本发明涉及二羟硼烷的肽衍生物，它们的制备方法，含有该类 衍生物的药物组合物以及作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的抑制剂的 用途。

丝氨酸蛋白酶之一的凝血酶是凝结过程中的关键酶，并在静脉 和动脉血栓病理学中起着主要作用，见F.Toti等人(Sang，Throm- bose，Vaisseaux，4，483—494，1992)及T.M.Reilly等人(Blood Coagulation and Fibrinolysis 3.513—517.1992)的文献所示。

与目前的方法相比，抗凝血方法更加有效且更加安全。在临床 研究中表明，凝血酶的直接抑制剂比用肝素有许多优点，但是该类 物质，水蛭素及其同类物(hirulog—1)的缺点是口服给药后无效。

此外，已知含有(D)—Phe—Pro—Arg序列的多肽是凝血酶催 化点的抑制剂(C.Kettner et al，J.Biol Chem，265(30)，18289—18297， 1990)。

具有抗凝血活性的二羟硼烷肽衍生物已在文献中有所披露。特 别可参见专利EP293,881及EP471,651中所述的化合物。进一步 地，M.A.Hussain等指出，AC—(D)—Phe—Pro—Arg—二羟硼烷 (DUP714)是凝血酶抑制剂(Peptides，12，1153—1154，1991)。

因此，合成新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂很有意义，以增加文献 中已知化合物在口服给药时的作用强度，选择性及活性。

明确地说，本发明涉及式(I)化合物 它们的对映异构体，非对映异构体及差向异构体以及和药学上可接 受的酸或碱形成的加成盐。 其中：

R1表示氢原子，直链或支链的C1—C6酰基，直链或支链的C1—

   C6烷氧羰基，苄氧羰基，苯氧羰基或直链或支链的C1—C6烷

   基(未取代的或被一或多个苯基，羧基，直链或支链C1—C6

   烷氧羰基，苯氧羰基，苄氧羰基或吗啉磺酰基所取代的)，或

   为R6SO2基团，其中R6为直链或支链C1—C6烷基，萘基，苯

   基，苄基或吗啉基(萘基，苯基，或苄基本身可任意地被一

   或多个卤原子或直链或支链的C1—C6烷基，直链或支链的

   C1—C6烷氧基，三卤甲基，氨基，烷氨基或二烷氨基所取

   代)， R2表示氢原子或下列基团之一：

—苯基，

—苄基(未取代的或在苯环上被一或多个卤原子或直链或支链

  的C1—C6烷基，直链或支链的C1—C6烷氧基，羟基，氨基，

  硝基或羧基所取代)，

—噻吩甲基，

—吡啶甲基，

—二苯甲基，

—芴基，

—萘甲基，

—苯并环丁基，

—(二环丙甲基)甲基，

—2，3—二氢化茚基，或

—(C3—C7环烷基)甲基， R’2表示氢原子或其它 R2和R’2一起表示C6H5—CH＝， R3表示下列基团之一： 其中： 1≤m≤6

R表示氢原子或直链或支链的C1—C6烷基，

R’表示直链或支链的C1—C6烷基，

X表示硫原子或氨基， R4和R5各自为氢原子或直链或支链C1—C6烷基，

或 形成蒎烷二醇的硼酸酯 A表示下列基团： 其中：

n为1或2，

A2表示苯基，2，3—二氢茚基，C3—C7环烷基(未取代的或被

一或多个直链或支链C1—C6烷基所取代的)，C3—C7—环烯基，

双环[2.1.1]己基或双环[2.2.1]庚基或基团 其中 X和Y是不同的，表示氧或硫原子或NH，或

CH2基团。

本发明还涉及式(I)衍生物的制备方法，其中，具式(II)的 保护氨基酸(其异构体通过常规分离技术已经选择地被分离)： 其中，R’1表示直链或支链的C1—C6酰基，苄基，直链或支链的C1— C6烷氧羰基，苄氧羰基或苯氧羰基，R2和R’2定义同式(I)， 按照W.Konig和R.Geiger(Ber.，103，788，1970)所述肽偶联技 术，与具式(III)的第二个保护氨基酸反应，

             HA-CO2-CH2C6H5    (III) 其中，A的定义同(I)(其异构体通过常规分离技术已经任意地被分 离)，以生成式(IV)化合物， 其中，R’1，R2，R’2和A的定义同上， 其间，酸性功能基通过催化氢化或皂化脱去，以生成式V化合物， 其中，R’1，R2，R’2和A的定义同上 其在1，3—二环己基碳化二亚胺存在下，在无水介质中，与N—羟 基琥珀酰亚胺反应，生成式VI化合物， 其中，R’1，R2，R’2和A的定义同上，Suc代表琥珀酰亚胺基，然后 在碱性介质中式(VI)化合物与式(VII)化合物反应， 其中，R’3表示基团Br—(CH2)m—，其中m的定义同式(I)，R’4和 R’5各自表示直链或支链C1—C6烷基，或 为蒎烷二醇 的硼酸酯，以生成式(VIII)化合物， 其中，R’1，R2，R3，R’2，A，R’4，R’5定义同上，然后其与任意取 代的硫脲或适合于获得一个恰如其分取代的胺衍生物反应，以生成 式(I/a)化合物，即一个具体的式(I)化合物， 其中，R’1，R2，R’2，R’3，A，R’4，R’5，R以及m的定义同上式 (I/a)化合物的末端胺功能基如需要可以脱保护，并且可在惰性介质 中借助于三氯化硼，使之转变为具式(I/b)的二羟硼烷(boronic acid)衍生物，即一个具体的式(I)化合物， 其中，R’1，R2，R’2，A和R3定义同式(I)，式(I/a)或式(I/b) 化合物；其可用常规的纯化技术被任意纯化，如有需要，可用常规 的分离技术将其对映异构体分离，并且如果恰当的话，利用药学上 可接受的酸或碱将其转变为加成盐。

药学上可接受的酸包括：

盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，三氟乙酸，乳酸，丙酮酸， 丙二酸，丁二酸，戊二酸，富马酸，酒石酸，马来酸，柠檬酸，抗 坏血酸，甲磺酸，樟脑酸，草酸及类似的酸，但不仅仅限于此范围。

药学上可接受的碱包括：

氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，但不限于此范围。

根据M.W.Rathke等人(J organomet.Chem.，122，145—149， 1976)所述的方法，由式(IX)化合物，(其中R’4和R’5定义同 上)， 与式(X)有机镁化合物反应， R′3MgCl             (X) 其中R’3定义同上，制得式(XI)化合物： 其中R’3，R’4及R’5定义同上，式(XI)化合物与1，1，1，3，3， 3—六甲基二硅氮烷(HMDS)在正丁基锂存在下进行反应，经酸处 理后得到式(VII)化合物。

也可采用D.S.matteson等人(Organometallics，3，1284—1288， 1984)及W.Rathke等人(J.Biol，Chem.，265(30)，18289—18297， 1990)所述的方法来制得式(XI)化合物。

除了新颖是事实之外，本发明化合物还具有特别良好的药理性 质。

它们是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的强抑制剂，与其它凝血丝氨 酸蛋白酶相比，本发明化合物具有高度的凝血酶选择性，与对照化 合物DUP714相比，经口服给药后它们的活性更强。

这些特性使其可用于治疗稳定性或非稳定性的心绞痛，治疗凝 血源病和/或凝血综合症，治疗或预防心肌梗塞和静脉或动脉凝血。 它们也可与抗血栓剂合用。

本发明还延伸至药物组合物，该组合物中含有至少一个作为活 性成分的式(I)化合物及一或多种惰性的无毒且适当的赋形剂。所 制得的该药物组合物可呈不同的剂型，较好的是片剂，包衣片剂，胶 囊、栓剂，口服悬浮液等等。

所采用的剂量按病人的体质及病情，给药途径，及病人的年龄 和体重来决定。该剂量随每日1—500mg而变，分单次或多次剂量。

用下列实例描述本发明，但不对本发明在任何情况下有所限制。

所采用的起始物是已知的，或是按已知方法制备的起始物。

“制备A”的方法可产生用于制备本发明化合物的合成中间体。

“实例”中所描述的化合物及其中间体的化学结构式均已通过常 用光谱技术确证。 制备A：(＋)—α—蒎烷二醇(R)—1—氨基—4—溴丁基二羟硼酸 酯(boronate)盐酸盐

按照C.Kettner等人(J.Biol.Chem.265(30)，18289—18297， 1990)所描述的方法，可以制得此化合物，即使烯丙基溴与儿茶酚 甲硼烷进行反应，接着用(＋)—α—蒎烷二醇进行酯基转移反应，然 后在二氯甲基锂化物存在下进行同系化反应，(增长一个带氯原子的 碳链)，最后与六甲基二硅氮烷进行反应。 熔点：160℃ 旋光性：[α]D25＝＋16.5°(C＝1％，乙醇) 元素分析：

         C％        H％        N％        Cl％ 计算值       45.88      7.15       3.82       9.67 实测         45.82      7.09       4.13       9.85 实例中应用的缩写如下： AC      代表乙酰基， Fmoc    代表9—芴基甲氧基羰基， Bz      代表苄基， Suc     代表琥珀酰亚胺基， (R)Phe  代表(R)—苯基丙氨酰基残基， Gly     代表甘氨酰残基， BOC     代表叔丁氧羰基， 实施例1：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—

     (N—环戊基)Gly]氨基}—4—(异硫脲基)丁基二羟

     硼酸酯 步骤A：BOC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly—OBZ

采用W.Konig及R.Geiger(Ber.，103，788，1970)提供的肽 连接(DCC/HOBT)技术，以无水二甲基甲酰胺作溶剂，从73mmol 的(N—环戊基)Gly—OBZ和BOC—(R)Phe——OH可以制得所期产 品，其经硅胶柱层析纯化，以97/3的CH2Cl2/乙醇混合物作洗脱液， 可得纯品。 产率：76％ 步骤B：H—(R)Phe—(N—环戊基)Gly—OBZ

置冰浴内，在1小时内将氯化氢气体鼓气泡于31mmol上述步 骤中制得产品的150ml无水乙酸乙酯中，使之脱保护。恢复至室温并 搅拌1小时，蒸发混合物，残渣用乙醚提取并重蒸发。 产率：99％ 步骤C：AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly—OBZ

将5mmol上述步骤中获得的化合物溶于一个含有10ml二恶 烷，5ml水，24ml乙酸酐和25mmolNaHCO3的混合物中，在室温下搅 拌3小时，蒸发后残渣用水/乙酸乙酯混合物提取。有机相用水洗涤， 然后用饱和NaCl洗涤。干燥蒸发后得所需产品。 产率：89％。 步骤D：AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly—OH

将5mmol的上述产品溶于25ml甲醇中，在氢气压力为4kg并有 150mg10％无水Pd/C存在下氢化12小时。过滤掉催化剂，蒸发溶剂 后得所期产品。 步骤E：AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly—OSuc

将4.46mmol上述步骤中获得的产品溶于20ml无水CH2Cl2中， 向其中加入4.46mmol(N—羟基琥珀酰亚胺的50ml无水CH2Cl2溶 液，然后加入4.46mmol二环己基碳化二亚胺的CH2Cl2溶液。混合物 于室温下搅拌12小时，过滤掉形成的二环己基尿素，蒸发后得所期 产品。 步骤F：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N— 环戊基)Gly]氨基}—4—溴丁基二羟硼酸酯

将4mmol制备A中所得的化合物的10ml无水CH2Cl2和4mmol 上述步骤中所得化合物一起置于—20℃下的氩气氛中，向其中滴加 56ml三乙胺，混合物于—20℃下保持30分钟。恢复至室温后，混合 物在氩气氛中搅拌过夜，用乙酸乙酯提取后，依次用水，NaHCO3，水， 0.2NHCl及水洗涤，有机层干燥蒸发。产品经“Sephadex”树脂纯化 得所期化合物。 产率：90％。 步骤G：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

     环戊基)Gly]氨基}—4—(异硫脲基)丁基二羟硼酸酯

将2.4mmol前述步骤中制得的化合物和7.3mmol硫脲的6ml 乙醇溶液一起于室温下搅拌60小时。蒸发溶剂(经“Sephadex”树 脂纯化，以甲醇作洗脱液，得所期产品。 产率：85％ 实施例2：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly]氨

    基}—4—(异硫脲基)丁基二羟硼基乙酸酯(boronic acid

    acetate)

氩气氛下，将2mmol实施例1中所得的化合物的25ml无水 CH2Cl2溶液冷却至-78℃，30分钟内加入8mmolBCl3。将温度升至 0℃，混合物搅拌30分钟，然后加入10ml冰水。搅拌15分钟，恢复 至室温，分出有机层，用10ml水/乙酸(90/10)混合物提取，余下 的水相用醚洗涤，合并水层并蒸发。残渣经Bio—gel纯化，以水/乙 酸(90/10)混合液作洗脱液，生成所期产品，其经过冷冻干燥。产 品的理化分析表明其符合所期的结构。 质谱：FAB+：[M＋甘油—2H2O＋H+]：m/Z＝561 实施例3：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R，S)Phe—

     (N—环戊基)Gly]氨基}—4—(异硫脲基)丁基二羟基

     硼酸酯

采用实施例1所述方法，步骤A中用(N—环己基)Gly—OBZ 代替(N—环戊基)Gly—OBZ，用BOC—(R，S)Phe—OH代替BOC— (R)Phe—OH可以获得所期化合物。 实施例4：1—(R)—{[AC—(R，S)Phe—(N—环己基)Gly]

     氨基}—4—(异硫脲基)丁基二羟硼基乙酸酯

从实施例3所述化合物开始，采用实施例2中所述方法，可以 制得所期化合物。 质谱：FAB+：[M＋甘油—2H2O＋H+]：m/Z＝576 实施例5：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—

     (N—环戊基)Gly]氨基}—4—(异硫脲基)丁基二羟

     硼酸酯

采用实施例1所述方法，在步骤A中用(N—环己基)Gly—OBZ 代替(N—环戊基)Gly—OBZ，可以获得所期化合物。 实施例6：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环己基)Gly]氨

     基}—4—(异硫脲基)丁基二羟硼基乙酸酯

采用实施例2所述方法，从实施例5所述化合物开始，可以获 得所期产品。 质谱：FAB+：[M＋甘油—2H2O＋H+]：m/Z＝576 实施例7：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—

     (N—环戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基

     二羟基硼酸酯

步骤A至F：同实施例1中步骤A至F。 步骤G：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—叠氮基丁基二羟基硼酸酯 步骤H：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—氨基丁基二羟基硼酸酯

步骤G和H中的预期产品是通过专利EP615978中所述方法 获得的。 步骤1：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—(N—甲基氨基)丁基二羟基硼

   酸酯苯磺酸酯

将5.793埃分子筛和3.75ml 40％的甲醛溶液加入1mmol上述 步骤中所得的化合物的20ml无水乙醇溶液中，混合物于室温下搅拌 过夜。过滤后，向醇相中加入1mmol苯磺酸，室温和常压下混合物 于100mg10％Pd/C存在下氢化过夜，过滤催化剂后用Sephadex树 脂纯化，得所需化合物。 步骤J：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羟基硼

   酸酯

采用实施例2中所述的专利EP615978的方法，使上述步骤中 所得的化合物与氨基氰进行反应，得所期产品。 实施例8：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly]氨

     基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羟硼基乙酸酯

采用实施例2所述方法，以实施例7中所述化合物作起始物，得 所期化合物。 质谱：FAB+：[M＋甘油—2H2O＋H+]：m/Z＝559 实施例9：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—

     (N—环己基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基

     二羟硼酸酯

采用实施例7所述方法，以(N—环己基)Gly—OBZ作起始原 料，得所期产品。 实施例10：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环己基)Gly]氨

      基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羟硼基乙酸酯

采用实施例2所述方法，以实施例9中所述化合物作起始物，得 所期产品。 质谱：FAB+：[I+]：[M＋H+]：m/Z＝516 实施例11：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)(3—氨

      基)Phe—(N—环戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基

      胍基)丁基二羟硼酸酯 步骤A：(R，S)(3—硝基)Phe—OH盐酸盐

在无水乙醇介质中，使3—硝基苄基溴与乙酰氨基丙二酸乙酯 进行反应，然后用6NHCl在乙酸存在下对形成的丙二酸二乙酯进行 水解，得到3—硝基苯基丙氨酸。 步骤B：Fmoc—(R)(3—硝基)Phe—OH

将14.4ml 10％的Na2CO3水溶液加入4mmol由上述步骤所得的 化合物中，冷却后，加4mmol Fmoc—Cl。恢复至室温后，混合物搅拌 过夜，然后倾入250ml水中。水相用乙醚洗涤，并用浓盐酸酸化至PH ＝1。过滤所期产品(以外消旋形式存在)，干燥，用HPLC分离异构 体，采用制备柱DAICEL OD(洗脱液：庚烷/异丙醇/三氟乙酸：650/ 350/0.5)。 步骤C：(R)(3—硝基)Phe—OH

在哌啶存在下，上述所得产品在二恶烷介质中脱保护。 步骤D：BOC—(R)(3—硝基)Phe—OH

在碳酸二叔丁酯存在下，上述步骤中获得的产品可以很容易地 被保护。 步骤E：BOC—(R)(3—硝基)Phe—(N—环戊基)Gly—OBZ

采用实施例1步骤A所述方法，以上述步骤中所得产品为原料 可以得所期产品。 步骤F至M：用实施例7步骤B至J所述方法可以获得这些步骤的 所期产品。 实施例12：1—(R)—{[AC—(R)(3—氨基)Phe—(N—环戊

      基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羟硼基

      乙酸酯

采用实施例2所述方法，以实施例11中所述化合物作起始物， 可以获得所期产品。 质谱：FAB+：[I+]：[M＋H+]：m/Z＝517 实施例13：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[吗啉代磺酰基—

      (R)Phe—(N—环戊基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基

      胍基)丁基二羟硼酸酯

采用实施例7所述方法，在步骤A中以吗啉代磺酰基—(R)— Phe—OH代替BOC—(R)Phe—OH，前者在J.Med.Chem.(Vol. 34，NO.7，P.1937，1991)中有描述，得所期产品。 实施例14：1—(R)—{[吗啉代磺酰基—(R)Phe—(N—环戊

基)Gly]氨基}—4—(1N—甲基胍基)丁基二羟硼基

乙酸酯

采用实施例2所述方法，以实施例13中所述化合物为原料，可 以制得所期化合物。 实施例15：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe

      (N—环戊基)Gly]氨基}—4—(亚胺甲基氨基)丁基

      二羟硼酸酯 步骤A至H：这些步骤与实施例7中的步骤A至H一致。 步骤1：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—(亚胺甲基氨基)丁基二羟硼酸

   酯

采用专利PCT/US94/04058所述方法，使亚氨甲酸乙酯盐酸盐 与上述步骤中获得的产品进行反应，即可制得所期产物。 实施例16：1—(R)—{[AC—(R)Ple—(N—环戊基)Gly]氨

      基}—4—(亚胺甲基氨基)丁基二羟硼基乙酸酯

采用实施例2所述方法，以实施例15中所述化合物作起始物， 可以获得所期化合物。 质谱：FAB+：[M＋甘油－2H2O＋H+]：m/Z＝544 实施例17：(＋)—α—蒎烷二醇l—(R)—{[AC—(R)Phe—

      (N—环戊基)Gly]氨基}—4—(N—甲基—N—亚胺甲

      基氨基)丁基二羟硼酸酯 步骤A至I：这些步骤同实施例7中步骤A至I。 步骤J：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—(N—甲基—N—亚胺甲基氨基)

   丁基二羟硼酸酯

采用实施例15中步骤I所述方法，以上述步骤中所述化合物为 起始原料、可以制得所期化合物。 实施例18：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly]氨

      基}—4—(亚胺甲基氨基)丁基二羟硼基乙酸酯

采用实施例2所述方法，以实施例17中所述化合物为起始原 料，得所期产品。 质谱：FAB+：[M＋甘油—2H2O＋H+]：m/Z＝545 实施例19：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—

      (N—环戊基)Gly]氨基}—4[(2—咪唑基)氨基]丁

      基二羟硼酸酯

采用实施例1所述方法，在步骤G中用1—三苯甲基—2—氨基 咪唑代替硫脲，然后进行酸性水解，得所期化合物。 实施例20：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly]氨

基}—4—[(2—咪唑基)氨基]丁基二羟硼基乙酸酯

采用实施例2所述方法，从实施例19中所述化合物出发，可以 制得所期化合物。 质谱：FAB+：[M＋甘油－2H2O＋H+]：m/Z＝555 实施例21：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—

      (N—环戊基)Gly]氨基}—4—[(1—甲基—2—咪唑

      基)硫代]丁基二羟硼酸酯

步骤A至F：这些步骤同实施例1中A至F步骤。 步骤G：(＋)—α—蒎烷二醇1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—

   环戊基)Gly]氨基}—4—[(1—甲基—2—咪唑基)硫

   代]丁基二羟硼酸酯

将2mmol溴衍生物(由步骤F中制得)加到一个含有2mmolNaH和2mmol1—甲基—2—巯基咪唑的10mlDMF溶液中，该溶液预先冷 却至0℃。恢复至室温后，加水。用乙酸乙酯提取，干燥蒸发后得所 需产品。 实施例22：1—(R)—{[AC—(R)Phe—(N—环戊基)Gly]氨

      基}—4—[(1—甲基—2—咪唑基)硫代]丁基二羟硼

      基乙酸酯

采用实施例2所述方法，从实施例21中所述化合物出发，可以 得所期产品。

本发明化合物的药理学研究 实施例23：抗凝血活性，人体凝血酶和凝血酶原时间的测定

在标准量的凝血酶或促凝血酶原激酶钙的存在下，正常的血浆 在指定和固定的时间内凝固的时间分别称作凝血酶时间(TT)和凝 血酶原时间(PT)。收集肘部的静脉血，置于柠檬酸三钠(0.109M) 溶液中，除尽血小板的血浆可以通过血样离心(3000g，15分钟)获 得。

凝血酶时间可以通过Thrombin Prest(Stago)试剂获得，凝血酶 原时间可以通过Neoplastine(Stago)试剂获得。它们可用ST4 (Stago)凝固测量计来自动测定。拮抗剂或溶剂(10l)加入到血浆 (90l)中，然后在37℃下培养2分钟。向其中加入100l凝血酶或200 l促凝血酶原激酶钙，起动秒表。在这些条件下，获得的人对照血浆 的TT值为20秒等级，PT值为12秒等级。抑制剂的活性是通过与 对照相比，其延长这些时间值的能力来评价的。在这些条件下，本 发明化合物可使凝血酶时间和凝血酶原时间延长50倍和更多，测定 了抑制剂的活性，并对使凝固时间加倍的浓度进行了测定(凝血酶 的CTT2及凝血酶原CPT2)。结果列于下表中：     产物     CTP2(μM)     CTT2(μM)     实例2     2.29     0.20     实例4     2.44     0.34     实例6     2.92     0.29     实例8     3.06     0.30     参考：DUP 714     2.63     0.18

实施例24：凝血酶抑制作用及丝氨酸蛋白酶凝固和纤维蛋白溶解抑 制作用

为了评价硼—精氨酸产品对人体凝血酶(Sigma，特定活性 3220NlHU/mg)在体外的抑制活性，将纯化的人类纤维蛋白原(6M， 酶研究实验室)加到指定量(0.7nM)，且预先加有或无待测抑制剂 一起经过培养(20℃，10分钟)的凝血蛋白中。

为了在体外评价这些产品对不同丝氨酸蛋白酶的纤维蛋白溶解 和凝固的选择性，可对下列物质应用同样的实验方案：对纯化的人 体血浆酶(2nM，Stago)；纯化的人体活化蛋白C((2nM，Stago)； 纯化的人体活化因子X(2nM，Calbiochem)；血浆酶原的组织活化剂 (2nM，Calbiochem)，纯化的人类尿激酶(2nM，Choay)；纯化的人体 血浆激肽释放酶，(2nM，Calbiochem)。使用不同的肽对硝基苯胺类 作底物：如用＜Glu—Phe—Lys—PNA(0.50mM，S2403，Kabi)于血 浆酶；用N—Cbo—Arg—Gly—Arg—PNA(0.39mM，S2765，Kabi)于 Xa因子；用＜Glu—Pro—Arg—PNA(0.52mM，S2366，Kabi)于活 化蛋白质C；用H—D—Pro—Phe—Arg—PNA(0.45mM，S2302， Kabi)于激肽释放酶；用H—(D)—lle—Pro—Arg—PNA(0.48mM， S2288，Kabi)于血浆酶原组织活化剂以及用＜Glu—Gly—Arg—PNA (0.56mM，S2444，Kabi)于尿激酶。

抑制剂，酶和底物用同样的缓冲剂稀释(0.10mM磷酸缓冲液， PH＝7.4，含有0.12M NaCl及0.05％的牛白蛋白血清)，然后分散 到体积为501由聚苯乙烯制成的微平皿中。

在20℃下，分别反应5分钟或30分钟后，用分光光度方法对由 于凝血蛋白形成的纤维蛋白及丝氨酸蛋白酶作用而释放的对硝基苯 胺进行测定，所用波长为405nm。

下表给出了在参考物(DUP 714)及实施例2化合物存在下，使 酶活性抑制50％时化合物的浓度，此结果是与没有本发明产品的对 照组相比较的。表中结果显示实施例2化合物抑制凝血酶的作用与 DUP714一样强，但对其他丝氨酸蛋白酶的凝固及纤维蛋白溶解的 抑制作用不及DUP714。因此，化合物2，6，8比DUP714对于凝血 酶来说是一个更具选择性的抑制剂。    凝血酶   血浆酶  tPA 尿激酶   FXa  激钛释   放酶    PCa 参考DUP714     0.55    24  5.3    22    81     6.8    15     例2     0.59  1038  108  2503 ＞100000     164    593     例6     1.75  1261  92  1508  10850     181    467     例8     0.74 ＞33000  395 ＞33000 ＞33000     1076    458 实施例25：体外抗凝血活性的测定

本品经静脉(i.v.)途径给予大鼠

对禁食或未禁食的OFA大鼠用戊巴比妥(60mg/kg.i.p)进行 麻醉。暴露出颈动脉和颈静脉并插入导管，导管用含枸椽酸盐的生 理盐水(1/40)净化。安好导管后，采集1.5cm3的动脉血置于0.109M 构椽酸盐(1/9)中。 —30分钟后静脉给予受试化合物(体积1ml)。 —动脉采血(1.5ml)，然后在1分半，5分钟，15分钟，30分钟，和 60分钟时再进行测试。 —每次采集的1.5ml含枸椽酸盐的生理盐水，再经颈动脉重新注射 给动物。 —将盛血试管在3000g下离心5分钟制备血浆。 —将100l血浆与100l活性脑磷脂进行培养，加入100l钙后测定凝 血现象出现的时间。 -0.25mg/kg的本发明受试化合物可以持续地增加活化脑磷脂时间 (ACT)。结果列于下表，其显示了凝固时间增加的指数。                                   时间/分     1.5     5     15     30     60      例2     2.6     1.8     1.2     1.2     1.1 实施例26：体外抗凝血活性测量

本产品经静脉途径(i.v.)给予狗

禁食的狗给予戊巴比妥(30mg/kg，i.v.)进行麻醉，暴露股动 脉和隐静脉并安上插管。使狗自由呼吸，采血步骤与上述实施例25 中大鼠的采血一致，受试的本发明化合物在0.5mg/kg的剂量下持续 地使活化脑磷脂时间(ACT)增加，观察到的本发明化合物所引起的 ACT的增加在给药60分钟后依然很明显，且其不伴有血小板减少 (见表)     产品(剂量) 时间(分钟)       ACT     增强指数 血小板数范围  (对四组的％)       实例2     (0.5mg/kg)     1.5     5     15     30     60      9.6      3.6      1.9      1.4      1.1      -3      -2       0       0       0 DUP714在0.25mg/kg剂量下所引起ACT的增加可与实施例2化合 物在0.5mg/kg剂量下所引起结果相比。DUP714产生作用的同时伴 有血小板减少20％。 实施例27：体外抗凝血活性的测定

本品经口服途径给药予狗

采集血样后，口服给予本产物。在处理后特定的时间下静脉采 血。制备血浆，进行血小板计数，然后进行凝血酶时间试验。

表中显示实施例2产物在2.5mg/kg的剂量下可以引起TT值 的增加而不改变血小板数。活性是持久的(4小时)。                                时间(小时)     0.5     1     2     4        实例2     1.1     1.6     1.5     1.1

实施例28：药物组合物

制备1000片、每片含10mg(活性成分)的制备配方：

实施例2化合物      10g

羟丙基纤维素       2g

小麦淀粉           10g

乳糖               100g

硬脂酸镁           3g

滑石               3g