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生物相容性组件

阅读：794发布：2020-05-12

IPRDB可以提供生物相容性组件专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种生物相容性组件，所述生物相容性组件具有用于与活组织接触的表面，其中所述表面包含金属氧化物的颗粒，所述颗粒的平均粒度小于100nm。还提供一种用于制备这样的生物相容性组件的方法。已发现与参考相比，所述生物相容性组件的生物活性增加，这是因为它在体外诱发更早的磷灰石成核。据信，通过所述生物相容性组件，可以在体内诱发早期羟基磷灰石成核并因此促进植入物的骨整合。，下面是生物相容性组件专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种生物相容性组件，所述生物相容性组件具有用于与活组织接触的表面，其中所述表面包含金属氧化物的颗粒，所述颗粒的平均粒度小于100nm。

2.根据权利要求1所述的生物相容性组件，其中所述颗粒的平均粒度小于25nm。

3.根据权利要求1或2所述的生物相容性组件，其中所述颗粒具有最高至40％的通过电喷射-扫描电迁移率粒径谱仪(ES-SMPS)获得的粒度分布。

4.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述颗粒总体上具有球形形状。

5.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述金属氧化物至少部分是晶体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述金属氧化物包括二氧化钛。

7.根据权利要求6所述的生物相容性物品，其中所述二氧化钛的主要形式是锐钛矿。

8.根据权利要求6或7所述的生物相容性组件，其中所述金属氧化物的颗粒包括基本上由二氧化钛组成的颗粒并且任选地还包括基本上由锆、铪、钒、铌、钽、钴或铱的氧化物中的一种或多种组成的颗粒。

9.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述颗粒形成层。

10.根据权利要求9所述的生物相容性组件，其中所述层的厚度在8nm至约1um，典型地50nm至500nm，例如100nm至400nm的范围内。

11.根据权利要求9或10所述的生物相容性组件，其中所述层是所述颗粒的单层。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的生物相容性组件，其中所述层是所述颗粒的连续层。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的生物相容性组件，其中所述层完全覆盖所述表面。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的生物相容性组件，其中所述颗粒在整个所述层中均匀地分布。

15.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述颗粒是非烧结的。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的生物相容性组件，其中所述颗粒中的至少一些是烧结的。

17.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中相比于缺少所述颗粒并且具有由天然金属氧化物覆盖的表面的相应生物相容性组件，所述表面的电化学相对活性表面积(Aaa)为至少1.5，优选至少1.8。

18.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述生物相容性组件包括具有所述表面的基底，所述基底包括金属材料。

19.根据权利要求18所述的生物相容性组件，其中所述金属材料选自钛、锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱，及其合金，并且优选包括钛或钛合金。

20.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中与所述颗粒接触的所述基底的部分包括氧化钛，优选天然氧化钛。

21.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中所述生物相容性组件用于植入到活组织中。

22.根据权利要求21所述的生物相容性组件，其是牙植入物，优选是牙固定器。

23.根据权利要求21所述的生物相容性组件，其是整形外科植入物。

24.根据前述权利要求中任一项所述的生物相容性组件，其中当浸入在模拟体液中时，所述生物相容性组件在12小时内在其表面上诱发羟基磷灰石晶体的成核。

25.一种制备生物相容性组件的方法，所述方法包括：a)提供具有表面的基底；

b)提供金属氧化物的颗粒在溶剂中的分散体，所述颗粒的平均粒度小于100nm；和c)将所述颗粒的分散体涂覆在所述基底的所述表面上。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述颗粒的平均粒度小于25nm。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述颗粒完全分散在所述溶剂中。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述分散体通过旋涂进行涂覆。

29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，所述方法还包括：d)使所述溶剂蒸发。

30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，所述方法还包括：e)烧结所述颗粒。

31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述金属氧化物的颗粒的分散体通过以下方式提供：b-i)在水中进行TiCl4的受控水解以获得胶体分散体；和b-ii)对所述胶体分散体进行透析。

32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述基底包括选自以下各项中的金属：钛、锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱，及其合金。

33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述基底的所述表面包含天然氧化物。

34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述基底体的所述表面在步骤c)之前已经经过粗糙化表面处理，如磨蚀性喷砂和/或化学浸蚀。

35.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述基底体是车削的。

36.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述基底体的所述表面是抛光的。

说明书全文

生物相容性组件

发明领域

[0001] 本发明涉及用于与活细胞或组织接触的生物相容性组件，尤其是用于植入到活组织中的植入物的领域。

[0002] 发明背景

[0003] 牙植入物是用来恢复伴随丧失一颗或多颗牙齿的功能的医疗装置。为了获得长期的成功功能，牙植入物必须被充分地锚固在骨中以承受由例如咀嚼导致的力。用于获得高锚固强度的两个重要因素是i)材料的化学组成和ii)在所有长度范围的植入物设计。不同长度比例上的形貌特征诱发例如对于防止骨质吸收并最终增加骨所需的用于胶原蛋白和矿物质的成核位点，细胞附着和生物机械刺激。

[0004] 目前通常使用的牙植入物由钛或钛合金制成，其具有螺丝形状设计和粗糙的表面。

[0005] 迄今有若干方法用于处理金属植入物如牙钛植入物以获得该植入物的更好固定，以及因此改善的骨整合。这些方法中的一些涉及改变植入物的形态，例如通过在植入物表面产生不规则性以与未处理表面相比增加表面粗糙度。据信，增加的表面粗糙度，其在植入物和骨组织之间给出更大的接触和附着面积，在植入物和骨之间提供更好的机械保持和强度。本领域中已知的是，表面粗糙度可以通过，例如，等离子体喷镀，喷砂或酸浸蚀提供。

[0006] 此外，已知的是，成骨细胞，即，骨形成细胞，感受表面下的多种化学和物理特征并对其有反应。植入物表面处的骨形成需要前体细胞分化成分泌性成骨细胞以产生未矿化的胞外基质(ECM)，以及随后的该基质的钙化，如在例如Anselme K，Osteoblast adhesion on biomaterials(在生物材料上的成骨细胞粘附)，Biomaterials21，667-681(2000)中所述。

[0007] 植入物表面的化学性质的改变经常被用于实现植入物至骨组织的更好附着。若干方法涉及在植入物表面上涂覆陶瓷材料如羟基磷灰石的层，以便改善植入物与骨的结合，因为羟基磷灰石化学上与骨有关。

[0008] 然而，利用包含羟基磷灰石的涂层的共同缺点是，它们可能是易碎的并且可能由于在骨和涂层之间形成比在涂层和植入物之间更强的结合而导致从植入物表面的剥落或折断，这可能导致植入物最终失效。关于蛋白质涂层的使用，其也已经被提出，有额外的方面需要考虑。由于蛋白质的化学性质，具有蛋白质涂层的表面可能需要特定的灭菌和储存条件以保持其生物学活性。此外，宿主组织对生物分子如蛋白质的反应(例如免疫反应)可能是无法预测的。

[0009] 虽然植入物表面的多种物理和化学性质被通常认为是对于材料生物相容性的决定因素，但是新骨形成的机制在分子水平上仍然是未知的。

[0010] 简言之，虽然存在许多现有技术用于改善植入物的骨整合，但是仍需要这样的植入物，其对于骨整合和强的骨-植入物固定的形成提供进一步改善的特性。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明的一个目的是至少部分地克服已知植入物的与新组织形成(尤其是骨和/或骨整合)相关的问题，并且提供生物相容性组件，例如牙植入物的部分，其提供改善的组织-植入物附着。

[0013] 根据本发明的第一方面，这个和其他目的通过具有(被设计成)用于与活组织接触的表面的生物相容性组件实现，其中所述表面包含金属氧化物的颗粒，所述颗粒的平均粒度小于100nm。在本发明的优选实施方案中，所述颗粒的平均粒度小于25nm。

[0014] 本发明的发明人发现，通过在生物相容性组件的表面上提供纳米尺寸的金属氧化物颗粒，由于与参照相比其在体外引发更早的磷灰石成核，所以该生物相容性组件的生物活性增加。

[0015] 在将植入物植入到患者体内后，植入物表面与例如血液接触。存在于血液中的离子被吸引到植入物表面并开始形成小的羟基磷灰石晶体，即称为成核的过程。羟基磷灰石晶体随后有助于将蛋白质和细胞，如成骨细胞，吸引到植入物表面并且建立组织-植入物结合。据信，通过增强组织再生(renereration)速率，本发明的生物相容性组件将在体内引发早期的羟基磷灰石成核并且因此促进骨整合过程。观察到，当被浸入在模拟体液中时，根据本发明的实施方案的生物相容性组件在12小时内诱导了Ca/P比为1.7的磷灰石晶体的形成，这与存在于骨中的天然羟基磷灰石相同。

[0016] 通过在生物相容性组件的表面上涂覆薄的、相对均质的纳米颗粒层，与当涂覆具有相同化学组成和结晶性的非颗粒状(non-particular)层或涂层(其中大块材料性质是更主要的)时相比，获得不同的表面性质。例如已经证明，相比于更大的类似物，小的纳米颗粒具有更高的表面电荷(Zareen Abbas，Christophe Labbez，Sture Nordholm和Elisabet Ahlberg.，J.Phys.Chem.C2008，112，5715-5723)。据信，这会影响磷灰石形成以及蛋白质和细胞在涂有这样的颗粒的表面上的吸附。

[0017] 金属氧化物的纳米尺寸的颗粒可以在生物相容性组件的表面上提供纳米多孔层。所述颗粒可以在表面上紧密充填在一起，产生具有范围分别为0.225*R(对单层)和为0.732*R(对多层)的内在孔隙度的层，R是纳米颗粒的半径。多层，即在垂直于其中存在颗粒的表面的方向上包含超过一个颗粒的层，由于在基本上呈球形的纳米颗粒的充填中的不重合，而可以具有更高的孔隙度。层的多孔性质导致与不具有纳米颗粒的表面相比产生更大的形成的界面面积。此外，纳米颗粒还提供更大的电化学活性表面面积，因为电解质可以穿透到多孔结构中。因此，纳米颗粒结构，其形成所述组件的外表面，相比于不具有所述颗粒的表面或者具有比本发明中使用的颗粒尺寸更大的颗粒的涂层的表面，更具有反应性并且可以具有不同的电子性质。还发现，相比于形貌的小改变，覆盖骨植入物表面的氧化物薄膜的电子性质对细胞附着和磷灰石成核具有更大的影响，并且较不绝缘的氧化物薄膜对于钛牙植入物可以是优选的。此外，如在本发明的实施方案中使用的，颗粒的层可以具有这样小的孔隙度以致其不允许细菌渗透到该层中和/或在该层内累积。

[0018] 此外，据信，对于包含纳米颗粒的表面发现的带隙中的高数目的能态对氧化还原活性蛋白质如纤维蛋白原的吸附可以是有益的。

[0019] 在本发明的实施方案中，所述颗粒具有最高至45％，优选40％，并且更优选最高至35％的粒度分布，该粒度分布被视为在半极大处的全宽度(FWHM)除以使用电喷射-扫描电迁移率粒径谱仪(ES-SMPS)获得的平均粒度之间的比率。因此，作为一个实例，对于平均尺寸为10nm的颗粒来说，个体粒度将是10+4.5nm，优选10+4.0nm并且更优选10+3.5nm。作为窄粒度分布的结果，获得颗粒的平滑表面结构，其具有遵循个体颗粒尺寸的波形。

[0020] 典型地，所述颗粒总体地具有球形。

[0021] 在本发明的实施方案中，金属氧化物至少部分是晶体的。所述金属氧化物典型地包括二氧化钛。在优选的实施方案中，所述二氧化钛的主要形式是锐钛矿。例如，所述氧化钛可以主要由锐钛矿(至少50％锐钛矿)组成。

[0022] 然而，也可以使用其他金属氧化物，典型地与二氧化钛组合使用。在本发明的实施方案中，所述颗粒可以包括i)基本上由二氧化钛组成的颗粒，和任选地还有ii)基本上由以下各项中的一种或多种的氧化物组成的颗粒：锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱，锆和/或铱的氧化物是尤其有利的。将钛颗粒与以上氧化物中的一种或多种的颗粒混合，可以获得所得层的多种性质，例如关于颜色、强度和/或电子性质。例如，与二氧化钛的颗粒组合，氧化铱的颗粒可以用于增强所述层的电子性质。

[0023] 在本发明的实施方案中，金属氧化物的颗粒在生物相容性组件的的表面上的至少一部分上形成层。因此，因为生物相容性组件的表面用于接触活组织，所以所述颗粒要接触活组织，尤其是骨。

[0024] 在本发明的实施方案中，由所述颗粒形成的所述层的厚度可以在8nm至约1μm，典型地50nm至500nm，例如100nm至400nm的范围内。薄的层因为与基底表面更好的粘附而是有利的。并且，在颗粒的烧结层(见下)的情况中，这样的薄的层可能比更厚的层具有更高的强度。所述层可以是所述颗粒的单层。因此，层厚度的下限大约与颗粒的尺寸相同。纳米尺寸的颗粒的薄层将减小亚微米水平上的表面粗糙度，同时保留更大尺度上的表面粗糙度(喷砂水平)。这对植入物的长期骨整合是重要的。

[0025] 所述层可以是所述颗粒的连续层，该层可以覆盖所述表面的至少一部分。连续层是指形成单一区域的连贯的层。与连续层相反，不连续层将由多个分开的层区域形成。在本发明的实施方案中，所述颗粒可以形成完全覆盖生物相容性组件的表面的层。

[0026] 在本发明的实施方案中，所述颗粒在整个所述层中均匀分布。

[0027] 在本发明的实施方案中，所述颗粒可以是烧结的。纳米尺寸的颗粒的层的谨慎烧结可以改善颗粒至基底的附着。颗粒的烧结可以产生陶瓷或陶瓷样的层。然而，所述颗粒也可以是非烧结的。

[0028] 在本发明的实施方案中，相比于缺乏颗粒并且具有由天然金属氧化物覆盖的表面的相应的生物相容性组件，所述表面具有为至少1.5、优选至少1.8的相对活性表面积Aaa(电化学活性表面积)。增大的活性表面积产生更具有反应性的表面，并且因此可以在更大的程度上吸附离子和/或增强磷灰石沉淀速率。

[0029] 在本发明的实施方案中，所述颗粒的层的平均表面高度(Sa)可以在5nm至70nm，例如5至15nm的范围内。

[0030] 在本发明的实施方案中，生物相容性组件包括具有所述表面的基底，其中所述基底包括金属材料。典型地，所述基底包括由所述金属材料形成的金属体。金属材料可以选自钛、锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱，及其合金。与所述颗粒接触的基底的表面可以包含氧化钛，尤其是在其中所述基底包含钛或由钛形成的实施方案中。在这样的实施方案中，氧化钛可以是在与氧接触后(例如在空气中)在钛表面自然和瞬时形成的天然氧化钛。在其中所述基底包括另一种上述金属材料或由其形成的实施方案中，其与所述颗粒接触的表面典型地包括上述各个金属的天然氧化物。

[0031] 在本发明的其他实施方案中，基底可以包括非金属材料，如生物相容性陶瓷材料，例如氧化锆，或生物相容性聚合材料。合适的材料是本领域技术人员已知的。在这样的实施方案中，基底可以由陶瓷体形成，或由聚合材料体形成。

[0032] 根据本发明的生物相容性组件典型地用于植入到活组织，尤其是骨组织中。备选地，所述组件可以用于植入到软组织中。例如，所述生物相容性组件可以是牙植入物或其部分，如牙固定器(dental fixture)。备选地，所述生物相容性组件可以是整形外科植入物或其部分。

[0033] 有利地，根据本发明的实施方案的生物相容性组件当被浸入在模拟体液中时可以在12小时内引发羟基磷灰石晶体的成核。

[0034] 在另一方面中，本发明提供一种制备生物相容性组件的方法，所述方法包括：

[0035] a)提供具有表面的基底；

[0036] b)提供金属氧化物的颗粒的分散体，所述颗粒的平均粒度小于100nm，所述颗粒分散在溶剂中；和

[0037] c)将所述颗粒的分散体涂覆在所述基底的表面上。

[0038] 在步骤b)的分散体中，颗粒可以是完全分散的。在这样的实施方案中，在步骤c)中，存在于分散体中的每个颗粒将单个地涂覆到表面上。然而，一旦涂覆在基底表面上，颗粒就紧密地堆积在一起从而形成紧密堆积的结构。

[0039] 典型地，所述颗粒的平均粒度小于25nm。

[0040] 所述溶剂可以是含水溶剂，典型地是去离子水。

[0041] 在本发明的实施方案中，所述金属氧化物的颗粒的分散体可以通过以下方式制备：

[0042] b-i)对TiCl4进行受控水解以获得胶体分散体；和

[0043] b-ii)对所述胶体分散体进行透析。

[0044] 步骤b-i)典型地通过将TiCl4缓慢、优选逐滴添加到去离子水中进行。TiCl4的温度可以为低于0℃，典型地低于-10℃，并且所述水的温度可以在0℃至5℃的范围内，优选0℃在搅拌下。

[0045] 所述分散体可以通过任何合适的方法涂覆到基底上，所述方法包括旋涂、喷涂、浸渍、浸没、溶胶-凝胶涂布、电泳沉积等。

[0046] 在本发明的实施方案中，所述方法还包括在涂覆所述分散体后允许所述溶剂蒸发。

[0047] 任选地，所述方法可以进一步包括烧结所述颗粒的步骤。在本发明的实施方案中，也可以使用两步程序，其中涂覆所述颗粒的第一层并烧结，之后涂覆其他本文所述的金属氧化物的颗粒，其不被烧结。因此，烧结颗粒和非烧结颗粒的益处都可以获得。

[0048] 所述基底可以典型地包括选自钛、锆、铪、钒、铌、钽、钴和铱，及其合金的金属，并且优选包括钛或其合金。基底表面可以包含天然金属氧化物，如在钛基底情形中的天然氧化钛。

[0049] 在本发明的实施方案中，可以在步骤c)之前对基底的表面进行粗糙化表面处理。粗糙化处理的实例包括磨蚀性喷砂(abrasive blasting)和化学浸蚀。备选地，基底可以是车削的(turned)，或经过非粗糙化处理，如抛光。

[0050] 注意，本发明涉及权利要求中引述的特征的所有可能的组合。

[0051] 附图简述

[0052] 图1显示根据本发明的实施方案的TiO2纳米颗粒的X射线衍射。

[0053] 图2a-c显示包含8nm(图2a)和22nm(图2b，c)的TiO2颗粒，商业TiO2颗粒(图2d)的表面和没有颗粒的双重侵蚀表面(图2e)的高分辨率SEM图像。

[0054] 图3显示从在包含纳米尺寸的TiO2颗粒的表面和参考表面(TS)上进行的循环伏安法获得的伏安图。

[0055] 图4显示对于本文中研究的不同钛(Ti)表面的Mott-Schottky图。

[0056] 图5显示包含纳米尺寸的TiO2颗粒的金表面的Mott-Schottky图。

[0057] 图6显示作为相对于平带电势的电势的函数，包含纳米尺寸的TiO2颗粒的表面和参考表面的态密度(DOS)。

[0058] 图7是这样的柱状图，其显示在分别在模拟体液中浸入12小时、72小时和1周后的五种不同表面上的磷灰石覆盖率。

[0059] 图8a-d显示在模拟体液中浸没12小时后包含8nm(图8)、22nm(图8b)的TiO2颗粒、商业TiO2颗粒(图2c)的钛表面和没有颗粒的参考表面(图8d)的高分辨率SEM图像。图8e-h显示图8a-d的表面的所选元素的EDX谱和记录的原子浓度。

[0060] 图9a-c是SEM图像，其显示在模拟体液中浸没12小时(图9a)、72小时(图9b)和1周(图9c)后的包含22nm TiO2颗粒的钛表面。

[0061] 图10a-b是SEM图像，其显示覆盖有根据本发明的实施方案的纳米颗粒的钛表面。

[0062] 图11a-b是覆盖有根据本发明的实施方案的纳米颗粒的表面的AFM图像。

[0063] 图12是覆盖有根据本发明的实施方案的纳米颗粒的钛固定器的250,000x放大率的FEG-SEM图像。

[0064] 图13是覆盖有根据本发明的实施方案的纳米颗粒的钛固定器在安装到腓骨中和从腓骨取出后的100,000x放大率的FEG-SEM图像。

[0065] 图14是这样的柱状图，其显示在根据本发明的实施方案的表面上生长的成骨细胞中检测到的cbfa的基因表达水平。

[0066] 图15是这样的曲线图，其显示在根据本发明的实施方案的表面上生长的成骨细胞中检测到的BMP-2的基因表达水平。

[0067] 图16是这样的曲线图，其显示由在根据本发明的实施方案的表面上生长的成骨细胞分泌的IL-6的水平。

[0068] 发明详述

[0069] 实施例1：含有颗粒的表面的制备和表征

[0070] 1.1样品制备和表征

[0071] 1.1.1样品制备

[0072] 通过TiCl4的受控水解合成二氧化钛(TiO2)纳米颗粒而获得颗粒的清洁表面。通过以下方式获得不同尺寸的TiO2颗粒：在0℃合成，但是在0℃(对于8nm尺寸的颗粒)和20℃(对于22nm尺寸的颗粒)进行胶体分散体的透析和储存。

[0073] 在典型的合成中，TiCl4(99％)在-16℃冷却，并且在剧烈搅拌下将5.2±0.05ml的此溶液逐滴加入到200ml的去离子(Milli-Q)水中。大多数使用1:40TiCl4:H2O体积比进行所述合成，其中所得的TiO2浓度为18g/l。不同尺寸的TiO2颗粒通过调节反应温度、透析时间/温度和储存时间/温度而获得。透析步骤对于避免聚集是重要的，并且所得的混悬液主要由单一纳米颗粒组成。合成的细节可以在Z.Abbas，J.Perez Holmberg，A.-K. M. J.Bergenholtz，M. 和E.Ahlberg，ColloidsSurf.A：Physicochem.Eng.Aspects，2011，doi：10.1016/j.colsurfa.2011.03.064 中找到。所述合成产生这样的分散体，其中颗粒基本上是单分散的(Perez Holmberg，Z.Abbas，E.Ahlberg，M. 和J.Bergenholtz，J. Phys.Chem.C，2011，其已被接收用于发表)。

[0074] 将个体粒度在30-80nm的范围内并且锐钛矿与金红石比率为4∶1的商业TiO2颗粒(Degussa P25)仔细清洗以去除有机表面物质并在超声波浴中处理以获得分散的溶液。然而，动态光散射显示存在较大的聚集体，并且不可能使系统完全分散。在若干步骤中将所述颗粒旋涂在Ti(具有车削表面的4级盘，直径1.1em)或Au盘(用SiC纸(4000)抛光，直径0.6em)上。在旋涂后，将样品用去离子水清洗并且在使用前使其干燥。作为含有纳米颗粒的表面的补充，纳米结构的TS+AT1(相继用草酸和氢氟酸处理的车削表面)表面包括在此研究中。

[0075] 1.1.2粒度分布的确定

[0076] 合成的TiO2纳米颗粒的粒度分布可以通过如在Z.Abbas，J.Perez Holmberg，A.-K. M. J.Bergenholtz，M. 和E.Ahlberg，ColloidsSurf.A：Physicochem.Eng.Aspects，2011，doi：10.1016/j.colsurfa.2011.03.064中描述的电子喷射-扫描电迁移率粒径谱仪(ES-SMPS)法获得。

[0077] 1.1.3表面形貌

[0078] 使用在1kV下运行的Leo Ultra55FEG SEM来记录高分辨率SEM图像。表面粗糙度分析通过使用原子力显微镜(AFM)( Multimode IIIa，Digital Instruments)进行。每个样品在三个点并且以三个不同扫描尺寸，10×10、5×5和3×3μm(扫描频率0.8Hz、512线)进行轻敲模式AFM测量。将AFM数据输入到 19(Alicona Imaging GmbH)软件中，在那里粗糙度分析和进行3D-表面粗糙度参数的计算。通过使用多个扫描尺寸和在软件中应用不同尺寸的高斯滤波器，接收到关于在10μm到150nm范围的形貌特征的信息。

[0079] 1.1.4表面分析

[0080] 将利用CuKα辐射的Siemens D5000粉末衍射仪用于鉴定晶相。以不同的入射角测量X射线衍射以从样品的不同深度获得信息。对于XPS分析，使用Quantum2000ESCA扫描显微镜(Physical Electronics，USA)，其中X射线源为单色AlKα。

[0081] 1.1.5电化学测量TM

[0082] 循环伏安法和阻抗测量通过使用Gamry Reference600 稳压器/恒电流仪/ZRA进行。在用于静止条件的专门设计的三电极电解池中进行电化学测量。将样品放置在电解池的底部，其中车削的表面朝向电解质。将大的Pt对电极共中心地围绕样品放置以确保最佳电流分布并且将参比电极放置在电解池的中央。该电解池构造可用于所有类型的平面样品并且在阻抗测量中显示良好的特性。所有电势都对于Ag/AgCl(饱和KCl，E＝0.197V对she)参比电极提及。电化学阻抗(EIS)测量在除气的0.5M H2SO4中进行，并且在阻抗测量期间保持用N2气体的连续低压吹洗。以恒定的电势，在1kHz至10mHz的频率范围内，利用9点/十(point/decade)和10mV rms的振幅记录阻抗谱。电势以50mV为步长从+1到-0.5V-1变化，其中在记录下一个谱图之前的等待时间为300s。在0.1M KOH中使用50mVs 的扫频速率获得循环伏安图。

[0083] 1.2.表面表征结果

[0084] 1.2.1粒度分布

[0085] 在将分散体在0℃和室温储存1和3周后获得的粒度分布非常相似。之前的分析 (Z.Abbas 等，Colloids Surf.A：Physicochem.Eng.Aspects，2011，doi：10.1016/j.colsurfa.2011.03.064)已经显示，可以获得具有窄的尺寸分布的TiO2胶体纳米颗粒。该分布作为为半极大处的全宽度(FWHM)除以平均尺寸之间的比率测得，并且发现为35-40％。

[0086] 1.2.2XRD和XPS

[0087] 图1显示从含有8或22nm颗粒的悬浮液获得的粉末形式的纳米颗粒的X射线衍射。在分析前，所述颗粒在120℃干燥16小时。主相是锐钛矿但是具有小的来自板钛矿的分布，如由在2θ＝30.8°的反射所示。宽的衍射峰表明颗粒由较小的微晶(～4nm)组成，并且生长研究显示，颗粒通过初始形成的该尺寸的沉淀的缓慢聚集而形成。在图1的插图中，显示了附着于钛的颗粒的衍射图。因为纳米颗粒层薄，所以信号非常弱，但是可以观察到主要的锐钛矿峰。这显示，颗粒的相在沉积和干燥后保持。附着于钛的P25颗粒显示典型的衍射图，其中锐钛矿和金红石的比率为～4/1。对于TS+AT1改性，没有观察到来自氧化物的衍射峰，这表明沉淀的层是无定形的或太薄而不能检测到。

[0088] 在纳米颗粒层上进行的XPS分析显示纯的TiO2，具有痕量的氯化物。没有观察到Ti金属的信号，这表明薄膜完全覆盖该表面。没有观察到低价钛离子。碳信号对于所有样品是相似的并且与表面污染相关。

[0089] 1.2.3表面形貌结果

[0090] 图2显示分别包含8nm(TS+8nm，图2a)或22nm(TS+22nm，图2b；Au+22nm，图2c)的TiO2颗粒的表面的高分辨率SEM图像。所有三种表面看起来相当平滑。从这些表面的SEM图像，似乎在下的基底被完全覆盖。对于本工作中使用的两个其他改变则不是这样的。P25的悬浮液含有颗粒的聚集体并且在旋涂程序中这些被转移到Ti表面。作为结果，表面粗糙度高，但是在车削的表面之间是可见的，图2d。对于相继在草酸和氢氟酸中浸蚀的TS+AT1表面，形成相当大的沉淀，其间具有非常薄的氧化物层。与球形纳米颗粒相反，TS+AT1表面上的沉淀可以被认为是高度为0.45μm的棒(从5个峰和谷的最大高度的平均值确定，S10z)，参见图2e。

[0091] 表面的形貌分析通过AFM分析使用叠加扫描尺寸和不同尺寸的高斯滤波器进行以获得在10至0.150μm范围内的表面特征的信息。3D-表面粗糙度参数使用软件计算，并且三个不同参数的值列在表1中。

[0092] 表1.通过AFM确定的3-D表面粗糙度参数.

[0093]

[0094] Sa＝表面的平均高度，Sdr＝形成的界面面积，Sdq＝表面斜率的均方根。数据来自10×10μm扫描尺寸，水平宽度的20％(1.996μm)的高斯滤波器。

[0095] Sa值(平均高度)对于表面TS+P25和TS+AT1比对于包含纳米颗粒的表面和车削的表面显著更大。这两种表面处理在车削的表面的顶部产生额外的表面结构而没有完全覆盖它，图2d-e。8和22nm颗粒的层分别完全覆盖具有颗粒的车削表面，这又导致表面粗糙度的下降，因为车削痕迹被覆盖，参见图2a-b和表1。对于金基底观察到相同的趋势(图2c)，其中在涂覆22nm颗粒的层后Sa值减小。在TS+8nm和TS+22nm表面的Sa值之间仅有微小的差别，但是对于较小的颗粒获得的较低的值表明颗粒的曲率反映在表面粗糙度中。斜率的均方根(Sdq)已显示与界面剪切强度相关并且因此对于牙植入物应用的研究是重要的参数。从生物机械的角度看，大的Sdq值可能是所需的。Sdr(形成的界面面积)值的趋势遵循与Sa和Sdq值相同的趋势，其中对于包含纳米颗粒的表面获得最小值。

[0096] 1.3.电化学表征

[0097] 1.3.1循环伏安法(CV)

[0098] 在图3中，显示伏安图的实例以举例说明扫描范围和扫描数对于一种类型的电极(图3a)、不同粒度(图3b)、部分涂覆的电极(图3c)和不同基底(图3d)的影响。利用Ti作为基底获得的伏安图的总体特征是相同的，具有在最大负性电势处的对称过程和在较小负性电势处的峰。在最大负性电势处观察到的过程已被归因于导带中的电荷累积，反应(1)，或就在导带下方的填充阱，反应(2)。在两种情况中，发生质子的吸附以在酸溶液中获得电荷平衡。

[0099]

[0100]

[0101] 在碱性溶液中，电解质阳离子可能是电荷平衡的物质，即本例中的K+的吸附。在较小负性电势处的峰已归因于导带下的表面态的填充，即根据(2)，Ti(IV)到Ti(III)的还原。对于反应(2)，TiO(OH)也可能在碱性溶液中形成。备选地，在较小负性电势处的峰可以归因于在薄膜中的晶界处的俘获状态。通常，在最大负性电势处的电流指数地增加并且最终通过水还原而发生析氢。对于纳米颗粒覆盖的电极TS+8nm和TS+22nm观察到的负极电荷和正极电荷之间的对称，表明如果电势被限制到-1.8V则不涉及感应电流过程。极化至更大负性电势导致由于析氢所致的电流的进一步增加(未显示)。与纳米颗粒覆盖的电极的其他研究相反，在析氢开始前，电流在负向扫描上经过最大值。对此的原因是未知的，但是可能与正好在导带下的能量水平的完全填充相关。在较小负性电势处的峰已被归因于在薄膜中的晶界处的表面态或俘获状态的填充，如上所述。在本研究中，薄膜不是烧结的并且预期晶界的量低并因此该峰最可能是由于表面态导致的。正电势限为0V，但是这不足以完全清空在负向扫描期间填充的表面带。这从在随后的扫频上观察到的小得多的峰是明显的，图3a。峰电势偏移，这取决于涂布，其中对于TS+8nm电极，之后的TS+22nm和TS+P25表面的最大负性峰电势，图3b和表2。在最大负性电势处的过程的电流还取决于颗粒的类型，图3b，并且与纳米颗粒膜的活性表面积相关，这表明活性表面积随颗粒尺寸减小而增加。对于总是存在于钛金属上的天然氧化物，与颗粒覆盖的电极相比，还原峰出现在较小负性电势(-0.89V)处，并且氧化还原过程显示一定的可逆性，其中氧化峰在-0.81V处。对于TS+P25电极，也观察到在这些电势处的氧化还原过程中的一些可逆性，图3c。天然形成的氧化物的总电荷比TS+P25的低，这是预期的，因为P25的纳米颗粒膜的可用的表面积将更大。对TS+P25的伏安图的仔细观察显示存在来自具有天然形成的氧化物的未覆盖的表面的贡献(显示为峰的肩部)。这与图2d中的SEM图像相符，其中未覆盖的表面在多孔结构中是可见的。然而，较大负性电势处的过程是相同的，并且差别仅在于可逆性，其中TS+P25电极的阳极电荷更高。与TS+P25和车削的表面相比，此过程的可逆性对于TS+8nm和TS+22nm电极更高，并且很可能与较小的粒度和良好限定的表面相关。缺乏可逆性可能是由于感应电流过程导致，并且对于覆盖有22nm TiO2颗粒的金电极Au+22nm来说很可能是如此。还原峰更接近导带，并且析氢很可能发生在较大负性电势处，因为没有观察到氧化峰，图3d。然而，在-0.82V处观察到小的氧化峰，与对于Ti涂覆的电极观察到的峰非常一致。此峰与TiO2颗粒表面上的能态清空相关。

[0102] 基于伏安响应并且假设不发生感应电流过程，带隙中的态密度(DOS)和电子密度可以使用公式3确定。

[0103]

[0104] 其中g0(-eE)是在零K有效的带隙中的DOS的第一估计值。E是电极电势，L是层厚度，e是元素电荷，A是表面积并且v是扫频速率。实验数据显示两种类型的状态，一种与导带的指数尾相关，gtail(-eE)，在最大负性电势处，和具有高斯样分布的带隙中的状态，ggauss(-eE)，参见公式4和5。

[0105] gtail(-eE)＝gtail，BEexp[-αFE/RT] (4)

[0106] 其中gtail，BE是在导带边缘处的DOS，并且α与进入带隙中的尾部的延伸相关。高斯分布在公式5中给出。

[0107]

[0108] 其中gtail，BE对应于带隙中状态的完全填充，Ep是峰电势，并且σ是关于峰电势的标准差。进行尝试以将实验数据拟合到这些公式，但是带隙中的状态偏离高斯分布并且不能获得可靠的值。对于多孔纳米结构的膜，与指数增加相关的电荷之前已被证明与界面面积成比例。因为颗粒层的准确厚度是未知的，所以取自指数项的值仅可以用于计算用参考表面(缺少颗粒)的面积归一化的界面面积，表2。将这些值与形成的界面面积Sdr比较，显示即使P25具有最大的Sdr值，但是活性面积仅稍高于车削的表面的活性面积。相反，TS+8nm和TS+22nm表面的平滑外观产生更高的界面面积，其中对于最小的纳米颗粒获得最大的界面面积。缺乏一致性源于以下事实，即Sdr表示物理(被动)面积，而界面(主动)面积在接触电解质中产生。

[0109] 1.3.2电化学阻抗谱(EIS)

[0110] 在100kHz至10mHz的频率范围内，利用10mV rms的振幅，测量作为电势的函数的阻抗数据。通过使用由一个或两个时间常数组成的与溶液电阻(Rsol)串联的等效电路来拟合阻抗数据。每个时间常数由与氧化物相关的电阻并联的恒相位元件(CPE)组成。已经证明，对于时间常数的横向分布，溶液电阻被包括在计算中，而对于垂直于表面的时间常数分布，其可以被省略。对于这里研究的系统，在形成多孔氧化物并且电解质可以穿透大多数的多孔层的情况下，由于表面的孔隙度，时间常数的分布横向地发生，并且因此使用公式6来计算有效电容，

[0111]

[0112] 其中Rsol是溶液电阻，Rfilm与氧化膜电阻相关，并且α是CPE元件的分散因子。使用熟知的Mott-Schottky关系，公式7，有效电容被用于估计半导体性的二氧化钛层的电性质：

[0113]

[0114] 其中Csc是空间电荷电容，εr是TiO2的介电常数，ε0是真空的介电常数，Nd是电荷载体的数目，e是电子的电荷，E是施加的电势，并且Efb是平带电势。此处假设，双层电容远高于空间电荷电容。根据公式7，预期线性相关，从所述线性相关，电荷载体的数目可以获自斜率，并且平带电势可以获自截距。

[0115] 在图4中，显示不同表面的Mott-Schottky图。对于包含8和22nm颗粒的Ti表面，Mott-Schottky行为是相同的并且仅一条曲线显示在图中。对于这些表面，发现线性Mott-Schottky关系，除了接近平带电势处，其中对于所有平面都观察到非线性行为。对于TS+P25和TS+AT1表面，在最大正性电势处观察到斜率的变化。在每个电势从Mott-Schottky图的斜率计算电荷载体的数目并且在图4的插图中给出。虽然Mott-Schottky曲线的斜率有变化，但是电荷载体的数目是相当恒定的，并且对于最为线性的区域的值在以下表2中与平带电势一起给出。平带电势对于不同表面是相似的。

[0116] 对于覆盖有P25的表面，在电势高于0.4V处斜率显著增加，这给出较低的供体密度，其因子为1.6。可以将这条线外推以产生接近0V的表观平带电势。该值与对在相同基础材料上的阳极化层发现的值相同。因为预期在本发明中使用的pH下平带电势接近-0.35V，所以表观平带电势很可能受表面态的影响。同样在阳极化膜的情况中，观察到还原峰，其表示具有带隙中的能带的表面态。

[0117] 与其他电极相比，Au+22nm电极的Mott-Schottky图看起来不同，图5。在这种情况中，电容计算自在100Hz的恒定频率下获得的阻抗值。为了比较，也显示了TS+22nm电极的Mott-Schottky曲线，其中电容值以相同方式计算。在正性电势处开始，电容对于Au+22nm表面是恒定的，即与电势无关。该电容因此与绝缘的氧化物膜的电容相关。在接近平带电势处，曲线迅速变化。通过对氧化物电容进行校正，可以估计供体密度和平带电势，参见以下表2。由氧化物电容值，可以使用公式8计算平均氧化物厚度。获得28nm的值，这表明：在金的情况中，仅颗粒的单层附着于表面。

[0118]

[0119] 其中ε0是真空的电介质介电常数，εr是TiO2(60)的介电常数，A是电极面积，并且C是电容。

[0120] 对于金上的纳米颗粒薄膜的电荷载体的数目远低于对于钛上的相同薄膜的电荷载体的数目。这表明，与金金属相比，TiO2纳米颗粒与钛上的薄氧化物膜的更紧密相互作用。因此，可以推断出，在循环伏安法中观察到的表面态不仅来源于颗粒而且还来源于颗粒和Ti上的天然氧化物膜之间的界面。对于TS+AT1表面，电荷载体的数目高于纳米颗粒膜的电荷载体的数目并且也高于天然氧化物(TS)的电荷载体的数目，表2。稍高的电导率的一个原因可能是在金属相中存在氢化钛。然而，对于喷砂的样品，发现用AT1处理的表面的电导率低于喷砂的样品的电导率(I.Mattisson和E.Ahlberg，Appl.Surf.Sci.，2011，已接收用于发表)。

[0121] 在碱性溶液中进行伏安测量，并且通过使用实验确定的、在酸性溶液中获得的平带电势并假定Nernstian pH移位，计算pH13的平带电势，Efb＝-1.1±0.1V。在图6中，将态密度(DOS)作为关于平带电势的电势的函数进行绘图。

[0122] 对于具有8nm颗粒的表面，DOS中的最大值出现在比平带电势更高的能量处，而对于其他表面，最大值接近Efb(TS+22nm)以及在相对于Efb的正性电势处(TS+P25和TS)。对于生物活性化合物的吸附以及由此在体内发挥功能的表面能力，能带的位置可以是重要的。以下关于在浸入在模拟体液中后获得的结果，将对此进行进一步的讨论。

[0123] 表2.从CV确定的峰电势，从EIS确定的Efb和Nd

[0124]

[0125] aEp在0.1M KOH中确定。b在对于E＝0-(-1.5)V的指数项上计算的。cEfb和Ndd在0.5MH2SO4中确定。从U.Pettersson，J.L. A.S.Fredriksson和E.K.Ahlberg，Biomaterials，2009，30，4471-4479，重新计算本研究中所用pH的Efb值。

[0126] 实施例2：表面生物活性的评价

[0127] 2.1.样品制备

[0128] 2.1.1浸入在模拟体液(SBF)中

[0129] 根据修订的描述于A.Oyane，H.M.Kim，T.Furuya，T.Kokubo，T.Miyazaki和T.Nakamura，J.Biomech.Mater.Res.A，2003，65，188-195中的SBF配方，在37℃制备SBF溶液。使用1M NaOH将溶液的pH设定为7.00±0.05，并且使用新鲜制备的SBF溶液。

[0130] 将根据以上实施例1.1制备的样品单个地浸入在40ml SBF溶液中并颠倒地与处理的表面装配在一起。在37.0℃浸入每个种类的9个样品，并且分别在浸入12h、72h和1周后评价每个种类的3个样品。对每个种类和浸没时间的一个样品进行X射线衍射(XRD)分析以考察样品的化学组成。对于所有样品类型，在每个样品的3个点处进行SEM(ESEM XL30，FEI Company)和能量弥散X射线谱(EDX)(Apollo14，EDAX)分析以评价形成的磷灰石的量和形态。使用的SEM设置为10kV，工作距离10mm，并且分析面积126x102μm。

[0131] 2.2结果

[0132] 通过将样品浸入在SBF溶液至达12h、72h和1周来评价表面引发磷灰石成核的能力。SBF溶液含有与人血浆相似浓度的离子，并且SBF溶液的配方可以变化。在本文中，使用由Oyano等提出的修订的SBF配方。将样品与颠倒悬挂的经处理的表面装配在一起以防止重力沉淀。

[0133] 通过EDX测量形成的磷灰石的量。使用公式9从浸入在SBF溶液中之后和之前的钛信号的比率来计算磷灰石覆盖率(Θ)。假定磷灰石是唯一的在浸入期间形成的沉淀。

[0134]

[0135] 结果显示在图7中，并且感兴趣的是注意到，与参考(TS)和TS+AT1表面相比，对于包含TiO2纳米颗粒的表面，磷灰石的早期成核显著更高。在SBF中浸入72小时后，含有颗粒的表面和参考之间的差异消失，并且代替地，TS+AT1表面显示最高的磷灰石覆盖。该趋势在1周后保持，图7。通过SEM和获得情况下的清楚差异考察不同表面的形态。

[0136] 图8a-d显示钛表面TS+8nm(图8a)、TS+22nm(Fig8b)、TS+P25(图8c)和参考表面TS(图8d)的高分辨率SEM图像。看到磷灰石晶体成核位点并用圆圈标记。此外，EDX分析(测量从源自电子壳层K的电子释放的能量)确认：相比于参考表面(TS，图8h)，在测试表面上存在更高量的钙(Ca)和磷(P)(图8e-g)。对于每个表面，仅在单个点上进行EDX分析。

[0137] 之前已经考察了表面粗糙度对磷灰石形成的影响，并且在对应于0.2至0.6μm的Ra值的表面粗糙度的情况下，已经显示连续且粘附的磷灰石层在各种材料上形成。由于测量技术和分析的差异，难以比较粗糙度参数的绝对值。然而，可以使用相对值，并且浸入1周后的结果支持之前的发现，即与更平滑的表面相比，较粗糙的表面有利于形成厚的和粘附的磷灰石层，表2。

[0138] 对于所有的表面(除了TS+P25表面)，观察到具有不同特性的断裂的磷灰石层。

[0139] 在TS+8nm和TS+22nm表面上形成的磷灰石层显示另一种类型的断裂，其类似于在钛上形成的磷灰石层上的断裂，其首先温育在纤连蛋白溶液中并且之后温育在Hanks缓冲盐溶液(HBSS)中达一周(A.P.Do Serro，A.C.Fernandes和V.S.B.de Jesus，J.Biomed.Mater. Res.，2000，49，345-352)。已经提出裂缝或断裂是由干燥收缩引起的，并且观察到其随着浸入时间的增加而更大且更深。一个备选解释涉及厚磷灰石层的3D生长机制，其中表面上的核生长并最终形成完全覆盖的膜。当不同的核开始相互作用时，施加应力并且磷灰石层破裂。这种机制似乎对TS+AT1表面有效，其中在12小时后没有沉淀，但是在72小时后有完全覆盖的膜。对于具有纳米颗粒的表面，成核的机制似乎是不同的。羟基磷灰石在表面上的某些位点处的快速沉淀在2D生长之后，其中所述层与下面的基底具有弱的相互作用。2D层的形成似乎防止了通常观察到的更大聚集体的形成，并且因此所述层仍然保持是薄的。对于TS+22nm表面，在图9中示出了在覆盖有纳米颗粒的表面上观察到的的早期成核。在12小时后，观察到不同的沉淀(其在图9a中用箭头标记)，但是所述表面未被沉淀完全覆盖。在该阶段，沉淀的Ca/P比接近1.7(许多测试点的平均值)，并且在沉淀之间没有获得Ca和P信号。这表明形成羟基磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))，其是热力学上最稳定的相。羟基磷灰石是骨中的主要矿物质，并且对获得高机械强度是关键的。在浸入72小时后，所述表面覆盖有薄的磷灰石层，并且裂纹开始形成，图9b。看起来，由于由沉淀和层之间的不重合引起的应力，裂纹从初始沉淀扩散。在浸入一周后，磷灰石层完全形成，但是仍然是薄的，图9c。

[0140] 在本研究中，所有表面(除了TS+P25)都具有断裂而与表面粗糙度无关，表2。TS+8nm和TS+22nm表面的磷灰石层似乎与下面的表面脱离。然而，在此上下文中，应当观察到的是在体内情形中，在将如本文中所述的生物相容性组件植入到活组织中后，大分子如蛋白质和蛋白聚糖，以及细胞将在植入后数小时内被吸引到组件表面，并且据信，它们的存在和/或活性将有效地防止形成磷灰石的任何2-D或3-D层。因此，在体外在一周后形成的磷灰石层的性质可能与体内植入结果几乎无关。所形成的磷灰石膜的Ca/P比计算自EDX测量结果，并且发现：在72小时和1周浸入后，对于所有表面，该比值的范围为1.42-1.56。
这可以表明在Ca/P比＝1.5下形成磷酸三钙(Ca3(PO4)2)。

[0141] 通过入射余角-X射线衍射(GI-XRD)分析形成的磷灰石层的化学组成。虽然对于1周后的TS、TS+8nm、TS+22nm和TS+P25表面，EDX测量显示相当高的磷灰石覆盖率，但是仅获得弱且宽的衍射信号。这表明形成的层是无定形的。从SBF溶液的均质生长以无定形相的形成开始，随后形成小的磷灰石晶体(Z.Z.Zyman，D.V.Rokhmistrov和V.I.Glushko，J.Mater.Sci.，Mater.Med.，2010，21，123-130)。

[0142] 对于其中获得较厚磷灰石层的TS+AT1表面，在SBF中浸入72小时和1周后观察到清楚的羟基磷灰石的衍射峰。

[0143] 长期结果表明：在更粗糙的表面上，厚磷灰石层的形成被促进。然而，含有纳米颗粒的更平滑的表面显示更快的成核以及无定形磷灰石的薄2D层的形成。在T.Kokubo和H.Takadama，Biomaterials，2006，27，2907-2915中已经考察了表面诱发羟基磷灰石成核的能力和体内反应之间的关联。

[0144] 因此，浸入在SBF溶液中可以是不同表面的生物活性的量度。在本研究中，观察到两种类型的成核和生长行为。对于更粗糙的表面，成核在开始被延迟，但是一旦开始，其形成厚的层。这些层具有由膜中的应力诱发的裂纹。对于更平滑的具有小的锐钛矿纳米颗粒的表面，初始沉淀是快速的，但是仅形成很少的羟基磷灰石的小核，而留下剩下的表面是未被覆盖的。

[0145] 对于由小的充分分散的纳米颗粒形成的表面膜，多孔层在表面上产生。与车削的表面和含有P25的聚集体的表面相比，这导致如由阻抗测量确定的更大的供体密度和更大的活性面积。此外，物理表面粗糙度似乎在磷灰石形成中具有重要作用，因为对于具有相当高的电导率的参考表面(TS)，磷灰石形成受限。对于早期成核，纳米颗粒覆盖的表面似乎是优选的。

[0146] 实施例3：纳米颗粒涂覆的表面的制备和表征

[0147] 3.1样品制备

[0148] 如上所述，通过TiCl4的受控水解来合成TiO2纳米颗粒。通过控制反应温度、透析时间/温度和储存时间和/或温度，获得粒度为～20nm的TiO2纳米颗粒。所述颗粒主要由锐钛矿组成，具有痕量的板钛矿。根据以下方案，所述颗粒被旋涂到车削的、脱脂的钛盘上：对于样品组A1，仅进行一个旋涂步骤，而对样品组A5进行五次旋涂。在旋涂后，将样品在水中清洗，并且在50℃干燥5分钟，之后包装并在21kGy下进行β灭菌。

[0149] 3.2样品表征

[0150] 使用以下技术来表征两个样品表面A1和A5：

[0151] -扫描电子显微术(SEM)(XL30，FEI Company，5651GG，荷兰埃因霍温)[0152] -场发射枪扫描电子显微术(FEG-SEM)(Leo Ultra55FEG SEM)

[0153] -能量弥散X射线谱(EDX或EDS)(XL30，FEI Company，5651GG，荷兰埃因霍温)[0154] -X射线光电子谱(XPS)(Quantum2000ESCA扫描显微镜，Physical Electronics，Chanhassen，MN USA和CasaXPS软件)

[0155] -X射线衍射(XRD)(Siemens D5000粉末衍射仪，使用CuKα辐射； )

[0156] -原子力显微镜(AFM)( Multimode IIIa，Digital Instruments)

[0157] -接触角测量(EQ-Q-2857，SY-0302)。

[0158] 3.2.1扫描电子显微术

[0159] 使用SEM和FEG-SEM考察三种不同样品表面的形态。FEG-SEM主要用于鉴别纳米结构的表面，A1和A5，因为使用普通的环境SEM不可能检测到离散的纳米颗粒。为了获得更高放大率的图像，结合降低的电势和所得的更短工作距离，使用inLense检测器。A1样品表面的图像显示在图10a中，并且样品表面A5的图像显示在图10b中，放大率都是100,000x。纳米颗粒涂覆层的厚度在所述图像中是看不到的，但是离散的纳米颗粒是可见的，其为表面上的小白点。

[0160] 在显示在图10a-b中的SEM图像中，A1和A5表面看起来相似。然而，表面粗糙度存在不同。表面粗糙度使用AFM来确定，并且将在以下进一步讨论。

[0161] 3.2.2能量弥散X射线谱(EDX)

[0162] 使用EDX来确定两个样品A1和A5疏松材料的总体元素组成的定性和定量元素分析。EDX从约1-2μm的深度收集信息，这意味着利用该方法仅可以检测到关于最外层的有限信息。在每个样品的三个不同位置(处于不同的边缘处的两个位置和在样品中部的一个位置)和以三种不同的加速电压(5、15和30kV)进行分析以研究化学组成是否随位置和/或穿透深度变化。

[0163] 由元素定量观察到的是，样品A1和A5具有相似的组成。因为来自EDX分析的值是相对的，所以对于不同的样品和加速电势分别计算氧/钛、氮/钛和碳/钛之间的比值，参见表3。可以看到，样品A1和A5具有相似的元素组成。此外，还可以推断：对于两个样品组，氧、氮或碳分别相对于钛的比值作为加速电压(即，分析深度)的函数减小。

[0164] 表3.如由EDX确定的作为加速电压(15和30kV，分别地)的函数的碳(C)、氮(N)、氧(O)分别和钛(Ti)之间的定量元素比(以％计)。(9个点/样品组的平均值)。

[0165]样品 C/Ti N/Ti O/Ti
A1，15kV 0.046 0.072 0.033
A1，30kV 0.035 0.041 0.023
A5，15kV 0.051 0.074 0.041
A5，30kV 0.035 0.051 0.033

[0166] 3.3.3X射线光电子谱(XPS)

[0167] 纳米颗粒涂覆的表面的化学组成使用X射线光电子谱(XPS)确定，数据显示在表4中。两个样品表面A1和A5具有相似的化学组成并且主要显示存在钛、氧和碳。由于人工的样品制备程序，两个样品都检测到大量的碳。对于任一个样品表面，没有鉴别到来自纳米颗粒合成的痕量氯化物。

[0168] 还进行使用Casa XPS软件对检测到的元素的扩展分析。对于所有样品，观察到Ti2p1/2和Ti2p3/2的结合能在465和459eV。双重峰归属于Ti(IV)并且显示TiO2是样品表面上的主要组分。对于表面A1和A5，在454.6eV和461.4eV也分别鉴别到Ti金属双重峰。Ti金属峰源自在下面的钛基底并且可以在表面A1和A5上鉴别出，因为TiO2纳米颗粒涂层薄。

[0169] 两个样品表面在531eV都显示源自Ti-O键的清楚的O1s峰。此外，观察到在更高结合能处的肩峰。对O1s谱去卷积给出在533eV的峰，其源自与碳结合的氧。对于O1s谱，C1s谱显示优势物质，其中肩峰处在更高结合能处。在285.5eV处的主峰已归因于烃类(C-C和C-H)的存在并且在环境条件下通常在氧化物层上看到。更高结合能(289eV)处的肩峰已分别归属于C-O和C＝O物质。

[0170] 表4.如由XPS确定的A1和A5样品的定量表面组成(以％计)(分析了每组的三个样品)。

[0171]样品位置 C1s N1s O1s NaKL Si2p Ti2p
A1-1 中部 24.4 1.2 51.4 - - 23.0
A1-1 边缘1 31.6 0.4 48.7 - - 19.3
A1-1 边缘2 26.1 0.8 50.4 - - 22.6
A1-2 中部 26.6 0.6 50.7 - - 22.1
A1-2 边缘1 30.6 1.1 48.6 - - 19.7
A1-2 边缘2 28.4 1.2 49.2 - - 21.2
A1-3 中部 39.1 0.9 41.8 - - 18.2
A1-3 边缘1 33.6 0.6 48.0 - - 17.8
A1-3 边缘2 25.8 1.0 50.4 - - 22.8
A5-1 中部 38.5 0.8 41.2 - 0.3 19.1
A5-1 边缘1 32.6 0.6 48.1 - - 18.7
A5-1 边缘2 38.2 0.9 42.4 - - 18.6
A5-2 中部 22.1 0.8 53.3 - - 23.8
A5-2 边缘1 27.1 0.7 51.4 - - 20.9
A5-2 边缘2 22.0 0.9 52.9 - 0.4 23.8
A5-3 中部 22.6 0.3 52.8 - 0.3 24.0
A5-3 边缘1 32.3 0.2 49.3 - - 18.2
A5-3 边缘2 22.1 1.0 53.5 - - 23.5

[0172] 3.3.4X射线衍射(XRD)

[0173] 分别在表面A1和A5上进行X射线衍射测量。两种样品表面都呈现所有七种钛金属信号。就单晶表面而论，金属信号不是随机取向的，这很可能是由于松散材料的冷加工。没有来自二氧化钛(金红石)的信号存在于所述表面上，这很可能是由于氧化物层薄。缺乏氧化物峰也可以表明氧化物是X射线无定形的，即，粒度超出Bragg的限制以致不能获得清楚的反射图。

[0174] 3.3.5原子力显微术(AFM)

[0175] 为了进一步考察表面粗糙度，还记录了AFM图像。图11a显示A1表面，而图11b显示A5表面。3D-表面粗糙度参数使用软件计算，并且对于三个不同参数的值列在表5中。

[0176] 从AFM图像可以观察到的是，表面A1和A5在车削的表面的顶部具有额外的表面结构。

[0177] 从样品A1(图10a)和A5(图10b)的SEM图像，这两个表面看起来非常相似，其中在下面的基底以相同的程度被覆盖。然而，当研究AFM图像时，图12a-b，清楚的是，情况不是这样。对于样品A5(图11b)，在下面的基底被若干层纳米颗粒完全覆盖，诱发厚的、平滑的氧化膜。样品A1(图11a)也具有纳米颗粒的覆盖涂层，虽然结构不如A5的结构平滑。这也通过表5中的表面粗糙度参数验证，其中可以看到A1的Sa值比A5的Sa值稍高。斜率的均方根(Sdq)显示为与界面剪切强度相关，并且因此是考察牙植入物应用的重要参数。从生物机械的角度看，大的Sdq值是理想的，相比于A5，对表面A1提供小的优势。Sdr(形成的界面面积)值中的趋势遵循与Sa和Sdq值相同的趋势，其中具有最厚纳米颗粒层的表面(即A5)获得最小的值。

[0178] 表5.如通过AFM确定的表面粗糙度参数。数据来自5x5μm扫描尺寸和20％水平宽度的高斯过滤器。

[0179]样品 Sa(nm) Sdq Sdr(％)
A1 10.91(2.11) 0.42(0.08) 8.45(3.01)
A5 6.88(1.78) 0.31(0.05) 5.06(1.18)

[0180] 3.3.6接触角

[0181] 表面A1和A5的亲水性使用接触角测量确定。根据通常的定义，两个样品表面都是亲水的，即接触角＜90°，参见表6。

[0182] 表6.样品A1和A5的接触角.

[0183]样品接触角(°)
A1 76.6(3.1)
A5 84.6(6.6)

[0184] 3.3讨论

[0185] A1和A5样品制备自相同类型的基底，即，车削的钛(级别4)盘。在两种情况中，旋涂的纳米颗粒层覆盖在下面的基底。纳米结构太小而不能用普通环境SEM鉴别，并因此样品通过高分辨率FEG-SEM来分析。在这些图像中，表面A1和A5看起来非常相似，其中离散的纳米颗粒或纳米颗粒的组沉积在在下的金属结构的顶部上。然而，当将SEM图像与AFM图像进行比较时，显而易见的是，在下面的表面结构被纳米颗粒的膜完全覆盖，形成连续的涂层。样品组A1仅被旋涂一次，而对于样品组A5，旋涂程序重复五次，产生更厚的涂层。这也由表面粗糙度测量证实，其显示与A1相比，表面A5的Sa值较低。

[0186] 接触角测量显示，两个样品都是亲水的。XPS分析显示样品是清洁的，并且表面主要由钛、氧和碳组成，并且还表明TiO2是样品表面上存在的主要组分。此外，对于样品A1和A5两者，可以观察到Ti金属信号，这表明纳米颗粒涂层薄，虽然A5涂层比A1涂层厚。

[0187] 虽然XPS分析显示两种样品表面都被TiO2覆盖，但是XRD分析未显示任何来自氧化物的反射。氧化物无法通过XRD证实，因为所述层太薄。

[0188] 实施例4：纳米颗粒涂层的粘附

[0189] 4.1样品制备

[0190] 根据Abbas等，Nanoparticles Colloids and Surfaces(纳米颗粒胶体和表面)A：Physicochem.Eng.Aspects384(2011)254-261制备粒度为19.5nm的TiO2纳米颗粒的溶液。
如下地将纳米颗粒溶液旋涂在商业纯的且清洁过的钛固定器(车削的，没有经过喷砂或酸浸蚀)上：将固定器安装在样品支架上并在1400rpm的旋转期间将其浸渍到所述纳米颗粒溶液中。在浸渍到纳米颗粒溶液中后，将固定器浸入在清洗水中。然后使固定器以4500rpm旋转约30s以去除残留的水。将固定器在烘箱中在50℃干燥数分钟。

[0191] 利用FEG-SEM以250,000x的放大率评价所述固定器(显示在图12中)。分析揭示所述表面展现纳米颗粒。

[0192] 4.2安装到骨中之后的评价

[0193] 进行测试以考察在固定器安装在死的腓骨中、从骨中取出并且后续洗涤程序后，纳米颗粒涂层是否保持pn表面。结果显示在纳米颗粒涂层中似乎不受固定器安装在腓骨中的影响并且在后续洗涤程序后也保持完整。图13是在100,000x放大率的FEG-SEM图像，其显示在从腓骨取出并且清洁后纳米颗粒涂覆的钛固定器。一些骨残余物保持在表面上。纳米颗粒也仍然粘附在螺齿的顶部。

[0194] 实施例5：体外细胞反应的评价

[0195] 使用基于实验室的细胞增殖测定和成骨分化标记物，使用来源于人的间充质干细胞模型，评价根据以上实施例3.1制备的样品表面的效果。

[0196] 5.1样品

[0197] 除了上述的样品A1和A5以外，使用机械加工的商业纯的钛盘(“Ti”)作为对照。

[0198] 5.2细胞培养

[0199] 将人腭间充质细胞(HEPM1486；ATCC)培养在含有厄尔盐(Earl’s Salts)、10％胎牛血清(FBS)、Pen/Strep抗生素[25mg/ml]和抗坏血酸盐[50mg/mL]、丙酮酸钠[1mM]、非必需氨基酸[0.1mM]、L-谷氨酰胺[2mM]的伊格尔最小必需培养基(Eagles Minimal Essential Media)(EMEM)中，在5％CO2的情况下进行培养。细胞培养需要经由胰蛋白酶分离HEPM细胞、计数(利用血球计)、沉淀(pelleting)和以50,000个细胞/10μl进行悬浮。将10μl的细胞悬浮液(Micromass法)在每个测试和对照表面上涂板，允许培养物进行1小时的粘附，之后利用1ml的EMEM+10％FBS温和地冲洗(Stanford，Jacobson等，1995，Journal of Biological Chemistry270(16)：9420-9428)。

[0200] 对于所述测定，使用3个盘/组/时间点。在第0、1、4、8和14天进行测定，第14天为测定终点。时间零点为在涂板前制备的细胞悬浮液的等分试样。每四天进行培养基的改变。从其中温育所述盘的二十四孔盘的每个孔中收集100μl的培养基。

[0201] 储存收集的培养基以用于骨相关蛋白质表达的蛋白质组学测定。在第0、1、2、4、6、8、12天，进行从培养基的用于蛋白质组学测量的培养基收集。

[0202] 5.3细胞增殖和细胞活性

[0203] 5.3.1细胞增殖测定

[0204] 在14天的时间内使用标准MTT测定测量细胞增殖。Vybrant MTT细胞增殖测定(分子探针试剂盒V-13154)是一种微板吸光度测定，其利用水溶性MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑 )向不溶性甲的转化。然后将甲溶解并且在微量滴定板读数器中在570nm处读数。

[0205] 将HEPM细胞的微粒(50,000个细胞/10μl培养基)放置在24孔板中的盘上。在1小时(以允许细胞粘附)后，用补充有抗坏血酸盐[50mg/ml]的1ml EMEM冲洗所述盘。
培养基还含有10％FBS和Pen/strep。在24小时后，依照Invitrogen Vybrant MTT细胞增殖测定来收集第1天的样品。将样品在37℃在SDS-HCl溶液中过夜温育，然后混合并且读取570nm的吸光度。对于在第2天、第4天、第6天、第8天和第14天的样品，重复此程序。

[0206] 将细胞增殖与标准曲线进行比较。观察到以下结果：

[0207] 第1天：与第1天的Ti相比，所有表面显示在A1和A5表面上细胞附着并且存活。与Ti相比，注意到在A1上细胞的数目增加。

[0208] 第4天：与Ti相比，A1和A5表面显示细胞的数目减少。

[0209] 第8天：与Ti表面相比，在8天后A1和A5表面都显示细胞的数目减少。

[0210] 第14天：在14天后，回收A1和A5表面上的细胞，显示与Ti相似的细胞数目。

[0211] 5.3.2骨相关基因标记物的基因表达水平

[0212] 使用多重和实时PCR策略在第0、1、4、8和14天分析碱性磷酸酶、cbfal、骨钙素和BMP-2的成骨细胞基因表达的变化。将微团培养物(50,000个细胞/10μl培养基)一式三份地涂板在塑料上作为对照，如之前所述(Schneider，Zaharias等，2004.Journal of Biomedical Materials research.69A3：462-468)。在附着1小时后，用EMEM/10％FBS和50mg/ml抗坏血酸盐冲洗所述孔。在第0、1、4、8和14天，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)，根据制造商的说明，提取总细胞RNA。然后将细胞均质化(QIAshredder柱，Qiagen)并施加到RNeasy柱，冲洗并洗脱。RNA浓度计算自260nm处的吸光度，而RNA纯度确定自260和280nm吸光度的比值。使用提取的RNA作为模板，利用TaqMan反转录试剂(Applied Biosystems)进行反转录反应，并且在PTC-200Peltier热循环仪(MJ Research)中进行RT反应。在在25℃的初始10min后，将反应混合物在48℃温育30min，在95℃加热5min，并且随后冷却至4℃。使用TaqMan核糖体RNA对照试剂盒(Applied Biosystems)检测18s核糖体RNA作为内源性对照。

[0213] 然后，通过多重PCR扩增碱性磷酸酶、cbfal、骨钙素和BMP-2靶标以及内源性rRNA对照，其中热循环参数为：50℃2min，95℃10min，40个循环的95℃15秒，和60℃1min，使用TaqMan Universal PCR基质混合物(Applied Biosystems)。实时PCR反应在96孔光学反应板(Applied Biosystems)中、在ABI Prism7300实时PCR检测系统中进行。用于成骨基因(此处仅显示BMP-2和cbfal)的RNA提取和RT-PCR方案遵循由Perinpanayagam，H.(2002)描述的方法。简言之，收获培养物，在PBS中清洗并提取总细胞RNA。利用Primer Express软件(Perkin Elmer)由对应于所述基因的外显子1和2的294bp的已知大鼠序列设计用于RUNX-2/Cbfal的实时PCR引物和探针(Xiao等.(1998)Journal of Biological Chemistry，273(49)：32988-32994)，产生与外显子接合重叠的80bp产物。DNA探针用5’-报告染料FAM(6-羧基荧光素)和3’-猝灭染料TAMRA(6-羧基-N，N，N’，N’-四甲基罗丹明)修饰。在每个反应管中，通过计算ΔCt将Cbfal水平归一化至18S rRNA，其中ΔCt＝(FAM)Ct-(VIC)Ct。减去一个常数而得到ΔΔCt，其中ΔΔCt＝ΔCt-k(k被调整(-ΔΔCt)
为大约最低的ΔCt值)。cbfal的相对水平作为2 计算。

[0214] 在不同时间点注意到以下结果：

[0215] 第1天：与Ti相比，在测试表面上，BMP-2、cbfal、碱性磷酸酶或骨钙素的基因表达没有差异。

[0216] 第4天：在表面A1上BMP-2和cbfal的表达增加，并且在A5上碱性磷酸酶的表达小量增加，而在所有测试表面上骨钙素的表达下降。

[0217] 第8天：在所有测试表面上增加的BMP-2反应显示与Ti相比在A1表面上的显著更高的值。相对于Ti对照表面，cbfal表达显示在A5表面上的更高水平，并且在A1上显示相当的水平。在所有表面上都观察到总体低水平的碱性磷酸酶表达。

[0218] 第14天：在A1表面上BMP-2表达显著增加。Ti对照和A1呈现相似水平的cbfal表达，但A5表面显示与对照(Ti)相比增加的水平。与对照相比，碱性磷酸酶或骨钙素表达水平没有提高。碱性磷酸酶水平低。

[0219] cbfa表达显示在图14中，并且BMP-2表达显示在图15中。

[0220] 5.3.3蛋白质水平测量

[0221] 选择提供在体外表达的成骨蛋白质标记物(骨钙素、骨桥蛋白和护骨素)最客观量度的多重试剂盒。简言之，将50μl细胞培养物上清与抗人多蛋白质标记物小珠在4℃温育18小时，其中通过过滤除去未结合的材料(Assay Millipore，Billerica，MA，USA)。加入25μl的抗人多肽生物素报告子，并将反应在室温在黑暗中温育1.5小时。加入25μl的链霉亲和素-红色藻胆素，并将平板在室温再温育30分钟。加入25μl的终止液，并在平板读出器(Model100IS，Luminex，Austin，TX，USA)中对平板进行读数。由标准物(2.3-至-10,000pg/ml)使用Beadview软件(Millipore，Billerica，MA，USA)外推细胞因子IL-6和TNF-α在每个样品中的浓度。

[0222] 所有表面遵循普通的愈合过程，在任何表面上都没有显示额外高的蛋白质水平。在8天后，促炎细胞因子TNF-a和IL-6显示IL-6的水平增加，并且在14天后，在A1表面上注意到最高值。IL-6反应显示在图16中。

[0223] 5.3.4概述和结论

[0224] 测试表面总体显示与Ti对照表面相当的增殖。总体上，与分化相比，更多地注意到增殖。这通过低活性的碱性磷酸酶表达显示，其在第4天达到峰值，但是在后面的时间点减小。仅对于A1表面(从第4天到第14天)注意到骨诱导性BMP-2。成骨细胞分化标记物cbfal在A5上从第4天到第14天增加。

[0225] 在测试表面上IL-6水平的小量增加可能反映BMP-2迟发反应。

[0226] 纳米颗粒涂覆的表面A1和A5对分化具有小的作用，但是在该体外研究中总体趋势是这些表面促进成骨细胞的增殖。

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生物相容性材料-专利编号CN1954004B	2020-05-11	797
生物相容性胶-专利编号CN1221443A	2020-05-12	794
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生物相容性组件-专利编号CN103501829A	2020-05-12	789
生物相容性材料-专利编号CN1954004A	2020-05-12	621
生物相容性组件-专利编号CN103501829B	2020-05-11	717
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