本发明涉及一种或多种预防或治疗性传播疾病的抗原及其在疫苗 制备中的用途，该疫苗用于向女性个体给药，预防或治疗与引起性传播 疾病的病原体相关的感染。本发明也涉及将该疫苗给药于女性个体以预 防或治疗与引起性传播疾病的病原体相关的感染的方法。

引起性传播疾病的病原体(STD)已为人所知，现在迫切需要有效 治疗或预防该病症的疫苗。

有时，性传播疾病由一种或多种病原体引起。因此，需要能够预防 和/或治疗一种或多种STD的组合疫苗。

现已发现，某些疫苗制剂在预防或治疗对STD易感或已罹患该病 的女性个体的STD具有惊人的效果。

本发明提供了治疗已经罹患一种或多种性传播疾病或对其易感的 女性个体的方法，该方法包括需要时给予女性个体有效量的疫苗制剂， 所述疫苗制剂含有一种或多种来自STD致病病原体或与其相关的抗原 以及一种佐剂。

优选该佐剂是TH1诱导佐剂。

在一个相关的方面，本发明提供了一种或多种来自STD致病病原 体或与其相关的抗原和一种佐剂在制备一种疫苗中的用途，所述佐剂尤 指TH1诱导佐剂，所述疫苗用于给药于女性个体预防和/或治疗一种或 多种STD。

来自STD致病病原体或与其相关的抗原的实例包括来自疱疹病毒 (HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV-所有病毒型)、沙眼 衣原体、淋病奈瑟氏球菌、梅毒密螺旋体(梅毒)和杜克雷嗜血杆菌(软 下疳)或与其相关的病原体。

包括重组细菌、重组病毒、融合蛋白、肽和模拟表位(mimotope) 的其它抗原来源也可使用。

上面所列并非穷举，其它病原体为执业医师和本领域其它技术人员 所熟知，并可参见普通教科书。

用于本发明的合适佐剂包括疫苗制备领域熟知的佐剂。“TH-1 诱导佐剂”是指优先刺激TH1细胞应答的佐剂。

公知的TH1应答已经受到刺激的信号是IFN-γ和IL-2等TH1型 细胞因子的产生增加。IFN-γ分泌与抗细胞内病原体(包括寄生虫、 细菌和病毒)的保护性应答相关。IFN-γ对白细胞的活化增强对细胞 内病原体的杀伤，增加Fc受体的表达。也存在直接细胞毒性，特别是 与淋病毒素(TH1细胞的另一种产物)协同作用时。IFN-γ既是NK细 胞的诱导物，又是其产物，NK细胞是保护作用的主要内生效应物。通 过IFN-γ或其它机制的TH1型应答优先对鼠IgG2a免疫球蛋白同种型 提供帮助。

相反，TH2型应答与体液机制和IL-4、IL-5、IL-6、IL-10以 及肿瘤坏死因子β相关。

能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂可参见国际专利申请WO 94/00153和WO 95/17209。

3 De-O-酰化单磷脂酰类脂A(3D-MPL)就是这样一种佐剂。这 一点可参见GB2220221(Ribi)。化学上，它是一种3 De-O-酰化单磷 脂酰类脂A与4、5或6酰化链的混合物，由Ribi Immunochem Montana 生产。优选的3 De-O-酰化单磷脂酰类脂A的“小颗粒”形式公开于EP 0 689 45481(SmithKline Beecham Biologicals SA)。

在这种3-DMPL的“小颗粒”中，3D-MPL颗粒小到足以通过 0.22微米膜过滤除菌(参见欧洲专利0 689 454)。

其它优选的可以用于本发明的佐剂包括QS21，来自Quillaja Saponaria Molina树皮的Hplc纯化的无毒级分。可选地，QS21可以与 3 De-O-酰化单磷脂酰类脂A(3D-MPL)混合，可选地还与一种佐剂 混合。

制备QS21的方法(以及QS21)公开于美国专利5,057,540，可获 自Aquilla Pharmaceuticals。

含QS21的无反应原性佐剂在之前已有详细描述(WO96/33739)。 这样的含QS21和胆甾醇的制剂在与抗原配制在一起时，已证实可成功 激活TH1。因而本发明中涉及的疫苗组合物包括QS21和胆甾醇。

优先刺激TH1细胞应答的其它佐剂包括免疫调制的寡核苷酸，如 公开于WO96/02555的非甲基化CpG序列。

诸如上述的不同TH1刺激佐剂的组合物也可作为优先刺激TH1应 答的佐剂。如QS21可与3D MPL配制在一起。QS21∶3D MPL的比例 一般为1∶10-10∶1，优选1∶5-5∶1，一般情况下是1∶1。二者最佳协同的优 选范围是3D MPL∶QS21在2.5∶1-1∶1之间。

优选本发明的疫苗组合物中也存在载体。载体可以是水包油乳剂， 或一种铝盐。其它的矿物盐也可用作载体，如钙盐、铁盐或锌盐。其余 载体包括聚磷腈、脂质体和ISCOMS。

无毒性水包油乳剂中优选在含水载体中含有无毒性油，如鲨烷或鲨 烯、乳剂，如吐温80。比如，含水载体可以是磷酸缓冲盐水。优选水 包油乳剂包括可代谢油，如鲨烯，α生育酚和吐温80，此外水包油乳 剂可含有span 85和/或卵磷脂。

一般而言，对人给药时，QS21和3D MPL在疫苗中的量是每剂1 μg-500μg，如10-100μg，优选10μg-50μg。一般水包油剂中含2- 10％鲨烯，2-10％α生育酚和0.3-3％吐温80。鲨烯：α生育酚的优选 比例是1或小于1，因为这提供了更稳定的乳剂。Span 85的量也可少 于1％。有些情况下，本发明的疫苗进一步含有稳定剂可能是有利的。

一种特别有效的佐剂制剂含有QS21、3D MPL和生育酚的水包油 乳剂，详述于WO95/17210。

在优选方面，根据本发明使用或生产的疫苗组合物包括氢氧化铝或 磷酸铝。

特别优选方面，根据本发明使用或生产的疫苗组合物中的抗原与 3D-PML和矾联合。

如需要的话，本发明所用疫苗可以包括通式(Ⅰ)的佐剂分子：

HO(CH2CH2O)n-A-R

其中，n是1-50,A是键或-C(O)-,R是C1-50烷基或苯基C1-50 烷基。

本发明的一个实施方案由疫苗制剂组成，它包括通式(Ⅰ)的聚氧 乙烯醚，其中，n在1-50间，优选4-24，最优选为9；R成分是C1-50， 优选C4-20烷基，而最优选C12烷基，A是键。聚氧乙烯醚的浓度应在 0.1-20％的范围内，优选0.1-10％，最优选0.1-1％。优选的聚氧乙烯醚 选自：聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-9-steoryl醚、聚氧乙烯-8- steoryl醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷基醚、聚氧乙 烯-23-十二烷基醚。聚氧乙烯醚如聚氧乙烯十二烷基醚描述于Merck index(12th ed:entry 7717)。

HSV-2是生殖器疱疹的原发病原因子。HSV-1是口唇疱疹的病原 因子。综合而言，这些病毒的特征在于它们诱发急性疾病和建立潜伏感 染的能力，主要潜伏于神经元神经节细胞。

WO92/16231提供生殖疱疹的更多的资料，并描述用于治疗易受 HSV感染者的疫苗，该疫苗包括与3-O-脱酰单磷酰基类脂A和合适的 载体组合的HSV糖蛋白D或其免疫片段。

WO92/16231的说明书提供糖蛋白D，其免疫片段和3-DMPL的细 节以及获得它们的方法。说明书介绍了一些侯选疫苗在动物模型中的有 前景的实验，但没有给出对人的数据。

在优选方面，本发明的方法或用途涉及预防或治疗与生殖疱疹相关 的感染，尤其HSV-2的感染。

可用于本发明的疫苗包括糖蛋白D或其免疫片段，其一般来自 HSV-2。

糖蛋白D定位于病毒的膜上，也可见于感染细胞的细胞质中 (Eisenberg R.J.etal；J of Virol 1980 35 428-435)。它含包括信号肽的393 个氨基酸，分子量约为60kD。在所有HSV膜糖蛋白中，这可能是鉴 定最充分的(Cohen etal J.Virology 60 157-166)。在体内，已知它在 病毒吸附细胞膜过程中起关键作用。而且，糖蛋白D在体内可诱导中 和抗体(Eing etal J.Med.Virology 127:59-65)。然而，在个体血清中 存在高滴度的中和抗体的情况下，潜伏的HSV-2病毒仍可以复活并诱 使疾病复发。

如WO92/16231中所述，一个优选的实施方案是含308个氨基酸残 基的截短的HSV-2糖蛋白D，它包括天然糖蛋白的1-306氨基酸，在 缺失了膜锚定区的截短蛋白C末端附加了天冬酰胺和谷氨酰胺。这种 含信号肽的蛋白形式被切割产生成熟的283个氨基酸的蛋白。在中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞中生产该蛋白参见EP-B-139 417。

在本发明范围内疫苗制剂中优选使用的成熟截短蛋白可被称为重 组gD2t(rgD2t)或简单地称之为(见本文后述)gD2t。

HSV抗原可以通过化学的或其它方式与特定的载体结合，见WO 92/16231所述。

本发明所用疫苗的一个优选方面含有gD2t,3-DMPL(尤其是3- DMPL的小颗粒)和氢氧化铝(矾)。

乳头瘤病毒是小DNA肿瘤病毒，它是高度物种专一性的。而已确 定有70个以上的人乳头瘤病毒(HPV)的基因型。HPVs一般专一于 皮肤(如HPV-1和HPV-2)或粘膜表面(如HPV-6和-11)，通常导致 持续几个月或一年的良性肿瘤(疣)。这种良性肿瘤会让个体有些烦恼 但不会有生命威胁，很少有例外。

有些HPVs也与肿瘤有关。HPV与人的肿瘤最强烈的关联是在 HPV-16、HPV-18与宫颈癌之间。在发展中国家宫颈癌是最常见的恶性 肿瘤，世界上每年约有500,000新病例。现在用疫苗抵抗HPV-16原发 感染甚至是已存在的含HPV-16肿瘤在技术上是可行的。对接种疫苗预 防和治疗HPV-16感染的综述见Cason J.,Clin.Immunother.1994；1(4) 293-306 Hagenesee M.E.,Infections in Medicine 1997 14(7)555-556,559- 564。根据本发明的优选疫苗组合物包括主要衣壳蛋白L1蛋白。

今天，不同型的HPVs已获分离，并利用细菌中的克隆系统和新发 展的PCR扩增进行鉴定。通过与早已明确的牛乳头瘤病毒1型(BPV1) 的比较，HPV基因组的分子结构已经确定。

尽管有少数例外，所有已描述的HPVs基因组至少有7个早期基因 E1到E7和两个晚期基因L1和L2。此外上游调控区包含调控序列，它 可能控制HPV基因组大多数的转录事件。

E1和E2基因分别参与病毒的复制和转录控制，在病毒整合时被打 断。E6和E7参与病毒的转化，目前研究表明E5也是如此。

与宫颈癌相关的HPVs如HPV16和18的致癌过程开始于病毒DNA 整合之后。整合导致编码衣壳蛋白L1和L2的基因的灭活，和两早期 蛋白E6和E7的持续过表达，这导致逐渐失去正常细胞分化，而使癌 发生发展。

宫颈癌常见于女性，它的发展经过一个癌侵入的癌前中间期，这阶 段常常导致死亡。已知该病的中间期在宫颈内皮形成瘤，按成瘤严重程 度分为Ⅰ-Ⅲ期。

临床上，HPV感染女性的会阴生殖道产生宫颈扁平湿疣，它的标 志是主要影响宫颈鳞状上皮的表层和中间层细胞的中空细胞病。

中空细胞是病毒致细胞病变的结果，出现核周有清晰晕圈的多核细 胞。由于疣体的损害产生异常角质化使上皮增厚。

这种扁平湿疣若是HPV-16或18血清型阳性，则是发展为宫颈内 皮癌(CIN)和原位癌(CIS)的高危险因子，它们被看作侵袭性宫颈 癌的前期损害。    

国际专利申请号WO96/19496公开了人乳头瘤病毒E6和E7蛋白 的变体，特别是E6和E7蛋白中均存在缺失的E6/E7融合蛋白。据称 这些缺失融合蛋白具有免疫原性。

基于HPV L1的疫苗公开于WO94/00152,WO94/20137， WO93/02184和WO94/05792。这种疫苗包含L1抗原单体，壳粒或病毒 样颗粒。这些颗粒还可含有L2蛋白。其它HPV疫苗则基于早期蛋白 如E7，或融合蛋白如L2-E7。

本发明的疫苗中，优选利用包括与具有T细胞表位的免疫融合配 体连接的E6或E7蛋白的组合物。

本发明的优选形式中，具免疫原性的融合蛋白来自流感嗜血杆菌B 的D蛋白。优选蛋白D衍生物是该蛋白大约前1/3部分，特别是大约N 端的100-110氨基酸。

因此，本发明可以使用包括蛋白D-HPV 16的E6、蛋白D-HPV 16 的E7、蛋白D-HPV 18的E7以及蛋白D-HPV 18的E6的融合蛋白。 蛋白D部分优选包括蛋白D的前1/3区。

专性细胞内细菌沙眼衣原体感染结膜和泌尿生殖道的粘膜上皮细 胞，导致广谱的人疾病如沙眼和生殖器感染，后者可以引起长期后遗 症。沙眼在几个发展中国家是地方性流行病，是世界上可预防的致盲的 主要原因；生殖器感染，在美国每年约有三百万病例，使每年有200,000 妇女由于salpingtis衣原体而不育(1)。因而该病原体是重要的公共卫 生问题，必需努力获得一种疫苗以抗人衣原体感染。

在人和人之外的灵长类使用整个有机体作为免疫原进行的疫苗试 验赋予血清异型特异性的保护，但有些疫苗会出现比再感染更为严重的 反应(2)。一些研究证实衣原体感染相关的病原学是免疫学介导的(3)； 而且纯化的衣原体57kD(Hsp60)已显示引发与动物原来的感染后再 感染相同的病理学(4,5)。这个发现说明，抗沙眼衣原体的保护只能 用亚单位疫苗才能获得。

沙眼衣原体按血清型有15个血清异型，分为3个血清群：B类复 合体(血清异型B,Ba,D,E,L1和L2)，中间型复合体(血清异 型F,G,K,L3)和C类复合体(血清异型A,C,H,I和J)(6)。 性传播疾病(STD)由血清异型从D到K引起，它们分属3个血清群。 因而抗衣原体STD的亚单位疫苗应能保护抗多血清异型，其或多或少 在抗原性上相关。

为设计亚单位疫苗，大多研究集中在血清型抗原上，它存在于40kD 主要外膜蛋白(MOMP)。该蛋白在体外显示的功能为孔蛋白(7)， 存在于此菌的整个生命循环中(8)；这个主要的表面蛋白对人和动物 具高免疫原性。MOMP具有由五个在各血清异型中高度保守的恒定区 包围的四个可变区域(VD)(9,10)。在体外和体内的中和B细胞 表位已在VDs上作图(11,12,13,14,15)，而T细胞表位在可变 区和不变区都已鉴定(16,17)。不同的研究者已在大肠杆菌中表 达了重组MOMP(18,19,20)；然而Manning等人的结果表明他们 的重组蛋白不能与识别MOMP抗原表位构象的单克隆抗体反应(18)。

以重组或纯化的MOMP免疫，然后以同型或异型衣原体在不同动 物模型中进行的攻击根据感染参数具有不同效果(21,22,23)。输 卵管炎的一流的试验模型已在小鼠体建立，人的沙眼衣原体菌株接种于 鼠子宫内导致其长期不育(24,25)。在异型攻击试验中，Tuffrey等 人指出用吸附在alhydrogel上的rMOMP肠道外或黏膜免疫可分别减低 输卵管炎的严重性和在下生殖道内定居持续时间。但对由感染引起的不 育没有保护作用(23)。

细胞介导的和体液的免疫在沙眼衣原体导致的生殖器病理中似乎 扮演一个保护性角色。但是Rank的研究小组指出小鼠T细胞介导的免 疫是控制衣原体生殖器疾病的主要的免疫机制(26,27,28)，在体 内，CD4和CD8阳性的T细胞显示对抗抗衣原体免疫有作用(29,30)。

本发明MOMP抗原的一个实施方案是来自血清异型2并利用重组 DNA技术在大肠杆菌中表达。这种情况下产生的蛋白没有信号肽序 列。

来源于淋病奈瑟氏菌或与其相关的抗原包括转铁蛋白结合蛋白 (Tbp)。两个蛋白参与形成Tbp复合物-TbpA和TbpB。淋球菌TbpA的 DNA/蛋白序列被公开在WO92/03467(北卡大学)。近期一篇专门关 于淋球菌的TbpA和TbpB以及它们如何在感染中需要的论文见Mol. Microbiol.,1998 Feb；27(3):611-616。其它抗原包括Por B蛋白，见Proc. Natl.Acad.Sci.USA.,1987,Nov；84(22):8135-8139，和Mol Biol Evol 1995 May；12(3)363-370。而另一抗原是脂多糖(R型)，见Can J Microbiol 1978 Feb；24(2):117-123。也见于J Immunol 1993 Jul 1；151(1):234-243。FrpB蛋白也是一候选抗原，见J Bacteriol 1995 Apr；177(8):2041-2049和WO96/31618。一种菌毛疫苗见J Clin Invest 1981 Oct；68(4):881-888。

来源于梅毒的病原体或与其相关的抗原包括密螺旋体属的外膜蛋 白，见Emerg Infect Dis 1997 Jan；3(1):11-20。作为人类梅毒的性传播的 病原体，苍白密螺旋体有一个独特的物理特性，即它的外膜所含的膜延 伸蛋白比典型革兰氏阴性菌的外膜少100倍，此特性与梅毒感染的长期 性有关。这些膜延伸的苍白密螺旋体的少见外膜蛋白名为TROMPs， 它们代表了潜在的表面暴露的毒力决定簇和宿主免疫的靶。苍白密螺旋 体的外膜被分离出来，其组成蛋白被鉴定。有5种蛋白与外膜相关，分 子量分别为17-、28-、31-、45-、和65-kDa。当用经梅毒感染并免疫的 兔及人的血清检测时，Tromps 1,2，和3具有抗原性。另一个候选者 是外膜蛋白P6，见述于J Exp Med 1986 Oct 1；164(4):1160-1170。也见 于Microbiol Rev 1993 Sep；57(3)750-779。

软下疳是由杜克雷嗜血杆菌(HD)引起的性传播疾病。来源于HD 或与之相关的抗原包括一个18,000MW的外膜蛋白，见Infect Immun 1996 Jun；64(6):1950-1955。由HD表达的一种新的脂蛋白见Infect Immun 1996 Dec；64(12):5047-5052。一个血红蛋白结合外膜蛋白与HD 在动物模型中的毒力表达相关，见Infect Immun 1996 May；64(5):1724- 1735。编码一个来自HD的血红蛋白受体的hgbA位点的鉴定见Infect Immun 1995 Jun；63(6):2194-2200，也见于J Med Microbiol 1992 Dec；37(6):413-419，文中鉴定了HD的高度保守的和种特异性的多肽。

根据本发明制备或给药的联合疫苗将含有免疫保护量的抗原，而且 可用传统技术进行制备和给药。

疫苗制备物见于“疫苗的最新趋势和进展”，由Voller等人编写， University Park出版社，Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。用脂质体 包囊见述于，例如，Fullerton，美国专利4,235,877。蛋白质共轭结合 为大分子公开于，例如Likhite，美国专利4,372,945和Armor等人的美 国专利4,474,757。

选择的每一疫苗剂量的抗原数量为：在一般疫苗受者中能诱导免疫 保护性或治疗应答，同时不会引起明显的负反应。该数量根据采用的 不同特异性免疫原有所变动。一般而言，每一个剂量预计包括1-1000μg 蛋白，优选为2-100μg，最优选为4-40μg。对一特定疫苗，最优选的 量将通过标准研究确定，包括观察个体的抗体滴度及其它反应。在初次 免疫之后，个体将于4周后接受一次加强免疫。

每一疫苗剂量中的抗原量应在一般女性疫苗接受者中能诱导免疫 保护性或治疗有效的反应，同时不会引起明显的负反应。

一般而言，每一个剂量预计包括1-1000μg抗原，优选为2-100 μg，最优选为4-40μg。如3-DMPL的TH-1诱导性佐剂的常规范围为 每剂10-200μg，优选为25-75μg，特别是约50μg。

载体的量可以变动并根据本领域的技术人员的知识进行选择。如果 使用氢氧化铝(矾)或磷酸铝，使用的量一般在每一疫苗剂量100-1000 μg范围，如250-750μg，优选为约500μg。

在疫苗中每一成分的量一般是抗原(20μg)、矾(500μg)、和 佐剂，尤其是3-DMPL等TH1诱导佐剂(50μg)。

在一个优选方面，本发明中使用的疫苗包括gD2t,3-DMPL(尤其 是小颗粒3-DMPL)和氢氧化铝(矾)。

根据一种优选给药方案，疫苗可以0、1和6月的间隔给药。其它 给药方案包括加强剂量也可使用。疫苗可以肌肉内给药。

根据本发明制备疫苗可由传统技术完成，如WO92/16231所述。该 方法一般包括将下列物质混合：一种或多种来源于某种STD的或与其 相关的抗原，和一种佐剂，尤其是TH-1诱导性佐剂，可选地还有上述 的一种载体。制成的疫苗组合物可根据本发明的方法用于女性个体的给 药，尤其是罹患或易于感染STD的性活跃的妇女。

一般而言，在下述研究中的妇女年龄在12-70岁之间，多为青少年 和小于60岁的妇女，如14-60岁，典型的为18-45岁。在一个方面， 一个合适的妇女群包括罹患或易于感染生殖器疱疹者。例如，本研究的 方法和用途可应用于有生殖器疱疹疾病个体的血清阴性的健康配偶。

本发明由以下非限定性实施例加以说明，显示当一种疱疹疫苗给药 于女性个体时的结果。当用抗其它STDs如HPV和衣原体抗原的疫苗， 以及用抗一种以上STD的联合或多价疫苗，特别是包括与单纯疱疹相 关的抗原时，尤其是HSV-2gD或它们的免疫原性片段如上所述的 gD2t，也可得到类似的结果。

实施例1-研究设计 待研究的疫苗    SmithKline Beecham Biologicals单纯疱疹候选疫

            苗(gD2t-20μg)，含有矾(500μg)和3-DMPL

            (50μg)。 名称            一个双盲，随机，有安慰剂对照的研究被用于评

            价含有3-DMPL的SmithKline Beecham

            Biologicals单纯疱疹候选疫苗(gD2t)在有生殖

            器疱疹疾病的个体的健康配偶中预防生殖器疱疹

            疾病的效果。 指示/研究群体   健康成年志愿者，男性和女性，年龄18-45，单纯

            疱疹感染(HSV-1和-2)血清标志物阴性，其配

            偶有临床生殖器疱疹疾病。

研究目标：

第一．

在17个月的实验期间(从第二次免疫后一个月开始)，对gD- Alum-3-DMPL疫苗与安慰剂对预防临床生殖器疱疹疾病的保护效果进 行比较。

第二．

从第二次免疫后一个月开始，对gD-Alum-3-DMPL疫苗与安慰剂 防止生殖器疱疹感染的保护效果进行比较。

在整个免疫过程结束后，对gD-Alum-3-DMPL疫苗与安慰剂防止 生殖器疱疹感染的保护效果进行比较。

在整个免疫过程结束后，对gD-Alum-3-DMPL疫苗与安慰剂在延 长临床随访期内防止生殖器疱疹感染的保护效果进行比较。

在整个免疫过程结束后，对gD-Alum-3-DMPL疫苗与安慰剂防止 生殖器疱疹感染的保护效果进行比较。

在整个免疫过程结束后，对gD-Alum-3-DMPL疫苗与安慰剂在延 长临床随访期内防止发生临床生殖器疱疹疾病的保护效果进行比较。

从第二次免疫后一个月开始，评价每个实验组发生疾病的时间。

从第二次免疫后一个月开始，评价每个实验组发生感染的时间。

评价每个实验组中发生典型和非典型生殖器疱疹疾病的病例数。

评价两实验组中初次发病的严重程度。

评价疫苗的体液和细胞免疫应答(不计1995年7月1日后的个 体)。

确定保护效果与血清或免疫的相关性(不计1995年7月1日后的 个体)。

评价两个实验组原发疾病或感染病例中复发的例数。

评价SmithKline Beecham Biologicals＇单纯疱疹候选疫苗(有3- DMPL)在HSV血清阴性的健康个体中的安全性及致反应性。

评价口唇疱疹(或非生殖器疱疹)病例数。

从第二次免疫后一个月开始，对gD-Alum-3-DMPL与安慰剂防止 出现生殖器疱疹可疑表征和症状的保护效果进行比较，这些可疑表征和 症状与对非疫苗抗原的蛋白质印迹血清转化相关或者是生殖器拭子 PCR检测HSV DNA结果阳性。

评价接种疫苗者在此后的临床随访期发生的生殖器疱疹疾病或 HSV感染。

研究设计

双盲，随机，安慰剂-对照研究。

免疫计划：0-1-6月。

初始随访期间：每个个体从第二次免疫后一个月开始，共17个月。

延长随访期间：每个个体共24个月(从第19月到第43月)

阶段A(双盲，包括疫苗组和安慰剂组)-当最后一个登记的个体 完成初始随访期后终止(大约在此时研究公开进行分析)

阶段B(公开，只有疫苗组)-开始于最后一个登记的个体完成初 始随访期后(第19月)，在最后一个登记的个体后结束43月随访时终 止。

由于最后一个登记的个体完成初始随访期的日期和研究完全公开 进行分析的日期之间可能有几个月的间隙(此段时间用于编码和清理所 有在初始随访期和延长随访期的阶段A期间收集的研究数据)，延长 随访期的阶段B的开始部分可能同时包括疫苗组和安慰剂组。

2个实验组：Ⅰ．gD2t-Alum-3-DMPL

               Alum-3-DMPL安慰剂组

HSV-007研究设计计划-研究时段：免疫(V)阶段；初始随访期 (初始f/u*)；延长随访期A；延长随访期B。

*注：初始随访期包括2-19月。

个体数目：将有800对夫妇登记以保证至少640可供评价。

初次效果终点：从第2次免疫后的一月开始的17个月的时期内(第 2-19月)，初次效果终点如下：

发病的预防：

两组中具有如下特征的个体数目之比较：至少有一种生殖器疱疹疾 病症状同时培养结果阳性，或者在6个月内通过蛋白质印迹能检测到针 对非疫苗来源抗原的抗体以及聚合酶链反应(PCR)检测局部单纯疱疹 DNA结果阳性。 临床症状 培养 抗非疫苗来源抗原 的抗体 PCR 发病 + + +/- NA + - + +

NA：未进行

Ⅱ．第二次效果终点：

1)感染的预防：

在疫苗组和安慰剂组之间，比较产生针对非疫苗抗原抗体(血清转 化)的个体数以及发病的个体(通过培养确定)的数目。

在下列时期对此终点进行评价：

随访的起始期(2-19月)；

7-19月；

延长随访期的A阶段；

随访的起始期(2-19月)结合延长随访期的A阶段；

7-19月结合延长随访期的A阶段。

从延长随访期的A阶段的数据分析包括，在每个个体第19月的访 问和A阶段的终点(此时最后一个登记的个体完成了其第19月的访 问)之后所有发生的事件。

病例的定义 临床症 状  培养 抗非疫苗来源抗原 的抗体   PCR 感染 发病     +    +    +/-   NA 感染 发病     +    -     +   +      感染    +/-    NA     +   NA

NA：未进行

2)在7-19月之间对发病的预防

在整个免疫过程(7-19月)结束后，和安慰剂组比较下列个体数 目：至少有一种生殖器疱疹疾病症状同时培养结果阳性，或者通过蛋白 质印迹能检测到针对非疫苗来源抗原的抗体以及聚合酶链反应(PCR) 检测局部单纯疱疹DNA结果阳性。

3)在延长随访期的A阶段期间对发病的预防

在延长随访期的A阶段期间，比较两实验组中下列个体的数目： 至少有一种生殖器疱疹疾病症状同时培养结果阳性，或者通过蛋白质印 迹能检测到针对非疫苗来源抗原的抗体以及聚合酶链反应(PCR)检测 局部单纯疱疹DNA结果阳性。

另外，对新的随访起始期(2-19月)与延长随访期的A阶段的结 合以及第7-19月与延长随访期的A阶段的结合，评价此终点。

4)从第二次免疫后一个月开始的17个月期间，评价每组中发生生 殖器疱疹疾病的时间。

5)从第二次免疫后一个月开始的17个月期间，评价每组中发生生 殖器疱疹感染的时间。

6)评价每组中典型生殖器疱疹疾病与非典型生殖器疱疹疾病的病 例数。

病例的定义见初次终点。

7)评价每组中病人主观的局部和全身性的生殖器HSV疾病的表征 与症状以及持续时间。

8)评价针对疫苗(不计1995年7月1日后的个体)的体液免疫(通 过ELISA检测的抗gD2的抗体以及抗HSV的中和抗体)和细胞免疫(淋 巴增生反应，γ-干扰素的分泌)应答。

9)如果显示有临床效果，将用按计划储存的血清和外周血淋巴细 胞对血清学及免疫学标志物进行进一步评价，目的是确定保护性效果与 实验室参数的相关性(不计1995年7月1日后的个体)。

10)在初次发病或感染中，评价每组中以后生殖器疱疹的复发数。

11)每次免疫后，通过记录每一个剂量后局部及全身的表征和症状 以及研究过程中的不良体验，对局部和全身反应性以及安全性进行评 价。在基线以及最后一次免疫后检测血液及生化参数。

在延长随访期间，疫苗个体所报告的所有严重的不良体验将被记录 下来。

12)评价每组中非生殖器疱疹疾病，包括口唇疱疹疾病的临床病例 数。

13)从第2次免疫后一个月的17个月的随访期间，与安慰剂组进 行如下疫苗接受者的比较：形成生殖器疱疹的表征和症状，同时有通过 蛋白质印迹检测到的针对非疫苗来源抗原的血清转化(从生殖器疱疹表 征或症状开始出现后6个月内)，或者在生殖器拭子通过PCR检测到 HSV DNA。

14)在延长随访期的B阶段，产生抗非疫苗来源抗原的抗体(血 清转化)的疫苗接受者数目和发病的个体(经培养证实)的数目将被分 析，分析它们与自最后一次免疫以来的时间间隔的关系。这些数据将用 来计算生殖器疱疹发病和感染的侵袭率。

实施例2

初次终点的分析基于对疫苗组与安慰剂组(在RAP中有述)的侵 袭率的比较。第2终点的分析则基于侵袭率的比较或者是如下所述的发 病或感染终点发生时间的比较。

统计检验为双向检验，采用SAS软件进行，α水平为0.05。应当注 意到虽然许多统计分析被报告，但是对第2终点，偏差率(α)不在控 制之下。因为对第2终点，没有进行α的调整，所以对p值应谨慎解释 而且仅作描述之用。

用于疫苗效果分析的群体

效果分析在两个群体进行：intention-to-treat群体(ITT)和 according-to-protocol群体(ATP)。ATP组在下文也被称为per-protocol 组(PP)。

对ATP群体的分析为首要的分析。ATP(或PP)群体根据被考虑 的研究时期进行定义：

1)对2-19月之间的时期，ATP群体包括如下个体：

-符合所有方案(protocol)标准者

-接受了3剂疫苗/安慰剂者

-或者是接受了2剂疫苗/安慰剂，而且，在第6月的随访之前 发生了被考虑的事件(发病或感染)的个体

-在2-19月时期开始之前没有发生被考虑的事件(发病或感染) 的个体。

2)对7-19月间的时期，ATP群体包括：

-符合所有方案(protocol)标准者

-接受了3剂疫苗/安慰剂者

-在7-19月时期开始之前没有发生被考虑的事件(发病或感染) 的个体。

对ITT群体的分析作为第2分析。该分析包括所有接受了至少一剂 研究疫苗而且至少有一次有关疫苗的评估。

两个分析的目的是为了确保诸如违反方案(protocol)、中途退出 和停止给药的个体不是与治疗有关的而且不会在效果结果中导致任何 选择性偏差。

包括在免疫原性和安全性分析的群体将在最后的报告中全面叙 述。

评价时期

进行分析的评价时期包括：

-第2-19月(ATP群体)

-第7-19月(ATP群体)

-第0-19月(ITT群体)

选择出来的结果如下所示，同时有本研究总体结论的简述。

表1a疫苗对生殖器疱疹发病发生的作用的调整，参数：性别-ITT 群体 模式中项目 偏差 自由度 P值 治疗组 320.5561  845 治疗组，性别 317.2083  844  0.067 治疗组，性别，和交互 作用 312.0443  843  0.023

表1b疫苗对生殖器疱疹感染发生的作用的调整，参数：性别-ITT 群体 模式中项目 偏差 自由度 P值 治疗组 510.8654  845 治疗组，性别 494.9266  844 ＜0.001 治疗组，性别，和交互 作用 491.5551  843  0.066

生殖器疱疹发病和HSV感染例数的分布，参数：治疗组

表2a．生殖器疱疹发病例数，参数：治疗组-男性和女性 时间间隔 ITT(N=847) PP* 疫苗(425) 安慰剂(422) 疫苗 安慰剂 0-2月 2  7 2-7月 9  8 7-19月 4  9  3(349) 7(349) 2-19月 13  17  12(371) 16(369) ＞19月 1  0 总共 16  24

*对每个时间间隔，PP有价值的个体的数目如()中所示。

表2b．生殖器疱疹发病例数，参数：治疗组-男性。 时间间隔 ITT(N=579) PP* 疫苗(288) 安慰剂(291) 疫苗 安慰剂 0-2月 2  2 2-7月 6  5 7-19月 3  3  2(240) 2(247) 2-19月 9  8  8(252) 8(261) ＞19月 1  0 总共 12  10

*对每个时间间隔，PP有价值的个体的数目如()中所示。

表2c．生殖器疱疹发病例数，参数：治疗组-女性。 时间间隔 ITT(N=268) PP* 疫苗(137) 安慰剂(131) 疫苗 安慰剂 0-2月 0  5 2-7月 3  3 7-19月 1  6  1(109) 5(102) 2-19月 4  9  4(119) 8(108) ＞19月 0  0 总共 4  14

*对每个时间间隔，PP有价值的个体的数目如()中所示。

表3a．生殖器疱疹感染例数，参数：治疗组-男性和女性 时间间隔 ITT(N=847) PP* 疫苗(425)  安慰剂(422)  疫苗 安慰剂 0-2月 2  10 2-7月 17  13 7-19月 11  16  10(349) 16(349) 2-19月 28  30  26(371) 29(369) ＞19月 5  2 总共 35  41

*对每个时间间隔，PP有价值的个体的数目如()中所示。

表3b．生殖器疱疹感染例数，参数：治疗组-男性。 时间间隔 ITT(N=579) PP* 疫苗(288) 安慰剂(291)    疫苗 安慰剂 0-2月 2  2 2-7月 9  8 7-19月 6  6   5(240) 6(247) 2-19月 15  14   13(252) 14(261) ＞19月 3  0 总共 20  16

*对每个时间间隔，PP有价值的个体的数目如()中所示。

表3c．生殖器疱疹感染例数，参数：治疗组-女性。 时间间隔 ITT(N=268) PP* 疫苗(137) 安慰剂(131) 疫苗 安慰剂 0-2月 0  8 2-7月 8  5 7-19月 5  10  5(109) 10(102) 2-19月 13  15  13(119) 15(108) ＞19月 2  2 总共 15  25

*对每个时间间隔，PP有价值的个体的数目如()中所示。

初步的效果分析

初次效果终点

在17个月的时期中，从第2次免疫后一个月开始(2-19月)，初 次效果终点如下：

发病的预防：

两组中具有如下特征的个体数目之比较：至少有一种生殖器疱疹疾 病症状同时培养结果阳性，或者在6个月内通过蛋白质印迹能检测到针 对非疫苗来源抗原的抗体以及聚合酶链反应(PCR)检测局部单纯疱疹 DNA结果阳性。

表4a．生殖器疱疹发病的预防-男性和女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 所有 ITT 33.8％ (-22.8,64.3％) 2-19月 PP 25.4％ (-55.5,64.2％)

表4b．生殖器疱疹发病的预防-仅男性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 所有 ITT -21.2％ (-176.2,46.8％) 2-19月 PP 3.6％ (-171.7,60.5％)

表4c．生殖器疱疹发病的预防-仅女性 时间间隔 群体     效果(95％CI) 所有 ITT 72.7％ (19.1,90.8％) 2-19月 PP 54.6％ (-46.4,85.9％)

第2次效果终点

1)感染的预防

在随访的初始期(2-19月)，在疫苗组和安慰剂组之间，比较产 生针对非疫苗抗原抗体(血清转化)的个体数以及发病的个体(通过培 养确定)的数目。

表5a．生殖器疱疹感染的预防-男性和女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 所有 ITT 15.2％ (-30.4,44.0％) 2-19月 PP 10.8％ (-48.4,46.4％)

表5b．生殖器疱疹发病的预防-仅男性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 所有 ITT -26.3％ (-138.8,33.2％) 2-19月 PP 3.8％ (-100.5,53.9％)

表5c．生殖器疱疹发病的预防-仅女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 所有 ITT  42.6％ (-3.9,68.3％) 2-19月 PP 21.3％ (-57.7,60.8％)

2)感染的预防

在第7-19月，在疫苗组和安慰剂组之间，比较产生针对非疫苗抗 原抗体(血清转化)的个体数以及发病的个体(通过培养确定)的数目。

表6a．生殖器疱疹感染的预防-男性和女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 7-19月 PP 37.5％ (-35.8,71.2％)

表6b．生殖器疱疹感染的预防-仅男性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 7-19月 PP 14.2％ (-177.3,73.5％)

表6c．生殖器疱疹感染的预防-仅女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 7-19月 PP 53.2％ (-32.2,83.4％)

3)在7-19月之间对发病的预防

在整个免疫过程(7-19月)结束后，和安慰剂组比较下列个体数 目：至少有一种生殖器疱疹疾病症状同时培养结果阳性，或者通过蛋白 质印迹能检测到针对非疫苗来源抗原的抗体以及聚合酶链反应(PCR) 检测局部单纯疱疹DNA结果阳性。

表7a．生殖器疱疹发病的预防-男性和女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 7-19月 PP 57.1％ (-64.4,88.8％)

表7b．生殖器疱疹发病的预防-仅男性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 7-19月 PP -2.9％ (-624.7,85.4％)

表7c．生殖器疱疹发病的预防-仅女性 时间间隔 群体 效果(95％CI) 7-19月 PP 81.3％ (-57.5,97.8％)

评价从第2次免疫后一个月开始的17个月的时期中，每一组中发 生生殖器疱疹疾病的时间。

ITT群体发生生殖器疱疹疾病的时间见图1a(女性和男性)，1b (仅对男性)和1c(仅对女性)。对ITT群体生殖器疱疹疾病发生时 间的效果分析见：表8a(男性和女性)，8b(仅对男性)，和8c(仅对女 性)。对PP群体(第2-19月)的发病时间未进行分析，因为在第2月 之前，在疫苗与安慰剂接受组未发病者之间观察到有早期的差异存在。

注：发病时间分析不包括19月之后的生殖器疱疹发病病例。

表8a．生殖器疱疹发病的预防，参数：发病时间-男性和女性 时间间隔 群体 P值(Log Rank检验) 效果(95％CI) 0-19月 ITT 0.1432 37.96％ (-18.27,67.45％)

表8b．生殖器疱疹发病的预防，参数：发病时间-仅男性 时间间隔 群体 P值(Log Rank检验) 效果(95％CI) 0-19月 ITT 0.8025 -11.54％ (-162.55,52.63％)

表8c．生殖器疱疹发病的预防，参数：发病时间-仅女性 时间间隔 群体  P值(Log Rank检验) 效果(95％CI) 0-19月 ITT  0.013 73.24％ (18.69,91.19％)

详细分析试验结果后的总结和结论

人口统计学特征和危险因子评价

总体来说，在登记的847个个体中(疫苗组425，安慰剂组422)， 697个个体(疫苗组344，安慰剂组353)完成了为期19个月的研究。 150个个体退出了研究；没有任何退出者是由于严重的负反应导致的。

疫苗组中370和安慰剂组369个个体在第2-19月的ATP群体中可 被评价。治疗组在所有人口统计学特征方面经过了平衡处理，用于ATP 群体分析的遵守方案(protocol)者的选择没有导致通过治疗组引入偏 差。

可能影响罹患生殖器疱疹疾病或感染的比例的危险因子被评价，包括 在研究进行之前关系持续时期，在与传染来源伙伴分开之前的平均时间， 性交频率(在基线和在效果随访期)，和使用安全套的频率(在基线和在 效果随访期)。

这些结果显示，疫苗组和安慰剂组在基线水平对所有危险因子进行 了平衡，而且在研究期间中这些平衡均被保持。ATP群体的概貌和ITT 群体的概貌在危险因子的类似性也确证，除去没有遵守方案(protocol) 者并没有使治疗组发生偏差。

用性别进行的次级分析显示，在每个性别组中可能影响罹患生殖器疱 疹疾病或感染的比例的危险因子通过治疗组是平衡的。

初次效果终点分析

在一个包括患生殖器疱疹个体的女性和男性的血清阴性健康配偶 的结合群体中，初次效果终点的分析没有显示疫苗抗生殖器疱疹的效 果。

初次效果终点分析的结果总结如下：

1)相对的疫苗效果在总体群体(2-19月，ATP)为25。4％(95％ CI:-55.5,64.2；p=0.449)。对ITT群体的相对疫苗效果为37.9％(95％ CI:-16.6,67.0；p=0.143)。

2)统计学显著意义的性别对组别对ITT群体的效果分析的相互作 用(p=0.03)。

3)通过性别进行的一个单独的分析显示，在2-19月ATP女性群 体疫苗效果为54.2％(95％CI:-47.7,85.5；p=0.238)，而且在女性 ITT群体中有统计学上显著的疫苗效果，为72.7％(95％CI:19.1,90.8； p=0.014)。在男性群体中，没有显示疫苗有效果。在2-19月ATP男 性群体疫苗效果为3.6％(95％CI:-171,60.5)，在ITT男性群体中 为-11.1％(95％CI:-157.6,52.1)。

多个基线共变量被研究以确定它们是否影响效果结果：性别，年 龄，在基线使用安全套的频率，性交频率以及在研究之前伙伴关系的持 续时间。疫苗效果的趋向与下列有关：女性，年龄大于30岁，不经常 使用安全套，性交频率小于中等水平以及伙伴关系较短。这些观察结果 均适用于ATP和ITT群体。

第二次效果终点分析

预防生殖器疱疹疾病发生(7-19月)

在3剂疫苗之后(在研究的7-19月间)，在女性中预防生殖器疱 疹疾病发生，观察到疫苗效果为81.1％(95％CI:-58.9,97.8)(p= 0.111)。在7-19月期间，未观察到男性有疫苗效果的趋向(-2.9％疫 苗效果，95％CI:-624.7,85.4；p=0.99)。在7-19月间ATP女性群 体中，疫苗效果的趋向与初次终点的ITT群体女性中疫苗效果的观察 相一致。

预防HSV感染

在疫苗组和安慰剂组之间比较疫苗在预防HSV感染的效果。总体 上，没有抵抗HSV感染的疫苗效果。但是，在ITT群体的女性(46.0％ 疫苗效果，95％CI:-2.1,71.4；p=0.072)和7-19月的ATP群体(52.8％ 疫苗效果，95％CI:-33.4,83.3；p=0.184)中，与疾病终点分析一致， 提示有抗HSV感染疫苗效果的趋向。

发生生殖器疱疹的时间

发生生殖器疱疹疾病的时间的计算从进入研究直到疾病的发生。主 要是分析通过Logrank检验进行；每组分别绘制Kaplan-Meier曲线。 在女性(2-19月ATP群体)，指示疾病病例发生的曲线与连续在安慰 剂组发生的病例分离，明显相差约9个月。在女性，疫苗效果估计为 53.6％(95％CI:-54.2,86.0)。在ITT女性群体中，疫苗组和安慰剂组曲 线分离从0月即明显，统计学显著的疫苗效果估计为73.2％(95％ CI:18.7,91.2；p=0.013)。男性群体未观察到有疫苗效果。同样，“发生 时间”分析的结果与初次终点分析一致。

生殖器疱疹疾病的严重性

在两个治疗组用来评估疾病严重性的参数包括：损伤的持续时间， 每次发作的症状的持续时间、数目和强度。在结合的2-19月的ATP群 体，每次发作的症状的持续时间明显长于发生在疫苗组中的少量病例的 时间(p=0.031)。性别特异的严重性数据也揭示，在疫苗组中每次发 作时，女性有统计学显著意义的高的生殖器疱疹疾病损伤(p=0.010)。 这些观察结果表明，尽管疫苗组中免疫接种也许可以预防轻微及中度疾 病，但不能预防具有更严重表征的疾病。

总体结论

分析表明，在一个有患生殖器疱疹的个体的女性和男性血清阴性健 康配偶的结合的群体中，虽然可能有抗生殖器疱疹疫苗效果的趋向，但 初次终点的分析没有显示有疫苗效果。但是，一个单独的通过性别组的 次级分析，基于被观察的性别的相互作用，令人惊奇地显示有在女性有 疫苗效果的趋向，在ITT群体中有统计学显著意义。在男性群体中没 有证据显示有疫苗效果。

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