一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体专利检索-转染生物工程专利检索查询-专利查询网

积极推动地理标志专门立法

2022-03-10 地理标志，立法，知识产权
保护知识产权是对创新最大的激励

2022-03-10 保护知识产权，创新，激励
谢商华：加快制定知识产权基本法

2022-03-10 知识产权基本法
擦亮“双奥之城”品牌

2022-03-10 双奥，知识产权
让冰雪运动“热”力全开

2022-03-10 冰雪运动，知识产权
携手共奋进　走好强国路

2022-03-10 强国，知识产权
坚持创新引领　方能稳中求进

2022-03-10 创新，稳中求进，知识产权
答好“两张卷” 奋进新征程

2022-03-10 知识产权
专家解读政府工作报告中的创新和知识产权相关部署

2022-03-10 政府工作报告，创新，知识产权
今年政府工作报告指出：加强知识产权保护和运用

2022-03-10 政府工作报告，知识产权保护

一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体

阅读：1052发布：2020-07-09

IPRDB可以提供一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，所述载体的主要组分为低分子壳聚糖和/或低分子壳聚糖衍生物，其中所述低分子壳聚糖是指壳聚糖经生物降解法、化学降解法或物理降解法降解，或者通过化学合成法或酶合成法得到的一种聚合度为2～120、分子量为320～20000的低分子壳聚糖。与现有技术相比，本发明提供的蛋白质转染细胞的载体具有以下技术效果：(1)载体与蛋白质结合后，能有效护蛋白质不受酶的降解；(2)载体介导蛋白质转染进入细胞的效率高、数量多、时间快；(3)载体对细胞无明显毒性；(4)载体适应广，可适用不同类型的动物细胞；(5)操作简单。，下面是一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的主要组分为低分子壳聚糖和/或低分子壳聚糖衍生物。

2.根据权利要求1所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述低分子壳聚糖是指壳聚糖经生物降解法、化学降解法或物理降解法降解，或者通过化学合成法或酶合成法得到的一种聚合度为2～120、分子量为320～20000的低分子壳聚糖。

3.根据权利要求1所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述低分子壳聚糖衍生物指以低分子壳聚糖为母体，对其中的原子或原子团用其他原子或原子团取代所形成的化合物，包括酰化、羧基化、羟基化、氰化、醚化、烷化、酯化、醛亚胺化、叠氮化、成盐、螯合、水解、氧化、卤化、接枝与交联反应制备的衍生物。

4.根据权利要求3所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述低分子壳聚糖衍生物为磺化甲壳素、磺化羧甲基甲壳素、N-羟乙基壳聚糖、N-乙酰化壳聚糖、O-羧甲基壳寡糖、N-羧甲基壳聚糖、N-三甲基氯化壳寡糖、N-羟丙基壳聚糖乙酸酯、氰乙基或苯基氰乙基壳聚糖、N-丙(丁、己)酰化壳聚糖、N-甲基(苯)磺酰壳聚糖、N-邻苯二甲酰壳聚糖、N-丁(辛、十六烷)基壳聚糖、N-羧基丁基壳聚糖、N-硫酸壳聚糖、6-O-羟乙基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、甘油(3-氯丙烷-1,2-二醇)壳聚糖、B-D半乳糖苷支化壳聚糖、6-脱氧壳聚糖、6-O-单硫酸(3,6-O-二硫酸)壳聚糖、十二烷基磺酸钠壳聚糖中的一种或几种。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的组分还包括次要组分，所述次要组分为聚乙二醇、聚乙烯亚胺、脂质体、磷酸钙、偏磷酸钙、海藻酸钠、HIV-1TAT短肽、多聚精氨酸、寡精氨酸、寡赖氨酸、聚苯乙烯、碳纳米管中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的主要组分和次要组分的摩尔比为1∶0～100。

7.根据权利要求6所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体可与一种或多种类型的蛋白质结合，从而形成复合物。

8.根据权利要求7所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述复合物中，载体的主要组分和蛋白质的摩尔比为1∶0.1～100。

说明书全文

一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白质转染细胞载体，属于生物材料领域。

背景技术

[0002] 蛋白质转染是直接把蛋白质转入细胞的过程，一般要用到载体帮助目标蛋白质转染进入细胞膜内。蛋白质转染进入细胞有非常重要的科研价值和应用前景，主要研究有：①蛋白质－蛋白质相互作用；②细胞内信号传导，细胞周期调控，细胞凋亡，肿瘤发生和转录调节；③未知蛋白质的功能；④细胞重编程；⑤功能性转录因子的递送和癌症治疗。

[0003] 但目前从事蛋白质载体进入细胞研究的人比较少。主要原因是本领域的人一般均习惯接受基因转染，因为将基因转染进细胞后会翻译成蛋白质，故认为无必要直接转染蛋白质进入细胞。另外，现在基因转染的技术已很成熟，且已有大量性能稳定的基因转染载体，如病毒、脂质体、纳米载体如PEI等。其中病毒效率最高，但有不可控风险，脂质体一般认为对细胞毒性较大，而纳米载体因为尺寸效应和非病毒性，一般认为比较有潜力成为更安全可靠的基因载体，所以本领域的人通常集中在对纳米载体改性，如研究在不增加载体细胞毒性的前提下，提高基因转染的效率。

[0004] 此外，本领域的人一般认为将蛋白质直接转入细胞存在以下的问题：①转入蛋白质数量有限，可能无法达到起作用的有效浓度；②蛋白质因为不能向像基因那样可以大幅度压缩，故所形成的载体－蛋白质复合物的尺寸比较大，纳米效应不明显，易产生细胞毒性；③转入的蛋白质一般为原核表达蛋白，没有蛋白质功能，要进入细胞后由内质网折叠修饰等加工程序后才具备功能，细胞是否会主动修饰所转染的蛋白质也是未知数；④现有的蛋白质载体不能同时满足安全低毒和高效转染两个基本要求，如PEI、阳离子脂质体转染效率高，但毒性大，微球接枝穿膜肽毒性小，但转染效率低，制备复杂；⑤人工重组获得的蛋白质或天然分离纯化的蛋白质获取均很困难，成本较高。总之，现在直接转蛋白质进入细胞的文献和专利均不多，而基因载体的研究和开发一直较热。

[0005] 综上原因可知，现在开展蛋白质转染细胞研究的同行较少。此外，已开发的性能可靠的蛋白质载体也很少，尤其不能同时具备转染效率高，安全低毒、适应广等重要要求。现有的蛋白质载体基本是直接使用目前较为成熟的非病毒基因载体。事实上，从一定程度上借鉴基因载体的经验也基本是可行的。目前在国内外，以下几种蛋白质转染试剂有见报道：

[0006] (1)聚苯乙烯微球：有人报道在聚苯乙烯微球表面合成双官能团，一个用来连接蛋白，一个用来细胞内追踪。结果微球体：(a)能稳定地连接蛋白质，(b)有一定的蛋白质转染效率，(c)进入细胞后，所释放的蛋白质有功能，可跟踪。(d)微球能进入初级免疫细胞、胚胎干细胞、人神经干细胞、分化小鼠神经干细胞和几个非吞噬细胞系等多种细胞。这主要是利用聚苯乙烯微球具有良好的亲水性。

[0007] (2)阳离子肽或阳离子脂质体试剂：阳离子肽被称为蛋白转导结构域(PTD)，已被证明能够有效地透过细胞膜。阳离子脂质体(Cationic liposome)，如LipofectamineTM2000等，因具有操作简便、生物安全性高、重复性好、转染效率较高等特点而成为目前应用最为广泛的非病毒载体，但仍有较大的毒性，限制了其应用。也有研究者将上述阳离子肽和阳离子脂质体进行混合，提高转染效率。

[0008] (3)多聚精氨酸：毒性非常大，一般认为没有临床应用前景，但适用细胞广，可有效地转染蛋白质到各种细胞，包括各种原代培养细胞和悬浮细胞。有研究者设计并制作了寡精氨酸，可减低其毒性，但毒性仍非常大。

[0009] (4)PEI：转染效率非常高，但因为毒性非常大，一般也不单独使用，常需与其它物质配合使用，以减低其毒性。如许多研究者将小分子PEI接枝到透明质酸等低毒性高分子载体上。也有研究者采用小分子PEI转染蛋白质，但毒性仍非常大。

[0010] 总之，现有的蛋白质载体不能同时具备安全低毒和高效转染两个基本要求，而且对细胞有一定的选择性。虽然已有少数的同行开展蛋白质载体的研究，但均未采用壳聚糖、低分子壳聚糖及其衍生物作为蛋白质转染载体。

[0011] 壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的甲壳素(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。值得指出的是，壳聚糖并非天然产物，它是天然物质甲壳素的脱乙酰产物。这种高分子的生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究均取得了重大进展。如壳聚糖降血脂、降血糖的作用已有研究报告；壳聚糖被作为增稠剂、被膜剂列入国家食品添加剂使用标准GB-2760。壳聚糖的降解也很安全，文献表明，已有30多种酶可以对它起作用，所以动物体内和细胞内都有相当多的酶可以降解它，如溶菌酶等。总体而言，壳聚糖是一种非常安全的物质。

[0012] 但是，壳聚糖作为基因载体，其转染效率低。众多文献表明，壳聚糖及其衍生物可以作为基因载体转染基因物质进入细胞，但转染效率仍普遍低于阳离子脂质体和病毒载体。故本领域的人一般关注将壳聚糖改性，提高其转染效率，这方面已有少量的文献和专利。研究者主要通过以下几个方法进行改性：1.接枝或共混PEI或精氨酸等阳离子载体，这主要因为阳离子载体穿膜效率高；2.接枝或共混PEG或酸如琥珀酸等，这主要是通过提高载体的亲水性来增加载体的穿膜能力；3.加入磷酸钙，这主要是因为磷酸钙与DNA结合成复合体，易于转染进入细胞；4.接枝TAT肽(穿膜肽)于壳聚糖，从而提高穿膜效率；5复合药物，提高靶向目标细胞能力，如复合半乳糖靶向肝细胞，如复合LHRH肽，靶向肝癌细胞等。

[0013] 另外，壳聚糖作为基因载体，对细胞有一定的选择性，这是壳聚糖作为基因载体的另一个缺点。文献表明，壳聚糖/DNA纳米粒子易进入肿瘤细胞、巨噬细胞等，而很难进入干细胞和成纤维细胞等。

[0014] 总之，壳聚糖虽然安全，但转染效率低，适用细胞类型少，不适宜作基因载体，未获得本领域人的普遍认可。而比壳聚糖分子量更小的低分子壳聚糖及其衍生物则更不宜作基因载体，这是因为低分子壳聚糖所携带的正电荷过少，很难完成包裹和压缩目的基因的任务。

[0015] 壳聚糖还应用在药物载体领域。壳聚糖作为一种安全的药物载体，已有人用于蛋白质(如抗体)药物载体的研究，如应用于蛋白质药的控释和缓释，属于药剂学领域。在控释领域，由于高分子壳聚糖及其衍生物具备海绵状特殊结构和溶解性，且降解产物不含任何对人体有害的物质，已应用于控制药物持续释放、改善药物的溶解性和吸收性等方面，如有人通过改变壳聚糖微粒的交联程度和负载蛋白质的量达到了优化药物包封率、微粒大小和释放度的目的。

[0016] 在缓释领域，壳聚糖作为缓释剂可使药物的释放受到控制，血药浓度平稳，并保持在有效浓度范围内，延长有效时间而不出现毒性。而且壳聚糖制成的缓释剂在胃肠内可以延长滞留时间，提高药物的生物利用度。目前研究的缓释剂型有：颗粒剂、片剂和胶囊剂等，如有人将高分子壳聚糖、海藻酸钠与蛋白质复合，口服给药，研究蛋白质药物的肠溶缓释作用。

[0017] 但至今还没有将低分子壳聚糖及其衍生物作为载体转染蛋白质进入细胞的研究和应用。

[0018] 事实上，一般科研购买的壳聚糖(分子量大于20000)及其改性的壳聚糖衍生物是不能作为载体转染蛋白质进入细胞的。主要原因是因为这个分子量级别的壳聚糖已不能溶于水，只能溶于酸性溶液。即使在酸性环境下，壳聚糖与蛋白质可构成可溶复合物，一旦应用在PH值为7.4的人体或细胞培养环境中，则立即发生沉淀反应，故无法转染蛋白质进入细胞，即使有少量进入，转染效率也低。而作为基因载体则影响较小，因为基因有较大的可压缩性，高分子壳聚糖与基因通过电荷作用可形成纳米级别的复合物，具有纳米尺寸效应，故可以溶于水，可以穿透细胞膜(虽然效率不高，对细胞有一定的选择性)。而作为药物载体，因为研究目的不是介导蛋白质进入细胞，而是控释和缓释蛋白质药物，故要求壳聚糖的分子量较大，一有利于缓释，二有利于包裹更多的蛋白质。故在此领域，常规使用的壳聚糖分子量常为50－100KD，甚至200－500KD。

[0019] 而低分子壳聚糖有这个能力，因为它在中性PH值下仍是溶于水的，不会发生沉淀反应，从而可以高效的介导蛋白质进入细胞。

[0020] 低分子壳聚糖可以分为两种，一种叫壳寡糖，一般为聚合度在2～10之间，分子量为320-1700之间的壳聚糖，这种壳寡糖的很多性质与一般应用于基因载体和药物载体的壳聚糖的性质差异很大；一种是介于壳寡糖和壳聚糖之间的物质，一般聚合度在10～60之间，分子量为1700-10000之间的壳聚糖，这种物质的性质介于壳寡糖和高分子壳聚糖之间。在本发明中，申请人发现，只要壳聚糖(包括衍生物改性或增加添加物)能溶于中性水溶液，其转染蛋白质的效率就高，而不溶解的则效率就低。

发明内容

[0021] 本发明的目的在于提供一种安全高效适应广的蛋白质转染进入细胞的载体。

[0022] 为达上述目的，本发明提供的一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的主要组分为低分子壳聚糖和/或低分子壳聚糖衍生物。

[0023] 本发明所述低分子壳聚糖是指壳聚糖经生物降解法、化学降解法或物理降解法降解，或者通过化学合成法或酶合成法得到的一种聚合度为2～120、分子量为320～20000的低分子壳聚糖。

[0024] 本发明所述低分子壳聚糖衍生物指以低分子壳聚糖为母体，对其中的原子或原子团用其他原子或原子团取代所形成的化合物，包括酰化、羧基化、羟基化、氰化、醚化、烷化、酯化、醛亚胺化、叠氮化、成盐、螯合、水解、氧化、卤化、接枝与交联反应制备的衍生物。低分子壳聚糖衍生物为磺化甲壳素、磺化羧甲基甲壳素、N-羟乙基壳聚糖、N-乙酰化壳聚糖、O-羧甲基壳寡糖、N-羧甲基壳聚糖、N-三甲基氯化壳寡糖、N-羟丙基壳聚糖乙酸酯、氰乙基或苯基氰乙基壳聚糖、N-丙(丁、己)酰化壳聚糖、N-甲基(苯)磺酰壳聚糖、N-邻苯二甲酰壳聚糖、N-丁(辛、十六烷)基壳聚糖、N-羧基丁基壳聚糖、N-硫酸壳聚糖、6-O-羟乙基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、甘油(3-氯丙烷-1,2-二醇)壳聚糖、B-D半乳糖苷支化壳聚糖、6-脱氧壳聚糖、6-O-单硫酸(3,6-O-二硫酸)壳聚糖、十二烷基磺酸钠壳聚糖中的一种或几种。

[0025] 进一步的，本发明所述载体的组分还包括次要组分，所述次要组分为PEG(聚乙二醇)、PEI(聚乙烯亚胺)、脂质体、磷酸钙、偏磷酸钙、海藻酸钠、HIV-1TAT短肽、多聚精氨酸、寡精氨酸、寡赖氨酸、聚苯乙烯、碳纳米管中的一种或多种。

[0026] 本发明所述载体的主要组分和次要组分的摩尔比为1∶0～100。

[0027] 本发明所述载体可与一种或多种类型的蛋白质结合，从而形成复合物，由于蛋白质和载体非共价结合，因此不会破坏蛋白质的生物学活性。所述复合物中，载体的主要组分和蛋白质的摩尔比为1∶0.1～100。

[0028] 本发明提供的载体具有安全、高效和适应广的特性，其中的安全是指载体本身和载体与蛋白质形成的复合物转染进入细胞后，载体本身对细胞的生长周期、增殖、凋亡、坏死无明显影响，载体的主要组分已通过FDA认可，没有或很少细胞毒性；高效是指载体本身和/或复合物转染进入细胞的比例可超过80％，载体可转染高浓度(最高达1-10mg/L)的蛋白质进入细胞，载体转染蛋白质进入细胞的时间快(一般为0.1-6h)；适应广是指载体本身和载体与蛋白质形成的复合物能转染进所有的动物细胞，载体转染蛋白质进入细胞的应用步骤简单，能免受细胞外的相关酶的降解。本发明所述复合物进入细胞，是指所形成的复合物进入细胞膜内，所述蛋白质转染进入细胞，是指蛋白质进入细胞膜内的细胞质或细胞核、内质网、线粒体等细胞器。

[0029] 与现有技术相比，本发明提供的蛋白质转染细胞的载体具有以下技术效果：

[0030] (1)载体与蛋白质结合后，能有效护蛋白质不受酶的降解。低分子壳聚糖和蛋白质主要通过电荷作用结合在一起，这种结合是共价结合，不会破坏蛋白质的生物学活性。但是这种结合可以将蛋白质的活性基团掩盖，故无法被培养基中的酶所识别，从而能有效护蛋白质而不受酶的降解。当然，培养基中也含有降解壳聚糖的酶，但因为降解低分子壳聚糖的酶专一性和效率均较差，故短时间内无法将低分子壳聚糖载体完全降解，所以无法解除低分子壳聚糖对蛋白质的保护作用。故如果应用于动物体内，低分子壳聚糖短时间内也不会(可很少量)被细胞外基质中的酶所降解，而会介导蛋白质进入到细胞。

[0031] (2)载体介导蛋白质转染进入细胞的效率高、数量多、时间快。在中性水溶液中，低分子壳聚糖呈正电荷，而大部分蛋白质为负电荷，即使少量蛋白质为正电荷，其正电荷的数值也远远小于低分子壳聚糖。两种溶液混合后，蛋白质与低分子壳聚糖将会团聚，一般情况下，会生成不规则的阳离子物质，即本发明中提到的复合物。在超声分散的情况下，如果蛋白质与壳聚糖的比例又恰当的话，将会出现大小比较均一的带正电荷的分散球体。由于复合体呈阳离子特性，易于进入细胞，所以蛋白质转染进入细胞的效率高、数量多、时间快。

[0032] (3)载体对细胞无明显毒性。载体材料低分子壳聚糖在食品领域和基因载体领域已经证实是无毒。由于动物体内和细胞内有多种可以降解壳聚糖的酶，低分子壳聚糖将会被逐步降解，蛋白质将会从复合物中解脱出来。由于低分子壳聚糖分子量不大，这个降解过程不长，降解产物也不多，故毒性很小或没有。而解脱出来的蛋白质将会根据自己的性质和细胞的种类而进入不同的细胞器，完成下一步的调控。所以载体对细胞的影响极小，蛋白质对细胞的影响就显现出来了，所以非常适合蛋白质的作用研究。

[0033] (4)载体适应广，可适用不同类型的动物细胞。由于不同的细胞有不同的吞噬能力，所以有些载体进入细胞的效率差别很大。本发明所提供的复合物能够进入所有类型的细胞，原因估计一是具有阳离子特性，二是粒子比较小，三是有糖基片断。

[0034] (5)操作简单。只需要将低分子壳聚糖和蛋白质进行简单的共混，就能制备出可以转染进入细胞的复合物。在超声分散的情况下，如果蛋白质与壳聚糖的比例又恰当的话，将会出现大小比较均一的带正电荷的分散球体。这有可能进一步降低载体的毒性。

附图说明

[0035] 图1为实施例3所形成的复合体的TEM形貌图；

[0036] 图2为本发明应用实施例1中制备的低分子壳聚糖-Dnase I酶复合体的琼脂糖凝胶电泳图；图中A:15000kb DNA marker；B:2ul 1600ng/ml的Oct4质粒DNA；C:B+7.5ul 100ug/ml Dnase I；D-I:B+7.5ul低分子壳聚糖-蛋白复合物(D:200ug/ml低分子壳聚糖-5000+100ug/ml DNase I；E:50ug/ml低分子壳聚糖-5000+100ug/ml DNase I；F:12.5ug/ml低分子壳聚糖-5000+100ug/ml DNase I；G:3.125ug/ml低分子壳聚糖-5000+100ug/ml DNase I；H:D:0.78ug/ml低分子壳聚糖-5000+100ug/ml DNase I；
I:0.19ug/ml低分子壳聚糖5000+100ug/ml DNase I)；

[0037] 图3为本发明应用实施例2中三种载体介导GFP蛋白进入细胞的荧光显微镜图；

[0038] 图4为本发明应用实施例3中hBMSC经复合体诱导后的光镜形貌图；

[0039] 图5为本发明应用实施例3中hMSCs经四种心肌调控蛋白诱导后的免疫荧光图；

[0040] 图6为本发明应用实施例3中超声心动图检测细胞移植后的心EF图；图中Sham：正常对照组；PBS：PBS对照组；iCPC：iCPC细胞移植组，N＝6，*P<0.01vs PBS组；

[0041] 图7为本发明应用实施例3中细胞移植后4周后梗死区域的HE染色图；

[0042] 图中A：正常对照组；B：PBS对照组；C：iCPC细胞移植组。

具体实施方式

[0043] 实施例1

[0044] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分为分子量500的低分子壳聚糖。

[0045] 将上述载体配成200ug/ml水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用TEM观察复合体的形貌；采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0046] 实施例2

[0047] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分为分子量1300的低分子壳聚糖。

[0048] 将上述载体配成200ug/ml水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用TEM观察复合体的形貌；采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0049] 实施例3

[0050] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分为分子量5000的低分子壳聚糖。

[0051] 将上述载体配成200ug/ml水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用TEM观察复合体的形貌(如图3所示)；采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0052] 实施例4

[0053] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分为分子量20000的低分子壳聚糖。

[0054] 将上述载体配成200ug/ml水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用TEM观察复合体的形貌；采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0055] 实施例5

[0056] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分为低分子壳聚糖衍生物，低分子壳聚糖衍生物为N-羟乙基壳聚糖、N-乙酰化壳聚糖、O-羧甲基壳寡糖。

[0057] 将上述低分子壳聚糖衍生物按质量比1：1：1配制成200ug/ml水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能溶于中性水溶液，能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0058] 实施例6

[0059] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分由分子量1300的低分子壳聚糖和低分子壳聚糖衍生物组成，其中低分子壳聚糖衍生物为N-羧基丁基壳聚糖和N-硫酸壳聚糖(分子量均为20000，均可溶于中性水)，低分子壳聚糖和低分子壳聚糖衍生物的摩尔比为1：1。

[0060] 将上述载体配制成200ug/ml水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能溶于中性水溶液，能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0061] 实施例7

[0062] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分由分子量1300的低分子壳聚糖和次要组分组成，其中次要组分为分子量5000的PEG，低分子壳聚糖和次要组分的摩尔比为1：0.2。PEG的加入主要是提高亲水性能。

[0063] 将上述载体配成200ug/ml的水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0064] 实施例8

[0065] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分由低分子壳聚糖衍生物和次要组分组成，其中低分子壳聚糖衍生物为N-羧甲基壳聚糖，次要组分为阳离子脂质体(LIPO2000)，低分子壳聚糖衍生物和阳离子脂质体的摩尔比为1：0.2。

[0066] 将上述载体配成200ug/ml的水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0067] 实施例9

[0068] 本实施例提供的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其组分由分子量5000的低分子壳聚糖、低分子壳聚糖衍生物和次要组分组成，其中低分子壳聚糖衍生物为O-羧甲基壳聚糖，次要组分为PEI(分子量为20000)，低分子壳聚糖、O-羧甲基壳聚糖和PEI的摩尔比为1：1：0.2。

[0069] 将上述载体配成200ug/ml的水溶液；取Dnase I蛋白质，将其配成100ug/ml的PBS溶液；将上述两种溶液各取7.5ul混合于EP管中，超声15秒，获得混合溶液，即形成了复合体；将混合溶液直接加入到已培养hMSC细胞的细胞培养基中，培养基体积为2ml。采用免疫荧光方法观察蛋白质转染的效果，结果证实上述载体能将蛋白质转染进入hMSC细胞。

[0070] 本发明提供了一种蛋白质转染细胞的载体，操作简单，包括以下步骤：制备或购买低分子壳聚糖，或制备低分子壳聚糖的衍生物，将其配成一定浓度的水溶液；制备或购买一种或多种蛋白质，将其配成一定浓度的水溶液；将上述两种溶液按一定的比例混合、震荡；将混合溶液直接加入到已培养细胞的细胞培养基中，或直接注射到动物体内如静脉中。

[0071] 应用实施例1

[0072] 应用实施例2制备的载体，与DNase I酶形成复合物，考查该复合物能否降解OCT4质粒，明确低分子壳聚糖与DNase I酶的配比关系。包括以下步骤：

[0073] (1)取载体定量成浓度为10mg/ml的水溶液，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调PH值至7.4。将上述水溶液梯度稀释至200.00，50.00，12.50，3.13，0.78，0.19ug/ml浓度。

[0074] (2)取DNase I酶，配制成100ug/ml的PBS溶液。

[0075] (3)分别取上述稀释的低分子壳聚糖溶液与100ug/ml DNase I酶各7.5ul混合，4℃，震荡过夜，即为系列“低分子壳聚糖-DNase I酶”混合溶液。

[0076] (4)将上述混合溶液、对照组进行琼脂糖凝胶电泳。

[0077] 结果如图2所示，DNase I酶浓度为100ug/ml，低分子壳聚糖浓度为200.00，50.00，12.50，3.13，0.78ug/ml时，均具有保护作用，其中壳聚糖浓度为200.00，50.00ug/ml时，因为浓度过大，电泳效果较差，无法进行有效的分离。12.50，3.13，0.78ug/ml三个浓度的DNase I酶较适宜。

[0078] 应用实施例2

[0079] 应用实施例3、7和9制备的载体，将GFP蛋白转染进入hBMSC细胞，研究上述载体的转染能力和实验方法。包括以下步骤：

[0080] (1)取实施例3、7和9制备的载体，将其分别配成浓度为200ug/ml的溶液。

[0081] (2)取GFP蛋白，配制成100ug/ml的PBS溶液

[0082] (3)分别取上述载体溶液与100ug/ml GFP蛋白溶液各7.5ul混合，4℃，震荡过夜，即为复合体溶液。

[0083] (4)将1ug/ml的复合体溶液加入2ml的培养基中，3h后，荧光显微镜下观察其转染状况。

[0084] 结果如图3所示，上述三种载体均能有效的转染GFP蛋白进入hBMSC细胞。因为hBMSC细胞很难被蛋白转染进去。这说明上述三种载体的转染能力非常优异。且随着时间的增加，其转染率逐渐提高。

[0085] 应用实施例3

[0086] 应用实施例3制备的载体，介导Tbx5,Hand2,Mef2c,Gata4等四个重组蛋白进入hBMSC细胞，观察细胞是否转化成心肌祖样细胞。包括以下步骤：

[0087] (1)取载体定量成浓度为10mg/ml的水溶液，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调PH值至7.4，将其分别配成浓度为200ug/ml的溶液。

[0088] (2)将上述四种蛋白分别溶解于PBS溶液，其浓度分别为100ug/ml。

[0089] (3)将上述五种溶液各取7ul，共混，震荡，获得复合体溶液。

[0090] (4)加入hBMSC细胞的培养基中，分别于不同时间观察其表面变化形貌，通过免疫荧光观察细胞的变化。

[0091] (5)收集12d的细胞直接注射入心肌梗死模型的大鼠心肌受损心肌处，在造模的同时给予超顺磁氧化铁颗粒(SPIO)标记的piCPC局部注射，注射等量PBS为对照。

[0092] (6)分别于1周，2周，3周和4周超声心动图检测各组大鼠的心功能，HE染色检测移植细胞对心梗区域的修复作用。

[0093] 图4和图5的结果显示，hMSCs经四种心肌调控蛋白诱导后，isl-1、myl2等心肌特异蛋白的表达量有明显上调，不论是聚集还是经消化后散布生长，hMSCs都呈现向心肌祖细胞方向分化的趋势，表达其三个谱系的标记。这说明通过蛋白质转染的方法，有望可以实现hMSCs往心肌祖细胞的分化。图6和图7的结果显示，采用转化的细胞比PBS组有明显的优势。

标题	发布/更新时间	阅读量
具转染力的分子-专利编号CN1163896A	2020-05-13	699
细胞转染-专利编号CN1158898A	2020-05-11	577
聚肽型转染试剂-专利编号CN100434520C	2020-05-12	290
聚肽型转染试剂-专利编号CN1821399A	2020-05-13	929
转染颗粒-专利编号CN1290178A	2020-05-11	918
细胞转染方法-专利编号CN104619848A	2020-05-12	832
转染具有基因沉默活性的寡核苷酸的组合物-专利编号CN101631553B	2020-05-12	417
具转染力的分子-专利编号CN1281620C	2020-05-13	77
转染剂-专利编号CN1845932A	2020-05-11	828
转染剂-专利编号CN102131926A	2020-05-11	744

一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体

一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体

技术领域

背景技术

发明内容

附图说明

具体实施方式

IPRDB

热门服务

关于我们

友情链接

联系方式