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时空调节子

阅读：852发布：2020-05-13

IPRDB可以提供时空调节子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在一些实施方式中，本文提供了使得能够在工程化细胞中对核酸表达进行时空调节的方法、组合物、系统和试剂盒。，下面是时空调节子专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种工程化遗传构建体，其包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至(a)编码感兴趣的产物的核苷酸序列和(b)3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含至少一个microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中没有活性或有低水平活性，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中有所述miRNA传感器可检测的水平的活性。

2.根据权利要求1所述的工程化遗传构建体，其中所述microRNA传感器包含至少两个miRNA结合位点。

3.根据权利要求2所述的工程化遗传构建体，其中所述microRNA传感器包含2-10个miRNA结合位点。

4.根据权利要求3所述的工程化遗传构建体，其中所述microRNA传感器包含5-10个miRNA结合位点。

5.根据权利要求2所述的工程化遗传构建体，其中所述microRNA传感器包含至少5个miRNA结合位点。

6.根据权利要求5所述的工程化遗传构建体，其中所述microRNA传感器包含5-10个miRNA结合位点。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述miRNA结合位点为串联定位。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述miRNA结合位点彼此相同。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述3’UTR包含各自特异于不同miRNA的至少两个miRNA传感器。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述至少一种miRNA(miR)选自miR-154、miR-497、miR-29A、miR-720、miR-205、miR-494、miR-224、miR-191、miR-

21、miR-96、miR-449A和miR-183。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述靶细胞为癌细胞、免疫细胞或神经元。

12.根据权利要求书1-11中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子的长度为100-500个核苷酸。

13.根据权利要求12所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子的长度为100-125个核苷酸。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子包含串联重复核苷酸序列。

15.根据权利要求14所述的工程化遗传构建体，其中每个所述核苷酸序列的长度小于

12个核苷酸。

16.根据权利要求14或15所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子包含2-20个串联重复核苷酸序列。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的工程化遗传构建体，其中核苷酸间隔子位于每个所述重复核苷酸序列之间。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子的活性在所述靶细胞中比非靶细胞高至少10％。

19.根据权利要求18所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子的活性在所述靶细胞中比非靶细胞高至少50％。

20.根据权利要求19所述的工程化遗传构建体，其中所述合成启动子的活性在所述靶细胞中比非靶细胞高至少100％。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述感兴趣的产物为治疗分子、预防分子和/或诊断分子。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的工程化遗传构建体，其中所述感兴趣的产物为蛋白质、肽或核酸。

23.根据权利要求22所述的工程化遗传构建体，其中所述感兴趣的产物为选自RNA、DNA、或RNA和DNA的组合的核酸。

24.根据权利要求23所述的工程化遗传构建体，其中感兴趣的产物为选自短发夹RNA、短干扰RNA和microRNA的RNA。

25.根据权利要求21所述的工程化遗传构建体，其中所述感兴趣的产物为选自抗体、酶、激素、炎症分子、抗炎分子、免疫调节分子和抗癌分子的治疗和/或预防分子。

26.根据权利要求21所述的工程化遗传构建体，其中所述感兴趣的产物为选自荧光分子和发光分子的诊断分子。

27.一种载体，其包含根据权利要求1-26中任一项所述的工程化遗传构建体。

28.一种细胞，其包含根据权利要求1-26中任一项所述的工程化遗传构建体或权利要求27所述的载体。

29.一种组合物，其包含根据权利要求1-26中任一项所述的工程化遗传构建体、权利要求27所述的载体或权利要求28所述的细胞。

30.一种试剂盒，其包括工程化遗传构建体，所述工程化遗传构建体包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含至少一个microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中没有活性或有低水平活性，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中有所述miRNA传感器可检测的水平的活性，其中所述构建体还包含位于所述启动子和所述3’UTR之间的限制性位点。

31.一种方法，其包括将根据权利要求1-26中任一项所述的工程化遗传构建体或权利要求27所述的载体递送至细胞。

32.一种方法，其包括将根据权利要求1-26中任一项所述的工程化基因核酸或权利要求26所述的载体递送至受试者。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

说明书全文

时空调节子

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求2016年7月26日根据35U.S.C.§119(e)提交的美国临时申请第62/366,755号的权益，其全文通过引用并入本文。

发明内容

[0003] 在一些实施方式中，本文提供了用于离体和体内时空控制细胞功能的方法、组合物、系统和试剂盒。本公开的时空调节子整合了使得能够在靶细胞(靶标细胞)中进行选择性核酸表达的合成启动子和使得能够在非靶细胞(脱靶细胞)中抑制核酸表达的microRNA(miRNA)传感器。本文使用的合成启动子相对于天然存在的启动子表现出更准确的特异性，并且在靶细胞中表现出比非靶细胞更高的活性。miRNA传感器包含至少一个(一个或多个)特异于miRNA的miRNA结合位点，所述miRNA在非靶细胞中具有活性(在非靶细胞中导致抑制/降解)，但在靶细胞中没有活性或有低水平活性。这种双重功能使得能够在靶细胞中选择性增强核酸表达。

[0004] 这种技术对建立、工程化、制造和部署下一代人体细胞疗法具有广泛的变革性。对小分子或生物药物的时空控制是困难的，这使得治疗其中定位、时机或动力学重要的复杂疾病具有挑战性。工程化细胞提供了体内治疗的时空控制的潜力。本文提供的工程化遗传构建体(时空调节子)可用于细胞功能的时空编程，从而使得能够进行体内治疗的时空控制。

[0005] 因此，本公开的一些方面提供了工程化遗传构建体，其包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至(a)编码感兴趣的产物的核苷酸序列和(b)3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中没有活性或有低水平活性，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中有所述miRNA传感器可检测的水平的活性。

附图说明

[0006] 图1显示了在小胶质细胞(不在其他细胞类型中)中选择性抑制NF-κB通路的工程化病毒载体可以改善ALS和其他神经疾病中的神经炎症的实例。通过病毒载体(例如AAV)将工程化构建体递送至脑细胞，然后依赖于小胶质细胞特异性启动子和microRNA传感器以仅在小胶质细胞中实现NF-κB抑制剂的选择性表达。NF-κB抑制剂可以在NF-κB诱导型启动子的控制下表达，以使能够进行动态抑制而不是组成型抑制。

[0007] 图2显示了用于评估各种细胞特异性调节子(例如，启动子，5’UTR，3’UTR)的模块构建体的实例。合成启动子可以与3’UTR中的合成miRNA结合位点以及在一些情况下工程化5’UTR组合，以评估用于广泛应用的基因表达。

[0008] 图3显示了用于测定个体构建体的microRNA传感器载体的实例。

[0009] 图4的上图为数据图，显示了在实施例1中描述的两种细胞系中，microRNA以不同水平抑制报告基因的表达。在每组柱中，从左到右：MCF-10A；MDA-MB-453。图4的下图为数据图，显示了细胞类型之间的表达比率，显示了某些microRNA在细胞类型之间具有超过5倍的选择性。在每组柱中，从左到右：MDA/MCF；MCF/MDA。

[0010] 图5显示了整合合成启动子和microRNA传感器的构建体的实例。

[0011] 图6A显示了合成启动子和microRNA的组合的表达数据。在每组柱中，从左到右：pmirGLO；pSyn-3；pSyn-12；pSyn-18。图6B是相同数据的放大视图。在每组柱中，从左到右：
pmirGLO；pSyn-3；pSyn-12；pSyn-18。

[0012] 图7显示了合成启动子和microRNA的组合的另外的表达数据。在每组柱中，从左到右：pmirGLO；pSyn-3；pSyn-12；pSyn-18。图7B是相同数据的放大视图。在每组柱中，从左到右：pmirGLO；pSyn-3；pSyn-12；pSyn-18。

[0013] 图8A-8B显示合成启动子和microRNA的组合的表达数据的比率。在含有合成启动子和microRNA传感器的构建体中的多种中观察到预料不到的协同效应。例如，单独的启动子pSyn-18显示出～25倍的选择性，miR-29A(1x)为～4倍，组合为～250倍。在每组柱中，从左到右：pmirGLO；pSyn-3；pSyn-12；pSyn-18。

具体实施方式

[0014] 本文提供了工程化遗传构建体，其实现空间和/或时间选择性，使得能够离体和体内改善(增强)对细胞功能的控制。这些工程化遗传构建体可称为时空调节子。时空调节子可用于创建细胞和基因疗法，其在特定靶细胞(例如，癌细胞，如卵巢癌细胞或小神经胶质细胞)中被有条件地激活和在非靶细胞类型(例如，非癌细胞)中被抑制，以产生治疗输出(例如，分别为免疫疗法或抗炎介质)。此外，这些调节子可用于创建细胞和基因疗法，其在某些条件(例如，炎症)下被有条件地激活和在其他条件(例如，非炎症)下被抑制。定位、集中和定时治疗效应子的表达的能力使得能够治疗其中动力学起重要作用的复杂疾病。

[0015] 因此，本文描述了使得能够进行下一代细胞和基因疗法的强大技术。这些时空调节子可用于在特定条件下和/或特定时间控制特定细胞类型中遗传构建体的表达。该技术使得能够进行治疗剂在体内和离体有条件或局部产生。时空调节子利用与高通量设计-构建-测试-学习平台结合的合理设计方法，以快速集中于仅以细胞类型/细胞状态特异性方式激活的基因表达构建体。这些调节剂使用互补的整合机制在靶细胞中实现高活性和特异性基因表达，以增强严格性和活性。

[0016] 基因治疗中的靶特异性目前主要通过使用靶向病毒载体或天然启动子来实现。前者具有挑战性是因为并不总是有独特的细胞表面标记可用于特异性病毒靶向。后者具有挑战性是因为天然启动子并不总是对某种细胞类型完全特异，在靶标细胞相对于脱靶细胞方面可以具有较低的中靶-脱靶比(ON-OFF ratio)，并且可以尺寸非常大，因此限制了在具有有限容量的病毒载体中编码。如本文所述，>30倍的中靶-脱靶比在整合的遗传构建体中作为最小目标实现，并且>100倍的中靶-脱靶比在一些实施方式中实现。考虑到窄治疗指数的药物通常在最小有效浓度相对于最小毒性浓度之间存在<2倍的差异，这样的中靶-脱靶比是合理的(26)。

[0017] 在一些实施方式中，合成启动子和microRNA传感器可以并入逻辑门，例如AND门，和/或数字开关，以设置更尖锐的基因表达阈值。输出基因可以是，例如，治疗性有效负载，例如用于癌症应用的免疫治疗输出或用于神经炎症/神经变性应用(例如，肌萎缩侧索硬化[ALS])的炎症抑制剂。

[0018] 例如，对于癌症应用，检查点抑制剂、细胞因子和趋化因子的分泌以及抗CD3ε结构域的表面展示以触发T细胞杀死癌细胞可以是有用的。需要高严格性以使对正常细胞的脱靶效应最小化。本文提供的工程化遗传构建体可以通过非病毒载体或病毒递送至癌细胞以招募免疫疗法以从肿瘤自身内部杀死肿瘤。该方法克服了现有免疫疗法的主要限制。例如，CAR T细胞和双特异性T细胞衔接体(engager)需要难以发现的特定细胞表面靶标。此外，肿瘤可以产生在用传统方法克服时具有挑战性的免疫抑制环境。

[0019] 此外，ALS模型中的近期数据显示，小胶质细胞中NF-κB介导的通路导致运动神经元死亡(1)。全面抑制炎症并不改善ALS小鼠的存活，甚至可以使疾病恶化。此外，NF-κB介导神经元中的重要信号传导通路，因此以非靶向方式抑制它可能是不期望的。然而，在小胶质细胞中靶向抑制NF-κB通路可以使SOD1-G93A小鼠(ALS模型)寿命延长至多47％。因此，使用本文描述的构建体并通过AAV载体递送到脑中而对NF-κB通路进行空间/细胞类型特异性抑制，是用于治疗与包括ALS(图1)的神经炎症相关的疾病的转化性方法。通过用由外源性的、FDA批准的药物或天然产物调节的开关对小胶质细胞特异性NF-κB抑制进行进一步的时间控制(9-12)，使得能够进一步调节这样的方法的安全性和时间选择。

[0020] 本公开的一些方面提供了工程化遗传构建体，其包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至(a)编码感兴趣的产物的核苷酸序列和(b)3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中没有活性或有低水平活性，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中有所述miRNA传感器可检测的水平的活性。

[0021] 如果合成启动子可操作地连接至其的核酸的表达在靶细胞中比非靶细胞更高(例如，至少10％)(甚至是在不存在如本文提供的miRNA传感器的情况下)，则合成启动子被看作是具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性。在一些实施方式中，合成启动子的活性在靶细胞中比非靶细胞高至少10％。例如，合成启动子的活性可以在靶细胞中比非靶细胞高至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、
3500％、4000％、4500％、5000％或更高。在一些实施方式中，合成启动子的活性在靶细胞中比非靶细胞高10％-1000％、10％-500％、10％-100％、50％-1000％、50％-500％或50％-
100％。在一些实施方式中，合成启动子的活性在靶细胞中比非靶细胞高至少50％。在一些实施方式中，合成启动子的活性在靶细胞中比非靶细胞高至少100％。

[0022] 如果miRNA以足以抑制合成启动子可操作地连接至其的核酸的表达(例如，大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)的水平存在于非靶细胞中，则miRNA被看作是在非靶细胞中具有活性。如果miRNA不存在于靶细胞中(靶细胞不含特定miRNA)或者如果miRNA不结合至miRNA传感器，则miRNA被看作是在靶细胞中没有活性。如果mRNA存在于靶细胞中但不是以足以抑制合成启动子可操作地连接至其的核酸的表达的水平(沉默翻译或降解转录物)(例如，大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，则miRNA被看作是在靶细胞中有低水平活性合成启动子

[0023] 本公开的合成启动子是核酸序列的控制区，在该处控制核酸序列的其余部分的转录起始和速率。合成启动子通常含有调节蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他转录因子可结合的亚区。合成启动子驱动表达或驱动其调节的核酸序列的转录。当合成启动子处于与其调节以控制(“驱动”)序列的转录起始和/或表达的核酸序列相关的正确功能位置和方向时，它被看作是可操作地连接的。

[0024] 本公开的合成(非天然存在的)启动子在一些实施方式中的长度为100-500个核苷酸。例如，合成启动子的长度可为100、200、300、400或500个核苷酸。在一些实施方式中，合成启动子的长度为200-300个核苷酸。在一些实施方式中，合成启动子的长度为100-125个核苷酸。

[0025] 在一些实施方式中，合成启动子包含串联重复核苷酸序列。也就是说，合成启动子可包含彼此直接相邻定位(彼此连续)，或仅由少数(例如，1-5个)核苷酸(通过核苷酸间隔子)彼此分开的重复(相同)核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，长度为1-5个核苷酸(例如，1、2、3、4或5个核苷酸)的核苷酸间隔子位于重复核苷酸序列之间。例如，核苷酸间隔子可选自AGC、ATC、GAC、ACT、AGT、GTC、GAT和GCT。在一些实施方式中，重复核苷酸序列之间的间隔子长度不同(相对于彼此不是相同的长度)。

[0026] 合成启动子的重复核苷酸序列的长度在一些实施方式中小于12个核苷酸。例如，重复核苷酸序列的长度可以为11、10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。在一些实施方式中，重复核苷酸序列的长度是4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、5-11、5-10、5-9、5-8、6-11、6-10、6-9、7-11个核苷酸。在一些实施方式中，重复核苷酸序列的长度是11个核苷酸。在一些实施方式中，重复核苷酸序列的长度是8个核苷酸。也可以使用大于12个核苷酸的长度。

[0027] 在一些实施方式中，合成启动子包含2-20个串联重复核苷酸序列。例如，合成启动子可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个串联重复核苷酸序列。在一些实施方式中，合成启动子包含2-15、2-10、2-5、5-10、5-15或5-10个串联重复核苷酸序列。

[0028] miRNA传感器

[0029] microRNA(miRNA)是小的非编码RNA分子(例如，含有约22个核苷酸)，其通常在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。miRNA分子包含与一些mRNA转录物的3’非翻译区(UTR)中发现的序列完全或部分互补的序列。miRNA与mRNA的3’UTR中的miRNA结合位点的结合导致可以通过mRNA降解或翻译阻止而发生的沉默。

[0030] 如本文所提供的，被鉴定为在特定靶细胞中但不在非靶细胞中下调的miRNA被用于抑制编码感兴趣的产物(例如，输出基因)的核酸在非靶细胞中的表达，所述非靶细胞在其mRNA序列中含有miRNA结合序列。因此，基于miRNA的基因表达抑制在一些实施方式中仅在非靶细胞中发生，导致与靶细胞相比基因表达降低。

[0031] 本公开的miRNA传感器包含至少一个或至少两个mRNA结合位点，特定miRNA可与其结合以沉默与合成启动子可操作地连接的核酸的表达。例如，miRNA传感器可包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个miRNA结合位点。在一些实施方式中，miRNA传感器包含至少5个(或5个)miRNA结合位点。在一些实施方式中，miRNA传感器包含1-10个miRNA结合位点。例如，miRNA传感器可包含1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、
2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-
7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-9、8-10、8-9或9-10个miRNA结合位点。在一些实施方式中，miRNA传感器包含2-10个miRNA结合位点。在一些实施方式中，miRNA传感器包含5-
10个miRNA结合位点。

[0032] 在一些实施方式中，mRNA结合位点为串联定位。也就是说，miRNA结合位点可以彼此直接相邻(彼此连续)，或通过核苷酸间隔子(例如，长度为1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔子)彼此分开。

[0033] 在一些实施方式中，单个miRNA传感器内的miRNA结合位点彼此相同(具有相同的核苷酸序列)。在一些实施方式中，单个miRNA传感器内的miRNA结合位点共享至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的核苷酸序列同一性。

[0034] miRNA结合位点的长度可以变化。在一些实施方式中，miRNA结合位点的长度为15-30个核苷酸。例如，miRNA结合位点的长度可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，miRNA结合位点的长度为15-20、20-30或20-25个核苷酸。

[0035] 在一些实施方式中，miRNA结合位点与miRNA完全(100％)互补，而在其他实施方式中，miRNA结合位点与miRNA部分(小于100％)互补。

[0036] 工程化遗传构建体可包含单个miRNA传感器(例如，包含一个或多个miRNA结合位点)或多个(多于一个)miRNA传感器。单个miRNA传感器或多个miRNA传感器(例如，每个含有不同的miRNA结合位点)内的多个mRNA结合位点可以与合成启动子组合使用以增强细胞类型特异性和细胞状态特异性的严格性。因此，在一些实施方式中，单个miRNA传感器或多个不同miRNA传感器内的多个miRNA结合位点可以在靶转录物的3’末端串联编码，使得只有在多个microRNA在靶细胞中没有活性(例如，不存在)或具有低活性时才允许高水平基因表达。在一些实施方式中，3’UTR包含至少两个(例如，至少3、4或5个)miRNA传感器，每个传感器特异于不同的miRNA。在其中构建体包含多于一个miRNA传感器的实施方式中，传感器包含特异于不同miRNA的miRNA结合位点。例如，工程化遗传构建体可以包含第一miRNA传感器，其包含对miRNA#1(例如，miR-54)特异的单个mRNA结合位点或串联重复miRNA结合位点，并且同一工程化构建体可以包含第二(或更多)miRNA传感器，其包含对miRNA#2(例如，miR-497)特异的单个miRNA结合位点或串联重复miRNA结合位点。如本文所证实的，使用含有多个mRNA结合位点和/或传感器的工程化遗传构建体实现了大于3倍的选择性，并且在一些情况下大于5倍的选择性。

[0037] 在一些实施方式中，至少一种miRNA(miR)选自miR-154、miR-497、miR-29A、miR-720、miR-205、miR-494、miR-224、miR-191、miR-21、miR-96、miR-449A和miR-183。

[0038] 感兴趣的产物

[0039] 由本公开的工程化遗传构建体编码的产物可以为，例如，治疗性分子和/或预防性分子。在一些实施方式中，感兴趣的产物为蛋白质或肽(例如，治疗性蛋白质或肽)。在一些实施方式中，感兴趣的产物为核酸(例如，治疗性核酸)。核酸的实例包括RNA、DNA或RNA和DNA的组合。在一些实施方式中，感兴趣的产物为DNA(例如，单链DNA或双链DNA)。在一些实施方式中，感兴趣的产物为RNA。例如，感兴趣的产物可以选自RNA干扰(RNAi)分子，例如，短发夹RNA、短干扰RNA和microRNA。在一些实施方式中，感兴趣的产物控制病毒复制和/或病毒性。

[0040] 治疗性和/或预防性分子的实例，例如，抗体(例如，单克隆或多克隆；嵌合；人源化；包括抗体片段和抗体衍生物(双特异性、三特异性、scFv和Fab))、酶、激素、炎性分子、抗炎分子、免疫调节分子和抗癌分子。上述类别的治疗性分子的具体实例是本领域已知的，其中任一种均可根据本公开使用。

[0041] 在一些实施方式中，感兴趣的产物是免疫调节分子。免疫调节分子是调节免疫应答的分子(例如，蛋白质或核酸)。在一些实施方式中，免疫调节分子在癌细胞的表面表达或从癌细胞分泌。

[0042] 在一些实施方式中，免疫调节分子是合成T细胞衔接体(STE)。合成T细胞衔接体是与T细胞(例如，细胞毒性T细胞)表面上的分子结合(例如，通过配体-受体结合相互作用)或以其他方式引发细胞毒性T细胞应答的分子(例如，蛋白质)。在一些实施方式中，STE是结合T细胞表面上的配体的受体。在一些实施方式中，STE是抗CD3抗体或抗体片段。本公开的STE通常在编码STE的核酸被递送至的癌细胞或其他疾病细胞的表面表达或从所述癌细胞或其他疾病细胞分泌。参见，例如，国际公开号WO 2016/205737，其通过引用并入本文。

[0043] 本公开的STE的实例包括结合T细胞表面抗原的抗体、抗体片段和受体。T细胞表面抗原包括，例如，CD3、CD4、CD8和CD45。

[0044] 在一些实施方式中，感兴趣的产物选自趋化因子、细胞因子和检查点抑制剂。

[0045] 免疫调节分子包括免疫刺激分子和免疫抑制分子。免疫刺激分子是无论是单独还是与另外的分子组合，在受试者中刺激免疫应答(包括增强预先存在的免疫应答)的分子。实例包括抗原、佐剂(例如，TLR配体、包含未甲基化的CpG二核苷酸的核酸、单链或双链RNA、鞭毛蛋白、胞壁酰二肽)、包括白细胞介素(例如，IL-2、IL-7、IL-15(或这些细胞因子的超激动剂/突变形式)、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3-配体等)的细胞因子、免疫刺激抗体(例如，抗-CTLA-4。抗-CD28、抗CD3或这些分子的单链/抗体片段)等。

[0046] 免疫抑制分子是无论是单独还是与另外的分子组合，在受试者中抑制免疫应答的分子。实例包括抗CD3抗体或抗体片段，以及其他免疫抑制剂。

[0047] 抗原可以是但不限于癌抗原、自身抗原、微生物抗原、过敏原或环境抗原。

[0048] 癌抗原是优先由癌细胞表达的抗原(例如，它在癌细胞中以高于非癌细胞的水平表达)，并且在一些情况下，它仅由癌细胞表达。癌抗原可以在癌细胞内或在癌细胞的表面上表达。癌抗原可以为MART-1/Melan-A、gp100、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、FAP、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)--C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链和CD20。癌抗原可以选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)。癌抗原可以选自GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9。癌抗原可以选自BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、fodrin、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2神经节苷脂、GD2神经节苷脂、人乳头瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV编码核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、CD20和c-erbB-2。

[0049] 在一些实施方式中，感兴趣的产物为诊断性分子。诊断性分子可以为，例如，可检测的分子，例如，可通过显微镜检测的。在一些实施方式中，诊断性分子是荧光分子，例如，荧光蛋白。荧光蛋白是本领域已知的，其任一种均可根据本公开使用。在一些实施方式中，诊断性分子是可以在受试者(例如，人受试者)中成像的报告分子。例如，报告分子可以为碘化钠同向转运体(参见，例如，Galanis，E.等，Cancer Research，75(1)：22-30，2015，其通过引用并入本文)。工程化核酸

[0050] 工程化核酸(例如，工程化遗传构建体)是在自然中不存在的核酸。然而，应当理解，虽然工程化核酸作为整体不是天然存在的，但它可以包含在自然中存在的核苷酸序列。在一些实施方式中，工程化核酸包含来自不同生物(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方式中，工程化核酸包含鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是指通过连接核酸分子而构建，并且在一些实施方式中，可以在活细胞中复制的分子。“合成核酸”是指通过扩增或以化学或其他方式合成的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其他方式修饰，但可与天然存在的核酸分子碱基配对的那些。重组核酸和合成核酸还包括由前述任一者的复制产生的那些分子。本公开的工程化核酸可以由单个分子(例如，包含在同一质粒或其他载体中)或由多个不同分子(例如，多个不同的独立复制分子)编码。

[0051] 可以使用标准分子生物学方法产生本公开的工程化核酸(参见，例如，Green和Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2012，Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方式中，使用GIBSON Cloning(参见，例如，Gibson，D.G.等，Nature Methods，343-345，2009；和Gibson，D.G.等，Nature Methods，901-903，
2010，其各自通过引用并入本文)生产工程化核酸构建体。GIBSON 通常在
单管反应中使用三种酶活性：5’核酸外切酶，DNA聚合酶的’Y延伸活性，和DNA连接酶活性。
5’核酸外切酶活性咀嚼(chew back)5’末端序列并暴露互补序列以进行退火。然后聚合酶活性填充退火区域的间隙。然后DNA连接酶密封切口并将DNA片段共价连接在一起。相邻碎片的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的那些长得多，因此产生更高百分比的正确装配件。在一些实施方式中，使用 cloning(Takara Bio USA)产生工程化
核酸构建体。

[0052] 启动子是指核酸序列的控制区，在该处控制核酸序列的其余部分的转录起始和速率。启动子还可以含有调节蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他转录因子可以结合的亚区。启动子可以是组成型的、诱导型的、激活型的、抑制型的、组织特异性型的或其任意组合。启动子驱动表达或驱动其调节的核酸序列的转录。本文中，当启动子处于与其调节以控制(“驱动”)序列的转录起始和/或表达的核酸序列相关的正确功能位置和方向时，它被看作是可操作地连接的。

[0053] 组成型启动子是未经调节的启动子，其持续地激活转录。组成型启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(合成启动子，其含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的修饰MoMuLVLTR的U3区)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子。

[0054] 诱导型启动子为特征在于当存在信号、受信号影响或接触信号时调节(例如，启动或激活)转录活性的启动子。信号可以是内源性的或通常外源性的条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白(例如，细胞因子)，其以例如在调节来自诱导型启动子的转录活性时有活性的方式与诱导型启动子接触。转录的激活可以涉及直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏物失活而间接作用于启动子。相反，转录的失活可以涉及直接作用于启动子以阻止转录或通过激活随后作用于启动子的阻遏物而间接作用于启动子。如果在信号的存在下，来自启动子的转录被激活、失活、增加或减少，则启动子被看作是响应于信号。

[0055] 本文还提供了包含本公开的工程化遗传构建体的载体。在一些实施方式中，载体是附加型载体，例如质粒或病毒载体(例如，腺病毒载体，逆转录病毒载体，单纯疱疹病毒载体和/或嵌合病毒载体)。

[0056] 细胞

[0057] 本公开的工程化遗传构建体可以全身性地递送和在特定靶细胞中有条件地(基于输入信号的存在或不存在)激活(构建体的转录被激活)。

[0058] 靶细胞和非靶细胞之间的差异可以是，例如，疾病状态(例如，疾病相对于非疾病)、细胞类型(例如，神经元细胞相对于神经胶质细胞)或环境状态(例如，促炎症状态的T细胞相对于抗炎症状态的T细胞)。如本文所提供的，靶细胞(和非靶细胞)的选择不限于特定类型的细胞或条件。

[0059] 在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞、良性肿瘤细胞或其他疾病细胞。因此，在一些实施方式中，将工程化遗传构建体递送至具有肿瘤细胞或癌细胞的受试者，并且工程化遗传构建体在肿瘤细胞或癌细胞中表达。

[0060] 癌细胞可以是任何类型的癌细胞，包括但不限于恶变前瘤、恶性肿瘤、转移瘤、或特征在于不受控制的细胞生长使得它被认为是癌性的或癌前性的任何疾病或病症。癌症可能是原发性或转移性癌症。癌症包括但不限于眼癌、胆道癌、膀胱癌、胸膜癌、胃癌、卵巢癌、脑膜癌、肾癌、包括胶质母细胞瘤和成神经管细胞瘤的脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、包括急性淋巴细胞性和骨髓性白血病的血液瘤、多发性骨髓瘤、艾滋病相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤、包括鲍恩氏(Bowen)病和佩吉特氏(Paget)病的上皮内瘤、肝癌、肺癌、包括霍奇金病和淋巴细胞淋巴瘤的淋巴瘤、神经母细胞瘤、包括鳞状细胞癌的口腔癌、包括起因于上皮细胞的那些的卵巢癌、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤的肉瘤、包括黑色素瘤的皮肤癌、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、包括生殖器肿瘤如精原细胞瘤、非精原细胞瘤、畸胎瘤、绒毛膜癌、间质瘤和生殖细胞肿瘤的睾丸癌、包括甲状腺腺癌和髓样癌的甲状腺癌，以及包括腺癌和威尔姆氏(Wilm)瘤的肾癌。常见的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和脑癌。在一些实施方式中，肿瘤是黑素瘤、癌、肉瘤或淋巴瘤。

[0061] 本公开的工程化遗传构建体可以在广泛的宿主细胞类型中表达。在一些实施方式中，工程化遗传构建体在哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达。本公开的工程化遗传构建体可以体内表达，例如在受试者如人受试者中。

[0062] 在一些实施方式中，工程化遗传构建体在间充质干细胞(MSC)、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、天然杀伤(NK)细胞、T细胞、造血干细胞(HSC)和/或其他免疫细胞中表达(例如，对于离体工程化的细胞)。在一些实施方式中，工程化遗传构建体在免疫细胞、肌肉细胞、肝细胞、神经元、眼细胞、耳细胞、皮肤细胞、心脏细胞、胰腺细胞和/或脂肪细胞中表达(例如，对于体内靶向的细胞)。

[0063] 在一些实施方式中，工程化遗传构建体在哺乳动物细胞中表达。例如，在一些实施方式中，工程化遗传构建体在人细胞、灵长类动物细胞(例如，vero细胞)、大鼠细胞(例如，GH3细胞、OC23细胞)或小鼠细胞(例如，MC3T3细胞)中表达。存在多种人细胞系，包括但不限于人胚肾(HEK)细胞、HeLa细胞、来自国家癌症研究所(National Cancer Institute)的60种癌细胞系的癌细胞(NCI60)、DU145(前列腺癌)细胞、Lncap(前列腺癌)细胞、MCF-7(乳腺癌)细胞、MDA-MB-438(乳腺癌)细胞、PC3(前列腺癌)细胞、T47D(乳腺癌)细胞、THP-1(急性髓性白血病)细胞、U87(胶质母细胞瘤)细胞、SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞(克隆自骨髓瘤)和Saos-2(骨癌)细胞。在一些实施方式中，工程化核酸在人胚肾(HEK)细胞(例如，HEK 293或HEK 293T细胞)中表达。在一些实施方式中，工程化核酸在干细胞(例如，人干细胞)，例如，例如多能干细胞(例如，包括人诱导多能干细胞(hiPSC)的人多能干细胞)中表达。“干细胞”是指能够在培养物中无限期分裂并产生专门细胞的细胞。“多能干细胞”是指能够分化成生物体的所有组织，但不能单独维持完整生物体发育的类型的干细胞。“人诱导多能干细胞”是指通过被迫表达对维持胚胎干细胞的决定性特性重要的基因和因子而被重编程为胚胎干细胞样状态的体(例如，成熟或成体)细胞(参见，例如，Takahashi和Yamanaka，Cell 126(4)：663-76，2006，通过引用并入本文)。人诱导多能干细胞表达干细胞标志物并且能够产生所有三个胚层(外胚层，内胚层，中胚层)特有的细胞。

[0064] 可以根据本公开使用的细胞系的另外的非限制性实例包括293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-
1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five细胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L细胞、Jurkat、JY细胞、K562细胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3......48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/
0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL细胞、RenCa、RIN-
5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2细胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1和YAR细胞。

[0065] 组合物和试剂盒

[0066] 本公开还提供了包含工程化遗传构建体的组合物，所述工程化遗传构建体包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至(a)编码感兴趣的产物的核苷酸序列和(b)3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含至少一个microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中没有活性或有低水平活性，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中有所述miRNA传感器可检测的水平的活性。

[0067] 本公开进一步提供了包括工程化遗传构建体的试剂盒，所述工程化遗传构建体包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含至少一个microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中没有活性或有低水平活性，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中有所述miRNA传感器可检测的水平的活性，其中所述构建体还包含位于所述启动子和所述3’UTR之间的限制性位点。

[0068] 本公开的组合物和/或试剂盒可包括如本文所述包含任何合成启动子和/或miRNA传感器的任何工程化遗传构建体。

[0069] 方法

[0070] 本文还提供了包括向细胞递送工程化遗传构建体的方法，所述工程化遗传构建体包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至(a)编码感兴趣的产物的核苷酸序列和(b)3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含至少一个microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中不表达或在所述靶细胞中以所述miRNA传感器不可检测的水平表达，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中以所述miRNA传感器可检测的水平表达(使得工程化遗传构建体在靶细胞中表达并且在非靶细胞中沉默和/或降解)。

[0071] 在一些实施方式中，包含工程化遗传构建体的载体也可以被递送至细胞。

[0072] 此外，本公开提供了向受试者递送工程化遗传构建体，所述工程化遗传构建体包含至少一个合成启动子，所述合成启动子具有在靶细胞中比非靶细胞更高的活性并且可操作地连接至(a)编码感兴趣的产物的核苷酸序列和(b)3’非翻译区(UTR)，所述3’非翻译区包含至少一个microRNA(miRNA)传感器，所述microRNA传感器包含至少一种miRNA可与其结合的至少一个miRNA结合位点，其中所述至少一种miRNA在所述靶细胞中不表达或在所述靶细胞中以所述miRNA传感器不可检测的水平表达，并且其中所述至少一种miRNA在非靶细胞中以所述miRNA传感器可检测的水平表达。

[0073] 在一些实施方式中，还可将包含工程化遗传构建体的载体递送至受试者。

[0074] 在一些实施方式中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方式中，受试者是人受试者。

[0075] 本公开的方法可包括如本文所述包含任何合成启动子和/或miRNA传感器的任何工程化遗传构建体(的使用)。

[0076] 可以使用病毒递送系统(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关、辅助依赖性腺病毒系统、杂合腺病毒系统、单纯疱疹病毒、痘病毒、慢病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒)或非病毒递送系统(例如，物理：裸DNA、DNA轰击、电穿孔、流体动力学、超声波或磁转染；或化学：阳离子脂质、不同阳离子聚合物或脂质聚合物)(Nayerossadat N等，Adv Biomed Res.2012；1：27，通过引用并入本文)将工程遗传构建体递送至细胞。在一些实施方式中，非基于病毒的递送系统是基于水凝胶的递送系统(参见，例如，Brandl F等，Journal of Controlled Release，2010，142(2)：221-228，通过引用并入本文)。

[0077] 可以通过本领域已知的任何体内递送方法将工程化遗传构建体和/或细胞递送至受试者(例如，哺乳动物受试者，例如，人受试者)。例如，可以静脉内递送工程化遗传构建体和/或细胞。在一些实施方式中，工程化遗传构建体和/或细胞在递送载体(例如，非脂质体纳米颗粒或脂质体)中递送。在一些实施方式中，工程化遗传构建体和/或细胞被全身递送至患有癌症或其他疾病的受试者并在受试者的癌细胞或患病细胞中被特定地激活(转录被激活)。

[0078] 附加实施方式

[0079] 1.一种实现空间和/或时间选择性的合成基因回路(构建体)，所述合成基因回路包含一个或多个人工启动子，所述人工启动子在特定细胞类型而非其他细胞类型中有活性且可操作地连接至一种或多种核酸分子并驱动所述一种或多种核酸分子的表达，所述合成基因回路还包含miRNA传感器组分，所述miRNA传感器组分检测在特定靶标细胞但不在脱靶细胞中下调的一种或多种miRNA，其中所述核酸分子的基于miRNA的表达抑制在脱靶细胞中进行，使得核酸分子表达在脱靶细胞中与靶标细胞相比降低。

[0080] 2.根据实施方式1所述的合成基因回路，其中所述一个或多个人工启动子可操作地连接至编码治疗性或标志物多肽的一种或多种核酸分子并驱动所述编码治疗性或标志物多肽的一种或多种核酸分子的表达。

[0081] 3.根据实施方式1或实施方式2所述的合成基因回路，其中所述一个或多个人工启动子中的每一个包含200-300个碱基对。

[0082] 4.根据实施方式1中任一项所述的合成基因回路，其中所述一个或多个人工启动子在靶标细胞内与脱靶细胞相比具有至少10倍增强的活性，优选在靶标细胞内与脱靶细胞相比至少50倍增强的活性。

[0083] 5.实施方式1-4中任一项所述的合成基因回路，其中所述合成基因回路包含在靶转录物的3’末端串联编码的多个microRNA传感器，使得只有在多种microRNA在靶标细胞中不存在时才允许高水平基因表达。

[0084] 实施例

[0085] 实施例1

[0086] 在该实施例中，将5个拷贝的microRNA靶位点克隆到萤火虫荧光素酶的3’-UTR中：microRNA靶位点被标明为154、497、29A、720、205、494、224、191、21、96、449A或183。参见图
3。萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。将萤火虫荧光素酶表达对海肾荧光素酶表达进行标准化，帮助了控制转染效率和非特异性细胞应答。将携带microRNA靶位点和报告体的质粒转染到MCF-10A和MDA-MB-453细胞系中，并在第二天测量荧光素酶表达。microRNA对于两种细胞系以不同水平抑制报告基因表达。参见图4上图。
某些microRNA(miR-191、miR-21和miR-183)在细胞类型之间具有超过5倍的选择性。参见图
4下图。

[0087] 实施例2

[0088] 在该实施例中，对三种不同的合成启动子与两种不同的microRNA靶位点(1-5个拷贝)的组合进行测定。参见图5。表达数据在图6A-8B中显示。对于恶性细胞系相对于非恶性细胞系，许多组合表现出超过50倍的选择性。在含有合成启动子和microRNA传感器两者的时空调节子构建体中的多种中观察到预料不到的协同效应。例如，仅含有合成启动子pSyn-3、12、18(不含miRNA传感器)的构建体表现出25倍的细胞选择性(MDA-MB-453/MCF-10A细胞中的报告基因表达的比率)，而仅含有miRNA-29A的构建体(不含合成启动子)表现出4倍的细胞选择性。包含(1)pSyn-3、pSyn-12或pSyn-18和(2)miRNA-29A两者的时空调节子构建体分别表现出～100倍、～150倍和～250倍的细胞选择性。

[0089] 参考文献

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[0116] 本文公开的所有参考文献、专利和专利申请通过引用并入为其而引用各自的主题内容，其在某些情况下可涵盖整个文件。

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