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一种生物修复材料及其制备方法与应用

阅读：230发布：2021-03-03

IPRDB可以提供一种生物修复材料及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种生物修复材料及其制备方法与应用。本发明生物修复材料，是按如下步骤处理得到的：1)将筋膜用体积百分浓度为1-1.5%的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时；2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72小时；3)接着，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96小时，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8；得到所述生物修复材料；上述处理的温度均为2-8℃。本发明生物修复材料是以天然筋膜为基础，经过一系列独特的处理方法得到的，它对细胞具有良好的亲和力，低免疫原；而且它可以定向神经元沿着纤维的方向有序生长，这对于体内脊髓损伤的恢复是十分重要的。，下面是一种生物修复材料及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1、一种生物修复材料，是按如下步骤处理得到的：1)将筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时；

2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的 Tris-HCl缓冲液处理24-72小时；

3)接着，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96小时，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8；得到所述生物修复材料；

上述处理的温度均为2-8℃。

2、权利要求1所述生物修复材料的制备方法，包括如下步骤：1)将筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时；

2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的 Tris-HCl缓冲液处理24-72小时；

3)接着，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96小时，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8；得到所述生物修复材料；

上述处理的温度均为2-8℃。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述得到的生物修复材料还经过浓度为0.5-1.5mol/L强碱溶液处理5-10分钟。

4、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

5、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述制备步骤包括：1)将筋膜用体积百分浓度为1％的磷酸三丁酯溶液处理48小时，溶剂为 50mmol/LTris-HCl，pH为8；

2)然后，用含有1mol/L NaCl的50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液处理 48小时；

3)接着，用1g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理72小时，所述缓冲液为50mmol/L Tris-HCl，pH为8；

4)以lmol/L NaOH处理5分钟，得到所述生物修复材料；

上述处理的温度均为4℃。

6、根据权利要求2-5任一所述的制备方法，其特征在于：所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。

7、权利要求1所述生物修复材料在体外修复神经元的应用。

说明书全文

技术领域

本发明涉及生物修复材料及其制备方法与应用。

背景技术

脊髓是连接外周与中枢神经系统的桥梁，它将身体的感觉(如痛觉、温度觉、触觉)刺激传导至中枢(大脑)，也将大脑的指令传导到运动肌群而产生随意的运动。另外，还负责一些神经反射。由于各种因素(外伤、炎症、肿瘤等)引起了的脊髓横贯性损害被称为脊髓损伤(SCI)，这种疾病造成了损害平面以下的脊髓神经功能(运动、感觉、括约肌及植物神经功能)的障碍。
如何促进SCI后的神经再生和功能恢复，一直是医学界一大难题。很长一段时间，人们认为受损的中枢神经是无法再生的。直到1981年，神经科学家才在基础研究中证实中枢神经损伤后的神经修复是可能的，然而有效的治疗手段依旧缺乏。常规的手术手段已被证实功效甚微，只能使这些伤者中的极少数人彻底康复。目前公认的最有效的药物只有甲基强的松龙(methylprednisone)，它是一种消炎药物，已被大量的临床实验证实可以使脊髓受损状况减轻，但是它必须在脊髓损伤后立即使用，对于24 小时以后的脊髓病人则效果不佳。这种治疗手段匮乏的状况，在很长时间都没有得到改变。
随着组织工程学科的兴起，许多方法被尝试用来治疗脊髓损伤，如移植方法修复，包括周围神经、胚胎中枢神经、多种细胞都被证实能够改善脊髓损伤部位的微环境，促进损伤脊髓的再生和修复。一些营养因子与药物，如cAMP与NGF等也被证实能促进轴突的长出与延伸。但众所周知，脊髓损伤后很短的时间，在受损部位形成了空洞和疤痕，在这样一个不利的环境下，轴突即使能够生长，但也很难逾越这样的一个障碍。于是人们尝试使用支架材料，在促进轴突延伸的同时，给轴突生长提供支持，如胶原凝胶及一种由poly[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide](PHPMA)为原料的 NeuroGel[2，3]，它们都能够给神经元的生长提供良好的支持，但存在着一个共同问题没有解决，即如何定向这些延伸的轴突。因为在人体内，脊髓神经纤维(轴突)的生长是有方向的，正是这种定向，才使得准确有效的传送神经脉冲。所以在利用各种药物和移植物时，需要专门的指引措施定向神经元生长，否则轴突会无方向性生长，而不能起到准确传送信号的作用。
在这样的需求下，神经导向生物材料应运而生。一般而言，理想的神经导向材料需具备以下几个特点：
(1)有序的结构以定向神经元的生长，并提供足够的细胞生长空间；
(2)良好的生物相容性，即能支持细胞正常生长，并且没有免疫原性；
(3)管状的结构已形成一个相对封闭的空间，保护神经元的生长不受其它细胞的干扰；
(4)具有生物可降解性。
目前，神经导向材料主要由化学合成的材料制成，如poly(lactic-co-glycolic acid)](PLGA)及poly(2-hydroxyethylmethacrylate)(PHEMA)等，但它们存在着细胞相容性不好及易引起免疫排斥的问题。现今用于脊髓损伤修复的胶原支架，主要从酸溶的胶原制备，工艺复杂，步骤较多，而且主要以无序的管状和胶原凝胶为主。
筋膜(aponeurosis)是存在于肌肉表面的保护组织，属于肌腱的延伸部分，它的主要成分与肌腱一样，由I型与III型胶原纤维构成，其宏观图如图1A、图1B(图 1A为筋膜与肌肉相连的内层图，图1B为筋膜与肌肉相连的外层图)。但是，天然的筋膜结构紧密，并不适合于细胞的贴附和生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构有序的生物修复材料及其制备方法。
本发明所提供的生物修复材料，是按如下步骤处理得到的：
1)将筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时；
2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的 Tris-HCl缓冲液处理24-72小时；
3)接着，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96小时，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8；得到所述生物修复材料；
上述处理的温度均为2-8℃。
为了能够进一步改善材料的细胞相容性，得到的生物修复材料还经过浓度为0.5 -1.5mol/L强碱溶液处理5-10分钟。常用强碱有NaOH、KOH等。
步骤1)所述磷酸三丁酯溶液的溶剂通常可选用为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
本发明生物修复材料的优选制备方案，包括如下步骤：
1)将筋膜用体积百分浓度为1％的磷酸三丁酯溶液处理48小时，溶剂为 50mmol/L Tris-HCl，pH为8；
2)然后，用含有1mol/L NaCl的50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液处理 48小时；
3)接着，用1g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理72小时，所述缓冲液为50mmol/L Tris-HCl，pH为8；
4)以1mol/L NaOH处理5分钟，得到所述生物修复材料；
上述处理的温度均为4℃。
为了保证材料的质量，筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。
本发明的另一个目的是提供本发明生物修复材料的应用。
本发明发明人通过实验证实，在体外生长时，神经元可以很好的在本发明生物修复材料上生长，轴突沿着纤维有序生长，并能开始相互连接，可以作为体外修复神经元的材料。
本发明创造性的以天然筋膜为基础，经过一系列独特的处理方法得到一种新型具有有序表面结构的生物修复材料，该材料对细胞具有良好的亲和力，低免疫原；而且它可以定向神经元沿着纤维的方向有序生长，这对于体内脊髓损伤的恢复是十分重要的；此外，该材料可以根据不同需要很容易做出片状、有序管状支架或纤维。其中，由有序纤维构成的管状支架具有很好的应用前景，将胶原纤维填充入管中以后，不仅可以有效的增加神经元生长面积，定向神经元的延伸，而且形成了神经元生长相对封闭的空间，防止非神经类细胞的入侵。

附图说明

图1为筋膜的宏观图；
图2为本发明生物修复材料的照片；
图3为皮层神经元在天然筋膜和本发明生物修复材料上的生长照片。

具体实施方式

实施例1、生物修复材料的制备
一、取材与处理
1、预处理筋膜
取新鲜带有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去离子水冲洗3遍；用镊子和手术刀分离出筋膜，尽量去除内层粘附的肌肉组织，和外层的脂肪等组织。
2、材料制备
将预处理筋膜按如下步骤处理：
1)1％TnBP(磷酸三丁酯)溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，体积百分比)中48 小时；
2)50mM Tris-C1 buffer(pH＝8.0，含有1M NaCl)中处理48小时；
3)1g胰蛋白酶/100ml(50mM Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0)中处理72小时；
4)1M NaOH中处理5分钟，充分清洗直至中性；
冻干，即得到本发明的生物修复材料，命名为apo-collagen。
二、材料的形态
所得apo-collagen为白色片状形态，还可以将其制备为有序的管状或者胶原纤维。apo-collagen的形态图如图2所示，图2a、图2b和图2c分别表示片状的、管状的及纤维状的apo-collagen，标尺长＝1cm；图2d为apo-collagen的扫描电镜照片。由图2表明，apo-collagen保持了天然胶原纤维的结构，其电镜照片显示了它具有有序的表面结构，其粗糙的表面结构也利于细胞的贴附。
实施例2、生物修复材料的制备
按照实施例1的方法预处理筋膜，将预处理筋膜按如下步骤处理：
1)1.5％TnBP溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，体积百分比)中24小时；
2)80mM Tris-C1 buffer(pH＝7.8，含有0.8M NaCl)中处理72小时；
3)0.5g胰蛋白酶/100ml(80mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.8)中处理96小时；
冻干后，即得到本发明的生物修复材料。
材料的特性与实施例1所得材料相同。
实施例3、
按照实施例1的方法预处理筋膜，将预处理筋膜按如下步骤处理：
1)1％TnBP溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，体积百分比)中48小时；
2)100mM Tris-C1 buffer(pH＝8.0，含有1.3M NaCl)中处理24小时；
3)1.4g胰蛋白酶/100ml(30mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0)中处理48小时：
4)0.5M KOH中处理5分钟，充分清洗直至中性；
冻干，即得到本发明的生物修复材料。
材料的特性与实施例1所得材料相同。
实施例4、神经元在apo-collagne上的生长
分离大鼠的皮层神经元，然后分别接种在胶原膜和实施例1所得材料上 (apo-collagen)上，37℃及5％CO2条件下培养，5天后以二醋酸酯荧光素染色，观测培养结果，如图3所示：图3a为皮层神经元在胶原膜上的生长；图3b、图3c和图 3d是皮层神经元在apo-collagen上的生长。
如图3a所示，神经元在胶原膜上轴突生长较少，而且轴突延伸方向很随机；而在apo-collagen上，神经元生长良好，轴突沿着纤维有序生长(图3b)，而且神经元的轴突开始相互连接(图3c、图3d)。

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