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船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法

阅读：1056发布：2021-02-07

IPRDB可以提供船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法；本发明根据船舶压载水的特性，使用3μm和0.22μm微孔滤膜的两级过滤和冷冻固定，加固了微生物在滤膜上的附着，使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理得到的微生物总DNA纯度达到直接进行后续分子生物学研究的需要，提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及变性梯度凝胶电泳(DGGE)，将电泳图进行数字化分析后可判断船舶压载水微生物种群多样性程度，通过将特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，得到压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成，为今后研究船舶压载水及沉积物中微生物多样性与生态功能奠定基础。，下面是船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)收集船舶不同压载舱压载水样品；

2)对船舶压载水样品进行预处理；

3)提取预处理后样品中微生物总DNA；

4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图，判断总DNA提取是否成功；

5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；所述专用引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

6)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，并判断总DNA片段在专用引物的引导下是否扩增成功；

7)将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图，判断船舶压载水微生物种群多样性程度和压载水优势菌群的种类，分析船舶压载水微生物多样性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述不同压载舱为船舶不同空间位置的压载舱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述预处理包括依次使用3μm和0.22μm微孔滤膜进行两级过滤抽取微生物、冷冻固定。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的提取是使用体积质量比为2％十六烷基三甲基溴化铵处理样品后，使用3S DNA Isolation提取试剂盒进行提取。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述PCR扩增所采用的PCR反应体系为：35μLddH2O，5μL含15mmol/L镁离子的10*反应缓冲液，1μL如SEQ ID NO.1所示的上游引物，1μL如SEQ ID NO.2所示的下游引物，5μL脱氧核糖核酸，1μL Taq酶，

2μL模板；PCR扩增程序为：起始95℃预变性5min，94℃变性1min，65℃退火1min，72℃引物延伸30s，20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃引物延伸30s，15个循环；72℃终延伸8min，得到微生物PCR扩增产物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中所述的变性梯度凝胶电泳包括：在基因突变检测系统上对PCR反应产物进行电泳分离，电泳结束后染色拍照。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中还包括：使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，得到变性梯度凝胶电泳条带强度图，根据每个条带的相对灰度计算细菌群落结构多样性指数H′和均匀度指数J，进而判断船舶压载水微生物种群多样性程度。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中还包括：对获得的变性梯度凝胶电泳分离电泳图电泳谱带的特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成。

说明书全文

船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法

技术领域

[0001] 本发明属于环境微生物分子生态学领域，具体涉及一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法。

背景技术

[0002] 船舶压载水是船舶在空载时为了保持船体稳定性，在起航时压载进船舶压载舱的海水，抵达港口载货时则被排出压载舱。压载水及沉积物的排放是海洋生物在出发港和目的地港之间传播的主要途径，已被世界环保基金(GEF)认定为海洋面临的四大威胁之一。

[0003] 船舶到港装货的同时将卸载压载水，同时对压载舱清理，由于压载舱的特殊结构，不能达到彻底清理，随船舶每次压载当地新鲜海水，带入压载舱的生物和非生物组成多样，压载水沉积物随着压载水的排入排出长期积累沉降。压载舱作为船舶存放压载水的特殊舱室，其结构复杂，压载舱内无光、缺氧、有的还可能含有有害物质，对生物的生存是极为不利的，大部分生物无法忍受压载舱中的恶劣环境而死亡，大量不能适应压载舱环境的生物死亡后，其尸体下沉落入舱底，给食腐生物提供了食物来源。由于船舶具有高的表面积与体积比，大面积的微生物附着在其表面，所以压载舱成了微生物的避难所，这种情况被称作“船体内部污垢”。目前通过船舶压载水和沉积物的排放，有害微生物可能在港口国之间传播，致病微生物可能会对环境内生物和人造成威胁，现阶段船舶压载水和沉积物中微生物生存状态并未完全探究，微生物的多样性还不明了。

[0004] 目前国内压载水微生物多样性的研究主要是在港口调查停靠船舶压载水中细菌总数、大肠菌群等卫生指示菌和某些致病菌。利用分子生物学手段对船舶压载水中微生物进行研究还未完全展开，而微生物DNA提取作为分子生物学手段进行分析的第一步也是最重要的一步，其方法的研究还未见报道。

[0005] 变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。变性梯度凝胶电泳(DGGE)是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16SrRNA和18SrRNA等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开。由于变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所运用PCR-DGGE技术可以对环境样品中的微生物多样性进行研究。

[0006] 压载舱结构和压载水配给规律导致船舶压载水的物理、化学性质与河水、海水和环境污水存在高度差异，微生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样品在进行微生物群落构成分析时存在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行船舶压载水微生物多样性研究的相关报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法；本发明根据船舶压载水的特性，使用3μm和0.22μm微孔滤膜的两级过滤和冷冻固定，加固了微生物在滤膜上的附着，使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理，去除对DNA提取造成影响的物质，使得微生物总DNA的纯度达到直接进行后续分子生物学研究的需要，提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及变性梯度凝胶电泳，使用QuantityOne软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，判断船舶压载水微生物种群多样性程度，通过对特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成。

[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0009] 本发明提供了一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法，该方法包括以下步骤：

[0010] 1)收集船舶不同压载舱压载水样品；

[0011] 2)对船舶压载水样品进行预处理；

[0012] 3)提取预处理后样品中微生物总DNA；

[0013] 4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图，判断总DNA提取是否成功；

[0014] 5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；所述专用引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

[0015] 上游引物357F-GC(SEQ IDNO.1)：

[0016] 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，[0017] 和下游引物518R(SEQ ID NO.2)：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；

[0018] 6)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，并判断总DNA片段在专用引物的引导下是否扩增成功；

[0019] 7)将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图，判断船舶压载水微生物种群多样性程度和压载水优势菌群的种类，分析船舶压载水微生物多样性。

[0020] 优选地，步骤1)中所述的不同压载舱为：船舶不同空间位置的压载舱。

[0021] 优选地，步骤2)中所述预处理包括：过滤抽取微生物，冷冻固定。具体为：依次使用3μm和0.22μm微孔滤膜进行两级过滤抽取微生物、冷冻固定。

[0022] 优选地，步骤3)中所述的提取方法如下：使用2％(m/v)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理预处理后的样品后，使用3S DNA Isolation提取试剂盒进行提取，操作步骤根据试剂盒的说明进行。

[0023] 优选地，步骤4)中所述对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测包括：用1％的琼脂糖凝胶电泳检测粗提DNA；染色拍照。

[0024] 更优选地，步骤4)中所述的对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测为：以每个样品5μL的上样量，1μL 6×Loadding buffer在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为1×TAE缓冲；电压140V，时间20min；用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图。

[0025] 优选地，步骤5)中所述PCR扩增所采用的PCR反应体系为：35μLddH2O，5uL含15mmol/L镁离子的10*反应缓冲液，1μL上游引物357F-GC(SEQ ID NO.1)，1μL下游引物
518R(SEQ ID NO.2)，5μL脱氧核糖核酸，1μLTaq酶，2μL模板；PCR扩增程序为：起始95℃预变性5min，94℃变性1min，65℃退火1min(每个循环退火温度降低0.5℃)，72℃引物延伸30s，20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃引物延伸30s，15个循环；72℃终延伸8min；4℃保存PCR扩增产物。

[0026] 优选地，步骤6)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测如下：用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；染色拍照。

[0027] 更优选地，步骤6)中所述的对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测为：以每个样品5μL的上样量，1μL 6×Loadding buffer在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为1×TAE缓冲；电压140V，电泳时间为20min；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

[0028] 优选地，步骤7)中所述的变性梯度凝胶电泳包括：在基因突变检测系统上对PCR反应产物进行电泳分离；电泳结束后染色拍照。

[0029] 更优选地，步骤7)中所述将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳为：制作变性剂梯度为35％～65％、丙烯酰胺强度为8％的凝胶；组装放入含有1×TAE缓冲液的电泳槽中，预热到60℃；每孔加入30μL的PCR反应产物和15μL的6×Loadding buffer；接通电泳电源，在160V、60℃条件下电泳16h；电泳结束后，小心取出凝胶，EB避光染色20min，在清水中退染20min，然后用凝胶成像系统观察结果并拍照，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图。

[0030] 优选地，步骤7)中还包括：使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，得到变性梯度凝胶电泳条带强度图，根据每个条带的相对灰度计算细菌群落结构多样性指数H′和均匀度指数J，进而判断出船舶压载水微生物种群多样性程度。

[0031] 优选地，步骤7)中还包括：对获得的变性梯度凝胶电泳分离电泳图电泳谱带的特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成。

[0032] 更优选地，本发明的船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法包括以下具体步骤：

[0033] 1)收集船舶不同压载舱压载水样品：在船舶的不同压载舱中使用采水器采集压载水，用灭菌蓝口玻璃瓶收集2L样品，4℃保存至样品预处理；

[0034] 2)对船舶压载水样品进行预处理：取压载水样品，经3μm和0.22μm微孔滤膜(滤膜事先灭菌处理)两级过滤后，弃去3μm微孔滤膜，0.22μm微孔滤膜上即压载水微生物；使用灭菌手术镊子，将0.22μm滤膜转移到1.5mL离心管中，立即放入-80℃冰箱中冷冻4h；取出冷冻后放有微生物滤膜的离心管，使用灭菌手术剪刀和镊子，将0.22μm滤膜剪碎转移到1.5mL灭菌离心管中；

[0035] 3)提取预处理后样品中微生物总DNA：向装有滤膜的离心管内加入200μL 2％(m/v)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，65℃水浴1h；使用3S DNA Isolation提取试剂盒对微生物DNA进行提取，向预处理后的样品中加入200μL Solution SUS，将样品悬浮起来；加入400μL Solution LYS，300mg石英石，盖上离心管盖，在涡旋振荡器上高速剧烈震荡30分钟；用台式离心机，12000r/min，室温离心5min；将上清液完全转移至灭菌1.5mL离心管中，加入120μL Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀；将溶液用1mL TIP全部转移至3S柱内，柱子放入2mL离心管中，不盖离心管盖，室温放置5min；盖上离心管盖，12000r/min，室温离心5min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，加入
600μL Wash Solution，10000r/min，室温离心2min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；重复，将柱子放回同一根离心管中，加入600μL Wash Solution，10000r/min，室温离心2min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，10000r/min，室温离心
2min，以去除残留的Wash Solution；将TE预热到50-55℃，将柱子放入新的1.5mL灭菌离心管中，在柱子中央加入30μL TE，将柱子及收集管放置在50-55℃烘箱中，放置2min，取出后12000r/min，室温离心1min；重复，打开离心管盖，在同一根柱子中央加入30μL TE，放置在50-55℃烘箱中，放置2min，取出后12000r/min，室温离心1min；收集管中的液体即为微生物总DNA；

[0036] 4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测：以每个样品5μL的上样量，1μL6×Loadding buffer在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为1×TAE缓冲；电压140V，时间20min；用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；

[0037] 5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增：专用引物为357F-GC：

[0038] 5 ′ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ′ (SEQ ID NO.1)和518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′(SEQ ID NO.2)；PCR反应体系为：35μLddH2O，5μL含15mmol/L镁离子的10*反应缓冲液，1μL上游引物357F-GC，1μL下游引物518R，5μL脱氧核糖核酸，1μLTaq酶，2μL模板；PCR扩增程序为：起始95℃预变性
5min，94℃变性1min，65℃退火1min(每个循环退火温度降低0.5℃)，72℃引物延伸30s，
20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃引物延伸30s，15个循环；72℃终延伸8min；
4℃保存PCR扩增产物；

[0039] 6)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：以每个样品5μL的上样量，1μL6×Loadding buffer在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为
1×TAE缓冲；电压140V，时间20min；上样量为5μL PCR扩增产物，1μL 6×Loadding buffer；用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

[0040] 7)将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳：制作变性剂梯度为35％～65％、丙烯酰胺强度为8％凝胶；组装放入含有1×TAE缓冲液的电泳槽中，预热到60℃；每孔加入30μL的PCR反应产物和15μL6×Loadding buffer；接通电泳电源，在160V、60℃条件下电泳16h；电泳结束后，小心取出凝胶，EB避光染色20min，在清水中退染20min，然后用凝胶成像系统观察结果并拍照，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图。使用QuantityOne软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，判断船舶压载水微生物种群多样性程度，通过对特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成。

[0041] 本发明具有如下有益效果：

[0042] 1、针对船舶压载水的特殊性，利用使用3μm和0.22μm微孔滤膜的两级过滤和冷冻固定，加固了微生物在滤膜上的附着，并使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理，CTAB不仅可用于细胞裂解，还有助于去除腐殖酸，得到的DNA纯度较高，A260/A230可达1.32±0.02。所用方法简单方便，不需经纯化即可用于后续的PCR分析和DGGE分析。

[0043] 2、针对船舶压载水的特殊性，本发明的方法省去了冗长、繁琐的DNA洗涤步骤，节省时间和避免DNA损失，确定了适合于压载水微生物DNA提取的方法，使得操作简便。

[0044] 3、利用本发明方法提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及变性梯度凝胶电泳，使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，得到变性梯度凝胶电泳条带强度图，根据每个条带的相对灰度计算细菌群落结构多样性指数H′和均匀度指数J，进而判断船舶压载水微生物种群多样性程度，并可对变性梯度凝胶电泳谱带的特异条带切胶回收、克隆测序，进行BLAST序列比对，从而确定微生物群落结构组成。

附图说明

[0045] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

[0046] 图1为粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；

[0047] 图2为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

[0048] 图3为变性梯度凝胶电泳分离电泳图(a)和条带强度示意图(b)；

[0049] 图4为细菌群落结构多样性指数(H′)和均匀度指数(J)；

[0050] 图5为变性梯度凝胶电泳特异条带序列比对结果。

具体实施方式

[0051] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0052] 实施例

[0053] 选取船舶，进行采样，取船舶不同空间位置的压载舱的压载水，对细菌的种群结构分析和优势菌群的确定步骤如下

[0054] 1)压载水微生物总DNA提取及检测：

[0055] 在船舶的不同压载舱中使用采水器采集压载水，用灭菌蓝口玻璃瓶收集2L样品，4℃保存；取压载水样品，经3μm和0.22μm微孔滤膜(滤膜事先灭菌处理)两级过滤后，弃去3μm微孔滤膜，0.22μm微孔滤膜上即压载水微生物；使用灭菌手术镊子，将0.22μm滤膜转移到1.5mL离心管中，立即放入-80℃冰箱中冷冻4h；取出冷冻后放有微生物滤膜的离心管，使用灭菌手术剪刀和镊子，将0.22μm滤膜剪碎转移到1.5mL灭菌离心管中；向装有滤膜的离心管内加入200μL 2％(m/v)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，65℃水浴1h；
使用3S DNA Isolation提取试剂盒对微生物DNA进行提取，向经CTAB处理后的样品中加入200μL Solution SUS，将样品悬浮起来；加入400μL Solution LYS和300mg石英石，盖上离心管盖，在涡旋振荡器上高速剧烈震荡30分钟；用台式离心机，12000r/min，室温离心5min；将上清液完全转移至灭菌1.5mL离心管中，加入120μLSolution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀；将溶液用1mL TIP全部转移至3S柱内，柱子放入2mL离心管中，不盖离心管盖，室温放置5min；盖上离心管盖，12000r/min，室温离心5min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，加入600μL Wash Solution，10000r/min，室温离心2min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；重复，将柱子放回同一根离心管中，加入600μL Wash Solution，10000r/min，室温离心2min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，10000r/min，室温离心2min，以去除残留的Wash Solution；将TE预热到
50-55℃，将柱子放入新的1.5mL灭菌离心管中，在柱子中央加入30μL TE，将柱子及收集管放置在50-55℃烘箱中，放置2min，取出后12000r/min，室温离心1min；重复，打开离心管盖，在同一根柱子中央加入30μL TE，放置在50-55℃烘箱中，放置2min，取出后12000r/min，室温离心1min；收集管中的液体即为微生物总DNA。

[0056] 以每个样品5μL的上样量，1μL 6×Loadding buffer在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为1×TAE缓冲；电压140V，时间20min；用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图(见图1)。由图1可知，微生物总DNA片段在染色后呈现光亮，说明DNA提取成功。

[0057] 2)PCR扩增及产物检测：

[0058] 以

[0059] 357F-GC：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(SEQ ID NO.1)和518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′(SEQ IDNO.2)为引物；PCR反应体系：35μLddH20，5uL 10*反应缓冲液(含15mmol/L的镁离子)，1μL上游引物357F-GC，1μL下游引物518R，5μL脱氧核糖核酸，1μLTaq酶，2μL模板；PCR扩增程序为：起始95℃预变性5min，94℃变性1min，65℃退火1min(每个循环退火温度降低0.5℃)，72℃引物延伸30s，20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃引物延伸30s，15个循环；72℃终延伸8min；4℃保存PCR扩增产物；以每个样品5μL的上样量，1μL6×Loadding buffer在
1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为1×TAE缓冲；电压140V，电泳时间为20min；上样量为5μLPCR扩增产物，1μLlording buffer；用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图(见图2)。由图2可知，PCR产物大小在200kb-300kb之间，表明DNA在专用引物引导下完成了16SrDNA的扩增，可用于后续的变性梯度凝胶电泳。

[0060] 3)进行变性梯度凝胶电泳分离及结果表示：

[0061] 制作变性剂梯度为35％～65％、丙烯酰胺强度为8％的凝胶；组装放入含有1×TAE缓冲液的电泳槽中，预热到60℃；每孔加入30μL的PCR反应产物和15μL的
6×Loadding buffer；接通电泳电源，电压160V，温度60℃，时间16h；电泳结束后，小心取出凝胶，EB避光染色20min，在清水中退染20min，然后用凝胶成像系统观察结果并拍照，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图(见图3a)，使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，得到变性梯度凝胶电泳条带强度示意图(见图3b)。由图3a和图3b可知，6个压载水样品在经过DNA提取和特异性扩增，进行变性梯度凝胶电泳后，不同碱基顺序的相同大小的DNA片段得到分离，共得到17个特异条带。

[0062] 4)判断船舶压载水微生物种群多样性程度和确定微生物群落结构组成：

[0063] 使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，根据每个条带的相对灰度计算细菌群落结构多样性指数(H′)和均匀度指数(J)(见图4)。由图4可知，群落多样性指数与均匀度指数呈现反比例，样品2的细菌群落多样性指数最高，均匀度指数最低。在分析微生物种群多样性程度后，使用灭菌手术刀将每一个特异条带割下，分别放置于1.5mL灭菌离心管中，向每个离心管中加入30μL双蒸水，5000r/min，室温离心
1min，静置过夜，送到生物公司进行克隆测序，将碱基序列进行BLAST序列比对，将得到每个特异条带对应的微生物种类，从而确定微生物群落结构组成。由图5可知，每个特异条带代表的微生物种类都经过BLAST序列比对找到了对应的种类名称。

[0064] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

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