本发明一般地涉及用于降低系统中毒素的生物利用度和毒性/致癌性 的基于粘土的吸附剂组合物以及方法，其通过在胃肠道中螯合这些毒素 (即肠吸附)来实现。更具体地，描述了口服组合物，其用作肠吸附剂治 疗以减轻黄曲霉毒素对具有黄曲霉毒素中毒和肝癌风险的人群的不良效 应(急性的和慢性的)。这种风险的提高来自饮食中频繁的和高水平的黄 曲霉毒素暴露。所述组合物包含有效量的经加工的粉剂形式铝硅酸钙粘 土。该经加工的铝硅酸钙粘土具有低于EPA、JECFA和WHO所推荐的 人体每日可容许摄入量的四氯二苯并对二噁英(TCDD)和优先有毒金属 污染(priority toxic metal contamination)。该组合物和方法被用作口服 治疗的一部分。另外，本发明的粘土不干扰所治疗系统或介质对天然存在 于饮食中的重要维生素及其他微量营养素的利用。本发明的经加工粘土在 胃肠道中以高亲和力和大容量优先地结合黄曲霉毒素，导致暴露显著减少 (根据黄曲霉毒素特异性生物标志物来测定)。对来自受污染饮食的黄曲 霉毒素暴露的减少可降低由这些毒物所致的患病和死亡的风险。
黄曲霉毒素
简介：对动物和人所食用食物的质量和安全问题的关切已引发人们对 与黄曲霉毒素化学物相关的重要危险的持续关注。在历史上，食物中的黄 曲霉毒素问题是由来已久、难以避免并且似乎是无法解决的。黄曲霉毒素 (Af)是霉菌生长的有害副产品，对人和动物可能是致命的。重要的是， 黄曲霉毒素是热稳定的，能承受多种食品加工工序，并成为大多数食物(特 别是来源于玉米和花生的那些食物)的污染物。黄曲霉毒素B1(AfB1)是 四种天然黄曲霉毒素中毒性最强的(图1)，它是一种直接作用的诱变剂 并已显示破坏参与致癌作用和肿瘤抑制的基因。它在体内与DNA反应得 到作为主要黄曲霉毒素-DNA加合物的反式-8，9-二氢-8-(N7-quanyl)-9-羟基 -黄曲霉毒素B1。它与乙型肝炎病毒感染均已成为肝细胞癌(HCC)的可 能诱因。黄曲霉毒素B1还显示出免疫毒性和抗营养性。在美国，人所食用 食物中Af的作用水平已被设定为20ppb。最近在肯尼亚爆发的黄曲霉毒 素中毒涉及食用含有高达8,000ppb水平的食物，这表明迫切需要用于减 轻处于黄曲霉毒素中毒高风险人群中急性黄曲霉毒素中毒的治疗方案。
发生：干旱是真菌感染和黄曲霉毒素产生增加的常见原因。这在发展 中国家(赤道南北纬40°)尤为明显，在这些国家中人和动物饮食中的黄 曲霉毒素基本上得不到监控。这个问题对最贫困的人群造成影响，因为他 们最有可能食用被黄曲霉毒素污染的食物并遭受包括疾病和急性死亡的 后果。因此，减轻人和动物中黄曲霉毒素中毒的饮食干预和治疗是当务之 急；利用可食用蒙脱石粘土作为黄曲霉毒素肠吸附剂可提供针对该问题的 实用且低成本高效的方法。
调节黄曲霉毒素代谢的化学预防策略：避免食用黄曲霉毒素污染的食 物可显著降低系统、介质或受试者中急性或慢性黄曲霉毒素中毒的风险； 然而，在发展中国家，改变饮食通常是行不通的。解决该问题的一个方法 是在高风险人群中进行化学预防。该策略包括利用天然的或合成的药剂来 阻断、延迟、逆转或调节致癌过程。已经研究了许多化学预防药剂，其中 某些为人饮食中的天然成分(例如在水果和蔬菜中发现的那些成分)。这 些成分中的某些已显示出抗多种致癌物质的保护效力；然而，它们大多数 在营养均衡的膳食中含量很低，并且不易被胃肠道所吸收。在中国，已研 究了抗血吸虫药奥替普拉(oltipraz)作为化学预防剂对暴露于饮食黄曲霉 毒素的系统或受试者的用途。在临床试验中，研究人员已证明奥替普拉提 高了谷胱甘肽S-转移酶所介导的黄曲霉毒素8，9-环氧化物缀合，并抑制细 胞色素P450 1A2的活性。另一些工作已显示，奥替普拉还可通过提高p53 水平来抑制乙型肝炎病毒(HBV)的转录，这同样也有利于HCC化学预 防。天然产物例如叶绿酸也可用于吸附黄曲霉毒素，并减少毒素到达肝脏 的量。叶绿酸是人饮食的组成部分，已发现它在几个动物模型中是有效的 抗癌物质。认为叶绿酸增强代谢并通过与致癌物质(例如AfB1)结合而作 为拦截分子起作用，从而减少了生物利用度。在一例中国的临床试验中， 将参与者随机分成两个组，在四个月中分别一天三次地给予100mg叶绿 酸或安慰剂。与服用安慰剂组相比，每餐服用叶绿酸使黄曲霉毒素-N7-鸟 嘌呤加合物的尿中值水平(median urinary level)总体减少55％(Egner 等，2001)。将这些化合物扩展用于人尚需认真进行评估，这包括对酶调 节的长期效应以及对来自饮食的必需营养物之吸收的潜在干扰。源自绿茶 的多酚类作为用于HCC高风险人群的可能干预手段也正在研究中。在多 种动物模型中的不同器官部位，这些化合物均是高效的抗癌化学预防剂。 研究已表明，绿茶通过调节AfB1代谢来抑制大鼠中AfB1所诱导肝癌的发 生。使用B6C3F1小鼠的另一些研究显示，施用绿茶(水中3％)可防止 由狄氏剂诱导的肝局灶性损伤扩大。绿茶辅助治疗还造成小鼠肝局灶性损 伤中凋亡指数增加。在人中，也观察到了绿茶服用水平与癌症发病的发生 和/或时间之间的负相关关系。
减少黄曲霉毒素生物利用度的食用粘土干预：自传统人类社会以来， 有关食用粘土(食土癖)的记录已达数个世纪，并且其在非洲和中国是“文 化上可接受的”。我们实验室使用多种动物模型已揭示钙蒙脱石粘土可有 效地防止食用黄曲霉毒素引起的不良效应。通过在饮食中加入多种结合剂 或吸附剂来减少食源性接触真菌毒素的策略已得到相当的关注。早在1979 年，有报道称吸附剂粘土矿物与液体中的黄曲霉毒素B1结合。另外，发现 用于加工芥花籽油的漂白粘土减弱了T-2毒素的作用。
对饮食中黄曲霉毒素的HSCAS肠吸附剂干预：在最初的黄曲霉毒素 肠吸附剂的研究中，有报道称HSCAS(HSCASTM)——作为动物饲料抗 结块添加剂出售的钙蒙脱石粘土——在水溶液中以高亲和力和大容量吸 附黄曲霉毒素B1，并且挽救了受饮食中7,500ppb黄曲霉毒素毒性影响的 肉仔鸡和来亨鸡仔鸡。自从这些早期研究以来，HSCAS及其他类似的蒙 脱石和膨润土已被报道在多种动物幼仔(包括啮齿动物、鸡雏、火鸡雏、 鸭雏、羔羊、猪、貂和鳟鱼)中降低了黄曲霉毒素的作用。HSCAS还已 经显示出在家禽、大鼠和猪中降低放射性标记的黄曲霉毒素的生物利用 度，并减少黄曲霉毒素残留(图2)。在饮食中加入HSCAS还减少了来 自泌乳牛和山羊的乳中黄曲霉毒素M1的水平。
HSCAS吸附黄曲霉毒素的分子机制和热力学：对AfB1吸附在HSCAS 表面上的认识来自于以下观察：某些黄曲霉毒素类似物之间的立体化学差 异导致对结合紧度的显著影响(即使羰基官能团是相同的)。这些结果还 提示，黄曲霉毒素吸附在HSCAS上的分子机制可能有利于呋喃背向表面 排列的最佳朝向。基于吸附的热力学以及估计的吸附热(焓)约40kJ/mol， AfB1与HSCAS牢固地结合。可解释这些结果的可能的化学反应是电子供 体受体(EDA)机制。该机制涉及将来自粘土负电表面的电子与部分带正 电的所吸附分子中原子共享。黄曲霉毒素中包含二羰基系统的碳是部分带 正电的(缺电子的)，并且也已显示对吸附过程是必需的。当用每个配体 之羰基官能团碳的部分电荷的总和对结合强度作图时，存在显著的相关 性。当从测试化合物组中除去分子中与二氢呋喃官能团相对的一侧上不是 平面的配体时，相关性显著提高。来自具有立体化学限制性基团的化合物 的干扰也可对吸附过程起重要作用。对于包含使其大于AfB1的官能团的类 似物来说，其在粘土表面上的插入、锚定和吸附而将中间层槽(interplayer channel)隔开的现象可能受到限制。
HSCAS对黄曲霉毒素的特异性：研究支持下述结论：HSCAS在0.5 ％(重量/重量)或更低的水平(针对动物饲料中抗结块活性的推荐水平) 下对饮食中水平的黄曲霉毒素具有明显偏好(和容量)。例如，在家禽饮 食中0.5％水平的HSCAS不削弱对肌醇六磷酸盐或无机磷的利用。在其它 的家禽营养研究中，加入0.5％浓度的HSCAS不削弱对核黄素、维生素A、 锰或锌的利用。同样，在早先的研究中，已显示HSCAS(0.5％的加入比 例)保护仔鸡抵抗很高水平的黄曲霉毒素(即7,500ppb)。虽然基于粘土 的干预对黄曲霉毒素明显奏效，但还没有用于其它重要真菌毒素的类似技 术。这在很大程度上是因为，未经改良的NS粘土不与其它结构多样的真 菌毒素(例如玉米赤霉烯酮、脱氧瓜萎镰菌醇、T-2毒素、赭曲毒素A、 环匹阿尼酸(cyclopiazonic)、麦角胺和串珠镰孢毒素)“紧密地”结合， 当包含在动物饮食中时它们也不显著防止这些真菌毒素的不良效应。例 如，在家禽中针对真菌毒素(除黄曲霉毒素以外)的肠吸附剂研究中，在 饮食中加入HSCAS不显著地防止环匹阿尼酸、T-2毒素、蛇形菌素、赭 曲毒素A和串珠镰孢毒素的不良效应。在喂饲赤霉烯酮的貂中使用粘土有 助于减轻某些胎儿毒性，但不降低高雌激素效应。同样，在饮食中加入0.5 和1.0％(重量/重量)的粘土不影响暴露于脱氧瓜萎镰菌醇的猪的平均每 日体重增加。在该研究中，减少脱氧瓜萎镰菌醇毒性的唯一有效方法是用 未污染的玉米稀释污染的玉米。还研究了向家畜饮食中补充HSCAS以防 止羊茅中毒的可能性。尽管体外实验预测麦角胺与蒙脱石粘土在水溶液中 结合良好，但是HSCAS(2.0％(重量)水平)不保护大鼠或绵羊免受羊 茅中毒。为了进一步验证HSCAS对AfB1的特异性，开发了如下方案：将 HSCAS在石英表面上形成纳米结构薄膜并使用所得到的复合材料作为针 对污染介质中黄曲霉毒素的亲和探针。我们的发现提示，该复合介质(当 包装在洁净的小玻璃柱中时)与VICAM的Aflatest亲和柱的选择性是相 当的。
HSCAS的长期动物研究：在最初的使用HSCAS的短期动物研究中， 在饮食中摄取粘土后未报道有可观察到的副作用。在最近的研究中， Sprague-Dawley(S-D)大鼠在孕期全程中在饮食中摄取浓度高达2.0％的 HSCAS，母体和胎儿均未显示毒性，并且在多种组织中也不显示显著的微 量金属生物利用度。还使用啮齿动物模型来评估通过饮食慢性暴露于 HSCAS的相对安全性。该研究涉及在6.5个月期间随意用定量含有0、0.25、 0.5、1.0和2.0％水平的NS粘土饲喂的雌性和雄性Sprague-Dawley大鼠。 该研究的结果表明，用饮食中的0.25-2％NS粘土处理的大鼠在体重增加、 饲料转化率、相对器官重量、主要器官的粗略解剖和组织学外观、血液学 和血清生物化学参数方面不显示剂量依赖的或HSCAS相关的副作用。另 外，所选必需营养物(包括维生素A和E、铁和锌)未受影响。这些发现 提示，用HSCAS进行肠吸附剂治疗或饮食干预可能是在高风险人群中处 理黄曲霉毒素中毒的可能选择。
在系统或受试者中使用HSCAS的不良效应试验：基于啮齿动物的长 期研究，在健康的人类志愿者中进行HSCAS的两周短期安全性评估。该 I期不良效应试验意在确定受试者中HSCAS的短期安全性和耐受性。在包 封前，分析HSCAS中多种环境污染物的浓度，包括二噁英/呋喃和重金属， 以确保符合美国联邦政府标准和国际标准(表1)。例如，HSCAS的衍生 剂量中重金属污染量要低于联合国粮农组织/世界卫生组织的食品添加剂 联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Commission on Food Additives，JECFA)的标准。更具体地，每日3g HSCAS的衍生剂量中等 同于的钴、铬、锌、钼、硒、镍、汞、铅、镉、砷和二噁英(TCDD和 OCDD)低于JECFA的标准。
HSCAS在包封进胶囊前在121℃灭菌。在无菌条件下参照美国药品生 产质量管理规范(U.S.Good Manufacturing Practices)生产HSCAS胶囊。 在对人的研究中，整个方案遵循随机化和双盲的I期临床试验原则。有总 共50个满足招募标准的成年人自愿地加入该研究。将他们随机分为两个研 究组。其中低剂量组一天三次服用三个HSCAS胶囊(0.5g)，共两周。 高剂量组一天三次服用三个HSCAS胶囊(1.0g)，共两周。所有胶囊的 颜色和大小均一样。所述两个剂量水平由先前已公开的动物研究推知。结 果表明，该研究中使用的这两个HSCAS剂量对所有研究参与者均是可耐 受的。在某些受试者中发现胃肠副作用，其中1.5g组中有24％(6/25)， 3.0g组中有28％(7/25)。症状包括胃气胀(bloating)、便秘、腹泻、 腹胀(flatulence)以及腹部不适。低剂量(1.5g HSCAS)组中两名参与 者报告发生了某种程度的头晕，这在高剂量(3.0g NS)组中不明显。所 述的全部症状均在服用NS胶囊后最初的2天中记录到，而其后没有记录 到任何症状(或不适)。除了一名参与者以外，其它所有报告的副作用均 认定为是轻微的，并且两个处理组之间没有观察到显著差异。该研究的结 果显示，如生化和血液学参数以及身体检查的分析所证明的，在14天中以 1.5-3.0g/天向健康受试人施用HSCAS胶囊是相对安全的。已推测某些粘 土矿物可吸附维生素；然而，在该研究中用任一剂量HSCAS处理后均未 观察到维生素A和E血清水平的统计学差异。这一证据进一步证实了 HSCAS与AF特异性结合而不与维生素A和E相互作用。所分析的大多 数矿物水平均未发现显著差异，只有两个例外：低剂量组中无机硫浓度较 低，以及两组中锶浓度均较高。这些发现的临床意义尚不可知，在将来的 干预研究中将继续对其监测。
黄曲霉毒素致癌性：人肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见的癌症 之一，并且是中国和非洲某些地区的主要死亡原因，在这些地区中乙型肝 炎病毒(HBV)慢性感染以及饮食中接触黄曲霉毒素被认为是主要的病因。 在较发达的国家中，充足的粮食供给以及监控食物中这些黄曲霉毒素水平 的规定提供了保护和减少人群接触黄曲霉毒素的手段。在饥饿横行且没有 食品质量规定的国家中，每天暴露于黄曲霉毒素显著地增加了患HCC及 其他人体健康不良效应的风险。在多数这些情况下，扔掉和/或替换这些真 菌毒素污染的食物不是可行的做法。遗憾的是，这样的生存状况在21世纪 的今天依然存在，因此减少或消除饮食接触黄曲霉毒素以改善这些高风险 人群的健康状况和生活品质的重要性愈加突出。黄曲霉毒素是多种黄曲霉 (Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)菌株产生的二 呋喃香豆素衍生物；特别地，黄曲霉是农业中常见的污染物。这些产毒的 真菌物种遍布全世界，相比于温带的环境，其在温暖的亚热带和热带气候 中更加盛行。谷物、油籽、坚果、水果、烟草和许多其它农产品的天然污 染是经常发生的。在曲霉属所产生的四种主要的黄曲霉毒素同类物(B1、 B2、G1和G2)中，黄曲霉毒素B1(AfB1)是最强的致肝癌物质并极大地 威胁人类健康。肝脏是所摄取的黄曲霉毒素进行生物转化的主要部位。首 先，AfB1被细胞色素P450 CYP1A2和CYP3A4所氧化，得到两种黄曲霉 毒素-8，9-环氧化物立体异构体。外环氧化物(一种高活性中间体)与鸟嘌 呤的N7原子反应形成促突变DNA加合物——AfB1-N7-鸟嘌呤。该黄曲霉 毒素-DNA加合物是不稳定的，并发生脱嘌呤作用继而在尿中排泄。该外 环氧化物还能够与血清白蛋白及其它细胞蛋白质中的赖氨酸残基结合。 CYP1A2还催化AfB1的羟基化作用而产生AfM1(其是人体中主要的黄曲 霉毒素代谢产物)，还产生另外的氧化产物例如AfP1和AfQ1。这些代谢 产物可不经过进一步生物转化就被排泄掉，或者它们可通过UDP-葡糖醛 酸基转移酶进行缀合，然而AfM1不是葡醛酸缀合反应(glucuronidation) 的底物。黄曲霉毒素-8，9-环氧化物中间产物也是谷胱甘肽S转移酶的底物， 其产生在胆汁中排出的稳定、无毒、极性产物。所述黄曲霉毒素-谷胱甘肽 产物进一步在肝和肾中依序代谢，最终作为巯基尿酸(黄曲霉毒素-N-乙酰 半胱氨酸)在尿中排泄。黄曲霉毒素最初在1993年由国际癌症研究机构 (International Agency on Research in Cancer)划定为人类致癌物质，进 一步对其进行流行病学和实验研究表明黄曲霉毒素暴露与HCC之间密切 相关。仅在中国，HCC每年造成超过200,000人死亡，是癌症死亡的第三 大主要原因。特别是在中国东部的江苏省启东市，HCC是癌症死亡的主要 原因，并且在某些乡镇地区中占所有成年人死亡的多达10％。早先有关黄 曲霉毒素暴露与HCC相关的证据大都基于对黄曲霉毒素摄入的估计(如 对污染食物进行测量或者来自饮食调查问卷)。进一步的研究依赖于将测 量尿和血中的多种生物标志物作为一种将黄曲霉毒素暴露与HCC发生相 关联的更精确的手段。尿中的AFB-N7鸟嘌呤加合物已被用于许多针对介 质、系统或受试者的AfB1研究中，作为暴露于黄曲霉毒素的定量指标。 AfM1是AfB1摄入后排泄的主要尿代谢产物，其也可用作黄曲霉毒素暴露 的线性生物标志物。另外，血清中的黄曲霉毒素-白蛋白加合物已被用于长 期暴露估计。这些黄曲霉毒素特异性生物标志物的获得和应用有助于更好 地表征高风险人群中人对黄曲霉毒素的暴露以及敏感度。例如，在二十世 纪九十年代初期上海进行的巢式病例对照生物标志物研究显示了黄曲霉 毒素暴露与HCC之间显著的关联性，并且当黄曲霉毒素暴露伴随慢性乙 型肝炎感染时肝癌风险增加六十倍之多。随后在台湾和启东的研究也实了 这些发现。
Phillips等人在1993年1月12日授权的发明名称为“溶液中真菌毒 素的选择性固定和检测”的美国专利5,178,832描述了某些矿物、特别是多 种天然形式的氧化铝优先从真菌毒素混合物中选择性结合选定的真菌毒 素。当将这些吸附剂与现有技术的吸附剂以不同组合和/或联合使用时，可 以构建可分析溶液中真菌毒素的检测管并提供对饲料或食品样品中真菌 毒素浓度的半定量荧光测定。所述检测管包含装填有选定矿物的分离层的 透明管。将来自可能污染真菌毒素之样品的溶剂提取物通过该柱。随着真 菌毒素混合物通过所述检测管并与多种矿物吸附剂接触，选定的真菌毒素 被固定在特定矿物上，而其它真菌毒素和共提取的有机化合物则通过该层 在随后的下游矿物层上被固定。通过在长波UV光源下检测发光的检测管 来确定真菌毒素的存在。
Taylor等人在1992年11月24日授权的发明名称为“使动物饲料中存 在的真菌毒素失活的动物饲料添加剂和方法”的美国专利5,165,946描述了 能够使真菌毒素失活的干固体动物饲料组合物。当饲料被真菌毒素污染并 且与包含能够使真菌毒素失活的层状硅酸盐矿物颗粒的真菌毒素失活剂 混合时，所述混合物质增强所述层状硅酸盐的真菌毒素失活能力。
用于针对黄曲霉毒素治疗的粘土
本发明的基于粘土的组合物可用于结合与治疗对环境毒素的暴露、治 疗急性黄曲霉毒素中毒以及预防黄曲霉毒素诱发的肝癌和慢性黄曲霉毒 素中毒。然而，本领域普通技术人员会了解到存在许多不同类型的粘土， 并且在人类历史上对粘土的用途和应用已经有充分的记载。
粘土是水合硅酸盐颗粒聚集物的通称。一般地，粘土由多种层状硅酸 盐矿物(通常富含硅和铝的氧化物)和氢氧化物组成。粘土以其小尺寸、 呈薄片或分层的形状、对水的亲和性以及高塑性指数而不同于土壤中存在 的其它小颗粒(例如泥沙)。层状硅酸盐粘土主要分为高岭石、蒙脱石- 蒙皂石、伊利石和绿泥石。
蒙脱石粘土通常作为低硅岩的风化产物形成。蒙脱石是蒙皂石的一员， 并且是膨润土的主要成分。
纹泥(或明显分层的粘土)是具有可见年层的粘土，其由侵蚀和有机 物含量的季节性差异形成。这类沉积物在来自先前冰河时期的冰川湖中很 常见。
流粘土是一种独特类型的海相粘土(marine clay)，它是挪威、加拿 大和瑞典的冰蚀地形所特有的。这是一种高灵敏性粘土，易于液化，并已 引发几次非常危险的滑坡。
粘土的另外的名称包括：HSCAS、Akipula、硅酸铝、无水硅酸铝、 askipula、贝保蒙脱石(beidellitic montmorillonite)、benditos、生物电 矿物(bioelectrical mineral)、cipula、白垩、粘土灰(clay dirt)、粘土 尘(clay dust)、粘土锭剂(clay lozenge)、粘土悬浮产品、粘土片剂、 胶体矿物、胶体微量矿物、硅藻土、腐殖页岩、印第安愈合粘土(Indian healing clay)、高岭土、kipula、岩粉(mountain meal)、panito del senor、 植物源液体矿物、tirra santa、杂褐铁埃洛石(Terra sigillata)、白粘土、 白泥等。
粘土的医药用途。现在，粘土已在许多工业工艺中用于制造砖、烹饪 用锅、艺术品、餐具、火花塞壳、水泥产品以及化学过滤器。根据民间传 说，食用粘土具有许多医药用途，但科学文献表明摄入某些粘土可能对食 用者有害。粘土的化学性质可使得它们吸附多种可能有害的物质。例如， 装有糖果(Jarritos牌Tamarindo糖果)的粘土罐已在美国被食品和药物 管理局召回，其原因是糖果中含有来自粘土罐的高水平的铅。粘土制品可 含有不同含量的铝、砷、钡、铅、镍、钛及其他微量金属。此外，在农场 饲养的鲶鱼以及用含有密西西比矿山球粘土的饲料饲养的鸡所产的蛋中 已发现高水平的2，3，7，8-四氯二苯并对二噁英。另外，长期食用粘土可能与 微量元素缺乏症有关。然而，应当指出，在制陶工业中主要使用的以及系 统或受试者食用的粘土种类是高岭土(球粘土)。
为此，被入体所摄取的粘土(尤其是高岭土)不应含有高水平的有毒 物质。本发明的经加工粘土可用于治疗或预防黄曲霉毒素毒性。尽管粘土 在非洲、印度和中国以及被美洲土著人用于医疗已经历了数个世纪，但本 领域普通技术人员了解，长期口服摄入某些粘土可能导致严重的副作用。 如下所述，科学界和医学界认为这些副作用有可能大大超过任何可能的益 处。
食用泥土、粘土或其它非营养物质的做法可称为“异食癖”或“食土 癖”，常见于幼年以及精神障碍或精神病患者。一些证据证明矿物质缺乏 (例如铁缺乏)可导致异食癖，这在发展中国家和贫困地区尤为常见。长 期摄入粘土可导致铁吸收不良以及加剧此症状。对于将粘土用于任何医学 病症，尚无充分的科学证据进行支持或反对。长期口服摄入粘土的潜在副 作用有可能大大超过任何可能的益处。
粘土制品可含有不同含量的铝、砷、钡、铅、镍、钛及其他微量金属。 某些胶体矿物添加物还可能包含非安全浓度的放射性金属。当用于怀孕期 或哺乳期的患者时，或者用于儿童时，摄入某些粘土可能是不安全的。某 些粘土可具有结合钾的能力，长期摄入这些粘土与严重的低钾血症有关， 特别是在肾功能不全的患者中。已提示，经常性食用高岭土(异食癖或食 土癖)可导致铁吸收不良以及严重缺乏，并可能与贫血和铅中毒有关。
以下是所报道的“异食癖”或“食土癖”的生理问题：
对某种粘土产生变态反应/超敏感性，其特征为出现水肿、扩张性心肌 病、多尿以及死亡。另外，注意到受试者的上下肢皮肤干燥、皮肤溃疡。
神经病/CNS：异食癖与儿童发生铅中毒有关，并可带来中枢神经系统 损伤的风险。在一份病例报告中，一名6岁女孩在摄入来自釉面粘土罐的 柠檬汁后死于铅中毒并发症和脑病。埃塞俄比亚的病例对照研究中报道， 当用粘土器具烹调山黧豆时，患神经型山黧豆中毒(一种引起导致瘫痪的 身体痉挛性轻截瘫的神经退行性不可逆病症)的风险增加了四倍。
精神病：习惯性异食癖可发生干患有精神疾病(包括精神病)的患者 中。
肺/呼吸：在二十世纪六十年代，有报道称有异食癖病史的儿童比健康 儿童更易于发生更频繁的和严重的呼吸道感染。慢性支气管炎、呼吸困难 和尘肺也与重粘土工业中的灰尘暴露有关。
心血管：有报道称异食癖与扩张性心肌病和死亡有关。
胃肠：食用粘土可导致便秘或腹泻。还报道了饭后的胃灼热、腹胀、 食欲不振和呕吐。食用粘土还与引起肠穿孔的肠梗阻和坏死性小肠炎有 关。已报道，在两名有异食癖的儿童中发现结肠结石。食土癖也与肝脾大 有关。
肾：粘土具有结合钾的能力，长期摄入粘土与严重的低钾血症有关， 特别是在肾功能不全的患者中，而在接受血液透析的患者中却尚未发现。
内分泌：在一个摄入大量粘土的病例报告中已报道由严重低钾血症引 起的肌病。
泌尿生殖：长期食用粘土与多尿和紧迫性尿失禁以及性腺功能减退有 关。
血液学：异食癖可导致铁吸收不良以及严重缺乏，并与贫血有关。 肌骨胳：长期摄入粘土与肌炎有关。已报道大量粘土摄入导致由严重 低钾血症引起的肌病。
感染性疾病：粘土摄入还与钩虫感染有关。已报道，在食用粘土的婴 儿中以及脐带被粘土包覆的新生儿中感染来自粘土的破伤风。
铁、钙、镁：某些粘土可作为阳离子交换树脂。这些粘土中的钙和镁 可与铁发生交换，由于形成不溶的铁络合物使铁难以利用。可发生铁缺乏， 并且钙或镁的水平可提高。
钾：某些粘土具有结合钾的能力，并与低钾血症有关。
本领域普通技术人员可理解，对于将某些粘土用于医学用途，文献中 尚无充分的科学和临床证据进行支持或反对，然而，当前医学中的实例倾 向于教导不要将使用粘土作为黄曲霉毒素中毒患者或易患肝癌患者的安 全治疗。本发明的方法和组合物应用通常不被系统/受试者食用、或用于陶 瓷餐饮器具制造的经分离粘土组合物。本发明的经加工粘土具有特别的化 学组成，当口服施用时其不会对健康造成有害影响(基于对人和动物的广 泛的科学研究)。

本发明的第一方面是口服组合物，其用作在受试者中减轻环境毒素(特 别是黄曲霉毒素)所污染食物之效应的预防性治疗，所述受试者由于暴露 于高水平黄曲霉毒素而具有发生肝癌和黄曲霉毒素中毒的风险。所述组合 物包含有效量的经加工的粉末形式铝硅酸钙粘土，其中所述经加工的铝硅 酸钙粘土含有低于EPA、JECFA和WHO推荐的人体每日可容许摄入量 的四氯二苯并对二噁英(TCDD)和优先有毒金属污染。此外，该粘土对 黄曲霉毒素具有大容量和高亲和力。所述经加工的铝硅酸钙粘土具有的化 学组成包含：高于3.2％的CaO；4.0-5.4％的MgO；5.4-6.5的Fe2O3；0.50-0.90 ％的K2O；0.10-0.30％的Na2O；0.01-0.03％的MnO；14.8-18.2％的Al2O3； 62.4-73.5％的SiO2；其中，该化学组成以重量百分比给出。优选的经加工 铝硅酸钙粘土具有小于80微米的平均粒径以及5～9的pH值。
本发明的第二方面是减轻受试者中食源性黄曲霉毒素效应的方法，所 述受试者具有发生HCC和/或黄曲霉毒素中毒的高风险。所述方法包括(a) 口服施用有效量的经加工的粉末形式铝硅酸钙(”CAS”)，其中CAS 包含可接受水平的TCDD和优先有毒金属污染，并能够与黄曲霉毒素结 合；(b)针对急性中毒，等待一段时间(例如小于约24小时)；以及(c) 重复步骤(a)-(b)，直到黄曲霉毒素的效应被减轻；(d)针对慢性中 毒，施用CAS直到不再具有暴露于黄曲霉毒素的风险。优选的CAS具有 的化学组成包含：高于3.2％的CaO；4.0-5.4％的MgO；5.4-6.5的Fe2O3； 0.50-0.90％的K2O；0.10-0.30％的Na2O；0.01-0.03％的MnO；14.8-18.2 ％的Al2O3；62.4-73.5％的SiO2；其中，该化学组成以重量百分比给出。优 选的经分离CAS具有小于80微米的平均粒径以及5～9的pH值。
本发明基于粘土的组合物也称为CAS，其能够减轻任何环境毒素的效 应，尽管不如黄曲霉毒素有效。

以下附图构成本说明书的一部分，其用于进一步阐明本发明的某些方 面。通过将这些附图的一幅或多幅与本文所给出之具体实施方案的详细说 明结合起来参考，可以更好地理解本发明。
图1显示主要的黄曲霉毒素同类物的化学结构。
图2显示使用HSCAS的体内研究结果。
图3显示规则的HSCAS对比破碎的HSCAS之等温曲线。
图4显示摄入不同水平CAS的三个组在不同时间段后的维生素A水 平。
图5显示摄入不同水平CAS的三个组在不同时间段后的维生素E水 平。
图6显示NS干预试验的总体研究设计。
图7显示NS干预对血清AFB1-白蛋白加合物水平的剂量效应。
图8显示NS干预对血清AFB1-白蛋白加合物水平的时间效应。
图9显示NS干预对尿AFM1水平的剂量效应。
图10显示NS干预对尿AFM1水平的时间效应。
发明详述
在详细描述本发明之前，应理解本发明不局限于特定的组合物或组合 物递送系统，它们是可以改变的。还要理解本文使用的术语目的仅在于描 述特定的实施方案，而不旨在限制。另外，在描述本发明的详细实施方案 之前，有必要对用于描述本发明的定义进行阐明。所阐明的定义仅适用于 本专利中使用的术语，并且可能不适用于他处(例如在科学文献或者其它 专利或申请中，包括本发明人或转让给共同所有人的其它申请)使用的同 样术语。另外，当给出实施例时，它们仅旨在示例性而非限制性的。
必须指出，除非上下文明确指明，否则本说明书和所附权利要求书中 使用的单数形式包含复数含义。因此，例如，“药理学活性剂”包括两种 或更多种这样的化合物的混合物，“基质”包括两种或更多种基质的混合 物，等等。
在本发明的描述和权利要求中，下列术语将参照如下定义来使用。
“活性剂”、“药理学活性剂”、“组合物”和“药物”在本文中可 互换使用，其指可用于预防和治疗黄曲霉毒素中毒和黄曲霉毒素所诱导肝 癌的组合物和药物。该术语还包括这些药物的可药用、药理学活性的衍生 物和类似物，其包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、包合物、 类似物等。所以，当使用术语“活性剂”、“药理学活性剂”或“药物” 时，应理解申请人旨在包括活性组合物本身以及可药用、药理学活性的盐、 酯、酰胺、前药、活性代谢物、包合物、类似物等，其在本文中统称为“可 药用衍生物”。
本发明涉及使用有效量粘土作为黄曲霉毒素结合剂或吸附剂来预防或 治疗黄曲霉毒素中毒的组合物和方法。黄曲霉毒素是一类主要由真菌黄曲 霉和寄生曲霉产生的致癌真菌毒素，并且其常常在食品和农产品中检测 到。这些化合物是热稳定的，并且可承受多种食品加工工序；因此黄曲霉 毒素可能是大多数食物和家畜饲料中“不可避免的”污染物。在四种天然 黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)中，黄曲霉毒素B1是毒性最强的，并已 显示出破坏参与致癌和肿瘤抑制的基因。另外，一些研究提示，暴露于低 水平黄曲霉毒素可引起免疫系统的抑制以及增加对疾病的易感性。
尽管不希望被理论所局限，尚没有可在多种农产品中完全消除真菌毒 素污染的确切方法；然而，基于粘土的方法的确提供了一种用于减少饮食 暴露于黄曲霉毒素的经济实用的解决办法。此外，食用黄曲霉毒素肠吸附 剂和非特异性结合剂用于预防和治疗黄曲霉毒素中毒的用途将在下文实 施例中进行描述。
本发明还涉及使用有效量的粘土作为毒素结合剂或吸附剂来预防或治 疗任何环境毒素效应的组合物和方法。
实施例
提供下列实施例以进一步对本发明及其实施方式进行举例说明。然而， 应理解实施例中给出的具体细节仅仅是选来用于举例说明的，而不应解释 为对本发明的限制。
实施例1
用于处理农产品中黄曲霉毒素的一些策略是可用的，其中最简单的是 需要分离并破坏污染源。然而，该方法常常是不实用的，这是因为可能没 有可替代的食物供应，或者替代供应可能是经济上不允许的。用于在家畜 中预防黄曲霉毒素中毒的一个最有前景且研究充分的方法涉及将粘土或 多种“结合剂”掺入受这些毒素污染的饮食中。该添加剂减少了毒素在胃 肠道中的生物利用度；也即，它们作为该毒素的螯合剂(肠吸附剂)，因 此降低了在血液和靶器官中的吸收和分布。
已报道，吸附性粘土矿物与液体中的黄曲霉毒素B1结合。在第一个 有关黄曲霉毒素的肠吸附剂研究中，常用作动物饲料抗结块添加剂的钙 蒙脱石粘土显示出在水溶液中以高亲和力和大容量显著吸附黄曲霉毒 素B1，并保护了肉用仔鸡和来亨鸡免受饮食中7,500ppb黄曲霉毒素的 毒性作用。从这一最初研究开始，已有报道称钙蒙脱石粘土及其它类似 的蒙脱石粘土在多种动物幼仔(包括啮齿动物、鸡雏、土鸡雏、鸭雏、 羊羔、貂和猪)中降低了黄曲霉毒素的毒性作用。饮食中的粘土还显示 出降低了乳中的黄曲霉毒素M1水平。最近，通过加入钙蒙脱石粘土减 少了狗中的AfB1暴露的尿中生物标志物。因此，饲料中0.5％(重量/ 重量)的CAS保护免受同样饲料中7,500ppb黄曲霉毒素的不良效应。 正常情况下，食物或饲料的污染物中不会有如此高的黄曲霉毒素水平， 因此，这代表了“最坏的情况(worst case scenario)”。饮食中低至0.25 ％(重量/重量)的水平可显示出黄曲霉毒素保护。推及人的情况，胶 囊中约3g剂量的CAS近似于食物中0.25％的水平，这是基于加纳的食 物摄入数据以及70Kg体重来推算的。
体内使用粘土的GRAS状态和安全性研究。本领域普通技术人员可 以认识到，科学出版物支持将钙蒙脱石粘土作为黄曲霉毒素结合剂用于 动物饲料中。本文描述了在多种动物物种中涉及钙蒙脱石粘土的多项体 内研究的汇编(参见图2)。例如，根据生产或饲养的质量管理规范，通 常认为水合铝硅酸钠钙以不超过2％的水平在饲料中使用时是安全的。
在涉及钙蒙脱石粘土的动物研究中，尚未有报道称粘土治疗(以高 达饮食中2.0％的水平)具有副作用。在最近使用啮齿动物的研究中， 在怀孕Sprague-Dawley大鼠的整个怀孕期间，在饮食中高水平(2.0％ 重量/重量)暴露后对潜在的毒性以及微量金属的生物利用度进行评估。 以2.0％(重量/重量)水平将粘土添加到怀孕期间Sprague-Dawley大 鼠的均衡饮食中。在怀孕第16天进行毒性评估，除了胚胎吸收以外， 还包括母体体重、母体饲料摄入、幼仔重量。收集肝、肾、胫骨、脑、 子宫、合并的胎盘以及合并的胚胎，并称重。将组织冻干，然后进行中 子活化分析(neutron activation analysis，NAA)。NAA所考虑的元素包 括：铝、溴、钙、铈、钴、铬、铯、铜、镝、铕、铁、铪、钾、镧、镥、 镁、锰、钠、钕、镍、铷、硫、锑、钪、硒、钐、锶、钽、钍、碲、钍、 钛、铊、铀、钒、镱、锌和锆。电感耦合等离子体-质谱进一步确定脑 中的铝低于检出限(0.5ppm)，这表明该金属由于在胃肠道中与粘土相 互作用而没有显著的生物利用度。补充任一粘土的动物在毒性评估和金 属分析方面与对照类似，只是补充粘土后脑中的铷有所减少。总的来说， 该研究的结果揭示出，在怀孕大鼠中粘土在高饮食浓度下没有产生明显 的毒性，也没有影响矿物质的吸收或利用。在一些实施方案中，根据粘 土的GRAS状态、优先微量金属纯度和二噁英水平来选择用于测试的粘 土，参见表1。
在啮齿动物和受试者中进行的其它研究证实了钙蒙脱石粘土用于 人类饮食的安全性。在啮齿动物研究中，用含约0、0.25、0.5、1.0和 2.0％水平之钙蒙脱石粘土的饲料来饲养大鼠。在研究结束时测量、标准 化并比较体重、体重增加、器官重量、组织病理、血浆生化性质、血清 维生素A和E以及微量营养物(铁和锌)，以确定毒性以及粘土与重要 营养物的任何相互作用。暴露于粘土6周后，在治疗组中未观察到患病 或死亡。主要器官、血清生化性质或微量营养物水平没有变化。在每种 性别的治疗组中，肝、肾、肺、心、脑、脾和胫骨的器官重量与最终体 重的比例没有显著差异，对肝和肾进行组织病理学分析表明对照与粘土 治疗组之间没有差异。这些结果表明，饮食中包含水平低于2.0％(重 量/重量)的粘土不会导致明显的毒性，并可安全地用于减少胃肠道中 黄曲霉毒素的暴露。在人体研究中，首先检测钙蒙脱石粘土的微量金属 和二噁英含量，以确定物质组成并确保低水平污染。
然后将钙蒙脱石粘土加热灭菌，装入胶囊以用于研究。该研究设计 基于2个治疗组：(1)低剂量——3×500mg胶囊×3次/天，共2周， 以及(2)高剂量——3×1,000mg胶囊×3次/天，共2周。所述2周 试验由50个健康成年人组成，年龄22～40岁，通过最初的体检、体液 (biological fluid)实验室分析和问卷调查来挑选。本领域技术人员能 够制备根据上文所述修饰的剂量有所变化的胶囊，参见Remmington’s Pharmaceutical Sciences第17版。然后，在饭前用矿泉水将粘土胶囊 施用给参与者。医疗人员在现场监测有无任何症状或不良效应。在2周 结束时取血样和尿样，并再次进行实验室分析和体检。根据NIH的指 南对任何不良效应进行报告。在2周的研究期间，对给药的依从性达到 100％。用于监测不良效应的临床分析和生化数据、针对肝和肾功能的 血和尿参数未显示任何具体的不良效应。
作用模式和机理研究。一些体外研究已对黄曲霉毒素吸附至水合铝 硅酸钠钙粘土(HSCAS)表面上进行了评估。水溶液中的HSCAS显示 出紧密并优先吸附AfB1以及在分子结构中含有完整β-二羰基体系的黄 曲霉毒素B1(AfB1)类似物。AfB1吸附至HSCAS的等温分析显示出高 亲和力和大容量的特点，并且还提示AfB1吸附在粘土表面可能有不同 的位点和/或作用机制来参与。AfB1吸附的焓(约40kJ/mol)显示出某 些变化，这提示HSCAS上的各位点具有不同的热力学性质。这些发现 表明，HSCAS表面上的多个位点可化学吸附AfB1，并且AfB1分子的最 佳取向很有可能是平铺在夹层粘土表面上。黄曲霉毒素类似物上的官能 团可能在空间上阻碍在HSCAS表面上的吸附，或者可能通过与夹层区 域相互作用而阻断吸附。AfB1吸附至HSCAS表面的其它机制可能涉及 与占优势的夹层阳离子(例如钙以及多种其它的边缘位置金属)可能发 生螯合。
成分描述和特征。铝硅酸钙粘土(CAS)与水合铝硅酸钠钙(HSCAS) 粘土具有不同的组成，后者为深棕褐色。CAS的外观为灰白色至灰绿色 的自由流动粉末。CAS是无味的，比重约为2.4。经分离的CAS在水中 基本不溶，pH为约5～9。由于含有硅石成分和铝硅酸盐成分，因此如 果吸入经分离CAS的干燥颗粒会导致一些不良反应，但是尚未发现摄 入所述颗粒对健康造成不良影响。典型的数值如下：
典型的物理性质：
游离水分(LOD)              9％
松密度                     0.64g/cc，40磅/英尺3
紧密度                     0.80g/cc，50磅/英尺3
粒径分布                   5％+100目
                           18％+200目
                           60％+325目
典型化学分析：
利用X射线分级(XRF)谱的化学       ％CaO 3.2-4.8
分析(重量百分比)                 ％MgO 4.-5.4
                                 ％Fe2O3 5.4-6.5
                                 ％K2O 0.50-0.90
                                 ％Na2O 0.10-0.30
                                 ％MnO 0.01-0.03
                                 ％Al2O3 14.8-18.2
                                 ％SiO2 62.4-73.5
另外，对来自Engelhard’s(现为BSAF)，Jackson，MS工厂的经 加工粘土产品的检测证实，CAS中含有低水平的TCDD(<0.33份/万亿 份(ppt))。Engelhard(BASF)的说明书中将TCDD作为食品成分中 存在二噁英的指标。
等温吸附分析的分析步骤和方法。使用由纯的AfB1晶体(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶于乙腈制备的黄曲霉毒素B1(AfB1) 储液进行等温吸附分析。然后，将一定体积的储液注射进纯水(去离子 水)中，得到8μg/mL的AfB1工作溶液。然后用紫外可见光分光光度 计来校验工作溶液的浓度(λmax＝362nm；ε＝21,865)。分批等温步骤需 要将含有100μg吸附剂的样品与浓度递增的溶质(AfB1)(0.4、0.8、 1.6、2.4、3.2、4、4.8、6、6.4、7.2和8μg/mL)接触。该研究中针对 每种溶质浓度重复三次。所述溶质浓度通过将适量的AfB1工作溶液加 至17×100mm无菌聚丙烯离心试管中、然后补充纯水至总体积为5ml/ 管来获得。在16×125mm一次性硼硅玻璃试管中称取约10mg吸附剂， 向该吸附剂中加入纯水，得到2mg/mL的悬液。将该吸附剂/水悬液涡 旋混匀3秒，然后用自动移液器将每50μL转移到每个重复中。在每次 转移前再次进行混匀。除了样品以外还有三组对照，其由5mL纯水、5 mL不含吸附剂的AfB1工作溶液以及5mL不含吸附剂的最低浓度AfB1 组成。将样品和对照封盖，并分别置于15、25或37℃孵箱中的电动定 轨摇床上，以1,000rpm孵育24小时。振摇后，将样品在与振摇相同 的温度下以10,000rpm离心15分钟。用分光光度计测量样品和对照的 上清液中剩余AfB1的紫外可见光吸收。在最高的AfB1浓度水平下，保 留上清用于HPLC分析以检查任何降解的化合物，这是因为该吸附计算 依赖于不同的计算方法。
数据计算和曲线拟合。使用紫外可见光吸附数据来计算每个数据点 的溶液中AfB1剩余量以及吸附量。使用TableCurve 2D软件(Systat Software Inc.，Richmond，CA)，将这些数据拟合Langmuir等温方程：
$q=Q_{\max }\times \left(\frac{K_d\times C_w}{1{+K}_d\times C_w}\right)$
其中q是所吸附AfB1的量，Qmax是所吸附AfB1的最大量，Cw是溶 液中AfB1的平衡浓度，Kd是分配常数。将Langmuir方程作为用户自 定义的函数输入TableCurve 2D程序，并且其变量参数具有限制以及一 级近似。Qmax的参数限制为0至最大1mol/kg的正数。Kd的参数限制 为0至1×1025。由TableCurve 2D来确定参数Qmax和Kd的初始估计值。 将这些值输入TableCurve 2D中的Langmuir用户自定义函数后，拟合 这些数据，获得Qmax和Kd的理论值。利用以下方程通过比较在15、25 和37℃时的各Kd值来计算ΔHads(吸附焓)：
$\Delta H_{\mathrm{ad}}=\frac{-R\ln (K_{d2}/K_{d1})}{(1/T_2)-(1/T_1)}$
通过从以下Langmuir方程中解出Kd得到Kd的定义：
Kd＝q/(Qmax-q)Cw
将Langmuir方程拟合15、25和37℃的吸附数据得出Qmax。
测量COLE指标的方法。一种膨胀性质的度量，即线性膨胀系数 (coefficient of linear extensibility，COLE)指标是润湿后土壤体积与润湿 前土壤体积的比值再减去一。COLE＝(润湿后粘土体积/润湿前粘土体积) -1。COLE指标值大于0.03标志着样品中存在大量的蒙皂石(膨胀粘土)。 一般步骤总结如下：
1、将5mL(5cm3)干燥粘土加至25mL量筒中；
2、将蒸馏水加至粘土，使总体积达到25mL；
3、剧烈振摇或搅拌，以确保粘土彻底润湿；
4、使悬液在室温静置24小时；
5、测量沉淀下来的粘土的膨胀体积。
胀缩潜力(shrink-swell potential)与粘土的种类和量密切相关。最大 胀缩潜力出现在含有大量2:1晶格粘土(例如蒙皂石)的土壤中。随水分 含量的变化，伊利石粘土的受影响程度居中，而高岭石粘土受影响最小。 图3显示规则的HSCAS和热破碎的HSCAS在25℃时的吸附等温曲线。
实施例2
原发性肝细胞癌(HCC)具有独特的地理、性别和年龄分布，其可能 由特定的致病因素(即肝炎和黄曲霉毒素暴露)来决定。根据地理位置的 不同，HCC的发病率有很大不同。在同一国家的不同种族中以及在同一国 家的不同区域中HCC的分布也不一样。
高发病地区(每年每100,000人中超过15例)包括撒哈拉以南的非洲、 中国、香港和台湾。所有HCC病例中超过40％发生在中国，其每年发生 137,000例。相反，北美、南美、欧洲大部分地区、澳大利亚和中东部分地 区的发病率很低，每年每100,000人中报道少于3例。但是，在过去20年 中美国的发病率有所增加，这可能由于许多人患长期慢性丙型肝炎所致。
男性比女性更易患HCC，据称在高发病地区更加悬殊，其男性患病率 为女性的2.1至5.7倍(平均为3.7:1)。在中等发病地区，该比值降至2.4:1， 在低发病地区则更低。尽管尚未完全弄清楚，但是性别分布的这些差异被 认为是由于肝炎携带状态、暴露于环境毒素以及雄性激素营养作用的差异 所致。
绝大多数HCC发生于患有慢性肝病或肝硬化的患者中。因此，患有 长期肝病的老年患者更易发生HCC。在亚洲和西欧进行的一些大规模前瞻 性研究中发现，发病的平均年龄在50至60岁之间。但是，在撒哈拉以南 非洲，HCC发病的平均年龄偏低，其发病平均年龄为33岁。
尝试了解HCC独特的分布特点使我们加深了对患该病的风险因素的 了解。因此，已有多种导致HCC发病的重要风险因素被鉴定出。这些因 素包括乙型肝炎携带状态、黄曲霉毒素、慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、 遗传性血色素沉着病以及由几乎任何原因导致的肝硬化。但是，HCC也发 生在无已知风险因素的患者中。下面分别讨论对所有这些疾病进行监视的 情况。
乙型肝炎携带状态。乙型肝炎携带状态与肝细胞癌之间的相关性已在 若干基于大量人群的研究中以及其它报道中得以表明。例如，在一份报告 中，在1975年至1978年间跟踪研究了台湾的22,707名男性政府雇员，其 中15％是HBV携带者(乙型肝炎表面抗原呈阳性)。这些HBsAg携带者 患HCC的相对风险是非携带者的223倍。在另一系列研究中，HBsAg的 相对风险917位患肝硬化或慢性肝炎的日本患者中为6.9。
黄曲霉毒素。黄曲霉毒素可导致HCC发病。黄曲霉毒素是常见于污 染玉米和花生的真菌毒素。摄入高比率的黄曲霉毒素与HCC有关。例如， 台湾的澎湖列岛具有极高的HCC发病率，其不完全由HBV携带所造成。 在一个研究中，对来自该地区的20名HCC患者与86名年龄匹配的对照 进行比较，患者中更大可能含有黄曲霉毒素B1-白蛋白加合物(65％对37 ％；调整后的优势比(adjusted odds ratio)为5.5)；94％的患者是HBsAg 携带者。在另一个来自上海的研究中，携带HBV且暴露于黄曲霉毒素的 个体发生HCC的风险是正常人群发病率的59.4倍。
已表明，在长期暴露于黄曲霉毒素的肝细胞癌患者中p53肿瘤抑制基 因发生突变。在肝癌发生动物模型中也已证实了类似发现，其中在暴露于 HBV和黄曲霉毒素的实验动物中观察到p53突变。在表达乙型肝炎表面抗 原的转基因小鼠中已证明这些风险因素的加强作用；在一个研究中，使其 中一些小鼠缺少一个p53等位基因和/或暴露于黄曲霉毒素。在13个月龄 时，具有所述三种风险因素的所有7只小鼠均发生严重的HCC，相比较地， 暴露于黄曲霉毒素的具有两个p53等位基因的小鼠中有62％患病，而缺少 一个p53等位基因但未暴露于黄曲霉毒素的小鼠中有25％患病。
食用已被确定为HCC致病剂的黄曲霉毒素是危险的。但是，世界上 许多低社会收入居民常常要在食用污染食物与饥饿之间做出选择。在这种 选择之下，患HCC的风险要优于饥饿和确定的死亡。
本发明的一个方面是在易患HCC的人中减轻黄曲霉毒素效应的方法， 其包括至少每天一次(优选每顿饭前、饭时或饭后)口服施用有效量的粉 末形式、片剂或胶囊形式的经分离低钠的、铝硅酸钙粘土。所述经分离的 低钠的、铝硅酸钙粘土基本不含二噁英和有毒重金属污染，并能够结合黄 曲霉毒素。在一个优选实施方案中，所述经分离的低钠的、铝硅酸钙粘土 具有如下化学组成(重量百分比)：高于3.2％的CaO；约4.0-5.4％的MgO； 约5.4-6.5的Fe2O3；约0.50-0.90％的K2O；约0.10-0.30％的Na2O；约 0.01-0.03％的MnO；约14.8-18.2％的Al2O3以及约62.4-73.5％的SiO2。另 外，在一个优选实施方案中，所述经分离的铝硅酸钙粘土具有小于约80 微米的平均粒径。但是，为了均一性和纯度，选择标称为200目的粒径。 这些特征对于研究和比较黄曲霉毒素在多种粘土表面上的吸附以及描绘 出该过程的热力学和动力学性质是理想的。本领域技术人员会了解粘土矿 物在结构和化学性质上是多样的。许多对于吸附黄曲霉毒素是无效的和/ 或非选择性的。本发明的CAS经评估含有：(a)可接受的配体吸附热力学 性质；(b)优先金属(priority metal)和二噁英/呋喃的可接受水平；(c) 在多种动物物种中有功效；(d)长期研究的安全性；(e)以及与维生素和 微量营养物的相互作用可忽略不计。
实施例3
黄曲霉毒素(AF)是霉菌生长的有害副产物，其主要由真菌黄曲霉和 寄生曲霉产生。天然存在的AF(例如B1、B2、G1和G2)已被列为单独或 同时存在于人和动物食用的多种食物中的危险污染物。黄曲霉毒素B1 (AFB1)已表征为具有基因毒性、免疫毒性和致肝癌性。急性黄曲霉毒素 中毒的人和动物通常基于剂量具有包括黄疸、低热、胃肠道出血、水肿、 抑郁、厌食、腹泻、脂肪肝、腹水、腹痛以及有可能肝衰竭和死亡的症状。 先前的报道揭示了暴露于AF与生长障碍特别是发育障碍(反映慢性营养 不良)及体重过轻(标志急性营养不良)之间具有强的剂量应答关系，如 在贝宁、多哥和西非的儿童中所见到的。
最严重的急性AF中毒爆发之一最近发生于肯尼亚(东非)，其与食用 当地种植且保管不善的、污染了高达8,000ppb水平之AF的玉米制得的食 物有关。此次中毒爆发夺走了125条生命，约为2004年1月至7月20日 所报道的317例病例的39.4％。先前的报道还指出，由于管理和保存不善， 人用的食物(特别是玉米和花生)的AF污染成为加纳主要的食品安全问 题。例如，Awuah和Kpodo(1996)报道了加纳市场上的花生样品中AF 水平为5.7～22,168ppb。另一项在加纳的研究表明，在94％的所收集样品 中，“kenkey”(一种常见的基于玉米的食物)中的AF总水平为6.2～196.1 ppb，平均值为50.9ppb。
与长期AFB1暴露有关的最常见效应是肝细胞癌(HCC)发病率增加。 AFB1已成为HCC发病的一个主要风险因素，特别是在撒哈拉以南非洲、 东南亚和南美的热带地区。在乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)呈阳 性的个体中，AFB1的致癌效力比在HBsAg阴性个体中高出约30倍。因 此，有必要开发并执行有效对抗饮食中AF的干预策略，特别是对于具有 黄曲霉毒素中度高风险或AF协同风险(例如由HBV导致的HCC)的人 来说。考虑到估计有80％的HCC病例发生于发展中国家，那么预防方案 应当是经济上可行的、文化上可接受的以及可持续的。
现存的科技文献中已充分证明，AF是多种食品中普遍的天然污染物， 并与人和动物的疾病和死亡有关。尽管该问题可能不会严重威胁发达国 家，但是食品中的AF污染仍然给发展中世界带来严重负担，缺乏无污染 食品供应以及贫穷仍是这些国家的主要且长期的挑战。避免食用AF污染 的食物是减少人黄曲霉毒素中毒风险的一个最基本手段。但是，对于发展 中国家的许多地区来说这是行不通的，因此迫切需要可行的干预方案来处 理受黄曲霉毒素污染的饮食以及治疗黄曲霉毒素中毒。
一种方法是化学预防。该策略包括使用天然或合成药剂来阻断、延迟、 逆转或调节AF的致癌过程。已研究了多种化学预防剂，一些作为人饮食 中的天然成分存在。在大量临床试验中，研究人员已经证明化学预防性的 化学物质(例如奥替普拉、叶绿酸和绿茶来源的多酚)在多种动物模型和 人中有效对抗AF。由于这些化合物被胃肠道所吸收并影响细胞代谢，将 它们在人体中长期应用尚需非常谨慎的评估，包括对酶调节的长期影响以 及对来自饮食的必需营养物摄取的干扰。在本实施例中，对饮食中加入铝 硅酸钙粘土进行研究，所述铝硅酸钙粘土不会被吸收、可优先结合胃肠道 中的AF并且降低血、肝和其它器官对毒素的生物利用度。
NovaSil(NS)(Englehard Chemical Corp.，Iselin，NJ)是用作抗结 块剂的天然经加工钙蒙脱石粘土。平衡吸附等温曲线和分子建模研究显 示，NS优先与含有平面酮内酯系统的AF结合。先前对啮齿动物、鸡雏、 火鸡雏、猪、羔羊、泌乳山羊和牛的短期研究中证实，饮食中加入NS显 著保护免受AF侵害。在所有这些研究中，没有报道食用NS粘土后可观 察到的不良效应。在发育毒性研究中，用高达2％(重量/重量)浓度的食 用NS饲喂怀孕期间的Sprague-Dawley(S-D)大鼠，没有检测到NS相关 的母体或胎儿毒性，并且在多种母体和胎儿组织中对微量金属的生物利用 度也没有发生显著变化。在最近的长期研究(6.5个月)中，用0.25-2％(重 量/重量)的食用NS粘土饲喂S-D大鼠，在体重增加、相对器官重量、主 要器官的整体外观和组织学外观或者血液学和血清生化参数方面没有剂 量依赖性的或NS相关的副作用。另外，必需营养物(包括维生素A和E) 以及微量营养物Fe和Zn的水平未受影响。
在开始本实施例所述的临床研究之前，先分析NS粘土的潜在有毒金 属和二噁英污染物，以确保：(1)符合国际标准和联邦标准，以及(2)水 平低于基于JECFA标准的食物中的TDI(每日可耐受摄入量)。结果显示 于下文表1中，其表明NS粘土未包含任何超过明文规定的标准。
表1.NS中的优先金属和二噁英类/呋喃类

a基于EPA(Superfund)和联合国粮农组织/世界卫生组织的食品添加剂联 合专家委员会(JECFA)标准的优先有毒金属和和二噁英/呋喃；b在原始 NS中测定优先有毒金属和二噁英/呋喃浓度；c对应于3g NS的推算金属剂 量和二噁英/呋喃的毒性当量(TEQ)(推测总浓度的生物利用度)；d基于 JECFA标准的来自食物的每日可耐受摄入量。世界范围内对来自食物和水 的Sr摄入的估计中值为1-5mg/天(WHO)。
基于在多种动物模型中所证明的NS的安全性和效力，推测基于NS 的干预对于治疗频繁暴露于高水平黄曲霉毒素并处于黄曲霉毒素中毒风 险中的人是有益的。在加纳，作为用NS进行人临床试验的前导，进行了 短期(2周)双盲I期研究，用以：(1)在50个健康人志愿者中评估NS 胶囊的安全性和耐受性；以及(2)建立用于人干预研究的最佳方案。NS 摄入(1.5和3.0g/天)14天后，参与者的依从性(99.1％)很好；体检结 果、尿检、血清生化和血液学参数未受影响；血清矿物质以及维生素A和 E的水平与基线值没有显著差异(Wang等，2005)。除了其所证实的安全 性之外，用于临床干预试验的每天3.0g剂量的NS是从先前的体外和体内 研究(包括Pimpukdee等，2004)推出的，所述研究显示，饮食中0.25 ％的NS是保护鸡雏免受AF毒性的最小有效剂量。该研究为目前在西非 加纳Ashanti区的Ej ura-Sekyedumase地区(ESD)的IIa期人干预研究 奠定了基础。
基于以下报告将Ashanti区的ESD选作干预研究地点，所述报告中称 在收集自该区域研究参与者的140份血清样品中的100％以及91份尿样品 中的91.2％检测到AFB1-白蛋白加合物和黄曲霉毒素M1代谢物(Jolly等， 2006)。Wild等(1992)报道的来自东非和西非国家的绝大多数(75-100 ％)人的血液AFB1-白蛋白加合物测试呈阳性支持了这些发现。在该报告 中，我们主要的目的是评估NS施用给人用于治疗黄曲霉毒素中毒时NS 的安全性，其通过以下步骤来实现：(1)确定NS在3个月期间内在人受 试者中的可能不良效应，和(2)建立用于在人受试者中进行长期(IIb或 III期)研究的基础和剂量测定。
Ejura-Sekyedumase地区(ESD)是加纳Ashanti区的21个地区之一。 其气候条件和土壤肥沃程度有利于作物生长，大约76％的居民从事农业。 在该地区生产并消费的主要作物包括玉米、花生、山药、木薯、棉花和烟 草(Adu和Mensah-Ansah 1995；地区卫生部门(District Health Directorate)，Ejura/Sekyedumase 2005)。地区卫生主管及其它医务人员 对进入社区进行了协调，并将研究小组介绍给6个社区的领导和居民，他 们构成了该地区超过一半的人口。研究之前，建立了4个社区的AF基线 数据和人口统计学信息(Jolly等2006)。另外两个社区在Ejura分区，它 们拥有整个地区中最多的人口。
每个社区的领导召集研究人员开会以确定研究的目的、持续时间、 期限、可能的参与者和监测者的责任以及其它方面，并给居民留出时间提 问和回答。在进入社区和信息获知过程之后，来自所述6个社区的总共507 位居民自愿参与该研究。在解释了知情同意文件之后，志愿者们在该文件 上签字并完成问卷调查(包括健康史和进食频率问卷)。然后给予受试者 识别编码，并提供给其带盖的无菌杯让他们收集早晨的首次尿样品。在样 品收集当天，志愿者接受了当地医生进行的体检。他们还提供了尿样用于 尿检和人绒毛膜促性腺激素(HCG)测试，以确定是否怀孕，并抽出总共 15ml血分装在两支管里(一管5ml，另一管10ml)以用于AF暴露分析、 肝功能和肾功能以及血液学分析。将5ml分装的血样送至加纳Ashanti区 Ejura地区医院，进行血液学分析(主要是WBC计数、血红蛋白和血细 胞比容)。从所述10ml血样收集的血清等分试样用于在阿克拉勒贡加纳大 学Noguchi Memorial医学研究所(Noguchi Memorial Institute for Medical Research(NMIMR)，University of Ghana，Legon，Accra)进行肝功能 和肾功能测试。将剩余的血清样品保存于-20℃，之后运至德克萨斯理工大 学(TTU)以确定每个志愿者的AFB1-白蛋白加合物水平。
合格的研究受试者个体(男性和女性)符合以下标准：根据体检结 果处于健康状态，18-58岁，一周至少4次摄入基于玉米和/或花生的食物， 血液AFB1-白蛋白加合物水平>每毫克白蛋白加合物0.5pmol AFB1(LOD＝ 每毫克白蛋白0.05pmol AFB1)，无慢性病史，未使用慢性病或急性病的处 方药，女性处于非怀孕和/或非哺乳期，血液学参数、肝功能和肾功能指标 (血液参数和尿参数)范围正常并签署同意书。具有异常肝功能值(ALT) 的受试者从研究中排除。因此，研究中不包括急性肝炎患者(无论他们是 否HBV携带——HBsAg+或HBsAg-)。在507名志愿者中，有302位受 试者符合除AF-Alb加合物水平之外的所有纳入标准。从该组中，仅根据 加合物水平选择180位受试者作为靶标人群。为了确定NS是否有效并进 一步评估其安全性，根据美国NIH指南(2006)针对II期临床研究所要 求的100～300位受试者的标准，选择总共180位受试者的样本规模(每个 治疗组60位)。在试验开始时，2名女性和1名男性受试者退出，其余177 位(101位男性，76位女性)成为最终的研究参与者。
NovaSil粘土(NS)获得自Engelhard Chemical Corporation(Iselin， NJ，USA)。首先，对用于人类研究之NS粘土中可能的环境污染物(包括 多氯二苯并对二噁英类/呋喃类(PCDD/PCDF)和重金属)进行评估。由 哥伦比亚分析服务公司(Columbia Analytical Services(CAS)，Inc.， Houston，TX，USA)对NS进行美国环境保护署(US Environmental Protection Agency(USEPA))制定的优先二噁英类/呋喃类(17)评估。 USEPA方法的标准化步骤使用高分辨率毛细管柱气相色谱/高分辨率质谱 来进行样品制备、清理和分析(USEPA方法1613B)。同样，由CAS公司 (Kelso，WA，USA)来分析NS粘土的重金属(例如砷、镉、汞和铅)。 金属分析步骤遵循标准USEPA方案(例如方法6010B和7471A)。NS粘 土(含有可接受水平的污染物)被送至药研院(Colorado Springs，CO， USA)用于在符合生产质量管理规范的无菌条件下进行胶囊封装。根据之 前的剂量测定方案(Wang等2005)，配制含有500mg NS、250mg NS或 安慰剂的具有相同大小、形状和颜色的胶囊。然后利用电子束照射 (National Center for Electron Beam Food Research，Texas A&M University)在密封塑料容器中对胶囊灭菌(每个容器中约含180个胶囊)。 应用靶剂量范围8.2-9.4KGy，并参照与在美国对人类食物进行灭菌类似的 方案。所使用的所有其它化学品、试剂和溶剂均购买所能获得的最高纯度 的产品。
整个研究设计参照随机化、双盲、安慰剂对照的II期临床试验。研 究方案在加纳获得了TAMU科研评价委员会(Institutional Review Board， IRB)以及针对伦理许可的NMIMR-IRB的批准。从2005年9月开始筛 选志愿者。该试验开始于2005年12月，完成于2006年4月(包括1个月 的试验后随访)。将符合招募标准的志愿者根据血清AFB1-白蛋白加合物水 平随机分为三个研究组(60位/组)。将具有最高AF暴露水平的前三个受 试者随机分到所述三个组中，然后将接下来三个最高暴露水平的参与者如 上随机分配，依此类推直至所有180位受试者均被分到各组中。作为双盲 研究，参与者、当地医生、护士以及所有其它现场工作人员都不知道胶囊 的内容物。为了确保对所制定治疗方案的最大依从性、保证对NS胶囊重 量的不知情和保证参与者的健康，受过训练的研究监测者每天发放胶囊， 亲眼看见其被服用并记录受试者可能感觉到的任何症状。每月进行体检， 以评估研究受试者的整体健康状况。在摄入NS的一开始(第0个月)、第 1、2和3个月收集来自每个参与者的尿和血液样品。摄入胶囊3个月后， 在不进行NS治疗的又一个月里监测受试者。在第4个月结束时，参与者 进行最后的体检并收集其血液及尿样。将EDTA-血液样品送至加纳库马西 的Komfo Anokye教学医院(KATH)以使用自动分析仪Sysmex KX-21 (Sysmex Corporation，Kobe，Japan)来进行血液学分析。在NMIMR 使用化学自动分析仪(Eos Bravo Plus；Hospitex Diagnostics，Italy)进行 血清生化分析。在NMIMR使用电解质(Na/K)自动分析仪(Humalyte； Human Diagnostic，Germany)来进行电解质分析。将部分尿和血清样品 送至TAMU和TTU进行效力评估。简言之，按照经Sarr等(1995)和 Wang等(1999)修改的Groopman等(1992)所报道的方案，分析尿样 中的急性AF暴露生物标志物AFM1。使用Wang等(1996)所报道的方 案，测量血清中的AFB1-白蛋白加合物(表明长期暴露AF的另一种生物 标志物)。
给予参与者ID号，并随机分配到下列3个治疗组之一中：高剂量 (HD)、低剂量(LD)或安慰剂(PL)，这表示他们在3个月期间一天三 次(饭前服用，并与至少100ml水一起服下)分别服用两个含有500mg NS、 250mg NS和250mg安慰剂的胶囊。总共，所述HD和LD组每天分别接 受3.0和1.5g NS。作为安全性预防，选择3.0g NS作为最高剂量，这是 因为基于先前的动物研究，它代表了NS针对AF的MED(最少有效剂量)。 该研究的剂量选择还基于从先前发表的动物模型中剂量测定数据(Phillips 1999；Phillips等2002，2006)以及在美国用于短期人类研究的NS水平 (Wang等2005)所作出的推断。所述HD(3.0g NS/天)表示加纳人平 均每天消耗食物估计量的约0.25％的NS(重量/重量)。另外，饮食中多至 2％的NS(重量/重量)(8倍于本研究中所述的HD水平)在暴露6.5个月 后的啮齿动物中没有表现出明显的副作用(Afriyie-Gyawu等2005)。
为了监测NS摄入的潜在毒性，列出了症状清单，其包括每日记录 工作表(Daily Diary Worksheet，DDW)作为评估工具。研究监测者记录 任何不良反应，并需要向上级和/或当地医生报告任何健康问题。研究团队 中的医生每两周审阅一次DDW。根据下列标准评估症状：
轻度(1级)，轻微困扰，对症治疗后缓解；
中度(2级)，困扰并干扰了活动，对症治疗后仅部分缓解；
重度(3级)，妨碍了常规活动，对症治疗后未缓解。
不论何时报告症状，都要进行体检和实验室分析以进行确认，如有 必要可在研究过程中进行。由当地医生对受试者进行治疗，如果认为症状 与NS摄入无关，则对其继续进行研究。如果症状与NS胶囊有关，则对 参与者进行治疗并停止继续摄入胶囊。当地医生可以使用美国NIH指南 制定的不良反应报告文件，从而向研究人员以及NMIMR和TAMU的IRB 报告任何不良反应。
所有数据均由NMIMR的数据处理团队使用受试者的识别码进行录 入。除研究人员之外的工作人员无法获知参与者的姓名。使用Microsoft Excel软件对来自问卷、临床报告以及针对摄入、毒性监测和不良反应事 件的DDW的所有数据进行录入和处理。在数据录入完成后，两个研究人 员独立地审阅所记录的数据以确保精确。
为了显示NS胶囊摄入的安全性，统计学评估着眼于对不同治疗水 平和不同时间点进行比较。计算每个参数的平均值、标准差和中值，除非 另有说明，否则参数的值表示为平均值±标准差。对于正态分布的参数， 使用双因素ANOVA和Bonferroni方法来比较不同治疗组和时间的平均值 之间的显著差异。使用卡方检验来分析不良反应/毒性数据的相关性和发生 率。对于非正态分布的参数来说，使用Kruskal-Wallis检验或Wilcoxon 秩和检验来比较不同治疗组和不同时间点的差异。P值小于0.05(双尾) 被认为具有显著性。所有分析均使用SAS软件9.1.3版(SAS Institute Inc.， Cary，NC，USA)来进行。
对NS粘土中二噁英/呋喃和金属的量进行分析。在17种USEPA优 先PCDD/PCDF中，1，2，3，4，6，7，8-七氯二苯并对二噁英(HpCDD)和八氯 二苯并对二噁英(OCDD)是NS中存在的仅有的两种高于检出限(对于 HpCDD，LOD＝1.1l份/万亿份(ppt)，对于OCDD是1.91ppt)的污染物。 NS粘土中HpCDD和OCDD的平均浓度分别是4.42和23.74ppt。应用毒 性当量因子(toxic equivalent factor，TEF)(WHO1998)，对HpCDD和 OCDD计算得到这些二噁英的毒性(或TCDD)当量(TEQ)值分别是 0.0442和0.00237ppt，再加上NS中另外的TEQ0.0466ppt。在所述HD 治疗中，3.0g的NS提供了0.1397pg/天的TEQ。根据WHO标准，TCDD 的人可耐受摄入量(tolerable human intake，THI)为2.3pg/kg体重/天， 也就是说，对于70kg的男性来说为161pg/天，对于60kg的女性来说为 138pg/天。根据这些值，3.0g NS/天的TEQ对于女性和男性平均而言分别 比每日WHO-THI标准低约1,000和1,100倍。在每天3g NS中，重金属 (例如砷、镉和铅)的水平比标准推荐值(JECFA 1998)低7至80倍(数 据未显示)。根据所使用的分析方法，发现汞低于检出限(LOD＝0.009mg/kg NS)。
筛选出的所有507名志愿者都是血清AFB1-白蛋白加合物阳性的(范 围：0.1-4.7pmol AFB1/毫克白蛋白)。下表2描述了参与本研究之受试者 的人口统计学特征。首先，我们根据所确定的纳入标准选择了总共180人 的研究群体，并基于参与者的血清AFB1-白蛋白加合物水平将他们随机分 为3个组(每组60人)——HD、LD和PL。治疗一开始便撤去了三个受 试者(一个来自LD组，两个来自PL组)，这是因为两名女性怀孕，一位 男性由于新工作的缘故选择退出。在NS摄入三个月后，生理参数(例如 年龄、体重和舒张压)未受到明显影响。在试验结束时，分别与121.9±23.1 和129.9±24.5mmHg的基线值相比，LD(112.7±15.0mmHg)和PL (117.4±19.8mmHg)的收缩压(SBP)平均值显著降低(P<0.01)，尽管 这没有临床意义。HD组的SBP未变化。
表2.人口统计学和生理参数

a平均值±标准差；b SBP/DBP的正常值为120/80；＊P<0.05，＊＊P<0.01(相 比于基线值)。
对于HD、LD和PL来说，完成全部三个月试验的研究参与者的百 分数分别是90.0、89.8和94.8％，完成该研究的受试者总数占91.5％。在 177位研究受试者中一共有15位(6位来自HD组，6位来自LD组以及3 位来自PL组)没有完成该研究。就依从性而言，在HD、LD和PL组中 分别有97.4、96.4和98.6％的参与者根据所述研究方案坚持NS治疗方案。 不论是否完成该研究，参与者中整体坚持率(服用胶囊的次数)超过97％。 表示参与者依从性与研究完成性的数据总结于表3中。
表3、参与者依从性与治疗方案的完成性

参与者向研究监测者报告的症状如下表4中所示。所述NS剂量水 平(1.5或3.0g/天)对HD和LD组中的参与者是可耐受的。所报告的症 状包括：恶心、呕吐、腹泻、腹部不适、胃灼热和头晕。超过50％的所报 告症状发生于研究的头两周，其余症状在之后间或被报告，直至研究结束。 所有三个组中有45位研究参与者(约56％女性和44％男性)报告了这些 症状中的至少一种，所述参与者分别为：17人(37.8％)来自HD组，13 人(28.9％)来自LD组以及15人(33.3％)来自PL组。除了恶心症状 以外，所有这些效应均不是剂量依赖性的或与NS有关的。这些症状中绝 大部分由一至三名任意组的受试者报告，呕吐、腹泻、胃灼热和头晕除外 (它们由超过三个人报告，但剂量依赖性趋势不明显)。例如，HD组中一 位44岁女性受试者占了所记录28次头晕中的20次(表3)。在LD组中 胃灼热发生率似乎也较高，但是仅有两名受试者报告了该反应，其中一名 报告了22次记录中的18次。大多数症状被评定为“轻度”，少数为“中度”， 没有“重度”症状发生。在研究过程中超过99％的时间里，参与者未报告 不良的健康后果。
表4、所报告的健康状况

a表明所报告健康状况的次数
在血液学分析中(在下文表5中显示)，无论3个月试验之前还是之 后，三个治疗组中的任何参数均没有显著的剂量依赖效应(数据未显示)。 在时间效应方面，仅有白细胞(WBC)差异分析中的单核细胞百分比显示 显著降低，其出现在：试验结束时与基线值(3.2±2.1％)相比的HD组中 (2.2±1.7％，平均值±标准差)(P<0.05)；试验结束时与基线值(3.4±1.7 ％)相比的PL对照组中(2.5±2.1％)(P<0.01)(表4)。该效应在LD组 中未观察到。所有其它参数均未受影响。另外，在NS治疗组(HD和LD) 以及安慰剂组(PL)的所有所评估参数之间未观察到显著差异。
表5、血液学分析

a平均值±标准差；＊P<0.05，＊＊P<0.01，与相应基线值相比是显著的。
血清生化分析表明如下文表6中给出的少数参数具有孤立的统计学 显著差异。与基线值相比，丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平仅在试验结束 时的PL组中显著降低(P<0.05)。与基线值相比，总胆红素(T-BILI)含 量在摄入NS3个月之后的HD(P<0.01)和PL(P<0.05)组中略微下降。 而该效应在LD组中没有出现。另外，与基线值相比，血液尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平在研究结束时的所有治疗组中显著降低。试验结 束时，血清肌酸酐(CREAT)水平在所有组中均有略微提高(P<0.01)。 与基线值相比，试验结束时HD和LD组中的钠水平显著提高。而该效应 在PL组中未出现。试验结束时PL组中的钾水平相比于基线值略微降低 (P<0.01)。在所有这些生化效应中，在试验结束时NS治疗组和安慰剂组 之间未观察到统计学显著性差异。其它所有被评估的血清生化参数均未受 影响。两名医生(一名加纳的执业医生以及一名美国的非执业医生)确认 了研究中所评估的所有参数的结果。
表6、血清生化性质

a平均值±标准差；＊P<0.05，＊＊P<0.01，与相应基线值相比是显著的。
该研究的结果表明，如体检、血液学参数和生化参数所证明的，在 3个月的时期内施用NS胶囊(1.5和3.0g/天)显然是安全的。除了随机 化、双盲以及安慰剂对照的实验设计以外，还进行了相当多的工作以使可 能的混淆变量最少。例如，对PCDD/PCDF的分析表明，HD和LD组所 接受的NS胶囊中的二噁英比WHO-THI标准要低1000和2000倍。由于 PCDD/PCDF同类物可在脂肪组织中积累并对人具有高度毒性，因此上述 问题是很重要的(Startin等1990；Jensen 2001)。
研究参与者是根据既定的纳入标准进行挑选的，但随机化过程根据 他们的血清AFB1-白蛋白加合物浓度来严格执行。这种刻意的设计使得代 表各性别和各社区的参与者(每组中)数目相差悬殊。体重和血压值不以 剂量依赖形式受到影响。参与者对该治疗方案的坚持情况非常好(超过97 ％)，并且超过90％的研究受试者完成了该研究，这一点对于一项为期3 个月研究来说是值得称道的(表II)。所述NS剂量水平对参与者来说是可 耐受的。除恶心以外，所报告的症状中无一与NS有关。但是，在3个月 试验过程中，在HD和LD组中分别仅有一人报告了6次恶心，一人报告 了4次恶心。
血液学分析表明，在试验结束时NS治疗组和PL对照组之间没有剂 量依赖性的显著差异。在HD和PL组中，WBC差异分析显示基线值和试 验结束时之间单核细胞百分比显著降低。但是，该效应完全在临床参考范 围内，并且未在LD组中观察到(表4)。在NS治疗组和安慰剂对照之间 的所有其它参数是统计学相当的。这提示，食用NS不太可能促成炎性过 程、损害免疫力、造成骨髓改变或者导致感染性疾病发生率提高。
血清生化分析显示，少数参数具有孤立的统计学显著性差异，而没 有特定的相关性趋势或剂量依赖性趋势(表5)。另外，所有测量的参数均 在正常生理范围内。总的来说，这些参数的效应缺乏剂量依赖性，因此提 示NS对这些标准生化参数的生理水平没有显著的不良效应。
该IIa期临床干预试验评估了NS粘土在预防人受试者接触饮食AF 中的安全性和效力。尽管观察到几个参数的显著改变，但是这些效应似乎 均不是NS相关性或剂量依赖性的，并且所有参数都在正常生理界限内。 该证据提示，短期摄入最小有效剂量(MED)(0.25％(重量/重量))的 NS不太可能在人体中产生明显的毒性。重要的是，这些发现为将来使用 NS来挽救和保护急性暴露于高水平饮食AF的人提供了支持。接下来的研 究要确保使NS的剂量测定和递送方法最优化。还需要IIb期和III期干预 和流行病学研究来验证NS用于长期治疗的安全性和效力，以及将其加入 HBV高发/流行地区以及具有黄曲霉毒素中毒高风险地区的人类食物中的 可能性。
实施例4
除了造成肝损伤以外，饮食暴露黄曲霉毒素(AF)会降低血清和组 织的维生素(Vit)A和E水平。为了进一步评估NS对人体中这两种维生 素利用的影响，从上文实施例3中进行的2a期临床试验中收集第0、1和 3个月时个体的655份血清样品，利用HPLC法测量其Vit A和E水平， 所述个体包括接受为期3个月的1.5g NS/天(低剂量)、3.0g NS/天(高剂 量)或安慰剂的177名健康加纳志愿者。在开始时(时间为0，基线(BL))、 第1个月(第4周，W4)、第3个月(第12周，W12)和试验完成后1 个月时(第16周，W16)收集来自每位参与者的血样。
使用液液萃取方法提取血清Vit A和E，然后用带有UV检测器的 Thermo Finnigan(Waltham，MA)HPLC系统进行分析。调整梯度以同 时洗脱Vit A(在325nm处检测)和维生素E(在292nm处检测)。得到 标准曲线以进行样品定量。通过血清样品的体积来调节Vit A和E浓度。
更具体地，根据先前所述的步骤(Ruperez等2004)在柔和的红光 下提取人血清维生素A(VA)和E(VE)。简言之，将人血清样品(50ml) 与150ml乙醇:氯仿(3:1(体积/体积)，含0.01％BHT抗氧化剂)混合以 沉淀蛋白，并在1.5ml微量离心管中用300ml己烷进一步提取。离心后， 除去己烷层，利用Centrivap(Labconco，Kansas，MS)进行干燥。用 300ml流动相重溶残余物，用于根据Burri等(2003)的步骤进行HPLC 分析。使用带有P4000泵、有100ml通道(loop)的AS3000自动进样器 以及UV6000 LP光电二极管阵列检测器的Thermo Finnigan液相色谱 (Thermo Sep aration Products，Riviera Beach，FL)进行分析。利用具有 150mm 4.6mm ID和5mm粒径的Microsorb 100-5 C18柱(Varian，Palo Alto，CA)使用流动相A(ACN:THF:MeOH:AA为85:5:5:5，体积/体积 /体积/体积)和流动相B(ACN:THF:MeOH:AA为55:35:5:5，体积/体积/ 体积/体积)在1ml/分钟的流速下以50ml的注射体积进行色谱分离。洗 脱谱在最初5分钟由95％A和5％B组成，然后在13分钟内渐变为5％A 和95％B。之后，保持该条件2分钟，然后用95％A和5％B清洗该柱8 分钟。总运行时间是28分钟。基于将峰面积和保留时间与参考标准进行比 较来对两种维生素进行定量。
计算了血清VitA和E浓度的平均值、中值和标准差(SD)，将数值 表示为平均值±标准差。通过使用ANOVA或Kruskal-Wallis检验对三个 处理组在不同时间点的血清Vit A和E水平进行比较。使用非参数混合模 型分析NS治疗对VitA和E水平的剂量和时间效应。P值小于0.05(双尾) 被认为是统计学显著的。所有数据均使用SAS软件9.1.3版(SAS Institute Inc.，Cary，NC)进行分析。
下文表7中显示研究受试者中血清Vit A水平的结果。安慰剂组(2.09 ±0.56μmol/L)、低剂量组(2.15±0.74μmol/L)和高剂量组(2.14±0.92 μmol/L)中的血清Vit A基线水平是相当的(P＝0.8702)(图4a)。在第1 个月的样品中，在低剂量(2.28±0.85μmol/L)、高剂量(2.21±0.95μmol/L) 和安慰剂(2.21±0.57μmol/L)组之间没有发现显著差异(P＝0.7324)(图 4b)。在第3个月的样品中，在低剂量(2.22±0.87μmol/L)、高剂量(2.30 ±0.71μmol/L)和安慰剂(2.32±0.83μmol/L)组之间没有发现显著差异 (P＝0.7305)(图4c)。另外，在试验后1个月时收集的样品中，治疗组和 安慰剂组之间Vit A的水平没有统计学显著性差异(P＝0.3665)(图4d)。
表7、所述三个组在不同时间点的Vit A水平(μmol/L)
  组                 N        平均值        中值           SD 3.0g/天，BL        58       2.138         2.017         0.916 3.0g/天，W4        57       2.208         2.104         0.945 3.0g/天，W12       53       2.302         2.140         0.712 3.0g/天，W16       52       2.197         2.189         0.902 1.5g/天，BL        57       2.145         2.169         0.743 1.5g/天，W4        56       2.277         2.149         0.848 1.5g/天，W12       51       2.224         2.132         0.865 1.5g/天，W16       51       2.291         2.117         0.963 安慰剂，BL         55       2.085         1.976         0.561 安慰剂，W4         57       2.210         2.214         0.570 安慰剂，W12        54       2.321         2.106         0.828 安慰剂，W16        54       2.369         2.266         0.596
BL(基线)，W4(第4周)，W12(第12周)，W16(第16周)
下文表8中显示研究受试者中血清Vit E水平的结果。安慰剂组 (16.07±4.74μmol/L)、低剂量组(16.40±5.08μmol/L)和高剂量组(15.64 ±4.97μmol/L)中的血清Vit E基线水平也是相当的(P＝0.6798)(图5a)。 在第1个月的样品中，在低剂量(17.9±4.99μmol/L)、高剂量(17.08±4.83 μmol/L)和安慰剂(17.32±4.97μmol/L)组中未发现显著性(P＝0.5868) (图5b)。在第3个月的样品中，在低剂量(17.03±4.71μmol/L)、高剂 量(17.33±4.21μmol/L)和安慰剂(18.01±6.29μmol/L)组中未发现显 著性(P＝0.7618)(图5c)。另外，在试验后1个月时收集的治疗组和安慰 剂组样品的Vit E水平(P＝0.1543)没有统计学显著性(图5d)。
表8、所述三个组在不同时间点的Vit E水平(μmol/L)
  组              N      平均值        中值       SD 3.0g/天，BL     58     15.641        15.091   4.968 3.0g/天，W4     57     17.076        16.842   4.830 3.0g/天，W12    53     17.326        17.012   4.208 3.0g/天，W16    52     18.410        17.983   4.82 1.5g/天，BL     57     16.400        16.624   5.080 1.5g/天，W4     56     17.900        17.146   4.990 1.5g/天，W12    51     17.026        16.449   4.714 1.5g/天，W16    51     20.180        19.148   5.721 安慰剂，BL      55     16.065        15.771   4.736 安慰剂，W4      57     17.324        15.667   4.967 安慰剂，W12     54     18.010        16.998   6.P286 安慰剂，W16     54     20.168        19.566   4.608
BL(基线)，W4(第4周)，W12(第12周)，W16(第16周)
该结果显示，在3个月的期间里使用NS粘土饮食干预并未显著影 响研究参与者血清中Vit A和E的水平。这些结果表明，在具有黄曲霉毒 素中毒(以及可能的营养不良)高风险的人群中进行NS干预不会干扰这 些重要微量营养物的利用。
实施例5
为了进一步评估NS对人的影响，在研究开始和结束时测量上述实 施例3中所进行的2a期临床试验的受试者血清样品中的矿物质(分为营养 物和非营养物)浓度。营养物矿物质包括：Cu、Fe、K、Mg、Na、P、S、 Zn、Co、Cr、Mn、Mo、Ni和Se。非营养物矿物质包括：Ag、Al、As、 Ba、Be、Cd、Hg、Li、Pb、Sb、Sr、Ti、T1、U和V。该研究中的个体 包括分别接受了为期3个月的1.5g NS/天(低剂量)、3.0g NS/天(高剂量) 或安慰剂的177个健康加纳志愿者。
分析人血清样品中的微量矿物质如下进行测量。将血清样品(约0.45 g)与200ml浓硝酸在15ml离心管中混合，在90℃加热过夜，而后冷却。 然后加入100ml30％的H2O2，将样品在70℃加热一小时，然后冷却；然 后加入50ml浓盐酸，将样品在70℃加热一小时，然后冷却；然后加纯水 使样品终体积为10ml。用氯化锡作为还原剂使用M-7500(Cetac Technologies，Omaha，NE)通过冷蒸气原子吸收法(CVAA)来测定汞 (Hg)浓度。利用电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES)，使用带有轴向观察和 镱(Yb)作为内参的CirOS(Spectro Analytical Instruments，Fitchburg， MA)测定铝(Al)、硼(B)、钡(Ba)、铍(Be)、钙(Ca)、钴(Co)、 铜(Cu)、铁(Fe)、钾(K)、镁(Mg)、钼(Mo)、钠(Na)、磷(P)、 硫(S)、硅(Si)、锶(Sr)、钛(Ti)、钒(V)和锌(Zn)。利用电感耦 合等离子体-质谱仪(ICP-MS)使用Elan 6100(Perkin-Elmer，Wellesley， MA)测定银(Ag)、砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、锰(Mn)、镍(Ni)、 铅(Pb)、硒(Se)和铊(T1)，其中As、Cr、Mn和Se在DRC模式中 获得，并以铋(Bi)、镓(Ga)和铑(Rh)作为内参。除了空白、加标 空白、一式二份样品和加标样品以外，每一批样品均需制备并分析标准参 比物质(Seronorm，Billingstad，Norway)以验证结果。结果显示于下文 表9和表10中。
表9、研究受试者的血清样品中非营养物矿物质的分析：基线水平对比试 验结束时高剂量NS

*P<0.01
表10、研究受试者的血清样品中营养物矿物质的分析：基线水平对比试验 结束时的高剂量NS

除了钙、钾和钼以外，大多数所分析的矿物质水平未发现显著性差 异。血清Ca和K水平在正常范围内。Mo的正常范围值尚不明确。血清 钡和锶是仅有的在研究结束时显著增加的非营养物金属。对这些二价阳离 子的增加进行评价是困难的，这是因为其没有可用的临床参考。锶和钡都 是食物和水中天然存在的，3g(高)剂量NS粘土中所含有的Sr和Ba水 平完全低于推定的食物TDI。总之，这些研究的结果为将来在人饮食中使 用NS粘土来阻断或显著降低对AF的暴露以及在食用污染了AF之谷物的 人中预防AF不良反应提供了支持。另外，骨架矿物质(framework mineral) 例如铝并非被胃肠道显著利用。由于NS粘土暴露而显著增加的矿物质仅 有Ba和Sr，而这两种金属的临床参考正常范围尚不明确。
实施例6
如前所述测量含有多种粒径的CASAD粘土中存在的二噁英的量以 及尺寸选择后仅含有小于80微米颗粒的CASAD粘土中存在的二噁英的 量。尺寸选择前，所述CASAD粘土所含二噁英的量显示于下文表11中。
表11
  分析物 所发现浓度(pg/L) 检出限(pg/L) 2，3，7，8-TCDD -- 0.024 1，2，3，7，8-PeCDD -- 0.025 1，2，3，4，7，8-HxCDD -- 0.039 1，2，3，6，7，8-HxCDD -- 0.044 1，2，3，7，8，9-HxCDD -- 0.042 1，2，3，4，6，7，8-HpCDD 0.121 0.043 OCDD 1.243 0.108 总的四-二噁英类 1.284 0.024 总的五-二噁英类 1.820 0.025 总的六-二噁英类 1.994 0.039 总的七-二噁英类 -- 0.043
如表11所示，尺寸选择前的CASAD粘土含有0.121pg/L的七氯二 苯并对二噁英(1，2，3，4，6，7，8-HpCDD)和1.243pg/L的八氯二苯并对二噁 英(OCDD)。另外，总的四-二噁英类(tetra-dioxins)测定为1.284pg/L， 总的五-二噁英类(penta-dioxins)测定为1.820，总的六-二噁英类 (hexa-dioxins)测定为1.994。所检测的其它二噁英类或者不存在或者其 水平在测试装置的检出限以下。然后选择CASAD粘土的尺寸使其仅含有 尺寸小于80微米的颗粒。进行同样的二噁英含量分析。结果显示于下文表 12中。
表12
  分析物 所发现浓度(pg/L) 检出限(pg/L) 2，3，7，8-TCDD -- 0.024 1，2，3，7，8-PeCDD -- 0.025 1，2，3，4，7，8-HxCDD -- 0.039 1，2，3，6，7，8-HxCDD -- 0.044 1，2，3，7，8，9-HxCDD -- 0.042 1，2，3，4，6，7，8-HpCDD -- 0.043 OCDD 0.362 0.108 总的四-二噁英类 -- 0.024 总的五-二噁英类 -- 0.025 总的六-二噁英类 -- 0.039 总的七-二噁英类 -- 0.043
该结果显示在粒径小于80微米的CASAD粘土中二噁英含量大幅度 降低。仅剩的检出二噁英是八-氯二噁英(OCDD)，其量减少为0.362pg/L。
实施例7
主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的黄曲霉毒素(AF)是一类天然存在 的真菌代谢产物(真菌毒素)，其长期以来被认为是食物的危险污染物。 黄曲霉毒素B1(AFB1)具有肝毒性和基因毒性，并已被归类为已知的人 类致癌物质(第I组)。如许多报道(包括最近在肯尼亚爆发的)所证实的， 经由饮食急性暴露于高水平的AFB1会导致人类疾病(黄曲霉毒素中毒) 和死亡。在非洲和东南亚的几个地区，长期暴露于低水平AF是患人肝细 胞癌(HCC)的主要风险因素之一。重要的是，还显示AFB1是动物和人 体中强的免疫毒剂。因此，开发和应用针对黄曲霉毒素中毒的实用且高效 的干预策略与疗法对于改善人类健康(尤其在高风险人群中)来说是必要 的。
已有报道人和动物(数个世纪以来，并且在大多数大陆上)食用粘 土矿物(食土癖)。这种行为的原因一般难于解释，但是食用粘土通常被 认为是有益且安全的。例如，与自然密切接触的人们食用粘土是很常见的， 在南美和非洲的许多地方，食用粘土是文化上可接受的。NovaSil粘土(NS) 是天然存在并经过热处理的钙蒙脱土，其常用作动物饲料中的抗结块添加 剂。先前的研究已显示，在动物模型中当饮食中包含高达0.5％(重量/重 量)水平的NS时，NS是黄曲霉毒素的选择性肠吸附剂。NS显著地保护 多种动物幼仔(包括鸡雏、火鸡雏、猪、羔羊和啮齿动物)免受黄曲霉毒 素中毒。另外，NS还降低泌乳牛和山羊的乳中AF的残留，以及啮齿动物 中AF暴露的生物标志物。从机理上讲，NS降低了胃肠道中AF的吸收， 这导致AF暴露及其随后毒性的显著降低。从平衡吸附等温曲线和分子建 模研究推导出的信息表明NS偏好含有平面酮内酯系统的AF。
将NS添加至饮食后的短期动物研究中尚未报道可观察的不良效应。 在怀孕期间摄入浓度高达2.0％的NS的Sprague-Dawley(S-D)大鼠中没 有发现母体或胎儿毒性。另外，在多种母体或胎儿组织中未发现微量金属 生物利用度的显著变化。在一项长期研究中，在6个月的时间里，用饮食 中0.25-2.0％NS粘土治疗的S-D大鼠未在体重增加、饲料转化率、相对器 官重量、主要器官的整体外观和组织学外观以及血液学和血清生化参数方 面表现出剂量依赖性不良效应。此外，必需营养物(包括维生素A和E、 Fe和Zn)水平未受影响。
考虑到NS在多种动物模型中的安全性和效力及其低成本，在发展 中国家具有黄曲霉毒素中毒风险的人的饮食中加入NS可能是特别有益 的。首先，在健康志愿者中为期两周的I期临床试验显示每日摄入多至3g/ 天的NS对人受试者没有明显的不良效应。基于该研究的发现，在饮食暴 露于AF的180名加纳人中进行了为期3个月的随机化、双盲、安慰剂对 照的IIa期干预研究。在该实施例中，通过分析在研究之前(基线)、在干 预的第1个月和第3个月以及在干预后1个月时收集的血清和尿样品中的 生物标志物来评估NS干预的效力。该研究的结果为将来在人饮食中使用 NS来阻断或显著降低对AF的暴露以及在食用污染了AF之谷物的人中预 防AF不良反应提供了支持。
[3H]-AFB1(28Ci/mmol)购自Moravek Biochemicals(Brea，CA， USA)。标准AFB1、M1和放射性免疫测定试剂获得自Sigma(St.Louis， MO，USA)。单克隆抗体2B11由MIT的Dr.G.N.Wogan友情提供。免 疫亲和柱购自VICAM(Watertown，MA，USA)。NS粘土最初获得自 Engelhard Chemical Corporation(Iselin，NJ，USA)，并进一步检测其可 能的环境污染物(包括多氯二苯并对二噁英/呋喃(PCDD/PCDF)和重金 属，以确保符合联邦标准和国际标准，如前详细描述地(Afriyie-Gyawu 等，2007；Wang等，2005)。NS胶囊在药研院(Colorado Springs，CO) 按照药品生产质量管理规范(GMP)在无菌条件下进行制备。所有胶囊包 括匹配安慰剂在内都是相同尺寸、形状和颜色的。除非另有说明，所使用 的所有化学品和试剂均以可获得的最高纯度购得。
挑选四个来自Ejura-Sekyedumase地区(ESD)的社区以及两个来 自Ejura分区的社区用于筛选研究受试者。这两个地区属于加纳Ashanti 区，在那里大约76％的居民主要从事农业。在该区域种植的作物主要包括 玉米、花生、山药、木薯、棉花和烟草。研究之前，建立了其中4个社区 的AF暴露数据和人口统计学信息(Jolly等2006)。
试验开始于2005年9月，完成于2006年4月。整个研究设计遵循 如上文实施例中所述的随机化、双盲、安慰剂对照的II期临床试验的指导。 研究方案获得了德克萨斯农业机械大学科研评价委员会以及加纳的 Noguchi Memorial医学研究所针对伦理许可的科研评价委员会的批准。图 6显示总体研究设计和样品收集过程的流程图。简言之，从总共507名所 筛选志愿者中招募180位受试者，其符合以下标准：知情同意；血清AFB1- 白蛋白加合物水平>每毫克白蛋白0.5pmol AFB1；18-58岁；根据体检结 果、血液学参数、肝功能和肾功能标志物表明处于健康状态，以及无慢性 病史；未使用慢性病或急性病的处方药；女性处于非怀孕和/或非哺乳期。 将这些参与者随机分配到下列3个治疗组之一中——3.0g、1.5g和安慰剂 组，并且在3个月的时间里一天三次(饭前服用，并与至少100ml水一起 服下)分别服用两个含有500mg NS、250mg NS和250mg安慰剂的胶囊。 剂量选择基于先前动物研究中表明的NS的效力和安全性(Phillips 1999； Phillips等2002，2006)以及来自美国短期人体研究的剂量测定数据(Wang 等2005)。在研究开始时(基线)、在干预的第1个月和第3个月以及试验 结束后1个月时收集来自每个研究参与者的血样和尿样。立即将血清、血 浆和血细胞分离，并储存于-20℃。收集晨尿样品，测量其体积，并以50ml 分装储存于-20℃。将每种样品的等分试样冷冻运送至德克萨斯农业机械大 学和德克萨斯理工大学，以进行生物标志物分析。进行分析的实验人员对 样品来源是不知情的。
利用定量RIA方法(Wang等1996)来测定血清AFB1-白蛋白加合 物。简言之，浓缩血清样品，并重悬于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。通过 溴甲酚紫染料结合方法(Sigma，St.Louis，MO，USA)对血清白蛋白进行 定量，使用Bradford法(Pierce Biotechnology Inc.，Rockport，IL，USA) 确定总蛋白质的量。然后，用链霉蛋白酶(Pronase)(Calbiochem，La Jolla， CA，USA)消化总蛋白质，用丙酮提取该消化产物。对各含有2mg蛋白 质的一式两份血清蛋白质消化物，使用RIA方法对AFB1-白蛋白加合物进 行定量。使用合并的正常人血清标准品(Sigma，St.Louis，MO，USA) 来确定该测定中的非特异性抑制。使用非线性回归法(Gange等，1996) 建立RIA的标准曲线。AFB1-白蛋白加合物的浓度表示为每毫克白蛋白中 的AFB1量。该测定的检出限是每毫克白蛋白0.01pmol。
使用免疫亲和柱纯化继而进行HPLC-荧光检测来分析尿样中的 AFM1水平，该方法如经Sarr等(Sarr等，1995)和Wang等(Wang等， 1999)修改的Groopman等人(Groopman等，1992)所述。简言之，用 0.5ml的1.0M甲酸铵(pH4.5)将每份尿样(5.0ml)调整至酸性pH， 加水至体积为10ml并涡旋混匀。然后，如先前所述(Wang等，1999)， 以约0.3ml/分钟的流速将样品加样到1ml制备型Aflatest P免疫亲和柱 (VicamLP，Watertown，MA，USA)上。清洗之后，用80％甲醇洗脱 经纯化的AF级分，并在N2下干燥以用于使用具有荧光检测能力的Waters HPLC系统(Waters Corporation，Milford，MA)进行分析。使用孔径 为100、粒径为5μm的250mm×4.6mm LiCrospher RP-18封端柱 (Alltech Associates，Deerfield，IL，USA)来分离AF代谢产物。其流动 相由以20mM甲酸铵(pH3.0)缓冲的22％乙醇水溶液组成。通过流动相 等强度洗脱20分钟实现AF的色谱分离。将样品(100μl)注射到柱上， 洗脱速率为1.0ml/分钟。AFM1峰在约15.4分钟的保留时间处检测到。该 方法针对AFM1的检出限是每毫升尿中10pg/ml。AFM1的尿中浓度表示 为每毫克肌酸酐的pg数，以修正各个样品中尿稀释度的变化。
所产生的所有数据保存于Excel数据库中，并用SAS软件9.3版(SAS Institute Inc.，Cary，NC)进行分析。计算AFB1-白蛋白加合物和AFM1 浓度的中值、平均值、标准差(SD)和范围，除非另有指明，否则所述数 值表示为中值和平均值±SD。为了评估NS干预的效力，统计学评估着眼 于对不同治疗水平和不同时间点进行比较。对于正态分布的参数，使用双 因素ANOVA和Bonferroni方法来比较不同治疗组和时间的平均值之间的 显著差异。对于非正态分布的参数，使用Kruskal-Wallis检验或Wilcoxon 秩和检验来比较不同治疗组和不同时间点的差异。为了评估剂量和时间相 互作用对NS治疗的作用，如前所述应用非参数混合作用模型(Brunner 等，2002)。P值小于0.05(双尾)被认为是具有显著性的。
该使用NS的干预试验总共招募了180位受试者，治疗开始时有177 位受试者。参与者的总体坚持情况以及用于生物标志物分析的样品可用性 均是令人满意的。总共162位受试者(91.5％)完成了为期3个月的试验。 关于每个时间收集点用于分析血清中AFB1-白蛋白加合物和尿中AFM1水 平的样品数详细信息列于下文表13中。在样品收集的4个时间点中，从参 与者收集了>95％的血样和≥90％的尿样；这证实了我们使用暴露于AFB1 的生物标志物来描述NS效力的正确性。
表13

分析了在为期4个月的研究期间所收集的总共656个血清样品的 AFB1-白蛋白加合物。在下文表14中显示不同时间点时三个研究组(安慰 剂、1.5g NS和3g NS)中血清AFB1-白蛋白加合物的平均水平(平均值±SD) 和范围。在整个研究期间，这三个组中总体AFB1-白蛋白加合物水平的分 布显示于图7和8中。箱图(boxplot)显示在每个时间点时每个组中AFB1- 白蛋白加合物的分布。箱值是总样品的25～75％，其中的线表示中值。箱 两侧的柱分别代表5～25％和75～95％的范围。在基线样品中观察到高 AFB1-白蛋白加合物水平，在各组之间没有显著差异(P＝0.2354)。在NS 干预第1个月时三个研究组之间未观察到AFB1-白蛋白加合物水平的统计 学显著差异(P＝0.3645)。但是，相比于安慰剂组，1.5g NS和3g NS组中 干预第3个月时观察到AFB1-白蛋白加合物水平有统计学显著的降低 (P<0.0001)。在第4个月时(即干预之后第一个月)，3个组之间未发现 AFB1-白蛋白加合物水平的统计学显著性差异。如图8所示，在4个月的 研究期间，所有三个治疗组中均可见加合物水平显著降低，这显示AFB1- 白蛋白加合物水平的显著时间效应。但是，时间效应的模式在NS治疗组 和安慰剂组之间是不同的。对于安慰剂组来说，在干预第1和第3个月时 AFB1-白蛋白加合物的降低率是16.1％和19.9％。分别对于1.5NS和3.0NS 组来说，在干预第1个月时，AFB1-白蛋白加合物的降低率是22.3％和22.4 ％，在干预第3个月时，是42.8％和40.2％。在安慰剂组中，第3和第4 个月之间没有前后一致的变化；但是，在两个干预组中，血清AFB1-白蛋 白加合物的水平显著提高，并回到与安慰剂组在第4个月时相当的水平。 非参数混合效应模型分析进一步显示，剂量、时间和剂量-时间相互作用对 降低血清AFB1-白蛋白加合物水平的显著作用，这种降低是由于NS干预 所致的(下文表16)。
表14

＊数据表示为如下形式：平均值±SD(范围)。
在为期4个月的研究期间，分析了总共624个尿样的AFM1。在不 同时间点三个研究组(安慰剂、1.5g NS和3g NS)中AFM1的平均水平 和范围显示于下文表15中。在整个研究期间这三个组中尿AFM1水平的分 布显示于图9和图10中。箱图显示每个组在每个时间点AFM1水平的分布。 箱值范围是总样品的25～75％，其中的线表示中值。箱两侧的柱分别代表 5～25％和75～95％范围的值。由于AFM1数据高度倾斜，因此使用非参 数分析进行所有统计学评估。在基线时，三个研究组的中值AFM1水平之 间没有显著性差异(P＝0.2485)。在NS干预第1个月时，三个组的中值 AFM1水平之间未发现显著性差异(P＝0.3342)。但是，在NS干预第3个 月时，观察到中值AFM1水平的统计学显著的降低(P＝0.0445)。尽管安慰 剂组和1.5g NS组的中值AFM1水平是相当的(P＝0.3951)，但是发现3g NS 组和安慰剂组的中值AFM1水平降低率为58.7％(P＝0.0391)。还发现3NS 组和1.5g NS组的中值AFM1水平降低率为57.8％(P＝0.0219)。在干预后 第4个月时，也发现三个研究组的中值AFM1水平的显著性差异 (P＝0.0024)，这主要是由于1.5g NS组中较高的AFM1水平所致。如图 10所示，在4个月研究期间，3.0g NS组中可见AFM1水平显著降低，其 显示显著的时间效应(P＝0.009)。尽管在安慰剂组中也注意到显著的时间 效应(P＝0.002)，但是AFM1水平是高度可变的，如基线和第3个月的较 高中值水平以及第1个月和第4个月的较低中值水平所示。在4个月研究 过程中1.5g NS组中未发现AFM1水平的显著的时间效应(P＝0.3277)。非 参数混合效应模型分析也显示降低尿AFM1水平的显著剂量-时间相互作 用，该相互作用是由于NS干预所致的(表4)。
表15

＊数据以如下形式表示：平均值±SD(范围)。
安全性和效力是评估潜在的治疗和/或临床干预药剂的两个最重要 标准。NS的安全性(和剂量测定)已在动物和人的研究中充分记载，包 括在加纳的为期3个月试验(Afriyie-Gyawu等，2007)。该研究的主要目 的是确定NS在人体中的效力。NS能够在胃肠道中优先吸附AF，导致AF 生物利用度和毒性降低，这已在多种动物模型中得到明确证实。该研究的 结果证实了我们在动物中的工作，并显示施用NS3个月显著降低了人受 试者中血清AFB1白蛋白加合物的水平和尿AFM1水平。就我们所知，这 是第一项通过在具有黄曲霉毒素中毒风险的人群中监测AF特异性生物标 记物来研究饮食加入NS粘土的效力和健康益处的研究。
目前在人和动物研究中使用的AF特异性生物标记物包括AFB1代谢 产物和AFB1大分子加合物，即尿中的AFMx和血清中的AFB1白蛋白加合 物。AFB1白蛋白加合物(相比于尿中AF代谢产物)用作非常重要的生物 标志物，这是因为它较长的体内半衰期可反映较长时间内的总体暴露。从 与流行病学研究相关的实用前景来看，测量血清AFB1-白蛋白加合物提供 了可用于筛选非常大量人群(例如507个人)(Afriyie-Gyawu等2007)和 其它干预研究的快速且容易的方法。AFB1-白蛋白加合物也是研究人暴露 AF的最可靠分子生物标志物。在世界上一些地区的人群中发现AFB1-白蛋 白加合物水平与AFB1摄入之间的高度显著的相关性。另外，有报道所摄 入AFB1的约2％与血清白蛋白共价结合，该数值与向大鼠施用AFB1时观 察到的非常相似。使用多种分析技术，在中国和多个非洲国家中几乎100 ％的成人血清和12-100％的儿童血清中检测到AFB1-白蛋白加合物。除了 研究AF暴露之外，AFB1-白蛋白加合物在非洲已用作急性和慢性黄曲霉毒 素中毒的生物学应答标志物、在台湾、中国和非洲用作HCC风险的生物 学应答标志物，以及用作感染性疾病相关免疫抑制的生物学应答标志物。 另外，AFB1-白蛋白加合物已常规用作在人干预试验中评估不同药剂和技 术的代用效力生物标志物。
在该研究中，在NS干预之前的基线时，在参与者中观察到高水平 的血清AFB1-白蛋白加合物(1.52±0.34pmol/毫克白蛋白；范围0.96-2.93 pmol/毫克白蛋白)。这些水平高于在冈比亚、贝宁和英国所报道的水平， 并且与中国处于高肝癌风险的人群中发现的水平相当。因此，加纳的研究 参与者代表了具有高AF暴露风险的人群。在该研究中，发现每日施用NS 胶囊在降低血清AFB1-白蛋白加合物方面产生显著的剂量效应和时间效应 (表14)。相比于安慰剂组，在1.5g NS和3g NS干预组中第3个月时都 观察到显著性(AFB1-白蛋白加合物水平降低>40％)(表14和图8)。尽管 在两个NS治疗组中干预开始后第1个月时也观察到该生物标志物水平降 低，但是由于安慰剂组中加合物水平降低，因此未发现显著差异。该研究 中可见的加合物降低延迟与之前在中国启东用奥替普拉进行的化学预防 试验相似，其中只有到治疗5周后才观察到血清AFB1-白蛋白加合物水平 显著降低。该延迟可能由于白蛋白的长半衰期，其在正常和健康人体内估 计为约3周。重要的是，与白蛋白结合的AFB1(AFB1白蛋白加合物)可 能在几年内是稳定的。有报道称，使用奥替普拉也有类似发现，其中直至 白蛋白周转经过三个半衰期还可检测到AFB1-白蛋白加合物水平。在该研 究中观察到的显著时间效应(包括安慰剂组中的降低)，也与之前在奥替 普拉试验和最近的教育干预研究中的发现相一致。在我们目前的研究中， 1.5g NS和3g NS组中的AFB1-白蛋白加合物水平在第4个月(干预结束 后1个月)时都升高并回到安慰剂组的水平，其进一步证实了NS降低饮 食AFB1暴露的效力。
AFM1是AFB1的代谢产物，在尿和乳中普遍存在，并且其从前体 AFB1的形成在人体中主要是由肝CYP1A2进行催化的。在尿中排泄AFM1 代表近期(即24或48小时内)暴露于AFB1。因此，尿中AFM1水平可 用作AFB1暴露的短期生物标志物。血清AFB1-白蛋白加合物和尿AFM1 均已被充分表征，并在大量人群中证实了其作为AFB1暴露之生物标志物 的效力。血清AFB1-白蛋白加合物和人尿中排泄的AFM1的水平已显示出 与饮食摄入AF以及人HCC风险的显著相关性。与干预开始后第3个月 时血清AFB1-白蛋白加合物水平降低一致的是，相比于该研究的其它治疗 组，在3g NS组中尿AFM1水平也显著降低(表15和图9)。在用100mg 叶绿酸进行干预3个月后，3g NS治疗组中发现的中值AFM1水平的高达 58.7％的降低率与中值AFB1-N7-鸟氨酸水平的55％的降低率相当。所述 AFB1-N7-鸟氨酸产物也是类似AFM1的短期生物标志物。在该研究中，在 1.5g NS组中未观察到对尿AFM1水平的显著影响，这可能是由于短期标 志物测量中可观的个体内和个体间差异所导致的。在所有研究组中(包括 安慰剂组)还都观察到AFM1水平的显著时间效应，其可反映出每日饮食 AF暴露水平的变化(图10)。在之前对加纳的类似人群(Jolly等2006) 以及另一些人群(Wang等，2001)进行的筛选研究中还观察到尿AFM1 水平的变化。在我们的研究参与者中观察到的非常宽的AFM1水平范围(从 不可检出到13.3ng/毫克肌酸酐)提示AF代谢酶(例如CYP1A2)的基因 型或表型差异可能在个体对AF暴露的易感性方面起作用。尽管如此，在 该研究中，与降低的尿AFM1水平(和血清AFB1-白蛋白加合物)相关的 显著剂量-时间相互作用效应(下表16)证实了通过胶囊施用NS的效力。
表16

总之，该研究的结果提示用NS粘土进行干预可有效地降低暴露于 来自被污染食物的AF，如血液和尿中AF特异性生物标志物(即AFB1- 白蛋白加合物和AFM1)所表示的。最终需要长期(IIb期或III期)研究 以进一步评估，当包含在高风险人群的饮食中时，NS干预作为用于急性 黄曲霉毒素中毒和用于预防慢性黄曲霉毒素诱导疾病的肠吸附剂疗法的 效力。
本领域技术人员容易理解，本发明非常适于本文所述及其固有的 目的并获得本文所述的结果和优点。因此，很明显，胶囊形式和片剂形式 的CAS组合物是不同的，这些不同形式的口服剂型可用于预防或治疗中毒 以及预防黄曲霉毒素相关肝癌的方法。另外，本发明涵盖了所述组合物和 方法的变化。例如，可根据大规模生产所述组合物的需要而改变技术，该 工业规模的组合物生产被认为在本发明的精神范围内。本文所述的材料、 方法、步骤和技术是优选实施方案的现有代表，其旨在举例但不意在对范 围进行限制。应理解，药学领域普通技术人员可获得许多药学参考书，例 如Remmington’s Pharmaceutical Sciences 17th版，Alfonso Gennaro editor，Mack Publishing Company Easton，Pennsylvania 18042，其会允 许对本发明组合物和方法进行改进和更改配方。同样，本领域技术人员会 想到涵盖在本发明的精神范围内或者由所附权利要求的范围所限定的对 其改变和其它用途。
所引用参考文献
下述参考文献以它们提供举例步骤或其它细节以补充本文所述内容 的程度通过引用具体并入本文。
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Remmington’s Phamaceutical Sciences 17th Edition.Alfonso Gennaro editor，Mack Publishing Company Easton，Pennsylvania 18042，Entire Book，pages 1-1983.
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