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同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒

阅读：356发布：2021-02-23

IPRDB可以提供同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒，其包括检测MTHFR基因rs1801394位点的引物对和荧光探针对，所述引物对中上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述探针对中上、下游探针的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。藉由本发明提供的试剂盒，能够高灵敏度、特异性的、简便、快捷、准确的测定检测MTHFR基因rs1801394位点的SNP。，下面是同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒，其特征在于包括检测MTHFR基因rs1801394位点的引物对，所述引物对中上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于还包括检测MTHFR基因rs1801394位点的荧光探针对，所述探针对中上游探针和下游探针的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，且所述上游探针的5’端和下游探针的5’端还分别连接有荧光基团。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述荧光基团包括FAM或VIC基团。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述上游探针的5’端连接有FAM基团。

5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述下游探针的5’端连接有VIC基团。

6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述上游探针的3’端和下游探针的3’端还均连接有MGB基团。

7.如权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液，聚合酶和dNTP。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括正常基因型对照gDNA标本。

说明书全文

同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明具体涉及一种检测同型半胱氨酸代谢相关基因MTHFR A66G的rs1801394 SNP 位点的单核苷酸多态性 (SNP) 的试剂盒，属于生物医学领域。。

[0002]

背景技术

[0003] 同型半胱氨酸 (HCY)，或称为高半胱氨酸或同半胱氨酸，是从S-腺苷基甲硫氨酸透过两个反应步骤途径形成，并能回转成甲硫氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸或牛磺酸。缺乏维他命如叶酸、VB6 或 VB12，HCY 水平都会上升。补充叶酸、VB6、VB12 或三甲基甘氨酸会减少血液内的 HCY 的浓度。高水平的 HCY 与心脑血管疾病，胎儿发育异常，肿瘤发生等密切相关。叶酸，HCY 的代谢中相关酶基因的突变将导致酶活性的降低，使 HCY 水平上升。

[0004] 过去的大量研究表明，同型半胱氨酸代谢相关酶MTHFR的基因遗传多态性直接或间接影响同型半胱氨酸在体内的代谢过程。正常的 MTHFR 活性能保持叶酸和甲硫氨酸循环的有效性，维持体内 HCY 的正常水平，其中A66G多态将使相关基因编码的酶活性下降，减低机体对于叶酸的吸收利用能力，易造成叶酸缺乏，同时孕妇先兆流产。

[0005] 然而，目前尚缺少能有效、准确的检测MTRR A66G基因突变的相关手段。

发明内容

[0006] 本发明的主要目的在于提供一种同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒，以克服现有技术中的不足。

[0007] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了一种同型半胱氨酸代谢相关基因MTRR A66G的检测试剂盒，其包括检测MTHFR基因rs1801394位点的引物对，所述引物对中上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

[0008] 进一步的，所述的检测试剂盒还包括检测MTHFR基因rs1801394位点的荧光探针对，所述探针对中上游探针和下游探针的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，且所述上游探针的5’端和下游探针的5’端还分别连接有荧光基团。

[0009] 进一步的，所述荧光基团包括FAM或VIC基团。

[0010] 进一步的，所述上游探针的5’端连接有FAM基团。

[0011] 进一步的，所述下游探针的5’端连接有VIC基团。

[0012] 进一步的，所述上游探针的3’端和下游探针的3’端还均连接有MGB基团。

[0013] 进一步的，所述试剂盒还可包括PCR反应缓冲液，聚合酶和dNTP。

[0014] 进一步的，所述试剂盒还可包括正常基因型对照gDNA标本。

[0015] 藉由本发明的试剂盒，能够高灵敏度、特异性、准确（检测阴性、阳性参考品的符合率为100%）、简便快捷（一个检测周期最短可以控制在数分钟内）实现MTHFR A66G的rs1801394 SNP 位点的单核苷酸多态性检测，，适合临床和科研使用。

[0016]

具体实施方式

[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0018] 一、试剂盒的组成及配置1、主要原材料来源及制备方法：
本试剂盒的引物和探针序列如下：
上游引物rs1801394-fp如 SEQ ID NO.1 所示：
5′ - CTACACAGCAGGGACAGGCA-3′；
下游引物rs1801394-rp如 SEQ ID NO.2 所示：
5′ - GATCTGCAGAAAATCCATGTACCA-3′；
上游荧光探针rs1801394-FAM如 SEQ ID NO.3 所示：
5′ -FAM- TGCTCACATATTTC- MGB-3′。

[0019] 下游荧光探针rs1801394-VIC如 SEQ ID NO.4 所示：5′ -VIC- TGCTCACACATTTC- MGB-3′。

[0020] 2、每次实验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，视该次实验无效，需重复。为证明是否有污染存在，每次实验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次实验无污染；如结果为阳，则视该次实验无效，需重复。

[0021] 3、引物和探针：将 Genebank 数据库中调取的 MTRR A66G基因组全序列进行比对分析，用 Primerpremier5.0 和 Oligo6.0 设计 PCR 引物扩增获取目的 DNA 片段，同时在这个片段上设计特异性探针。要求各探针Tm值相差不超过5℃，在同一温度下具有最适宜的杂交灵敏度和特异性。

[0022] 引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，均由苏州金唯智生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。

[0023] 4、Taq DNA 聚合酶、dN(U)TP 等均可从市场够得，例如 Taq DNA 聚合酶可使用 Takara 公司公司产品。dN(U)TP 可使用上海普洛麦格 (Promega) 生物技术有限公司产品，稀释至使用浓度分装备用。

[0024] 5、阳性参考品：获取自合作医院，为十位MTHFR A66G rs1801394 SNP 位点突变患者的基因样品，经基因测序标定。

[0025] 6、阴性参考品：获取自合作医院，为十位健康人员的基因样品，经基因测序标定。

[0026] 7、配置阳性反应体系：PCR管内加入阳性参考品4.8μl、加入5μl扩增缓冲液（含10×PCR buffer、25mMMgCl2，100mMdATP、100mMdGTP，100mMdCTP、100mMdTTP，前述上、下游引物及上、下游探针，余量为超纯水）和 0.2 聚合酶 (2.5U/μl) 混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，避光备用。

[0027] 8、配置阴性反应体系：PCR管内加入阴性参考品4.8μl、加入5μl扩增缓冲液（含10×PCR buffer、25mMMgCl2，100mMdATP、100mMdGTP，100mMdCTP、100mMdTTP，前述上、下游引物及上、下游探针，余量为超纯水）和 0.2 聚合酶 (2.5U/μl) 混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，避光备用。

[0028] 9、对上述阴性、阳性反应体系同时进行 PCR 反应，PCR 程序见下表：同时于 Stratagene Mx3005P 荧光定量 PCR 仪上进行扩增检测。检测结果：阳性参考品及阴性参考品的检测符合率达到100%。

[0029] 12、随机选取一百位人员，并探询其家族病史和个人既往病史，其中1位的家族成员中普遍存在叶酸缺乏病症，2位人员曾被检出叶酸缺乏，其余均正常。

[0030] （1）全血基因组 DNA 的提取：取100位受检者外周静脉血 300μl，加入 700μl 细胞裂解液，颠倒混匀 5 次，12000rpm 离心 1 分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留 2 分钟，确保沉淀在管中，加入 300μl 双蒸水，涡旋震荡混匀成100份细胞裂解悬液。

[0031] （2）参照前述阳性或阴性反应体系的配置方法，分别将前述的各细胞裂解悬液4.8μl与5μl扩增缓冲液和 0.2μl 聚合酶 (2.5U/μl) 混合构成独立的反应体系。

[0032] （3）参照前述的第9步骤对这些独立的反应体系进行PCR扩增和荧光定量检测。检测结果：其中1位待检人员存在rs1801394位点突变，该待检人员为家族成员中普遍存在叶酸缺乏病症的待检人员。其余人员均正常。

[0033] （4）采集步骤（3）中检出的、存在rs1801394位点突变的待检人员的基因，并利用基因测序法对其MTRR A66G的rs1801394位点进行检测，发现其中存在碱基突变。

[0034] 同时，利用基因测序法对其余99位待检人员基因进行检测，其MTRR A66G的rs1801394位点均无突变。

[0035] 本发明的检测试剂盒具有高特异性和灵敏度，且使用时操作简单、经济高效、可进行高通量的样本检测。

[0036] 应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

标题	发布/更新时间	阅读量
防震试剂盒盖体-专利编号CN205708085U	2020-05-13	73
一种试剂瓶-专利编号CN204507729U	2020-05-11	756
安泡标定试剂-专利编号CN87212448U	2020-05-13	515
一种新型试剂盒-专利编号CN206125725U	2020-05-12	835
一种试剂瓶-专利编号CN203033111U	2020-05-11	1046
检测试剂盒-专利编号CN205774482U	2020-05-12	547
试剂盒-专利编号CN203324253U	2020-05-11	584
肌钙蛋白试剂盒-专利编号CN205991994U	2020-05-13	433
试剂盒系统-专利编号CN205720172U	2020-05-12	497
检测试剂盒-专利编号CN203324271U	2020-05-11	628

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