到与使用铂催化剂的电极同等的电流密度。而且，因为固定了本发明的电极催化剂的酶电极即使固定少量的电极催化剂，也可得到高电流值，所以可以降低成本。

[0031] 进而，因为本发明的电极催化剂的电子传递效率高，即，电极-电极催化剂之间的电子移动速度非常快，所以即使为了提高酶电极中的电极反应速度而不使用介体，也可以得到高电流值。

[0032] 另外，因为本发明的电极催化剂电子传递效率高、电极-电极催化剂之间的电子移动速度非常快，所以在固定了本发明的电极催化剂的酶电极中所得的催化电流与其说是受该电极催化剂的酶活性限制，不如说是受对电极的氧供给速度限制。即，固定了本发明的电极催化剂的酶电极可以显示稳定的电极活性，从而得到稳定的输出功率。因此，可以通过使用固定了本发明的电极催化剂的酶电极，实现提高燃料电池的输出功率、使得氧检测型传感器高灵敏度化。

附图说明

[0033] 图1是一种作为多铜氧化酶的来自大肠杆菌的CueO的分子结构。

[0034] 图2是含有各种多铜氧化酶的酶溶液的循环伏安图。

[0035] 图3是含有担载在各种碳载体上的各种多铜氧化酶的酶电极的循环伏安图。

具体实施方式

[0036] 以下，对于本发明的一种实施方式进行详细说明。

[0037] 本发明所涉及的电极催化剂含有CueO。

[0038] 氧化还原酶是催化氧化还原反应的酶，蛋白质的立体结构中具有活性中心和电子传递门。所谓“活性中心”是指底物与之特异性地结合、接受催化作用的部位。所谓“电子传递门”是指用于进行与活性中心之间的电子授受的部位。

[0039] 氧化还原酶大致分为使底物氧化的氧化酶、和使底物还原的还原酶。使用哪一种作为电极催化剂用酶根据电极极性不同而不同。即，在使用酶作为正极侧的材料时，使用能够通过反应接受电子(换而言之，能够催化以质子和氧为底物生成水的反应)的氧化酶。另一方面，在使用酶作为负极侧的材料时，使用通过反应释放电子的还原酶。

[0040] 另外，氧化还原酶是具有固有的三维结构的巨大分子，活性中心、电子传递门通常处于埋在三维结构的开口部分(凹陷、裂缝)的深处的状态。这时，活性中心和电子传递门可以位于同一开口部，或者可以位于不同的开口部。

[0041] 其中，就具有含有电子传递门的第1开口部和含有活性中心的第2开口部的氧化还原酶而言，在酶催化底物时，底物移动与电子移动不相干扰。因此，与在同一开口部含有活性中心和电子传递门的酶相比，酶/电极间的电子传递效率提高。

[0042] 特别是，就含有电子传递门的第1开口部位于含有活性中心的第2开口部对面的氧化还原酶而言，可以通过使第1开口部接近电极表面从而极为顺利地进行电极/电子传递门之间的电子传递。因此，酶/电极间的电子传递效率进一步提高。

[0043] 这里，所谓“第1开口部位于第2开口部的对面”是指第1开口部所处的面的法线方向与第2开口部所处的面的法线方向所成的角大于90°。优选2条法线所成的角较大，越接近180°越好。

[0044] 在氧化还原酶中，多铜氧化酶催化下述反应，即：使用从底物取出的电子将分子态氧进行4电子还原，从而生成水的反应。多铜氧化酶有作为电子传递门的单核蓝铜(I型Cu)、和作为活性中心的三核铜簇(II型Cu、III型Cu)，单核蓝铜与三核铜簇分别位于不同开口部的内部。而且，2个开口部分别在由蛋白质形成的立体结构的表面和里面。因此，多铜氧化酶或者将其通过基因操作进行了变化的修饰酶特别适合作为在生物传感器、燃料电池等各种电化学器件中使用的酶电极的正极用催化剂。

[0045] 作为多铜氧化酶，具体地说有漆酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白、CueO、芽孢杆菌属细菌的内生孢子外壳蛋白CotA等。其中，在使用CueO(特别是大肠杆菌的铜代谢相关氧化酶CueO(来自大肠杆菌的CueO))作为酶电极用电极催化剂时，得到了高于以往的氧化还原酶的电流密度。

[0046] 所谓“CueO”是指从各种菌株采集的一种多铜氧化酶。另外，所谓“来自大肠杆菌的CueO”是指从大肠杆菌采集的CueO。序列表的第1序列示出了天然型成熟CueO的氨基酸序列(swissprot登记号：Q8X947)。

[0047] CueO可以是从菌株直接采集的天然型CueO，或者可以是在不使催化活性和电子传递能力消失的范围内，通过基因操作改变、删除天然型CueO的一部分氨基酸序列而得的修饰型CueO。

[0048] 接着，对于本发明所涉及的酶电极进行说明。

[0049] 本发明所涉及的酶电极具有碳多孔体、以及担载在碳多孔体表面的含有CueO的电极催化剂。CueO特别优选来自大肠杆菌的CueO。其中，因为关于CueO和来自大肠杆菌的CueO如上所述，所以省略说明。

[0050] 担载酶的载体使用碳多孔体。因为碳多孔体不仅可以顺利地进行酶/电极间的电子传递，而且在细孔径适当的情况下，可以将酶物理性地担载在细孔内，并且可以抑制酶失活，所以特别适合作为载体。

[0051] 为了充分提高作为载体成分的酶的稳定性和活性，碳多孔体优选具备以下[1.]～[4.]的任1个以上的条件。

[0052] [1.平均细孔径]

[0053] 碳多孔体优选平均细孔径为2～50nm。平均细孔径进而优选为2～20nm。如果平均细孔径不足2nm，则细孔的尺寸小于酶的尺寸的情况增多，吸附性降低。另一方面，如果平均细孔径超过50nm，则引起比表面积降低，从而吸附性降低。另外，如果平均细孔径超过20nm，则有可能在担载一部分酶时容易产生不适合。

[0054] 另外，碳多孔体的平均细孔径优选为酶的分子直径以上。平均细孔径更优选为酶的分子直径的1～1.25倍。如果碳多孔体的平均细孔径为上述范围，则酶容易固定在细孔内。因为酶一被固定在细孔内，细孔外壁就会抑制热造成的酶结构变化，所以能够抑制热造成的酶失活，故而热稳定性提高。

[0055] 此外，所谓平均细孔径，是指在由后述的由氮吸附等温线求得的细孔径分布中，分布峰顶的细孔径值。

[0056] [2.细孔径分布]

[0057] 以细孔径分布区域在2～100nm范围的所有细孔容积为基准，碳多孔体优选在平均细孔径的±25％的范围内的细孔容量为60％以上的碳多孔体。如果细孔径的均匀性比这差，则可能除了细孔径最适合担载酶的细孔之外的细孔变多，酶的稳定性和活性不充分。

[0058] [3.比表面积]

[0059] 碳多孔体优选是比表面积为100m2/g以上的碳多孔体。比表面积更优选为500～2 2
1000m/g。在碳多孔体的比表面积不足100m/g的情况下，与酶的接触面积出现降低和酶可进入的细孔出现减少，故而酶的吸附性降低。

[0060] [4.细孔容量]

[0061] 因为碳多孔体的细孔容量根据比表面积和平均细孔径不同而变化，所以不特别限制，优选为0.1～50ml/g。细孔容量更优选为0.2～2.5ml/g。

[0062] 另外，在碳多孔体的细孔内，细孔径为酶的分子径以上的细孔的总容量优选为所担载的酶的总体积以上。

[0063] 此外，碳多孔体的比较面积和细孔容量可以通过以下所述的一般的容量法测定来求得。

[0064] 即，将碳多孔体装入容器内冷却到液氮温度(-198℃)，向容器内导入氮气并通过容量法求出其吸附量。接着，缓慢增加导入的氮气的压力，将相对于各平衡压的氮气的吸附量进行绘图，从而得到氮吸附脱附等温线。使用该氮吸附脱附等温线，可以通过SPE(扣除空隙效应，Subtracting PoreEffect)法计算出比表面积和细孔容量(K.Kaneko，C.Ishii，M.Ruike.H.Kuwabara，Carbon，30卷，1075页，1986年)。所谓SPE法，是通过αs-绘图法、t-绘图法等进行微细孔解析，来除去微细孔的强势场效应从而计算出比表面积等的方法，是对于计算微细孔性多孔体的比表面积等精度高于BET法的方法。

[0065] 另外，细孔径分布和分布峰顶的细孔径值可以从得到的氮吸附脱附等温线通过BJH解析求出(Barret E.P.，Joyner L.G.，Halenda P.H.，Journalof American Chemical Society，73卷，373页，1951年)。

[0066] 作为满足如上所述的条件的碳多孔体，具体地说有以下那样的碳多孔体。

[0067] [1.中孔碳粒子]

[0068] 碳多孔体的第1具体例是中孔碳粒子。所谓“中孔碳粒子”是指中度尺寸(2～10nm)的细孔规则排列的多孔碳材料，其中，相对于2～100nm的细孔径分布区域中的总细孔容积(S0)，2～10nm的细孔径分布区域中的总细孔容积(S)的比例(＝S×100/S0)为
80％以上。此外，这样的细孔径分布可以根据XRD法和氮吸附法测定。

[0069] [2.炭黑凝胶]

[0070] 碳多孔体的第2具体例是炭黑凝胶。所谓“炭黑凝胶”是指中度尺寸的细孔不规则排列的多孔碳材料，其满足以下的(I)和(II)的条件。

[0071] (I)在扫描区域2θ＝0.5～10°(CuKα线)中未看到X射线衍射峰。

[0072] (II)在由吸附脱附等温线计算出的细孔径分布中，

[0073] 在分布峰顶的细孔径值(d)处于2nm以上且不足10nm的范围的情况下，在相对于上述细孔径值(d)为d±2nm的细孔径区域中包含总细孔容量的60％以上，

[0074] 在分布峰顶的细孔径值(D)处于10nm～50nm的范围的情况下，在相对于上述细孔径值(D)为(0.75×D)～(1.25×D)nm的细孔径区域中包含总细孔容量的60％以上。

[0075] 条件(I)表示中度细孔有无排列规则。X射线衍射峰意味着样品中有该峰角度所对应的d值的周期结构。因此，在扫描区域2θ＝0.5～10°(CuKα线)中看到1个以上的峰的碳多孔体，是细孔以0.9～17.7nm的周期规则排列的所谓中孔碳(MPC)。

[0076] 另一方面，炭黑凝胶在扫描区域2θ＝0.5～10°(CuKα线)中未看到X射线衍射峰。这显示炭黑凝胶中的细孔不具有周期性排列结构。炭黑凝胶具有细孔相互连接的3维网络结构。如果使用炭黑凝胶作为载体，那么虽然其详细原因不明，但与使用中孔碳的情况相比，酶的稳定性和活性提高。

[0077] 此外，在X射线衍射测定(XRD)中，峰强度相对于背景噪音强度的比不足3的峰，不认为是X射线衍射峰。即，所谓“在扫描区域2θ＝0.5～10°(CuKα线)中未看到X射线衍射峰”，是指在扫描区域2θ＝0.5～10°(CuKα线)中，峰强度相对于背景噪音强度的比为3以上的X射线衍射峰1个也没有观测到。

[0078] 条件(II)表示细孔径的均匀性。因为如果细孔分布为上述范围，则细孔径最适合担载酶的细孔量增多，所以酶的稳定性和活性提高。

[0079] 炭黑凝胶优选除了上述的(I)和(II)之外，还具备以下的(III)的条件。

[0080] (III)炭黑凝胶优选在其细孔径分布中，分布峰顶的细孔径值为2～20nm。

[0081] 因为如果炭黑凝胶的细孔径值不足2nm，则细孔的尺寸小于酶的尺寸的情况较多，所以吸附性下降。另一方面，如果细孔径值超过50nm，则引起比表面积降低，故而吸附性下降。另外，如果分布峰顶的细孔直径超过20nm，则有可能在担载酶时产生不适合。

[0082] [3.含氮炭黑凝胶]

[0083] 碳多孔体的第3具体例是含氮炭黑凝胶。所谓“含氮炭黑凝胶”是指至少表面附近由含氮碳形成的炭黑凝胶。另外，所谓“表面”不仅包括外表面，也包括细孔的内表面。表面附近由含氮碳形成的炭黑凝胶具有酶的担载量、稳定性和活性提高等优点。

[0084] 含氮炭黑凝胶中N原子与C原子的原子比(N/C比)优选为0.01以上。在N/C比不足0.01的情况下，N原子减少，故而能与酶相互作用的吸附位点减少。N/C比更优选为0.05以上。

[0085] 另一方面，N/C比优选为0.4以下。如果N/C比超过0.4，则碳骨架的强度降低，故而难以维持细孔结构。N/C比更优选为0.3以下。

[0086] 此外，这样的含氮碳中的N/C比可以通过CHN元素分析或XPS来求得。另外，因为关于含氮炭黑凝胶的其它方面与炭黑凝胶相同，所以省略说明。

[0087] 作为电极催化剂的酶是担载在载体的表面上的。所谓“载体的表面”是指载体的外表面和细孔的内表面。优选将至少一部分酶担载在细孔的内表面。担载在细孔内的酶量越多越好。

[0088] 载体上所担载的酶量只要显示酶活性即可，不特别限制。一般来说，酶的担载量越多越能得到高活性。为了得到实用上充分的活性，酶的担载量优选相对于100质量份碳多孔体为0.01质量份以上。另一方面，如果酶的担载量过剩，则效果饱和，无实际益处。因此，酶的担载量优选相对于100质量份碳多孔体为80质量份以下。

[0089] 本发明所涉及的酶电极可以仅由上述的载体和酶构成，或者可以在载体上进一步担载可促进碳多孔体-酶之间的电子授受的介体。在本发明的酶电极中，作为电极催化剂的酶的电子传递效率非常高，与电极-酶之间的电子移动反应相比，氧供应速度为限速阶段。因此，本发明的酶电极即使不使用介体也可以得到高电流值，但并不排除使用介体，可以根据需要使用介体。

[0090] 作为介体，具体地说，有以ABTS、WCN为代表的金属氰化物、Os配合物等。这些介体优选固定在电极表面上，因此优选与聚-1-乙烯基咪唑那样的聚合物结合而使之不溶解来使用。另外，还可以将介体直接固定在碳载体上。这些介体可以单独使用，或者可以2种以上组合使用。

[0091] 此外，本发明所涉及的酶电极在载体为片状时，可以直接以使酶(以及根据需要的介体)担载在电子传导性载体表面的状态使用。另一方面，在载体为粉末状时，可以将担载了酶的载体进一步固定在适当金属电极(例如，铂电极)表面来使用。

[0092] 接着，对于载体所使用的碳多孔体的制造方法进行说明。在碳多孔体之中，中孔碳、炭黑凝胶和含氮炭黑凝胶可以通过以下那样的方法来制造。

[0093] [1.中孔碳的制造方法]

[0094] 对中孔碳粒子的制造方法不特别限制，例如，可以通过以下的方法制造。即，对中孔规则排列的二氧化硅、二氧化钛等多孔粒子(铸型)，吸附、浸渍蔗糖、糠醇等有机分子，然后在惰性气氛下进行碳化。然后，通过氢氟酸、NaOH/EtOH等溶解、除去铸型，结果得到中孔碳粒子。作为铸型，例如，可以使用二氧化硅中孔多孔体MCM-48。

[0095] [2.炭黑凝胶的制造方法]

[0096] 对炭黑凝胶的制造方法不特别限制，例如，可以通过以下那样的方法制造。

[0097] 即，首先依据文献(参考R.W.Pekala，C.T.Alviso，F.M.Kong和S.S.Hunlsey，J.Noncryst.Solids，145卷，90页(1992))所记载的方法合成有机凝胶。即，通过使间苯二酚等酚树脂与甲醛等醛类在碱催化剂或酸催化剂的存在下进行反应，并熟化，从而得到含有酚树脂的有机凝胶。接着，可以通过使得到的有机凝胶干燥，然后在惰性气氛下煅烧而使之碳化，从而得到炭黑凝胶。

[0098] [3.含氮炭黑凝胶的制造方法]

[0099] 对制造含氮炭黑凝胶的方法不特别限制，例如，可以通过以下那样的方法制造。

[0100] (A)使用一氧化氮在炭黑凝胶中导入N原子的方法。

[0101] 要在炭黑凝胶中导入N原子，例如，可以依据文献(P.Chambrion等，Energy&Fuels，11卷，681-685页(1997))所记载的方法来实施。即，在石英反应管中配置炭黑凝胶，在氦气流下加热到950℃左右。然后将用氦气稀释的NO(浓度1000ppm左右)导入反应管，在600～900°左右的反应温度下进行反应。对该反应所需要的反应时间不特别限制，但如果延长反应时间则进入碳骨架中的氮量增加。

[0102] (B)通过热CVD法在炭黑凝胶表面析出含氮碳的方法。

[0103] 该方法是在炭黑凝胶的细孔内导入含氮有机化合物，通过使该含氮有机化合物热分解来在炭黑凝胶表面析出含氮碳的方法。即，首先，在反应管中设置炭黑凝胶，一边将氮气、氩气等惰性气体导入反应管，一边加热到规定温度。接着，维持加热状态不变，通过将气态的含氮有机化合物导入反应管，从而在炭黑凝胶的细孔内导入含氮有机化合物，同时进行规定时间的CVD反应。由此，可以在炭黑凝胶的细孔内析出由C原子和N原子形成骨架的含氮碳。利用热CVD法进行的析出工序，因为在反应气氛为氧化气氛的情况下发生碳燃烧，所以通常在氮气、氩气等惰性气氛下进行。

[0104] 作为这里所使用的含氮有机化合物，只要是含有N原子的有机化合物即可，不特别限制，可列举例如，含氮杂环式化合物、胺类、亚胺类、腈类等。作为含氮杂环式化合物，可列举含氮单环化合物和含氮稠环化合物。

[0105] 作为含氮单环化合物，可列举作为5元环化合物的吡咯及其衍生物，吡唑、咪唑等二唑类及其衍生物；以及作为6元环化合物的吡啶及其衍生物，哒嗪、嘧啶、吡嗪等二嗪类及其衍生物，三嗪类以及三聚氰胺、氰尿酸等三嗪类衍生物等。

[0106] 另外，作为含氮稠环化合物，可列举喹啉、菲咯啉、嘌呤等。

[0107] 作为胺类，可列举伯～叔胺、二胺类、三胺类、多胺类和氨基化合物等。

[0108] 作为伯～叔胺，可列举甲胺、乙胺、二甲胺和三甲胺等脂肪族胺；以及苯胺等芳香族胺及其衍生物等。

[0109] 作为氨基化合物，可列举乙醇胺等氨基醇等。

[0110] 作为亚胺类，可列举吡咯烷和氮丙啶等。

[0111] 作为腈类，可列举乙腈等脂肪族腈和苄腈等芳香族腈等。

[0112] 作为其它含氮有机化合物，可列举尼龙等聚酰胺类、半乳糖胺等氨基糖、聚丙烯腈糖的含氮高分子化合物、氨基酸和聚酰亚胺类等。

[0113] 在利用热CVD法进行的析出工序中，当含氮有机化合物在常温下为液态时，可以使用扩散器、质量流泵等，通过蒸气蒸发将含氮有机化合物制成气态而导入反应管内。另外，这时优选使用氮气、氩气等作为载气来导入气态的含氮有机化合物。进而，优选通过在反应管出口侧设置加入了液体石蜡等的扩散器等来防止逆流，使得曾在反应管内流通的气体不从反应管的出口侧逆流。

[0114] 当含氮有机化合物在常温下为固态时，可以在反应管入口侧设置加热蒸发(升华)器，从而通过加热将含氮有机化合物制成气态导入反应管。另外，这时必须将蒸发器的温度调整到含氮有机化合物不热分解的温度。

[0115] 在含氮有机化合物具有聚合性的情况下，可以采取预先使之在炭黑凝胶的细孔内聚合，然后在反应管中、在惰性气氛下进行热分解的方法。

[0116] 进而，在含氮有机化合物不因加热而气化的情况下，可以通过溶液吸附法、蒸发干固法等预先在炭黑凝胶的细孔内导入含氮有机化合物，通过将它们在惰性气氛下进行热分解，从而使炭黑凝胶的细孔内析出含氮碳。

[0117] 利用热CVD法进行的析出工序中的反应温度，只要是含氮有机化合物热分解和碳化的温度即可，不特别限制，优选为300～1000℃。反应温度更优选为500～700℃。当反应温度不足300℃时，由于含氮有机化合物难以发生热分解，故而有含氮碳的析出速度减慢，反应时间和能量消耗增大的倾向。另一方面，当温度超过1000℃时，由于碳骨架中难以残留碳，故而N/C比降低。

[0118] 在析出工序中，对在炭黑凝胶的细孔内析出的含氮碳的析出量不特别限制，优选2
在以每克炭黑凝胶的比表面积为Ym 的情况下，为(0.0001×Y)g以上。在含氮有机化合物的析出量不足(0.0001×Y)的情况下，由于析出量较少，故而有可能不能通过N原子提高吸附性。

[0119] 析出量与CVD反应时间是相关关系，可以通过调整CVD反应时间来控制析出量。进而，析出量根据CVD反应温度、炭黑凝胶的种类、含氮有机化合物的种类和导入含氮有机化合物时的流量等不同而变化，但在各种情况下可以通过适当调整CVD反应时间来调整析出量。

[0120] 接着，对本发明所涉及的酶电极的制造方法进行说明。

[0121] 首先，在碳多孔体的表面担载酶。对酶的担载方法不特别限制，可以使用升华法、浸渍法等各种方法，但优选浸渍法。

[0122] 通过浸渍法来担载酶如下地进行。即，首先，使酶溶解到水或缓冲液中使得其为不生成沉淀的浓度(优选为0.1～1000mg/ml)。然后，在该溶液不冻结、并且酶不变性的温度(优选为0～50℃)下，在其中悬浮粉末状的载体，或使其浸渍片状的载体中，从而使酶与载体接触。接触时间优选为至少5分钟以上，更优选为30分钟以上。从而在载体的表面或细孔内固定酶。

[0123] 对在溶液中悬浮载体时的浓度不特别限制，优选为0.1～1000mg/ml左右。另外，在担载工序之后，可以进一步有通过进行离心分离等来将载体与溶液分离而取出的工序。或者，可以通过进行干燥等来除去液体成分。

[0124] 对在载体上担载介体的方法，可以使用与在载体上担载酶的方法相同的方法。还可以在载体上同时担载酶与电子移动介体。

[0125] 接着，对本发明所涉及的电极催化剂和酶电极的作用进行说明。

[0126] 图1显示一种作为多铜氧化酶的来自大肠杆菌的CueO的分子结构(Sue A.Roberts等，PNAS，99卷(2002年)，2766-2771页)。如图1所示，蛋白质的立体结构中，具有作为电子传递门而发挥作用的单核蓝铜(I型Cu)、和作为活性中心的三核铜簇(II型Cu、III型Cu)，单核蓝铜与三核铜簇分别处于不同开口部的内部(片冈邦重，生化学，第77卷(2005年)，第148页～第153页)。并且，2个开口部分别处于由蛋白质形成的立体结构的表面和里面。而且，天然型CueO，其单核蓝铜的上部被称为螺旋5的螺旋状分子覆盖。

[0127] 如果使用这样的CueO作为酶电极用的电极催化剂，则可得到高于现有的氧化还原酶的电流密度。

[0128] 其详细原因不清楚，但认为由于以下原因。

[0129] (1)由于CueO的酶分子中，催化氧化反应的活性中心与电子传递门分离，故而即使将酶固定在电极固体表面也能同时完成催化反应和电子传递。

[0130] (2)因为CueO中电子传递门更接近分子表面，所以在固定于固体表面的状态下，电子传递门与电极之间的距离减小，故而电子移动效率提高。

[0131] 另外，在将CueO固定在载体上的情况下，如果使用具有规定的细孔径、细孔分布和比表面积的碳多孔体，则可得到高电流密度。

[0132] 认为这是由于下述原因(1)和原因(2)：

[0133] 原因(1)因为可以将大多数酶固定在碳多孔体的细孔内，所以载体/酶之间的电子移动变得容易；以及，

[0134] 原因(2)因为蛋白质立体结构的变化被细孔壁抑制，所以减轻了热造成的失活，提高了热稳定性。

[0135] 另外，如果使用炭黑凝胶作为碳多孔体，则可得到高电子传递效率。认为这是由于，具有大量适合担载酶的细孔、细孔相互连接而形成了三维的网络等原因。

[0136] 进而，如果使用含氮炭黑凝胶作为碳多孔体，则可以长时间地维持高电子传递效率。认为这是因为，通过在炭黑凝胶中导入氮而在细孔内壁导入了极性基团，在与蛋白质表面的亲水基团之间生成了氢键等新的结合的缘故。

[0137] 实施例

[0138] (实施例1、比较例1、2)

[0139] [1.试验方法]

[0140] 将来自大肠杆菌的CueO(实施例1)、来自漆树的漆酶(比较例1)、或来自漆斑菌属(Myrotheciumu sp.)的胆红素氧化酶(BOD)(比较例2)溶解在磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)中，调制8μM的酶溶液。

[0141] 使用预先饱和了氧的上述酶溶液，以HOPG(高定向热解石墨)电极作为作用极，通过循环伏安图法(电位：-50～650mV，扫描速度：20mV/秒)，来评价酶与电极之间的直接电子移动特性。对峙电极使用铂电极，参考电极使用银/氯化银电极。

[0142] [2.结果]

[0143] 图2显示循环伏安图。根据图2可知，漆酶(比较例1)和BOD(比较例2)在静止2
状态下0V的氧化电流密度为-500μA/cm 以下，与此相对，来自大肠杆菌的CueO在静止状
2
态下0V的氧化电流密度约为-2000μA/cm。

[0144] (实施例2、3、比较例3、4)

[0145] [1.炭黑凝胶的制作]

[0146] 使5.5g间苯二酚(和光纯药)和26.5mg碳酸钠(和光纯药)溶解在16.9g蒸馏水中，然后加入8.1g的37％甲醛溶液(和光纯药)搅拌混合。混合溶液为淡黄色透明。此外，各成分的摩尔比为间苯二酚∶碳酸钠∶甲醛＝200∶1∶400。

[0147] 接着，在得到的原液中加入水，以体积比计稀释到2倍。将稀释的溶液装入管形瓶中密封，在室温静置24小时，在50℃静置24小时，进而在90℃静置72小时，从而得到水合的有机凝胶。

[0148] 接着，为了除去有机凝胶中的水分，将有机凝胶浸渍在作为交换溶剂的丙酮(和光纯药)中。一将有机凝胶浸渍在丙酮中，有机凝胶中的水分就扩散到丙酮中，从而可以将凝胶中的水分置换成丙酮。水分扩散饱和之后，将丙酮换成新品，将操作重复几次，从而将凝胶中的水分完全置换成丙酮。接着，将浸渍溶剂换成正戊烷(和光纯药)，反复进行溶剂交换-浸渍，直至有机凝胶中的丙酮完全被正戊烷替换。进而，使溶剂置换成正戊烷的有机凝胶风干，从而得到干燥有机凝胶。

[0149] 将得到的干燥有机凝胶在氮气流下(流量300ml/min)、在1000℃进行加热，使有机凝胶碳化。加热时间为6小时。

[0150] [2.酶电极的制作]

[0151] 在含有5％PDVF(聚偏氟乙烯)的NMP(N-甲基吡咯烷酮)溶液中悬浮其量为6.7％的炭黑凝胶(实施例2)或科琴导电碳黑(Ketjen Black)(实施例3)，从而调制浆料，在直径6mm的玻璃碳电极(BAS公司制造，型号：002012)表面上添加上述浆料，通过旋涂(3000rpm)将炭黑载体涂布在电极表面上。通过将得到的碳修饰电极在来自大肠杆菌的CueO水溶液(12.5mg/ml)中在4℃下浸渍1夜，从而将酶固定在碳修饰电极上。

[0152] 另外，按照同样的顺序，将来自漆树的漆酶固定在炭黑凝胶(比较例3)或科琴导电碳黑(比较例4)修饰电极上。

[0153] [3.试验方法]

[0154] 将[2.]所得各种酶电极作为作用电极，利用循环伏安图法(在电位为200～500mV之间进行电流扫描，扫描速度20mV/秒)来评价电极的电特性。对峙电极使用铂，参考电极使用银/氯化银电极。电解质使用饱和了氧的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)。进而，在使电解液和酶电极两者都静止的状态下进行电特性评价。

[0155] [4.结果]

[0156] 图3显示循环伏安图。根据图3可知，与科琴导电碳黑相比，在使用炭黑凝胶的情况下，漆酶、CueO的电流量均增加。特别是，CueO/CG的组合在200mV下的电流密度与漆酶/KB相比，增加到约7倍。

[0157] 以上，对于本发明的实施方式进行了详细说明，但本发明不受上述实施方式任何限制，可以在不脱离本发明的宗旨的范围内进行各种改变。

[0158] 工业可利用性

[0159] 本发明所涉及的电极催化剂可以作为生物传感器、燃料电池等各种电化学器件、太阳能电池等的电极催化剂使用。

[0160] 另外，本发明所涉及的酶电极可以作为生物传感器、燃料电池等各种电化学器件、太阳能电池等的电极使用。

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电极的制造方法-专利编号CN107925053A	2020-05-11	453
气体扩散电极-专利编号CN1831196A	2020-05-11	699
电芬顿电极组-专利编号CN208166642U	2020-05-11	782
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一种增强型复合石墨电极壳及电极-专利编号CN203399332U	2020-05-13	760

电极催化剂和酶电极

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