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运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法

阅读：1038发布：2020-10-11

IPRDB可以提供运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提出了sgRNA/CRISPRi在非分裂的神经元细胞中进行基因改造中的用途。发明人发现，sgRNA/CRISPRi在神经元中可以阻止靶向基因转录起始，提高单个细胞水平的表型均一性，并呈现卓越的靶向基因的特异性表达沉默。本发明是通过病毒传递CRISPRi策略快速而高效地实现神经元中基因失活，建立原代神经元和动物模型，为神经生物学研究提供灵活而多样的基因操作工具。，下面是运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非分裂的细胞为神经元细胞，任选地，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元，任选地，所述基因改造是通过如下方式实现的：

将无内毒素的sgRNA/CRISPRi表达质粒与pVSVG，psPAX2导入受体细胞，以便获得携带有sgRNA/CRISPRi的慢病毒，所述sgRNA/CRISPRi为靶向基因的sgRNA/CRISPRi；以及利用所述慢病毒感染所述神经元细胞；

任选地，所述受体细胞为HEK 293FT细胞；

任选地，所述导入是PEI介导的。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述基因包括选自Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed的至少之一。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述sgRNA靶向基因转录起始区的上游-

50bp～下游300bp；

任选地，所述sgRNA具有SEQ ID NO:1～15所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；

(2)将退火的所述sgRNA插入到BsmbI消化的所述初始慢病毒质粒，以获得单个sgRNA/CRISPRi的一体化表达质粒。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；

(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件；

(3)通过PCR扩增所述模板质粒，其中，PCR正向引物3’端包括所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物的5’端具有BsmbI识别序列和待插入第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述人源H1启动子序列的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有待插入第二sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；

优选地，所述PCR正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列；

(4)将(3)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得两个sgRNA/CRISPRi表达质粒，优选地，所述聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件紧密连接。

7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第三sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；

(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、人源7SK启动子、第二sgRNA序列插入位点，所述第二sgRNA序列插入位点包含BbsI识别序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、鼠源U6启动子；

(3)将退火的所述第二sgRNA序列插入BbsI消化的所述模板质粒，以获得含有第二sgRNA序列的模板质粒；

(4)通过PCR扩增获得的所述含有第二sgRNA序列的模板质粒；其中，PCR正向引物3’端为所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物的5’端具有BsmbI识别序列和第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述鼠源U6启动子的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有第三sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；

优选地，所述的PCR正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:20或21所示的核苷酸序列；

(5)将(4)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得三个sgRNA/CRISPRi表达质粒；

优选地，所述聚合酶III型转录终止子与人源7SK启动子和鼠源U6启动子紧密连接。

8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，sgRNA/CRISPRi双元表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供第一初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；

(2)提供第二初始慢病毒质粒，依据权利要求5所限定的方法构建单个sgRNA/CRISPRi表达质粒；

(3)通过PCR扩增sgRNA表达框，所述sgRNA表达框包括间隔序列、人源U6启动子、sgRNA序列、sgRNA骨架序列和聚合酶III型转录终止子；

优选地，相邻所述sgRNA表达框之间具有间隔序列；

优选地，所述间隔序列为慢病毒cPPT元件；

优选地，所述的PCR扩增正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:22～31所示的核苷酸序列；

(4)利用Golden Gate克隆方法组装多个sgRNA表达框到所述第二初始慢病毒质粒，获得sgRNA/CRISPRi双元表达质粒。

9.一种构建基因失活模型的方法，其特征在于，利用sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造，以便获得所述基因失活模型；

任选地，所述sgRNA/CRISPRi如权利要求2～8任一项所述限定的，任选地，所述非分裂的细胞为神经元细胞，

任选地，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元，优选地，所述基因失活模型为细胞模型或动物模型。

10.一种基因失活模型，其特征在于，所述基因失活模型为细胞模型，所述基因失活模型是通过权利要求9所述的方法构建获得的。

说明书全文

运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因编辑领域，具体地，本发明涉及sgRNA/CRISPRi在非分裂的神经元细胞中进行基因改造中的用途、快速地构建神经生物学研究的细胞和动物模型的方法。

背景技术

[0002] 来自细菌和古生菌的CRISPR/Cas9系统已被开发为基因组编辑工具，广泛地用于建立转基因细胞株和动物系。在向导RNA(sgRNA)的指引下，Cas9识别特定的目标基因组区域并引入双链断裂缺口(DSB)，随后细胞主要以随机修复方式完成缺口修补。实现精确的基因操作，目前主要依赖于转基因动物操作平台，基因敲除/敲入的效率以及冗长的制作周期仍然限制遗传操作的动物在实验室里更广泛的应用。基于各类病毒工具发展的基因编辑技术，能够在动物出生后的各个阶段，并且在生理及病理状态下实现在体操作，从分子到细胞，从环路到行为，解析基因型/表型关联，探索脑疾病的致病机制，并在此基础上寻求新的有效的治疗策略。

[0003] 单个基因可能在生物学过程中发挥着至关重要的作用之外，很多生命过程需要多基因或者信号通路协作完成。迄今为止，在细胞和动物整体水平阐释多基因复杂精神疾病以及蛋白质复合物的动态功能仍旧是生物学研究中的极大挑战，这对于理解疾病进程和蛋白质互作的全新模式具有重大的意义。

[0004] 大脑中由多种不同类型的神经元组成，它们在生命过程中以及神经疾病进程中发挥着不同的作用。例如多巴胺能，5-羟色胺能，小清蛋白和生长抑素能中间神经元活性的紊乱与精神疾病和神经退行性疾病等密切相关。干扰神经元活动是研究特定神经元亚群以及与之关联的环路/行为变法的重要方法。因而，灵活的特定神经元亚群的基因干扰工具将有助于阐释基因-神经元亚群-环路-行为的模式。

[0005] 本领域中仍然亟需开发简便易行的基因干扰工具，获得单个或者多重基因敲低的，以及特定神经元亚群的细胞或者动物的基因失活的研究模型。

发明内容

[0006] 本申请是基于发明人对以下问题或事实的发现而提出的：

[0007] 一方面，发明人发现，由于神经元随机修复DNA的缘故，在单个神经元水平可能产生多种不一样的基因型/表型变化，例如野生型，嵌合型，完全失活型，甚至功能获得型等。并且，终端分化的神经元具有不可分裂的特性，因而神经元细胞难以像分裂的细胞建立基因型均一的细胞株供研究使用。

[0008] 另一方面，现有技术中，利用不同品系的小鼠杂交获得多重基因失活的神经元或者动物模型的方法，不仅耗费时间和研究经费，而且缺乏靶向任意多重基因组合的灵活多变性。在出生后小鼠直接注射携带CRISPR/Cas9基因编辑系统的病毒，可以获得多重基因失活的细胞或者动物模型，但是它们靶向的多个基因常常呈现多种的嵌合组合失活，并且它们全部同时失活的神经元比例一般不超过20％，因此这样多个基因嵌合组合失活的模式在单细胞水平极有可能产生混淆的表型。

[0009] 发明人通过实验意外地发现，sgRNA/CRISPRi能提高单个神经元水平的表型均一性，在神经元中呈现卓越的靶向基因的特异性基因沉默。

[0010] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

[0011] 为此，在本发明的第一方面，本发明提出了sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造中的用途。发明人发现，sgRNA/CRISPRi在非分裂细胞中可以阻止靶向基因转录起始，提高单个细胞水平的表型均一性，在非分裂细胞中呈现卓越的靶向基因的特异性表达沉默。

[0012] 根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0013] 根据本发明的实施例，所述非分裂的细胞为神经元细胞。利用根据本发明实施例的sgRNA/CRISPRi方法，单个神经元水平的表型更加均一，在神经元中呈现更加卓越的靶向基因的特异性基因沉默。

[0014] 根据本发明的实施例，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元。利用根据本发明实施例的sgRNA/CRISPRi方法，可实现神经元亚群中的靶向基因的表达调控。

[0015] 根据本发明的实施例，所述基因改造是通过如下方式实现的：将无内毒素的sgRNA/CRISPRi表达质粒与pVSVG，psPAX2导入受体细胞，以便获得携带有sgRNA/CRISPRi的慢病毒，所述sgRNA/CRISPRi为靶向基因的sgRNA/CRISPRi；以及利用所述慢病毒感染所述神经元细胞。进而阻止靶向基因转录起始。

[0016] 根据本发明的实施例，所述受体细胞为HEK 293FT细胞。

[0017] 根据本发明的实施例，所述导入是PEI介导的。

[0018] 根据本发明的实施例，所述基因为神经元中表达基因或外源基因。根据本发明的具体实施例，所述基因可以选自Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed的至少之一。

[0019] 根据本发明的实施例，所述sgRNA靶向基因转录起始区附近。

[0020] 根据本发明的具体实施例，所述sgRNA靶向基因转录起始区的上游-50bp～下游300bp。进而sgRNA可以靶向神经元中的单个蛋白质编码基因，阻止靶向基因转录起始，引起基因表达下调，从而进行基因功能性鉴定。

[0021] 根据本发明的实施例，所述sgRNA具有SEQ ID NO:1～15所示的核苷酸序列。具有SEQ ID NO:1～15所示的核苷酸序列的sgRNA靶向Syt1、Vamp2、Stx1a、Snap25、Stx1b、Doc2a、Doc2b以及DsRed，阻止上述基因的表达。

[0022] 根据本发明的实施例，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)将退火的所述sgRNA插入到BsmbI消化的所述初始慢病毒质粒，以获得单个sgRNA/CRISPRi的一体化表达质粒。进而，sgRNA可以靶向神经元中的单个蛋白质编码基因，引起基因表达下调，从而进行基因功能性鉴定。

[0023] 根据本发明的实施例，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件；(3)通过PCR扩增所述模板质粒，其中，PCR正向引物3’端包括所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物5’端具有BsmbI识别序列和待插入第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述人源H1启动子序列的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有带插入第二sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；(4)将(3)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得两个sgRNA/CRISPRi一体化表达质粒。需要说明的是，本申请所述的“骨架序列”为tracrRNA部分，它为crRNA发挥作用提供骨架支持，一般为不变的序列；本申请所述的“第一或者第二sgRNA序列”为靶向目的基因的20bp序列，即crRNA。进而两个sgRNA可以分别靶向两个在功能上有关联的基因，在细胞中同时敲低两个基因，从而对多重基因或者复杂蛋白质机器的协作进行功能鉴定。

[0024] 根据本发明的具体实施例，所述PCR正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列。

[0025] 根据本发明的实施例，所述聚合酶III型转录终止子和人源H1启动子核酸序列元件紧密连接，以减少慢病毒载体容量。

[0026] 根据本发明的实施例，所述sgRNA/CRISPRi表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、第三sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)提供模板质粒，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、人源7SK启动子、第二sgRNA序列插入位点，所述第二sgRNA序列插入位点包含BbsI识别序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、鼠源U6启动子；(3)将退火的所述第二sgRNA序列插入BbsI消化的所述模板质粒，以获得含有第二sgRNA序列的模板质粒；(4)通过PCR扩增获得的含有所述第二sgRNA序列的模板质粒；其中，PCR正向引物3’端为所述第一sgRNA骨架序列的5’端序列，所述PCR正向引物的5’端具有BsmbI识别序列和第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端包括所述鼠源U6启动子的3’端序列，所述PCR反向引物的5’端具有第三sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；(5)将(4)中的PCR扩增产物用BsmbI消化后，与所述初始慢病毒质粒连接，以获得三个sgRNA/CRISPRi一体化表达质粒。需要说明的是，本申请所述的“一体化表达质粒”是指包括两个或者三个不同的pol III启动子驱动不同sgRNA表达，且与dCas9-KRAB在同一载体中，可以直接实现基因敲低。进而，三个sgRNA可以分别靶向三个在功能上有关联的基因，在细胞中同时敲低三个基因，从而对多重基因或者复杂蛋白质机器的协作进行功能鉴定。

[0027] 根据本发明的具体实施例，所述的PCR正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:20或21所示的核苷酸序列。

[0028] 根据本发明的实施例，所述聚合酶III型转录终止子与人源7SK启动子和鼠源U6启动子紧密连接。以减少慢病毒载体容量。

[0029] 根据本发明的实施例，sgRNA/CRISPRi双元表达质粒是通过如下方式获得的：(1)提供第一初始慢病毒质粒，所述初始慢病毒质粒包含顺序连接的EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE核酸序列元件；(2)提供第二初始慢病毒质粒，依据前面所限定的方法构建单个sgRNA/CRISPRi表达质粒；(3)通过PCR扩增sgRNA表达框，所述sgRNA表达框包括间隔序列、人源U6启动子、sgRNA序列、sgRNA骨架序列和聚合酶III型转录终止子；(4)利用Golden Gate克隆方法组装多个sgRNA表达框到所述第二初始慢病毒质粒，获得sgRNA/CRISPRi的双元表达质粒。需要说明的是，本申请所述的“双元表达质粒”是指多个串联的U6启动子驱动不同sgRNA表达，且与dCas9-KRAB在不同载体上，两者必须一起使用才可实现基因敲低。进而多个sgRNA可以分别靶向多个在功能上有关联的基因，在细胞中同时敲低多个基因，从而对多重基因或者复杂蛋白质机器的协作进行功能鉴定。

[0030] 根据本发明的实施例，相邻sgRNA表达框之间具有间隔序列，以降低相互间转录干扰；

[0031] 根据本发明的实施例，所述间隔序列为慢病毒cPPT(Central polypurine tract)元件。它一方面可以增加转导效率和转基因表达；另一方面可以降低多个U6启动子相互间转录干扰。

[0032] 根据本发明的具体实施例，所述的PCR扩增正向引物和反向引物具有SEQ ID NO:22～31所示的核苷酸序列。

[0033] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建基因失活模型的方法。根据本发明的实施例，利用sgRNA/CRISPRi在非分裂的细胞中进行基因改造，以便获得所述基因失活模型。根据本发明实施例的方法可以在非分裂细胞中获得特定基因失活且表型均一的模型。

[0034] 根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0035] 根据本发明的实施例，所述sgRNA/CRISPRi如前所述。

[0036] 根据本发明的实施例，所述非分裂的细胞为神经元细胞。利用根据本发明实施例的方法可以在神经元细胞中获得特定基因失活且表型均一的模型。

[0037] 根据本发明的实施例，所述神经元细胞为兴奋性谷氨酸能神经元或抑制性中间神经元。利用根据本发明实施例的方法可以在特定神经元细胞亚群中获得特定基因失活且表型均一的模型。

[0038] 根据本发明的实施例，所述基因失活模型为细胞模型或动物模型。根据本发明实施例的方法可以采用注射的方式，将前面所述的单个、两个、三个或多个sgRNA/CRISPRi表达质粒通过慢病毒的形式注射到动物如小鼠的大脑中，进而有效获得特定基因失活且表型均一的大脑基因失活动物模型。

[0039] 在本发明的第三方面，本发明提出了一种基因失活模型。根据本发明的实施例，所述基因失活模型为细胞模型，所述基因失活模型是通过前面所述的方法构建获得的。根据本发明的基因失活细胞模型的表型均一，基因失活具有高效和靶向特异性等特点。

[0040] 需要说明的是，本申请所述的“sgRNA/CRISPRi”是sgRNA和CRISPRi技术的合称。其中，sgRNA(single guide RNA)，又称“gRNA”，是单链向导RNA，它是由crRNA和tracrRNA融合成一条RNA链。CRISPRi(CRISPR interference)技术是指无核酸酶活性的dCas9和转录抑制子KRAB嵌合体在sgRNA指引下，结合在基因转录起始位点附近，并最终抑制靶向基因mRNA转录。

[0041] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0042] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0043] 图1是根据本发明实施例的构建单个或者多个sgRNA共表达质粒的方法的流程图，[0044] 其中，a是针对构建单个sgRNA的一体化表达质粒的方法的流程图，

[0045] b是针对构建两个sgRNA的一体化表达质粒的方法的流程图；

[0046] c是针对构建三个sgRNA的一体化表达质粒的方法的流程图；

[0047] 图2是根据本发明实施例的针对构建多个sgRNA的双元表达质粒的方法的流程图；

[0048] 图3是根据本发明实施例的CRISPRi高效地抑制原代神经元中靶向基因的表达的结果图，

[0049] 其中，(a)上，示意CRISPRi基因敲低技术与CRISPR基因敲除技术的原理差异；下，示意本发明中神经元使用的CRISPRi慢病毒质粒的构造。P2A剪切肽完成自体拼接后释放出dCas9-KRAB和EGFP，EGFP可以指示慢病毒感染的神经元，

[0050] (b，c)免疫印迹(b)与半定量分析(c)在感染CRISPRi或者shRNA/RNAi系统慢病毒的神经元中由靶向基因编码的蛋白质相对表达水平。数据展示为平均值±标准误差，n＝3；

[0051] (d)qRT-PCR半定量分析在感染CRISPRi或者shRNA/RNAi系统慢病毒的神经元中由靶向基因转录的mRNA相对表达水平。数据展示为平均值±标准误差，n＝3；

[0052] (e，f)从野生型、CRISPRi敲低和基因挽救的神经元中电生理记录的动作电位诱发的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current，EPSC)的代表性轨迹(e)和EPSC振幅(f)。定量数据展示为箱须图，最上须和最下须分别代表最大值和最小值，箱子代表2.5％，50％和97.5％分位数。非配对t检验(Unpaired Student’s t-test)，*P<0.05；**P<
0.001。

[0053] 图4是根据本发明实施例的CRISPRi在神经元中呈现卓越的靶向基因特异性的表达沉默的结果图，

[0054] 其中，(a，b)时间追踪的免疫印迹(a)与半定量分析(b)在感染靶向Syt1基因的CRISPRi或者shRNA/RNAi系统慢病毒的神经元中Syt1的相对表达水平；

[0055] (c)时间追踪的ChIP-qPCR分析dCas9-KRAB和dCas9靶向Syt1基因座的结合动力学；

[0056] (d)设计靶向Syt1基因的sgRNA突变体用以测试它们结合“错误”的Syt1基因的能力。蓝色核苷酸代表sgRNA中的错配位点；

[0057] (e)ChIP-qPCR分析Syt1sgRNA突变体引导dCas9-KRAB靶向Syt1基因的能力；

[0058] (f)qRT-PCR半定量分析Syt1sgRNA突变体对Syt1基因转录的mRNA相对表达水平的影响；

[0059] (g)免疫印迹与半定量分析Syt1sgRNA突变体对Syt1基因编码的蛋白质相对表达水平的影响；数据展示为平均值±标准误差，n＝3；非配对t检验(Unpaired Student’s t-test)，*P<0.05；**P<0.001。

[0060] (h)差异表达分析CRISPRi在神经元中失活外源DsRed基因表达的特异性。RNA-seq数据来源于两组独立的生物重复样本。

[0061] 图5是根据本发明实施例的基于CRISPRi的条件性失活Syt1能改变小鼠海马齿状回的兴奋性/抑制性平衡的结果图，

[0062] 其中，(a)图示神经元亚型特定的CRISPRi条件性失活系统的组成。小鼠CaMKIIα启动子(pCaMKIIα)和VGAT启动子(pVGAT)分别驱动dCas9-KRAB在谷氨酸能和GABA能神经元中的表达；

[0063] (b)免疫荧光代表图显示CRISPRi慢病毒感染的小鼠海马齿状回区域。EGFP指示感染神经元中dCas9-KRAB高效的表达。比例尺，1mm；

[0064] (c)流程图示意从小鼠大脑中分离纯化dCas9-KRAB表达的神经元；

[0065] (d)qRT-PCR半定量分析Vglut1和Gad1在分选的pCaMKIIα和pVGAT驱动神经元中的mRNA表达水平。数据展示为平均值±标准误差，n＝3；

[0066] (e)在分选的pCaMKIIα和pVGAT驱动神经元中的Syt1的mRNA相对表达水平。数据展示为平均值±标准误差，n＝3；

[0067] (f)免疫印迹分析Syt1在分选的pCaMKIIα(上)和pVGAT(下)驱动dCas9-KRAB表达的神经元中选择性的失活；

[0068] (g)在pCaMKIIα驱动表达dCas9-KRAB的神经元中，电生理记录对照组、CRISPRi介导的Syt1基因敲低和外源Syt1基因挽救的神经元由动作电位诱发的EPSC的代表性轨迹(左上)和EPSC振幅(左下)以及在非慢病毒感染神经元中记录的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic current，IPSC)的代表性轨迹(右上)和IPSC振幅(右下)。EPSC，n＝12-30；IPSC，n＝10-11。定量数据展示为箱须图，最上须和最下须分别代表最大值和最小值，箱子代表2.5％，50％和97.5％分位数；

[0069] (h)在pVGAT驱动表达dCas9-KRAB的神经元中，电生理记录对照组、CRISPRi介导的Syt1基因敲低和外源Syt1基因挽救的神经元由动作电位诱发的IPSC的代表性轨迹(左上)和IPSC振幅(左下)以及在非感染神经元中记录的EPSC的代表性轨迹(右上)和EPSC振幅(右下)。IPSC，n＝13-35；EPSC，n＝10-14。定量数据展示为箱须图，最上须和最下须分别代表最大值和最小值，箱子代表2.5％，50％和97.5％分位数。非配对t检验(Unpaired Student’s t-test)，*P<0.05；**P<0.001。

[0070] 图6是根据本发明实施例的调谐小鼠海马齿状回的兴奋性/抑制性平衡对学习和情感具有不同的效应的结果图，

[0071] 其中，(a)在连续八天的水迷宫(MWM)训练中，小鼠寻找到潜伏平台的平均延迟时间；

[0072] (b)小鼠在水迷宫测试中的代表性轨迹(左)和小鼠在原潜伏平台所在区域以及对应目标象限停留时间(右)；

[0073] (c)小鼠在巴恩斯迷宫测试(BM)中的代表性轨迹(左)以及小鼠在测试阶段定位原始洞和在探索阶段定位新洞的延迟时间；

[0074] (d)小鼠在奖励T迷宫测试(TM)中正确交替的百分比；

[0075] (e)小鼠在关联、变更和听觉的恐惧记忆测试(FC)中的凝滞反应百分比；

[0076] (f)小鼠在旷场实验(OFT)中的代表性轨迹以及在中心区域停留时间；

[0077] (g)小鼠在高架十字迷宫(EPMT)的开放臂停留时间；

[0078] (h)小鼠在悬尾实验(TST)中的静止时间；

[0079] (i)小鼠在强迫游泳实验(FST)中的静止时间。数据展示为平均值±标准误差，n＝8-10；非配对t检验(Unpaired Student’s t-test)，*P<0.05；**P<0.001。

[0080] 图7是根据本发明实施例的在小鼠脑中灵活多样的CRISPRi多重基因敲低策略的结果图，

[0081] 其中，(a)图示一体化和双元CRISPRi载体；

[0082] (b)qRT-PCR半定量分析在多重基因靶向的CRISPRi慢病毒感染原代神经元中靶向基因转录的mRNA相对表达水平；

[0083] (c，d)免疫印迹(c)与半定量分析(d)在多重基因靶向的CRISPRi慢病毒感染原代神经元中靶向基因编码的蛋白质相对表达水平；

[0084] (e)qRT-PCR半定量分析在多重基因靶向的CRISPRi慢病毒感染在体小鼠大脑神经元中靶向基因转录的mRNA相对表达水平。数据展示为平均值±标准误差，n＝3；非配对t检验(Unpaired Student’s t-test)，*P<0.05；**P<0.001。

具体实施方式

[0085] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0086] 本发明提供构建单个或者多个sgRNA共表达质粒的方法，所述sgRNA表达质粒与dCas9-KRAB包装成慢病毒并感染原代神经元或者直接注射进入小鼠大脑中，可以阻止靶向基因转录起始。特别地，设计的sgRNA应当靶向基因转录起始区附近，一般为上游-50bp到下游300bp左右。例如，本发明中，sgRNA可以靶向神经元中的单个蛋白质编码基因，引起基因表达下调，从而进行基因功能性鉴定。再例如，本发明中，两个或者多个sgRNA可以分别靶向两个或者多个在功能上有关联的基因，在细胞中同时敲低两个或者多个基因，从而对多重基因或者复杂蛋白质机器的协作进行功能鉴定。本发明还提供dCas9-KRAB在特定神经元亚群中的表达方法，通过神经元亚型特异的启动子驱动dCas9-KRAB表达，进而下调对应神经元亚群中的靶向基因的表达，例如兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性中间神经元等。

[0087] 根据本发明的一个方面，提供构建单个或者多个sgRNA共表达质粒的方法。

[0088] 根据本发明的具体实施例，参考图1a，针对构建单个sgRNA的一体化表达质粒的方法，包括：

[0089] (1)提供初始慢病毒质粒一，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的人源U6启动子、填充序列、sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE等核酸序列元件。

[0090] (2)通过将退火的sgRNA序列插入到II型(Type IIs)限制性核酸内切酶BsmbI消化的初始慢病毒质粒一，以获得单个sgRNA的一体化表达质粒。

[0091] 根据本发明的具体实施例，参考图1b,针对构建两个sgRNA的一体化表达质粒的方法，包括：

[0092] (3)提供初始慢病毒质粒一，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的第一人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE等核酸序列元件。

[0093] (4)提供模板质粒二，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和第二人源H1启动子。

[0094] (5)通过PCR扩增模板质粒二，扩增序列包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子和第二人源H1启动子序列。其中，PCR正向引物3’端为所述第一sgRNA骨架序列的5’端部分序列，并在其5’端附加BsmbI识别序列和第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端为所述人源H1启动子序列的3’端部分序列，并在其5’端附加第二sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；

[0095] (6)将(5)中的PCR扩增序列用II型限制性核酸内切酶BsmbI消化后，与初始慢病毒质粒一连接，以获得两个sgRNA的一体化表达质粒。

[0096] 根据本发明的具体实施例，参考图1c，针对构建三个sgRNA的一体化表达质粒的方法，包括：

[0097] (7)提供初始慢病毒质粒一，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的第一人源U6启动子、填充序列、第三sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE等核酸序列元件。

[0098] (8)提供模板质粒三，所述模板质粒包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、第二人源7SK启动子、第二sgRNA序列插入位点(含II型限制性核酸内切酶BbsI识别序列)、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、第三鼠源U6启动子。

[0099] (9)通过将退火的第二sgRNA序列插入到II型限制性核酸内切酶BbsI消化的模板质粒三，以获得含有第二sgRNA序列的模板质粒三。

[0100] (10)通过PCR扩增(9)中含有第二sgRNA序列的模板质粒三，扩增序列包括第一sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、第二人源7SK启动子、第二sgRNA序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、第三鼠源U6启动子。其中，PCR正向引物3’端为所述第一sgRNA骨架序列的5’端部分序列，并在其5’端附加BsmbI识别序列和第一sgRNA序列，PCR反向引物3’端为所述鼠源U6启动子序列的3’端部分序列，并在其5’端附加第三sgRNA的反向互补序列和BsmbI识别序列；

[0101] (11)将(10)中的PCR扩增序列用II型限制性核酸内切酶BsmbI消化后，与初始慢病毒质粒一连接，以获得三个sgRNA的一体化表达质粒。

[0102] 根据本发明的具体实施例，参考图2，针对构建多个sgRNA的双元表达质粒的方法，包括：

[0103] (12)提供初始慢病毒质粒四，所述初始慢病毒质粒四包含顺序连接的EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE等核酸序列元件，即dCas9-KRAB表达质粒。

[0104] (13)提供初始慢病毒质粒五，按照(1)和(2)构建单个sgRNA的一体化表达质粒，然后通过PCR扩增间隔序列、人源U6启动子、sgRNA序列、sgRNA骨架序列和聚合酶III型转录终止子，利用Golden Gate克隆方法组装多个sgRNA表达框于慢病毒质粒五，获得多个sgRNA共表达的慢病毒质粒。

[0105] 本发明的另一个方面，提供构建特定神经元亚群中的基因敲低方法。包括：

[0106] (1)提供初始慢病毒质粒一，所述初始慢病毒质粒一包含顺序连接的第一人源U6启动子、填充序列、第二sgRNA骨架序列、聚合酶III型转录终止子、EFS启动子、dCas9-KRAB、核定位信号、P2A、EGFP和WPRE等核酸序列元件。

[0107] (2)限制性内切酶EcoRI和XbaI消化初始慢病毒质粒一，去除原有的EFS启动子。

[0108] (3)PCR扩增神经元亚群特异的启动子，在PCR引物5’端添加初始慢病毒质粒一去除EFS启动子后残余两侧的同源臂和EcoRI/XbaI酶切位点，优选地，同源臂为15-20bp。

[0109] (4)同源重组将扩增的神经元亚群特异的启动子克隆至EcoRI/XbaI消化后的初始慢病毒质粒一，替换原有的EFS启动子。

[0110] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

[0111] 实施例1通过CRISPRi慢病毒感染原代神经元抑制靶向基因的表达

[0112] 首先构建靶向神经元中基因的单个sgRNA/CRISPRi一体化的表达质粒(图1a)，sgRNA序列参见下表1。用II型限制性核酸内切酶BsmbI 37℃酶切消化慢病毒质粒一约1h，电泳回收13kb片段。无DNAase水溶解sgRNA引物至10μM，等体积混匀后室温放置退火5min。按1：4比例混匀酶切后的慢病毒质粒一与退火sgRNA，再加入等体积的Solution I(Takara)，16℃连接1h。转化Stbl3感受态菌株，测序。纯化无内毒素的sgRNA/CRISPRi一体化质粒，然后利用PEI转染HEK 293FT细胞，以pVSVG，psPAX2和sgRNA/CRISPRi(1：1.5：2)包装慢病毒。同时，我们也选取了靶向基因的shRNA/RNAi作为参照，直接购于TRC文库。接着解剖分离初生乳鼠的海马或者皮层组织，胰酶消化，吹打并以单细胞种植在聚赖氨酸包被的
24孔板上。在原代神经元培养后的第三天以感染复数(MOI)为10加入慢病毒，第十四天用RIPA裂解液(50mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl，1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate和0.1％SDS以及蛋白酶抑制剂混合物)裂解细胞，12 000Xg离心15min收集细胞裂解物上清，然后免疫印迹分析靶向基因编码的蛋白质的表达(图3b和3c)或者Trizol提取总RNA(Life Technologies)，反转录cDNA(Life Technologies)，用2X SYBR Green预混液(Bio-Rad)和基因特异性引物(见表2)进行qRT-PCR分析靶向基因转录的mRNA丰度(图
3d)。结果表明无论是从mRNA还是蛋白质表达水平，CRISPRi能高效地抑制靶向基因的表达，抑制水平高达90％。

[0113] 选择实施例1中的高效沉默基因表达的sgRNA，并包装慢病毒。在原代神经元培养后的第三天加入慢病毒，第十五至第十七天电生理记录CRISPRi慢病毒感染原代神经元中动作电位诱发的EPSC以及表达相应外源基因挽救表型的变化(图3e和3f)。因为选取的四个基因参与神经递质释放，它们的功能失活将会抑制神经递质的释放。结果表明CRISPRi能显著的降低靶向基因EPSC振幅。因而，CRISPRi能有效地实现靶向基因的功能完全失活。同时，外源基因挽救实验也证实了CRISPRi靶向基因失活的特异性。

[0114] 表1：靶向神经元中基因的sgRNA序列和shRNA序列。

[0115]

[0116]

[0117]

[0118] 表2:靶向神经元中基因的qRT-PCR引物序列。

[0119]

[0120]

[0121] 实施例2评估CRISPRi系统在原代神经元中抑制靶向基因表达的特异性[0122] CRISPRi抑制基因表达的时间曲线分析。选择实施例1中的高效沉默Syt1表达的Syt1sgRNA2和Syt1shRNA1，包装慢病毒并感染培养三天的原代神经元，然后分别在第五、六、八、十、十二和十四天用RIPA裂解并收集细胞裂解物，免疫印迹分析Syt1随时间变化的表达情况(图4a和4b)。结果表明原代神经元在培养的第八天左右，CRISPRi系统开始发挥抑制基因的功能，并随着时间延长，抑制水平逐渐升高。RNAi系统尽管具有相似的时间抑制曲线，但是它们的抑制水平始终低于CRISPRi系统。

[0123] CRISPRi靶向基因的动力学分析。选择实施例1中的Syt1sgRNA2，包装慢病毒并感染培养三天的原代皮层神经元，然后分别在第五、六、八、十、十二和十四天收集细胞。即首先用1％甲醛交联细胞10分钟，125mM甘氨酸终止5分钟，收集交联后的细胞。然后用1％SDS裂解细胞并用超声波破碎仪将染色质DNA剪切成主峰在200-300bp左右的片段。接着用FLAG抗体4℃孵育过夜富集Syt1sgRNA2/dCas9-KRAB靶向片段，65℃解交联纯化富集的DNA。最后ChIP-qPCR分析CRISPRi系统随时间变化靶向Syt1基因的结合情况(图4c)。结果表明CRISPRi系统靶向基因位点随时间延长使得结合能力不断增强，而且在第八天左右达到最大结合阈值的一半。因而，结合CRISPRi抑制基因表达的时间曲线分析的实验结果，我们推定CRISPRi系统发挥抑制功能需要至少达到半最大结合阈值。

[0124] sgRNA/DNA错配对CRISPRi抑制基因表达的影响。设计了一系列的Syt1sgRNA2突变体(图4d)，包装慢病毒并感染培养三天的原代皮层神经元。第十四天收集1％甲醛交联细胞样品，FLAG抗体富集Syt1sgRNA2突变体的靶向片段，ChIP-qPCR分析sgRNA/DNA错配对Syt1靶位点结合能力的影响(图4e)、以及qRT-PCR分析(图4f)和免疫印迹分析(图4g)错配对Syt1基因表达的影响。结果显示CRISPRi对sgRNA/DNA错配容忍度极低，在错配时，dCas9-KRAB难以以高亲和力靶向基因位点，因而也不会抑制基因表达并产生脱靶效应。

[0125] CRISPRi系统在原代神经元中抑制靶向基因表达的特异性。设计并克隆DsRed基因的sgRNA(见表1)于单个sgRNA/CRISPRi一体化的表达质粒。在培养后三天和五天的原代神经元分别感染慢病毒表达的DsRed sgRNA/dCas9-KRAB和外源的Syn::DsRed。第十四天Trizol提取总RNA，然后送至华大基因建库进行RNA-seq转录测序分析。结果表明靶向DsRed的sgRNA能显著抑制DsRed的mRNA丰度，而对其它基因表达无显著改变。因而CRISPRi系统在原代神经元中具有卓越的靶向基因特异性(图4h)。

[0126] 实施例3利用CRISPRi实现特定神经元亚群中基因的选择性失活

[0127] 本实例利用特定神经元亚型的特异表达的启动子驱动dCas9-KRAB在特定神经元类型中表达，而不在其它类型神经元亚群中表达，实现指定神经元亚群中的靶向基因选择性失活。选择实施例1中的高效沉默基因表达的Syt1sgRNA2，然后将本载体EFS启动子替换成神经元亚型特异的小鼠CamKIIα(兴奋性神经元)或者VGAT(GABA能抑制性神经元)启动子(图5a)。即用PCR引物(表3)扩增小鼠CamKIIα和VGAT启动子，然后一步重组克隆(Vazyme Biotech)至EcoRI/XbaI消化后的一体化Syt1sgRNA2载体，替换原有的EFS启动子。

[0128] 表3:神经元亚型特异的基因表达启动子PCR引物序列。

[0129]

[0130] 将上述质粒包装的靶向兴奋性和GABA能抑制性神经元亚群的1μl慢病毒(1.0X 1010感染单位/ml)立体定位(Bregma)注射进入4周龄小鼠(相对于小鼠前囱注射参数：前后-
2.0mm，左右±1.5mm以及深度-2.5mm)。两周后进行下游实验分析。

[0131] 用4％多聚甲醛心脏灌流注射病毒后的小鼠，用冰冻切片机(Leica,VT1000S)将大脑切片成50μm厚度的脑片。5％正常山羊血清封闭，孵育抗GFP或者Syt1抗体以及相应荧光标记的二抗。结果显示慢病毒能感染大约20％小鼠海马齿状回区域的颗粒细胞(图5b左)。并且，CRISPRi能特异性的失活兴奋性和GABA能抑制性神经元亚群中Syt1的表达(图5b右)。

[0132] 活细胞分选鉴定靶向细胞亚群的特异性以及靶向基因的选择性失活(图5c)。首先用活体灌流液(115mM choline-chloride，2.5mM KCl，1.25mM NaH2PO4，26mM NaHCO3，10mM D-(+)-glucose，8mM MgSO4，1mM L-ascorbate-Na，3mM Na-pyruvate；pH 7.2-7.4)灌流注射病毒后的小鼠并用脑片模具将小鼠大脑切成脑片，然后将它们转移至二元气(95％O2与5％CO2)饱和的EBSS缓冲液(116mM NaCl，5.4mM KCl，26mM NaHCO3，1mM NaH2PO4，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，0.5mM EDTA，25mM glucose，1mM cysteine)，接着解剖分离小鼠海马，进一步用含20单位/ml Papain(Sigma)和0.005％DNase I的EBSS缓冲液在37℃消化1小时，始终保持二元气通畅。最后用含1mg/ml ovomucoid，1mg/ml BSA和0.005％DNase I的EBSS缓冲液终止反应，离心去除上清，并将组织块吹打成单细胞悬液，用DAPI/EGFP标记活细胞进行流式分选。利用Smart-seq222技术扩增分选后活细胞中的RNA。

[0133] qRT-PCR检测Vglut1和Gad1分别在流式分选的pCaMKIIα::dCas9-KRAB和pVGAT::dCas9-KRAB感染神经元中的表达(图5d)，qRT-PCR引物序列见表2。结果显示pCaMKIIα::
dCas9-KRAB阳性细胞主要表达兴奋性Vglut1，而pVGAT::dCas9-KRAB主要表达抑制性Gad1。

[0134] qRT-PCR检测Syt1在流式分选的pCaMKIIα::dCas9-KRAB和pVGAT::dCas9-KRAB感染神经元中的表达情况(图5e)。结果显示pCaMKIIα::dCas9-KRAB和pVGAT::dCas9-KRAB阳性细胞中，只有在Syt1sgRNA2存在时能抑制Syt1表达，而对照Scr sgRNA不能改变Syt1表达。

[0135] 免疫印迹分析Syt1在流式分选的pCaMKIIα::dCas9-KRAB和pVGAT::dCas9-KRAB感染神经元中的表达情况(图5f)。结果显示pCaMKIIα::dCas9-KRAB和pVGAT::dCas9-KRAB阳性细胞中，只有在Syt1sgRNA2存在时能抑制Syt1表达，而对照Scr sgRNA不能改变Syt1表达。并且，在pCaMKIIα::dCas9-KRAB和pVGAT::dCas9-KRAB阴性细胞中，Syt1表达都无显著变化。

[0136] 选择实施例1中的高效沉默基因表达的sgRNA，并包装慢病毒。在原代神经元培养后的第三天加入慢病毒，第十五至第十七天电生理记录CRISPRi慢病毒感染原代神经元中动作电位诱发的EPSC以及表达相应外源基因挽救表型的变化(图5g和5h)。结果显示pCaMKIIα::dCas9-KRAB阳性细胞中，相对于Scr sgRNA组，Syt1sgRNA2能减弱EPSC振幅，且能被外源Syt1挽救表型变化；pCaMKIIα::dCas9-KRAB阴性细胞中，IPSC振幅不受影响。另一方面，pVGAT::dCas9-KRAB阳性细胞中，相对于Scr sgRNA组，Syt1sgRNA2能减弱IPSC振幅，且能被外源Syt1挽救表型变化；pVGAT::dCas9-KRAB阴性细胞中，EPSC振幅不受影响。由于整个网络是由兴奋性和抑制性细胞共同构成，所以选择性的失活Syt1在兴奋性和抑制性细胞中的功能，将会扰乱整个神经网络的兴奋/抑制平衡。综上所述，病毒传递CRISPRi系统能用于快速建立神经生物学研究的神经元和动物模型。

[0137] 实施例4评估基于CRISPRi建立的动物模型的生物学功能变化

[0138] 水迷宫实验测试小鼠学习能力(图6a和6b)。在直径为1.2m的圆形池子中注入水(水温24℃，30cm深)，池子四周用不同颜色的形状标记作为参考路标，并且将直径为6cm的逃跑平台放在一个固定的象限中。在训练阶段，将小鼠放入池中1min任其自由寻找逃跑平台，并让其停留平台10s，如果未找到直接将其放在平台10s。每天4次，间隔40min，连续8天训练小鼠。在测试阶段，第9天先撤掉逃跑平台，然后将小鼠放入水池中1min。记录小鼠在逃跑平台区域以及各个象限的停留时间。结果表明在训练阶段，Syt1sgRNA2/pCaMKIIα::dCas9-KRAB小鼠(以下简称pCaMKIIα小鼠)相对于对照小鼠在训练的每一天中都需要更长的时间才能找到逃跑平台；而Syt1sgRNA2/pVGAT::dCas9-KRAB小鼠(以下简称pVGAT小鼠)相对于对照小鼠在训练的每一天中只需要很短的时间就能找到逃跑平台。在测试阶段，pCaMKIIα小鼠在平台区域及其所在象限停留时间较短，而pVGAT小鼠在这些区域的停留时间明显延长。综上，pCaMKIIα小鼠具有较差的学习记忆能力，而pVGAT小鼠学习记忆能力优秀。

[0139] 巴恩斯迷宫实验测试小鼠学习能力(图6c)。将小鼠饥饿处理，达到其正常体重的85％。首先连续2天将小鼠放入巴恩斯迷宫中熟悉环境15min，并用0.2g巧克力奖励小鼠。接着每只小鼠共接受10次寻找食物训练，然后接受5次寻找食物测试。在新洞测试中，小鼠从无标识的洞底座(与训练阶段的巴恩斯迷宫逆转180°)放入，每只小鼠测试5次。记录小鼠寻找到食物并将其放入贮藏洞的所耗时间以及经过路径。实验结果表明在原始洞和新洞测试中pCaMKIIα小鼠需要花费更多的时间以及更远的路程将食物带到贮藏洞中。相反，pVGAT小鼠能寻找更短的路程和花费短时间将食物带到贮藏洞中。

[0140] T迷宫实验测试小鼠学习能力(图6d)。将小鼠饥饿处理，达到其正常体重的85％。首先连续2天将小鼠放入T迷宫中熟悉环境，5min/5次/每天，并用0.2g巧克力奖励小鼠。然后连续8天训练小鼠一次强迫选择以及一次自由选择，两次选择间隔时间20s，每天共训练4次。在测试的第9天，两次选择间隔时间为1min，共测试4次。记录小鼠正确交替的百分比。结果表明pVGAT小鼠能做出更好的正确选择，即拥有优秀的学习记忆能力。

[0141] 恐惧记忆测试小鼠记忆能力(图6e)。在训练阶段，小鼠放入条件恐惧箱6min，然后经历连续两次声音刺激(2 800Hz，75dB，20s)，紧接着给予足部电刺激(0.7mA，2s)，间隔3min。测试第一天，每只小鼠重新放回条件恐惧箱中活动6min，不给予声音刺激。测试第二天，每只小鼠重新放回新的条件恐惧箱中活动熟悉6min，紧接着给予两次20s声音刺激，间隔3min。静止不动即为凝滞反应，表示为凝滞时间占总测试时间的百分比。结果表明相对于对照小鼠，pCaMKIIα小鼠在关联以及听觉暗示条件恐惧中表现出更少的凝滞反应，即学习记忆能力较次；而pVGAT小鼠表现更为突出的学习记忆能力。

[0142] 旷场实验测试小鼠的运动能力以及焦虑样情感(图6f)。将小鼠放入旷场(50cm X 50cm X 40cm)自由活动10min以测量小鼠的运动能力。结果显示pCaMKIIα和pVGAT均在旷场中心区域的停留时间减少。

[0143] 高架十字迷宫测试小鼠的焦虑样情感(图6g)。将小鼠以头部朝向高架十字迷宫开放臂且背对实验者姿势，放置在开放臂与闭合臂交接处，并任其在迷宫中自由活动5min。记录小鼠在开放臂的停留总时间。结果表明pCaMKIIα和pVGAT均在高架十字迷宫开放臂停留时间减少，它们具有焦虑样行为。

[0144] 悬尾实验测试小鼠的抑郁样情感(图6h)。用胶布将小鼠尾部悬起6min，记录小鼠放弃挣扎并保持静止不动状态的时间。结果表明pCaMKIIα和pVGAT小鼠在悬尾实验中静止时间均增加，它们具有抑郁样行为。

[0145] 强迫游泳实验测试小鼠的抑郁样情感(图6i)。将小鼠放入圆柱形水缸中6min，水温维持在23-25℃。记录小鼠在水中停止挣扎，仅将头露出水面漂浮的时间。结果表明pCaMKIIα和pVGAT小鼠在强迫游泳实验中静止时间均增加，它们具有抑郁样行为。

[0146] 实施例5在小鼠脑中灵活多样的CRISPRi多重基因敲低策略

[0147] 构建靶向神经元中基因的两个sgRNA/CRISPRi一体化的表达质粒(图1b和图7a上)，即由串联的人源U6启动子和人源H1启动子独立驱动各自sgRNA表达。首先利用高保真酶PrimeSTAR(Takara)扩增模板质粒二，扩增引物序列参见下表4。然后用II型限制性核酸内切酶BsmbI 37℃酶切消化PCR扩增片段和慢病毒质粒一约1h，电泳回收。最后加入Solution I(Takara)，16℃连接1h。转化Stbl3感受态菌株，测序。获得插入两个sgRNA的一体化CRISPRi表达质粒。

[0148] 构建靶向神经元中基因的三个sgRNA/CRISPRi一体化的表达质粒(图1c和图7a上)，即由串联的人源U6启动子、人源7SK启动子和鼠源U6启动子独立驱动各自sgRNA表达。首先利用II型限制性核酸内切酶BbsI 37℃酶切消化模板质粒三。无DNAase水溶解第二sgRNA引物至10μM，等体积混匀后室温放置退火5min。按1：4比例混匀酶切后的模板质粒三与退火sgRNA，再加入等体积的Solution I(Takara)，16℃连接1h。转化Stbl3感受态菌株，测序以获得在人源7SK启动子后插入第二sgRNA的模板质粒三。然后高保真酶PrimeSTAR(Takara)扩增已插入第二sgRNA的模板质粒三，扩增引物序列参见下表4。然后用II型限制性核酸内切酶BsmbI 37℃酶切消化上一步PCR扩增片段和慢病毒质粒一约1h，电泳回收。最后加入Solution I(Takara)，16℃连接1h。转化Stbl3感受态菌株，测序。获得插入三个sgRNA的一体化CRISPRi表达质粒。

[0149] 构建靶向神经元中基因的五个sgRNA共表达质粒(图2a和图7a下)，即由串联的人源U6启动子独立驱动sgRNA表达，并在紧邻的两个U6/sgRNA表达框之间增加间隔序列以降低相互间转录干扰。首先构建靶向神经元中基因的单个sgRNA/CRISPRi一体化的表达质粒。然后PCR扩增各个单个sgRNA表达质粒，扩增引物序列参见下表4，并且用BsmbI酶切消化PCR扩增的片段。最后用T4连接酶(NEB)连接各个sgRNA表达框于慢病毒质粒五，以获得五个sgRNA共表达的慢病毒质粒，并且将其与dCas9-KRAB表达的慢病毒质粒四联用进而实现多重基因敲低。

[0150] 在HEK293FT细胞中包装靶向多重基因的CRISPRi慢病毒(图7a)。在原代神经元培养后的第三天加入慢病毒，第十四天用Trizol提取总RNA，进行qRT-PCR分析靶向基因转录的mRNA丰度(图7b)，或者用RIPA裂解液收集细胞裂解物上清，然后免疫印迹分析靶向基因编码的蛋白质的表达(图7c和7d)。结果表明在原代培养神经元中，无论是一体化载体还是双元载体策略均能特异地抑制靶向的多个基因(2～5个)的mRNA和蛋白质表达水平，抑制效率与其靶向单个基因的效率相当。

[0151] 同时将两种不同的靶向多重基因的一体化CRISPRi或者双元慢病毒混合物立体定位注射进入四周龄小鼠。两周后，活细胞分选鉴定靶向多重基因的失活情况(图7e)。结果表明与原代培养神经元结果一致，在活体大脑中无论是一体化载体还是双元载体均能特异地抑制靶向的多个基因(2～5个)的mRNA和蛋白质表达水平，抑制效率与原代神经元中靶向单个基因的抑制效率相当。

[0152] 表4:靶向多重基因的sgRNA克隆引物序列。

[0153]

[0154]

[0155] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0156] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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发明人确认方法和发明人确认系统-专利编号CN110136030A	2020-05-11	485
IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用-专利编号CN109781977A	2020-05-13	335
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专利分析中的申请人或发明人合并方法-专利编号CN101685462A	2020-05-12	210
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一种陶艺雕塑工艺台-专利编号CN102092227A	2020-05-12	86
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运用CRISPRi基因敲低技术快速构建急性脑科学研究模型的方法

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