[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种检测试剂盒，特别是一种采用增强纳米胶乳免疫比浊法检测人血清中和关节腔液中补体C1q浓度的试剂盒及其方法。

[0002] 补体C1q是补体系统Cl的第一组成成份，是一个巨分子量糖蛋白，一个C1q分子由18个多肽链成，化学组成为胶原性蛋白分子量：410KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体C1q浓度，但是其步骤复杂，准确性不高。

[0003] 本发明的目的在于提供一种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体C1q浓度的试剂盒及方法，所述的这种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体C1q浓度的试剂盒及方法要解决现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体C1q浓度过程复杂，准确性不高的技术问题。

[0004] 本发明提供了一种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体C1q浓度的试剂盒，包括两种试剂，其特征在于：I试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000、EDTA-NA2和TX-100组成，在I试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量浓度为2.7g/L，所述的PEG6000的质量浓度为50g/L，所述的EDTA-NA2的质量浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，II试剂由兔抗人补体C1q抗血清或羊抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q单克隆抗体交联在胶乳颗粒上悬浊液组成。

[0005] 进一步的，所述的II试剂是通过碳二亚胺反应将兔抗补体C1q抗体、或羊抗补体C1q抗体、或鼠抗补体C1q抗体，或鼠抗人补体C1q单克隆抗体、IgG共价结合到胶乳颗粒上。

[0006] 进一步的，所述的TX-100的纯度为100％。

[0007] 进一步的，所述的兔抗人补体C1q抗血清的效价为1∶64。

[0008] 本发明还提供了一种检测人血清中补体C1q浓度的方法，采用上述的试剂盒，包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样本加入I试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入II试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准采用生化分析仪测定的步骤中，将校准加入I试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入II试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；

[0009] 结果计算：

[0010]

[0011] 上述测定的参数为：温度37℃，主波长546nm或600nm、副波长700nm，样本或校准品3-4μl，R1：240μl，R2：60μl，反应时间为10分钟。

[0012] 本发明的兔抗人补体C1q抗血清或羊抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q单克隆抗体可以在市场购买，也可以通过常规的免疫方法制备。

[0013] 本发明的试剂盒和方法是采用增强纳米胶乳免疫比浊法的测定原理，即利用补体C1q抗原和交联在乳胶颗粒上的兔抗人补体C1q抗血清、羊抗人补体C1q抗血清、鼠抗人补体C1q抗血清、鼠抗人补体C1q单克隆抗体相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浑浊，其浊度高低，即透光度减少、吸光度增加反映人血清样本中补体C1q的浓度，补体C1q的浓度可由校准品所作的剂量反应曲线算出。

[0014] 采用本发明的试剂盒和方法测得的C1q的浓度可以作为科研和教学使用。

[0015] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的试剂盒和方法用于测定补体C1q浓度的过程简单方便，准确性高。

[0016] 图1是由校准品所作的补体C1q浓度和吸光度的剂量反应曲线图。

[0017] 实施例1

[0018] 1.1适用仪器

[0019] 半自动、全自动生化分析仪。

[0020] 1.2分析方法

[0021] 增强纳米乳胶免疫比浊法。

[0022] 1.3性能要求

[0023] 1.3.1试剂外观

[0024] R1：无色澄清透明液体；

[0025] R2：淡黄色澄清液体或胶乳悬液。

[0026] 1.3.2试剂空白吸光度(A)

[0027] 吸光度(A)：R1+R2≤0.04A(在温度37℃；主波长546nm、600nm(副波长700nm))。

[0028] 1.3.3精密度

[0029] 1.3.3.1批内精密度

[0030] CV≤10％。

[0031] 1.3.4批间精密度

[0032] 相对极差≤10％。

[0033] 1.3.5准确度

[0034] 不准确度：±10％的范围以内。

[0035] 1.3.6分析灵敏度

[0036] 吸光度(A)＞0.04A。

[0037] 1.3.7线性

[0038] 在50mg/L-400mg/L范围内，相关系数(γ)≥0.9900。

[0039] 1.3.8稳定性

[0040] 试剂在2℃-8℃避光贮存至有效期末前后两个月，进行检测，其质量符合上项的规定。

[0041] 实验方法

[0042] 实施例2

[0043] 2.1检测条件

[0044] 2.1.1生化分析仪(以下简称仪器)

[0045] 日立7060自动生化分析仪。

[0046] 2.1.2工作环境温度

[0047] 室温15-32℃。

[0048] 室内湿度45-85％RH。

[0049] 2.1.3主要测定参数及操作步骤

[0050] 温度37℃；主波长546nm、600nm(副波长700nm)，样本或校准品3-4μl；R1：240μl；R2：60μl，反应时间10分钟。

[0051] 方法类型：二点终点法。

[0052] 样本或校准品加试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点(A1)，加入试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点(A2)，样本A＝A2-A1。

[0053] 结果计算：

[0054]

[0055] 2.1.4校准品

[0056] 本标准中所用校准品为浙江省玉环县南方试剂厂生产的标准品。

[0057] 2.2试剂外观

[0058] 光下目测试剂盒，R1：无色澄清透明液体；R2：淡黄色澄清液体。

[0059] 2.3试剂空白吸光度值

[0060] 取R1240μl，加蒸馏水4μl，置37℃孵育5min后，加入R260μl，置37℃孵育5min后，在7060自动生化分析仪上，用546nm、600nm波长，测定其吸光度值应符合实施例1中1.3.2项的规定。

[0061] 2.4精密度

[0062] 2.4.1批内精密度试验方法

[0063] 在仪器正常工作条件下，用同一批试剂，连续测试(约200mg/L)样本20次，计算其测量值的平均值 和标准差(SD)，再按以下公式计算变异系数(CV％)的值，其结果应符合实施例1中1.3.3.1项的规定。

[0064] n

[0065] SD＝{∑(Xi-X)2/(N-1)}1/2

[0066] I＝1

[0067]

[0068] 式中：SD-标准偏差；

[0069] CV-变异系数；

[0070] -n次测定值的均值；

[0071] Xi-第i次的测定值；

[0072] n-测量次数。

[0073] 2.4.2批间精密度试验方法

[0074] 在仪器正常工作条件下，取三个批号试剂，每个批号取一套。分别测定(约200mg/L)样本各3次。然后计算每批测定结果的均值 和三批试剂测定结果的总均值按照下列公式求出三个批号试剂的测定均值的相对极差(％)，其结果应符合实施例1中1.3.4项的规定。

[0075]

[0076] 式中： 为 中最大值， 为 中最小值。

[0077] 2.5准确度

[0078] 在仪器正常工作条件下，试剂用浙江玉环南方试剂厂生产的标准品经定标后，测定已知浓度的样本，重复测定10次，其测量结果的均值的相对偏差应符合实施例1中1.3.5项的规定。

[0079] RE％＝绝对偏差/TV×100％

[0080] 绝对偏差＝检测结果均值-标准品靶值

[0081] 式中：TV-测定标准品的靶值

[0082] 2.6分析灵敏度

[0083] R1试剂240μl，加入50mg/L样本4μl，置37℃孵育5min后，加入R260μl，置37℃孵育5min后，在7060自动生化分析仪上，用546nm、600nm，主波长(副波长700nm)，测吸光度，其结果应符合实施例1中1.3.6项的规定。

[0084] 2.7线性试验

[0085] 样本或校准品：选用按实施例3配制的1#、2#、3#、4#、和5#各测试浓度样本或校准品。

[0086] 测定步骤：在仪器正常工作条件下，经定标后，用试剂测定以上五个浓度样本或校准品，每一浓度样本或校准品分别测定3次，取均值为实测值Yi。

[0087] 计算：按以下公式计算相关系数γ，其结果应符合实施例1中1.3.7项的规定。

[0088]

[0089] 式中：γ-相关系数

[0090] Xi-i#样本的理论值

[0091] Yi-i#样本的实测值

[0092] i-不同浓度测试样本的编号

[0093] 5.8稳定性

[0094] 取在规定贮存条件下保存至有效期末前后二个月内的试剂进行检测，其结果应符合实施例1中1.3.8项的规定。

[0095] 实施例3

[0096] 试剂的配制

[0097] 取一含量约为200mg/L的样本，为样本4#，将样本4#按下表方法用生理盐水或纯水配制成5个测试样本。(此样本现用现配)

[0098]1# 2# 3# 4# 5#
校准品 - 4μl 2μl 4μl 8μl
生理盐水 4μl 12μl - - -
稀释后取样量 - 4μl - - -
浓度(mg/L) 0 50 100 200 400

[0099] 样本或校准品加试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点(A1)，加入试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点(A2)，样本A＝A2-A1。

[0100] 结果仪器计算：

[0101]

[0102] 通过上述样品的测定，得到了图1所示的补体C1q浓度和吸光度的剂量反应曲线图。

[0103] (图1是根据波长600nm的OD值所做的曲线，副波长700nm的仅供参考用。)[0104]

[0105] 通过图1，测定了500例正常人的血清，结果如下表描述，根据卫生部医政司“全国临床检验规程”中介绍的补体C1q在血清中正常参考值：157-237mg/L，说明采用本发明的试剂盒和方法测定的C1q的浓度还是准确的和可靠的。

[0106] 500例健康人人血清中补体C1q浓度(mg/L)

[0107]人数 数值 人数 数值 人数 数值 人数 数值 人数 数值 人数 数值
1 179 9 196 17 196 25 221 33 206 41 195
2 174 10 199 18 178 26 205 34 195 42 205
3 166 11 201 19 221 27 192 35 206 43 200
4 198 12 193 20 207 28 196 36 182 44 198
5 206 13 194 21 197 29 213 37 198 45 215
6 195 14 203 22 194 30 206 38 196 46 161
7 216 15 221 23 184 31 191 39 194 47 180
8 194 16 196 24 207 32 192 40 226 48 196[0108]
49 205 78 195 107 196 136 206 165 196 194 193
50 200 79 194 108 194 137 200 166 192 195 203
51 160 80 206 109 196 138 192 167 194 196 191
52 194 81 187 110 199 139 196 168 195 197 200
53 206 82 198 111 199 140 197 169 217 198 198
54 184 83 225 112 200 141 195 170 198 199 183
55 163 84 217 113 196 142 196 171 196 200 226
56 206 85 193 114 195 143 198 172 193 201 195
57 207 86 195 115 196 144 199 173 188 202 198
58 205 87 204 116 194 145 232 174 198 203 194
59 198 88 196 117 196 146 193 175 195 204 206
60 195 89 198 118 201 147 194 176 194 205 198
61 230 90 196 119 195 148 196 177 229 206 198
62 197 91 195 120 191 149 163 178 195 207 191
63 194 92 182 121 193 150 195 179 204 208 195
64 195 93 207 122 195 151 196 180 199 209 193
65 195 94 198 123 179 152 172 181 198 210 195
66 198 95 217 124 197 153 192 182 183 211 161
67 205 96 203 125 197 154 203 183 195 212 199
68 204 97 192 126 166 155 229 184 196 213 219
69 187 98 196 127 195 156 197 185 198 214 195
70 228 99 229 128 194 157 226 186 205 215 192
71 199 100 197 129 196 158 198 187 206 216 187
72 196 101 192 130 196 159 196 188 196 217 196
73 198 102 195 131 195 160 200 189 201 218 193
74 196 103 181 132 193 161 192 190 233 219 206
75 184 104 186 133 201 162 184 191 226 220 197
76 202 105 194 134 193 163 188 192 188 221 194
77 196 106 198 135 228 164 204 193 194 222 195[0109]
223 207 252 204 281 193 310 182 339 165 368 198
224 228 253 216 282 207 311 196 340 196 369 219
225 199 254 196 283 205 312 189 341 202 370 192
226 200 255 207 284 191 313 206 342 216 371 221
227 196 256 199 285 196 314 198 343 184 372 196
228 198 257 192 286 221 315 200 344 195 373 206
229 197 258 222 287 195 316 229 345 194 374 196
230 196 259 201 288 173 317 194 346 183 375 192
231 197 260 194 289 198 318 186 347 196 376 189
232 196 261 206 290 191 319 191 348 203 377 203
233 195 262 171 291 184 320 163 349 196 378 196
234 197 263 192 292 217 321 197 350 201 379 197
235 219 264 199 293 182 322 231 351 192 380 196
236 194 265 206 294 183 323 190 352 201 381 190
237 199 266 194 295 186 324 189 353 199 382 179
238 193 267 207 296 200 325 187 354 198 383 192
239 196 268 196 297 199 326 192 355 194 384 190
240 201 269 198 298 182 327 196 356 197 385 196
241 198 270 193 299 233 328 196 357 195 386 195
242 200 271 171 300 189 329 191 358 162 387 183
243 196 272 203 301 159 330 160 359 209 388 208
244 163 273 189 302 194 331 196 360 219 389 198
245 196 274 195 303 201 332 188 361 233 390 194
246 227 275 206 304 182 333 194 362 221 391 203
247 159 276 219 305 166 334 198 363 190 392 220
248 191 277 207 306 184 335 201 364 213 393 195
249 195 278 196 307 196 336 196 365 196 394 180
250 209 279 206 308 201 337 195 366 184 395 159
251 226 280 194 309 184 338 205 367 229 396 204[0110]
397 192 421 199 445 197 469 199 493 203 397 192
398 195 422 197 446 196 470 184 494 233 398 195
399 197 423 182 447 196 471 191 495 172 399 197
400 195 424 205 448 201 472 197 496 224 400 195
401 193 425 197 449 178 473 196 497 160
402 187 426 203 450 207 474 204 498 164
403 191 427 190 451 213 475 205 499 184
404 181 428 195 452 164 476 196 500 159
405 197 429 161 453 229 477 180
406 232 430 181 454 192 478 194
407 210 431 198 455 172 479 196
408 182 432 191 456 200 480 193
409 179 433 170 457 194 481 196
410 188 434 233 458 181 482 177
411 209 435 193 459 178 483 196
412 196 436 232 460 171 484 229
413 180 437 204 461 189 485 198
414 173 438 230 462 202 486 196
415 194 439 159 463 166 487 163
416 164 440 174 464 208 488 160
417 200 441 184 465 211 489 233
418 189 442 164 466 195 490 160
419 173 443 189 467 196 491 191
420 181 444 193 468 199 492 161