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一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法

阅读：409发布：2021-03-03

IPRDB可以提供一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。该方法主要利用电离辐射照射外周血，采用特异性抗体标记外周血淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX蛋白质，通过流式细胞术分析两种细胞中γ-H2AX蛋白质的含量，并以粒细胞作为参照，计算淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质的相对含量。采用γ-H2AX的RL/G值(淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值)来评价电离辐射后外周血淋巴细胞DNA损伤程度。该方法操作简单，结果稳定，可以广泛应用于诊断、细胞生物学研究等领域。，下面是一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法包括下列步骤：

1)外周血样品有核细胞的固定；

2)洗涤细胞，去除固定液；

3)加入破膜剂对有核细胞破膜，裂解红细胞；

4)洗涤细胞，去除破膜剂；

5)加入荧光标记的抗γ-H2AX蛋白质的特异性抗体；

6)洗涤细胞，去除未结合的抗体；

7)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质的含量；

8)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为粒细胞的γ-H2AX蛋白质的含量；

9)计算步骤7)中淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与步骤8)中粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值一一γ-H2AX的RL/G值；

10)DNA损伤程度的判断方法

γ-H2AX的RL/G值＜1.5为正常；γ-H2AX的RL/G值＞1.5为DNA损伤，γ-H2AX的RL/G值越大，DNA损伤越严重。

说明书全文

一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞的检测方法，具体涉及一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。技术背景

[0002] 外周血淋巴细胞是电离辐射的敏感细胞，是研究电离辐射致DNA损伤的细胞模型之一。γ-H2AX蛋白质是DNA损伤后发生改变的分子，是DNA损伤的特异性分子。对γ-H2AX蛋白质的检测可以评价DNA损伤情况，对于研究DNA损伤的分子机制有广泛地应用。流式细胞仪具有快速、高通量等特点，可以检测细胞内γ-H2AX蛋白质的含量。目前利用流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质的含量的方法存在实验重复性差，不同个体来源外周血样品之间差异大等问题，这些问题是因为缺少对照细胞，增加实验误差所引起的。

发明内容

[0003] 本发明的目的是解决流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量的方法存在实验重复性差，不同个体之间差异大等问题。我们的研究发现电离辐射后外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量增加，而粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量不受电离辐射影响，可以作为分析淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量的对照细胞，采用γ-H2AX的RL/G值(淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值)来评价电离辐射后外周血淋巴细胞DNA损伤程度。本发明提供一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。该方法操作简单，结果稳定，可以广泛应用于诊断、细胞生物学研究等领域。

[0004] 本发明的一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法包括下列步骤：

[0005] 1)外周血样品有核细胞的固定；

[0006] 2)洗涤细胞，去除固定液；

[0007] 3)加入破膜剂对有核细胞破膜，裂解红细胞；

[0008] 4)洗涤细胞，去除破膜剂；

[0009] 5)加入荧光标记的抗γ-H2AX蛋白质的特异性抗体；

[0010] 6)洗涤细胞，去除未结合的抗体；

[0011] 7)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为γ-H2AX蛋白质的含量；

[0012] 8)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为γ-H2AX蛋白质的含量；

[0013] 9)计算步骤7)中淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与步骤8)中粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值——γ-H2AX的RL/G值；

[0014] 10)DNA损伤程度的判断方法

[0015] γ-H2AX的RL/G值＜1.5为正常；γ-H2AX的RL/G值＞1.5为DNA损伤，γ-H2AX的RL/G值越大，DNA损伤越严重。

附图说明

[0016] 图1：不同剂量γ射线照射后外周血淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX蛋白含量变化。

[0017] 图2：62名未受照射人外周血γ-H2AX的RL/G值，平均值为1.21±0.12(1.01～1.54)。

[0018] 图3：不同剂量γ射线照射后外周血γ-H2AX的RL/G值的变化。

具体实施方式

[0019] 实施例

[0020] 1)利用肝素抗凝管取健康人外周血0.9ml，平均分为3份，每份0.3ml，其中第1份未照射，第2份经2Gyγ射线照射，第3份经6Gyγ射线照射；

[0021] 2)血样加入1.5ml固定液(2％多聚甲醛溶液)，室温作用30分钟；

[0022] 3)室温离心(500g)5分钟，去上清；

[0023] 4)利用1.5ml PBS缓冲液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g)5分钟，去除上清，保留沉淀；

[0024] 5)加入1.5ml浓度为0.4％的Triton-100溶液，混匀细胞沉淀，室温作用15min；

[0025] 6)室温条件下离心(500g)5分钟，去上清；

[0026] 7)加入1.5ml PBS缓冲液洗涤细胞，室温离心(500g)5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；

[0027] 8)重复步骤6)；

[0028] 9)在细胞沉淀中加入小鼠抗人γ-H2AX抗体100μl(1∶200倍稀释)，混匀后37℃条件下作用30min；

[0029] 10)1.5mlPBS洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的抗体；

[0030] 11)重复步骤9)；

[0031] 12)加入100μl FITC标记的兔抗小鼠IgG(第二抗体，1∶200倍稀释)，混匀后37℃避光作用30分钟；

[0032] 13)1.5mlPBS缓冲液洗涤细胞，弃上清；

[0033] 14)重复步骤12)；

[0034] 15)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质的含量；

[0035] 16)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为粒细胞的γ-H2AX蛋白质的含量；

[0036] 17)计算步骤15)中淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与步骤16)中粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值——γ-H2AX的RL/G值；

[0037] 18)DNA损伤程度的判断方法：

[0038] 19)γ-H2AX的RL/G值＜1.5为正常；γ-H2AX的RL/G值＞1.5为DNA损伤，γ-H2AX的RL/G值越大，DNA损伤越严重。

标题	发布/更新时间	阅读量
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