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一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法

阅读：1042发布：2020-08-14

IPRDB可以提供一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法，包括以下步骤：菌种活化；制备菌种的悬浊液；分光光度法测定菌种在不同浓度的抗生素胁迫下生长曲线。本发明采用分光光度法测定枯草芽孢杆菌对抗生素的敏感性和耐药性，根据细菌的生长状况与培养液的吸光度成正比，绘制菌种在不同浓度的抗生素下的生长曲线，来确定菌种抗生素的敏感性和耐药性，全过程进行过程为无菌操作，避免杂菌的污染而对实验结果造成影响。，下面是一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 菌种活化；

S2. 制备菌种的悬浊液；

S3. 分光光度法测定菌种在不同浓度的抗生素胁迫下生长曲线。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环境工程功能菌株为枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，抗生素为氯霉素、庆大霉素或利福平中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，菌种活化的方法为：将低温保存的菌种接种至LB固体培养基上，培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，挑取活化后的菌种至LB液体培养基中，震荡培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，配制含有不同浓度的抗生素 LB液体培养，接种菌种的悬浊液，恒温培养，每个浓度都分时段取样，测定吸光值，以吸光值为纵坐标，培养时间为横坐标，对各个浓度的结果绘制曲线，确定抗生素的敏感性和耐药性。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，接种方法为平板划线法。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，挑取是用灼烧冷却后的接种环在超净工作台上进行的接种。

说明书全文

一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种环境工程功能菌株枯草芽孢杆菌对抗生素敏感性和耐药性的确定方法。

背景技术

[0002] 抗生素是生物(包括微生物、植物和动物)在其生命活动过程中所产生的(或由其他方法获得的)有机代谢产物，它能在低微浓度下选择性地抑制或影响其他生物的次级代谢产物及其衍生物。自青霉素发现并使用以来，人类为追求利益的最大化，抗生素便在各个领域广泛使用。我国是抗生素的生产和使用大国，据估计，我国年消耗抗生素达 180 000 t(包括药用和农业用)，人均消耗量是美国的10倍。2003年我国仅青霉素产量就达28 000 t，占世界总产量的60%，土霉素产量10000 t，占世界总产量的 65%，多西环素产量也为世界第一。另有数据显示，我国药物处方中抗生素占70%，与西方国家(占30%) 相比，我国抗生素滥用情况严重。多数抗生素在人和动物体内都不能代谢完全，以原形或活性代谢产物的形式通过粪便排出体外抗生素一旦释放进入环境中，便分布到土壤、水和空气中，并经过吸附、水解、光降解及生物降解等过程产生一系列代谢及降解产物，而这些产物往往具有更大的毒性。

[0003] 抗生素作为抗微生物药物，能直接杀死某些微生物(杀菌作用)或者抑制其活性(抑菌作用)，因此抗生素进入土壤环境后，会扰乱微生物群落的正常秩序，主要表现在对微生物群落结构、功能的影响以及产生污染诱导群落耐性。

[0004] 对于微生物的环境工程，处理对象中所残留的抗生素会对处理效果造成较大影响。目前尚无探究环境工程功能菌株在不同抗生素存在水平的情况下的生长情况的方法，无法探讨抗生素对环境工程功能菌株在实际应用中的限制，严重影响了环境工程功能菌株在实际环境工程应用起到的作用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种确定环境工程功能菌株枯草芽孢杆菌对抗生素敏感性和耐药性的方法。

[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种确定环境工程功能菌株对抗生素敏感性和耐药性的方法，包括以下步骤：
S1. 菌种活化；
S2. 制备菌种的悬浊液；
S3. 分光光度法测定菌种在不同浓度的抗生素胁迫下生长曲线。

[0007] 优选地，所述环境工程功能菌株为枯草芽孢杆菌。

[0008] 优选地，抗生素为氯霉素、庆大霉素或利福平中的一种或几种。

[0009] 优选地，步骤S1中，菌种活化的方法为：将低温保存的菌种接种至LB固体培养基上，培养。

[0010] 优选地，步骤S1中，当菌株为枯草芽孢杆菌时候，在28～32℃培养22～26 h。

[0011] 更优选地，步骤S1中，当菌株为枯草芽孢杆菌时候，在30℃培养24 h。

[0012] 优选地，步骤S1中，接种方法为平板划线法。

[0013] 优选的，步骤S1中，LB固体培养基的配方为：蒸馏水中加入胰蛋白胨9.8～10.2 g/L、酵母提取物4.9～5.1 g/L、NaCl 9.8～10.2g/L和琼脂17.8～18.2 g/L，pH 7.2 7.4，经~高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭菌21 min，注意琼脂在调试完pH值后再进行添加。

[0014] 更优选的，步骤S1中，LB固体培养基的配方为：蒸馏水中加入胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L和琼脂18 g/L，pH 7.2 7.4，经高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭~菌21 min，琼脂在调试完pH值后再进行添加。

[0015] 优选地，步骤S2中，挑取活化后的菌种至LB液体培养基中，震荡培养。

[0016] 优选地，步骤S2中，当菌株为枯草芽孢杆菌时候，150～170 r/min，28～32℃震荡培养10～14 h。

[0017] 更优选地，步骤S2中，当菌株为枯草芽孢杆菌时候，在160 r/min，30℃震荡培养12 h。

[0018] 优选地，步骤S2中，挑取是用灼烧冷却后的接种环在超净工作台上进行的接种。

[0019] 优选的，步骤S2中，LB固体培养基的配方为：蒸馏水中加入胰蛋白胨9.8～10.2 g/L、酵母提取物4.9～5.1 g/L和NaCl 9.8～10.2g/L，pH 7.2 7.4，经高压蒸汽灭菌锅在121 ~℃下灭菌21 min，注意琼脂在调试完pH值后再进行添加。

[0020] 更优选的，步骤S2中，LB固体培养基的配方为：蒸馏水中加入胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L，pH 7.2 7.4，经高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭菌21 min，琼~脂在调试完pH值后再进行添加。

[0021] 优选地，步骤S3中，配制含有不同浓度的抗生素 LB液体培养，接种菌种的悬浊液，恒温培养，每个浓度都分时段取样，测定吸光值，以吸光值为纵坐标，培养时间为横坐标，对各个浓度的结果绘制曲线，确定抗生素的敏感性和耐药性。

[0022] 优选地，步骤S3中，菌种的悬浊液的体积为LB液体培养的1.5～2.5%。

[0023] 更优选地，步骤S3中，菌种的悬浊液的体积为LB液体培养的2%优选地，步骤S3中，每个浓度的抗生素设置至少2个平行重复。

[0024] 优选地，步骤S3中，抗生素的浓度为0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 mg·L-1。

[0025] 优选地，步骤S3中，取样的时间点为开始培养后0、12、24、36、48、72 h。

[0026] 优选地，步骤S3中，测定600 nm的吸光值。

[0027] 优选地，步骤S3中，抗生素先用无菌水配成1000 mg·L-1的母液，分别添加0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml 1000 mg·L-1的氯霉素母液至50 ml -1
LB液体培养基中，配置成氯霉素浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 mg·L 的LB液体培养基。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用分光光度法测定枯草芽孢杆菌对氯霉素、庆大霉素、利福平三种抗生素的敏感性和耐药性，根据细菌的生长状况与培养液的吸光度成正比，绘制枯草芽孢杆菌分别在不同浓度的氯霉素、庆大霉素、利福平三种抗生素下的生长曲线，来确定枯草芽孢杆菌对氯霉素、庆大霉素、利福平三种抗生素的敏感性和耐药性，全过程进行过程为无菌操作，避免杂菌的污染而对实验结果造成影响。

附图说明

[0029] 图1为不同浓度氯霉素对该菌生长量的影响；(◇)代表未添加氯霉素的生长量曲线；(□)代表氯霉素浓度为4 mg·L-1的生长量曲线；(○)代表氯霉素浓度为8 mg·L-1的生长量曲线。

[0030] 图2为不同浓度庆大霉素对该菌生长量的影响；(◇)代表未添加庆大霉素的生长-1量曲线；(□)代表庆大霉素浓度为0.25 mg·L 的生长量曲线；(○)代表庆大霉素浓度为
0.5 mg·L-1的生长量曲线。

[0031] 图3为不同浓度利福平对该菌生长量的影响；(◇)代表未添加利福平的生长量曲线；(□)代表利福平浓度为16 mg·L-1的生长量曲线；(○)代表利福平浓度为32 mg·L-1的生长量曲线。

具体实施方式

[0032] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0033] 实施例1一种确定枯草芽孢杆菌对抗生素敏感性和耐药性的方法一、枯草芽孢杆菌的活化
1、实验操作
S1. LB固体培养基平板的制备
配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂18 g、蒸馏水1 L，pH 7.2 7.4，~
经高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭菌21 min。玻璃培养皿在160 ℃的干热灭菌箱上灭菌2 h。

[0034] 灭菌后将玻璃培养皿和LB固体培养基转移至超净工作台，待玻璃培养皿冷却至室温和LB固体培养基冷却至50 ℃时，在酒精灯附近倒约20 ml LB固体培养基至玻璃培养皿中；S2. 用锡纸包裹从冰箱拿出装有枯草芽孢杆菌的离心管，待温度上升至室温后，转移至超净工作台。在酒精灯旁用烧灼冷却后的接种环蘸取少量菌液在S1配置的平板中划线，后倒置存放于30 ℃的恒温箱培养24 h。

[0035] 二、枯草芽孢杆菌悬浊液的配制1、实验操作
S1. LB液体培养基的配制：配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH 7.2 7.4，量100 ml上述培养基进250 ml锥形瓶，封上锡纸，经高压蒸汽灭菌锅在121 ~
℃下灭菌21 min，后转移至超净工作台，待其冷却至室温。

[0036] S2. 在酒精灯旁用烧灼冷却后的接种环挑取活化后的枯草芽孢杆菌至LB液体培养基中，封上封口膜，在160 r/min，30 ℃的摇床下培养12 h。

[0037] 三、枯草芽孢杆菌在氯霉素胁迫下生长曲线的测定1、实验操作
S1. LB液体培养基的配制：配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH 7.2 7.4，量100 ml上述培养基进250 ml锥形瓶，封上锡纸，经高压蒸汽灭菌锅在121 ~
℃下灭菌21 min，后转移至超净工作台，待其冷却至室温。

[0038] S2. 氯霉素母液配制：氯霉素用无菌水配成1000 mg·L-1的母液S3. 培养基的制备：添加0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml 1000 mg·L-1的氯霉素母液至50 ml LB液体培养基中，配置成氯霉素浓度分别为0、0.25、0.5、1、
2、4、8、16、32、64 mg·L-1的LB液体培养基。

[0039] S4. 在超净工作台中用灭菌后的移液枪吸取1 ml枯草芽孢杆菌悬浊液至上述培养基，封上封口膜后在160 r/min、30℃的摇床上分别培养0、12、24、36、48、72 h，采用紫外分光光度计，设置波长600 nm，测定其光度值，即OD600，，以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，对各个浓度的结果绘制曲线，确定枯草芽孢杆菌对氯霉素敏感性和耐药性。

[0040] 2、实验结果经系列梯度的菌株生长抗性实验，部分选取的数据结果见图1，可以看出当氯霉素浓度低于4 mg·L-1时，菌株生长量基本正常，当大于8 mg·L-1时，生长量基本维持在接种前的水平，即菌株停止生长，将浓度为4 mg·L-1、8 mg·L-1时的数据结果做生长曲线，如图1。

[0041] 四、枯草芽孢杆菌在庆大霉素胁迫下生长曲线的测定1、实验操作
S1. LB液体培养基的配制：配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH 7.2 7.4，量100 ml上述培养基进250 ml锥形瓶，封上锡纸，经高压蒸汽灭菌锅在121 ~
℃下灭菌21 min，后转移至超净工作台，待其冷却至室温。

[0042] S2. 庆大霉素母液配制：庆大霉素用无菌水配成1000 mg·L-1的母液S3. 培养基的制备：添加0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml 1000 mg·L-1的庆大霉素母液至50 ml LB液体培养基中，配置成庆大霉素浓度分别为0、0.25、
0.5、1、2、4、8、16、32、64 mg·L-1的LB液体培养基。

[0043] S4. 在超净工作台中用灭菌后的移液枪吸取1 ml枯草芽孢杆菌悬浊液至上述培养基，封上封口膜后在160 r/min、30℃的摇床上分别培养0、12、24、36、48、72 h，采用紫外分光光度计，设置波长600 nm，测定其光度值，即OD600，，以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，对各个浓度的结果绘制曲线，确定枯草芽孢杆菌对庆大霉素敏感性和耐药性。

[0044] 2、实验结果经系列梯度的菌株生长抗性实验，部分选取的数据结果见图2，可以看出当庆大霉素浓度低于0.25 mg·L-1时，菌株生长量基本正常，当大于0.5 mg·L-1时，生长量基本维持在接种前的水平，及菌株停止生长，将浓度为0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1时的数据结果做生长曲线，如图2。

[0045] 五、枯草芽孢杆菌在利福平胁迫下生长曲线的测定1、实验操作
S1. LB液体培养基的配制：配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH 7.2 7.4，量100 ml上述培养基进250 ml锥形瓶，封上锡纸，经高压蒸汽灭菌锅在121 ~
℃下灭菌21 min，后转移至超净工作台，待其冷却至室温。

[0046] S2. 利福平母液配制：利福平用无菌水配成1000 mg·L-1的母液S3. 培养基的制备：添加0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml 1000 mg·L-1的利福平母液至50 ml LB液体培养基中，配置成利福平浓度分别为0、0.25、0.5、1、
2、4、8、16、32、64 mg·L-1的LB液体培养基。

[0047] S4. 在超净工作台中用灭菌后的移液枪吸取1 ml枯草芽孢杆菌悬浊液至上述培养基，封上封口膜后在160 r/min、30℃的摇床上分别培养0、12、24、36、48、72 h，采用紫外分光光度计，设置波长600 nm，测定其光度值，即OD600，，以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，对各个浓度的结果绘制曲线，确定枯草芽孢杆菌对利福平敏感性和耐药性。

[0048] 二、实验结果经系列梯度的菌株生长抗性实验，部分选取的数据结果见图3，可以看出当利福平浓度低于16 mg·L-1时，菌株生长量基本正常，当大于32 mg·L-1时，生长量基本维持在接种前的水平，即菌株停止生长，将浓度为16 mg·L-1、32 mg·L-1时的数据结果做生长曲线，如图
3。

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