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生物降解方法和组合物

阅读：584发布：2021-02-15

IPRDB可以提供生物降解方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了处理海洋动物或海洋动物副产品以制备含有有用化合物的固体、液体和脂类组分的新颖微生物组合物和生物降解方法。，下面是生物降解方法和组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微生物组合物，包含在ATCC专利保藏名称PTA-10861中的微生物。

2.一种生物降解方法，其包括：

将海洋动物或海洋动物副产品与包含在ATCC专利保藏名称PTA-10861中的微生物的组合物混合以形成混合物；

使所述混合物发酵；和

将所述混合物分离成固体、水溶液和脂类组分。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述海洋动物是海洋节肢动物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述海洋节肢动物选自由虾和蟹组成的组。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述海洋节肢动物是磷虾。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述海洋动物是鱼。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述发酵通过兼性需氧发酵进行。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述分离通过离心进行。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述发酵在30℃至40℃的温度进行。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵在4.3至5.0的pH进行。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述发酵进行24-96小时。

12.根据权利要求2所述的方法，其中所述水溶液组分包含氨基酸、壳聚糖和葡糖胺。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水溶液组分进一步包含痕量元素。

14.一种水溶液或固体组分，其根据权利要求2的生物降解方法制备。

15.一种包含HYTb的组合物，其中所述HYTb是海洋节肢动物或海洋节肢动物副产品和包含在ATCC专利保藏名称PTA-10861中的微生物的组合物发酵得到的水溶液组分。

16.一种包含HYTc的组合物，其中所述HYTc是海洋节肢动物或海洋节肢动物副产品和包含在ATCC专利保藏名称PTA-10861中的微生物的组合物发酵得到的固体组分。

说明书全文

生物降解方法和组合物

技术领域

[0001] 公开了处理海洋动物副产品并且在一些情况下是完整海洋动物以制备含有有用化合物的固体、液体和脂类组分的新颖微生物组合物和微生物方法。

[0002] 发明背景

[0003] 鱼和海洋节肢动物如虾、蟹和龙虾的加工产生大量的海洋副产品。大部分用于低端产品如肥料、鱼贮饲料或宠物食品，但是未使用的副产品对海产品加工业造成了经济负担，因为需要以对环境无害的方式来处理这些残渣。据估计，这些副产品相当于渔业捕获总产量的25%。

[0004] 例如，为了随后的冷冻和销售，在虾的加工期间产生大量的残留物，因为所述动物的35%是不可食用的并且必须丢弃。这些残余物或副产品由虾头胸部和外骨骼组成。然而，这些虾副产品富含高附加值物质，如几丁质、蛋白质、脂类、类胡萝卜素色素(虾青素)和矿物质。大部分不可食用的副产品被通过填埋或倾倒回海洋来处理，因此引起了严重的环境问题并对虾加工工业带来间接损失。目前，只有少量这些副产品被用作动物饲料的添加剂。

[0005] 最常见的虾副产品利用技术是晒干。该技术卫生控制差，产品主要用于动物消费。其它方法使用化学酸和碱在不同浓度、温度和次数下提取几丁质并且回收蛋白质水解产物。然而，这些方法引起几丁质的解聚和部分脱乙酰化。此外，这些方法使其它产品(如蛋白质和色素)的回收变复杂。

[0006] 已经开发出用于提取几丁质、液体水解产物和色素的酶催化方法。这些方法使用酶催化提取或酶分离。已有其它研究报道使用微生物酶(如商业化碱性蛋白酶)来从虾和海洋动物副产品提取蛋白质。已经报道用碱性蛋白酶和胰酶的组合物来提取几丁质、水解的蛋白质和有颜色的脂类。

[0007] 乳酸发酵方法已经用作以上化学和酶催化方法的替代方法。发酵代表稳定并保持副产品营养品质的成本有效的技术。发酵的最优条件取决于若干因素，包括碳水化合物的选择和浓度、pH、温度、次数和需氧或厌氧条件的选择。另一个重要因素是微生物和最初接种浓度的选择。为了便利虾副产品的发酵方法，已经使用乳酸菌(LAB)纯培养物。这些LAB包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Rao，M.S.，Stevens，W.F.，2006，“Fermentation of shrimp biowaste under different salt concentrations with amylolytic and non-amylolitic Lactobacillus strains for chitin
production，”Food Technology and Biotechnology 44，83-87；Rao，M.S.， J.，Stevens，W.F.，2000，“Critical factors in chitin production by fermentation of shrimp biowaste，”Applied Microbiology and Biotechnology 54，808-813；Bhaskar，N.，Suresh，P.V.，Sakhare，P.Z.，Sachindra，N.M.，2007，“Shrimp biowaste fermentation with Pediococcus acidolactici CFR2182：optimization of fermentation conditions by response surface methodology and effect of optimized conditions on
deproteination/demineralization and carotenoid recovery，”Enzyme and Microbial Technology 40，1427-1434)，乳酸杆菌B2(Cira，L.A.，Huerta，S.，Hal，G.M.，Shirai，K.，2002，“Pilot scale lactic acid fermentation of shrimp waste for chitin recovery，”Process Biochemistry37，1359-1366；Shirai，K.，Guerrero，I.，Huerta，S.，Saucedo，G.，Castillo，A.，Gonzalez，R.O.，Hall，G.M.，2001，“Effect of initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation，”Enzyme and Microbial Technology 28，446-452)，干酪乳杆菌(Shirai
2001)，类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)(Jung，W.J.，Jo，G.H.,Kuk,J.H.,Kim,Y.J.,Oh,K.T.,Park,R.D.,2007,“Production of chitin from red crab shell waste by successive fermentation withLactobacillus paracasei KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3,”Carbohydrate Polymers 68,746-750)，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)(Bautista,J.,Jover,M.,Gutierrez,J.F.,Corpas,R.,Cremades,O.,Fontiveros,E.,Iglesias,F.,Vega,J.,2001,“Preparation of crayﬁsh chitin by in situ lactic acid production,”Process Biochemistry 37,229-234；Shirai 2001)，嗜酸乳杆菌B4495和乳酸乳杆菌(Bhaskar2007)，唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salvarus)(Beaney
2005)，屎肠球菌(Enteroccus facium)(Beaney 2005)，乳酸片球菌(Bhaskar 2007)和片球菌(Pedioccoccus sp.)L1/2(Choorit,W.,Patthanamanee,W.,Manurakchinakorn,S.,2
008,“Use of response surface method for the determination of demineralization efﬁciency in fermented shrimp shells,”Biores.Technol.99,6168-6173)。此外，已经使用四种LAB的混合物(Bhaskar 2007)并且有报道使用乳酸杆菌属与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)FS-3(Jung 2007)或肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)(Shirai 2001)的组合。然而，由于商业化接种剂的性能差，这些发酵方法的工业化还没有成功。

[0008] 虾副产品的乳酸发酵产生蛋白质水解产物、几丁质、矿物质和脂类。几丁质和其脱乙酰化衍生物在农业、生物医学、食品和造纸业中具有许多应用，而液体水解产物是可用于人或动物消费的必需氨基酸的优良的来源。脂类的糊液含有甾醇、维生素A和E和类胡萝卜素色素如虾青素，它们可用于鲑鱼饲料或用作食品工业的天然着色。

[0009] 几丁质是特别是在甲壳动物外骨骼、昆虫外皮和真菌细胞壁中发现的一种天然多糖。因为几丁质是最丰富的生物聚合物之一，所以对其生物医学、生物技术学和工业应用给予了大量关注。壳聚糖是由几丁质(β-1-4)-N-乙酰基-D-葡糖胺的脱乙酰化产生的聚-(β-1-4)-N-乙酰基-D-葡糖胺化合物。葡糖胺是由壳聚糖的解聚获得的氨基单糖。它参与粘多糖(一种主要种类的胞外复合多糖)的组成。硫酸葡糖胺、盐酸葡糖胺和N-乙酰基-葡糖胺通常单独使用或作为混合物的一部分使用。

[0010] 一般来讲，液体水解产物具有高含量的必需氨基酸，指示证明其用作动物和水产养殖营养物或用作微生物生长培养基的氮源的高营养价值。此外，这些水解产物是游离氨基酸的来源并且可作为生物刺激素用于植物中的营养。

[0011] 虾青素(3,3′-二羟基-β,β-胡萝卜素-4,4′-二酮)，一种从β-胡萝卜素氧化的酮基类胡萝卜素，在多种海洋和水生生物中天然存在。由于虾青素吸引人的粉红色、作为维生素A前体的生物功能和抗氧化活性，其可用作食品和药品中的着色剂。在虾青素的结构中，在C3和C3′处发现两个相同的不对称碳原子。然而，反式虾青素是在甲壳动物物种中数量上最普遍的类胡萝卜素。

[0012] 公开来自乳酸发酵的这些和其它产品的参考文献包括：Sanchez-Machado等，“Quantification of organic acids in fermented shrimp waste by HPLC”Food Technology and Biotechnology, 第 46 卷 ,456(2008)；Sanchez-Machado 等，“High-performance liquid chromatography with fluorescence detectionfor quantitation of tryptophan and tyrosine in a shrimp waste protein
concentrate”,Journal of Chromatography B, 第863卷,88(2008)；Lopez-Cervantes等，“Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HPLC”Journal of Chromatographic Science,第45卷,1(2007)；Lopez-Cervantes等，“Quantiﬁcation of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC”Biomedical Chromatography,第20卷,981(2006)；Lopez-Cervantes等，“High-performance liquid chromatography method for the simultaneous quantiﬁcation of retinol,alpha-tocopherol,and cholesterol in shrimp waste hydrolysate”Journal of Chromatography A,第1105卷,1-2(2006)；
Lopez-Cervantes等，“Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography”,Journal of Chromatography A,第1105卷,1(2006)。

[0013] 发明概述

[0014] 公开了微生物组合物和生物降解方法。

[0015] 一种微生物组合物包含(a)一种或多种乳酸菌(LAB)和(b)选自由芽孢杆菌属(Bacillus)、固氮菌属(Azotobacter)、木霉属(Trichoderma)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、微球菌属(Micrococcus)、硝化杆菌属(Nitrobacter)和变形杆菌属(Proteus)组成属的组的一种或多种或两种或更多种微生物。在优选实施方案中，所述芽孢杆菌属、固氮菌属、木霉属、根瘤菌属、芽孢梭菌属、假单胞菌属、链霉菌属、微球菌属、硝化杆菌属和变形杆菌属的至少一种是产生几丁质酶(例如内切几丁质酶和/或外切几丁质酶)的几丁质分解株。在一些微生物组合物中，所述LAB选自由乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Streptococcus)组成的属。当LAB是乳酸杆菌属时，优选LAB是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和/或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，更优选嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)和干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)。

[0016] 在该组合物中的芽孢杆菌属优选地选自由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)组成的组，更优选枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)和苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株( BT)。

[0017] 在该组合物中的固氮菌属优选棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，更优选棕色固氮菌(Bioderpac,2008)。

[0018] 在该组合物中的木霉属优选哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)，更优选哈茨木霉菌(TRICHOSIL)。

[0019] 在该组合物中的根瘤菌属优选大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)，更优选大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)。

[0020] 在该组合物中的芽孢梭菌属优选巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianu)，更优选巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)。

[0021] 在该组合物中的假单胞菌属优选荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，更优选荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)。

[0022] 另一种微生物组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种或两种或更多种微生物：枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株( BT)、链霉菌属
(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝化菌属(Bioderpac,2008)和变形杆菌属(Bioderpac,2008)。

[0023] 微生物组合物的另一个实施方案包含嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)和/或干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)。

[0024] 一种特别优选的微生物组合物包含枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌
(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株、链霉菌属(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝化杆菌属(Bioderpac,2008)和变形杆菌属(Bioderpac,2008)。

[0025] 一种优选的微生物组合物是HQE。HQE于2010年4月27日保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)并且授予专利保藏名称PTA-10861。

[0026] 还公开了选自由以下组成的组的分离的微生物：枯草芽孢杆菌(BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株( BT)、链霉菌属(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝
化杆菌属(Bioderpac,2008)和变形杆菌属(Bioderpac,2008)。

[0027] 所述生物降解方法包括将海洋动物或海洋动物副产品与任何上述微生物组合物混合以形成混合物；使所述混合物发酵；并且将所述混合物分离成固体、水溶液和脂类组分。不同于现有技术的生物降解方法，公开生物降解方法产生可在水溶液组分中发现的壳聚糖和葡糖胺。海洋动物优选海洋节肢动物，如虾、龙虾、蟹或磷虾。在一些实施方案中，海洋动物是鱼或鱼副产品如鱼皮、鱼肉或鱼器官。

[0028] 附图简述

[0029] 图1示意性地展示了用于虾副产品的优选降解方法。

[0030] 图2描绘了在虾副产品的乳酸发酵期间的pH和总可滴定酸度。

[0031] 发明详述

[0032] 本文中使用的术语“海洋动物”是指生活在海洋、大海或淡水中的任何动物。海洋动物包括鱼和海洋节肢动物。

[0033] 本文中使用的术语“海洋节肢动物”是指生活在海洋、大海或淡水中的具有外骨骼的无脊椎海洋动物。一般来讲，海洋节肢动物具有分节的躯体和连接的附肢。海洋节肢动物是甲壳动物亚门的成员。优选甲壳动物的纲包括鳃足亚纲(例如咸水虾、枝角类和鲎虫属(Triops))、头虾纲(例如马蹄虾)、颚足纲(例如藤壶和桡足类(浮游动物))、介形亚纲(例如介形类(ostracods))和软甲亚纲(例如蟹、龙虾、虾、磷虾等)。

[0034] 本文中使用的术语“副产品”是指海洋动物的任何部分。在一些实施方案中，副产品通过海洋动物的商业加工产生。例如，在虾产业中，头胸部和外骨骼是虾副产品。在蟹和龙虾加工工业中外骨骼(壳)是副产品。

[0035] 在一些实施方案中，在生物降解方法中可以使用完整的节肢动物。例如，许多磷虾成年为约1-2厘米(0.4-0.8英寸)长，而一些物种生长到大约6-15厘米(2.4-5.9英寸)。磷虾油含有至少三种组分：(1)类似鱼油中的那些的ω-3脂肪酸，(2)与磷脂缀合的ω-3脂肪酸和(3)抗氧化剂虾青素。此外，外骨骼含有氟化物。因此，这些组分可以在生物降解方法中分离，油组分在脂类组分中被分离而氟化物在液体组分中被分离。

[0036] 本文中使用的术语“微生物组合物”是指含有或物理上承载一种或多种(优选两种或更多种)微生物的液体、固体或凝胶状培养基。微生物组合物包括但不限于含有一种或多种微生物的发酵液和通常用于开始发酵液的接种物并且所述接种物含有比存在于发酵液中的更高浓度的微生物。含有物种/菌株的微生物组合物有时称为“Bioderpac微生物组合物”，它是指含有一种或多种所述微生物或一种或多种微生物与其它微生物的组合的组合物。

[0037] 本文中使用的术语“分离的微生物”是指含有或物理上承载一种微生物的液体、固体或凝胶状培养基。

[0038] 公开的微生物组合物或分离的微生物可以与其它微生物组合以形成可用于不同于本文中具体公开的方法的新的微生物组合物。公开的微生物的选择将取决于其生物学性质(例如蛋白质或碳水化合物或几丁质降解酶的产生)、所选择的其它微生物和所述组合物将使用的方法。这些组分和方法的选择在本文中公开之后对本领域技术人员而言将是显而易见的。

[0039] 一种微生物组合物包含(a)一种或多种乳酸菌(LAB)和(b)选自由芽孢杆菌属、固氮菌属、木霉属、根瘤菌属、芽孢梭菌属、假单胞菌属、链霉菌属、微球菌属、硝化杆菌属和变形杆菌属组成的属的组的一种或多种或两种或更多种微生物。在优选实施方案中，所述芽孢杆菌属、固氮菌属、木霉属、根瘤菌属、芽孢梭菌属、假单胞菌属、链霉菌属、微球菌属、硝化杆菌属和变形杆菌属的至少一种或多种、两种或更多种或三种或更多种是产生几丁质酶(例如内切几丁质酶和/或外切几丁质酶)的几丁质分解株。在一些微生物组合物中，所述LAB选自由乳酸杆菌属、片球菌属、乳球菌属和链球菌属组成的属。当LAB是乳酸杆菌属时，优选LAB是嗜酸乳杆菌和/或干酪乳杆菌，更优选嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)和干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)。

[0040] 在该组合物中的芽孢杆菌属优选选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌(BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)和苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株( BT)。

[0041] 在该组合物中的固氮菌属优选棕色固氮菌，更优选棕色固氮菌(Bioderpac,2008)。

[0042] 在该组合物中的木霉属优选哈茨木霉菌，更优选哈茨木霉菌(TRICHOSIL)。

[0043] 在该组合物中的根瘤菌属优选大豆根瘤菌，更优选大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)。

[0044] 在该组合物中的芽孢梭菌属优选巴氏芽孢梭菌，更优选巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)。

[0045] 在该组合物中的假单胞菌属优选荧光假单胞菌，更优选荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)。

[0046] 另一种微生物组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种或两种或更多种微生物：枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株( BT)、链霉菌属
(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝化杆菌属(Bioderpac,2008)和变形杆菌属(Bioderpac,2008)。

[0047] 微生物组合物的另一个实施方案包含嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)和/或干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)。

[0048] 一种特别优选的微生物组合物包含枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌
(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌HD-1株和HD-73株( BT)、链霉菌属(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝化杆菌属
(Bioderpac,2008)和变形杆菌属(Bioderpac,2008)。

[0049] 用于生物降解方法的优选微生物组合物是HQE。HQE于2010年4月27日保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC)并且授予专利保藏名称PTA-10861。HQE是由来源于肥沃土壤的微生物和来自商业来源的微生物组成的微生物组。构成商业来源的微生物包括枯草芽孢杆菌( BS)、苏云金芽孢杆菌ND-1株和HD-73株( BT)和哈茨木霉菌，每种微生物均可从Biotecnologia Agroindustrial S.A.DE C.V.,Morelia,Michoacan,Mexico Microorganisms获得，根据菌株或物种命名为“Bioderpac 2008”，并且菌株可来源于HQE。然而，还可以使用HQE中的微生物亚型。枯草芽孢杆菌( BS)、苏云金芽孢杆菌( BT)和哈茨木霉菌(TRICHOSIL)微
生物产生在生物降解的开始时特别重要的几丁质分解酶。几丁质分解酶有助于降解含有可对进一步消化构成阻碍的固体的几丁质。这些生物体还产生促进蛋白质、脂类和碳水化合物分解的蛋白酶、脂肪酶和其它酶。

[0050] 本文中使用的术语“HYTb”是指从生物降解方法中获得的水溶液组分。HYTb含有通常含有氨基酸(约3wt%至12wt%，通常约12wt%)、壳聚糖(约1.2wt%)、葡糖胺(约1wt%)和痕量元素(约6wt%)(包括钙、镁、锌、铜、铁和锰)。壳聚糖的量可在约0.5wt%至1.5wt%，更优选在约1.0wt%至1.5wt%的范围内。葡糖胺的量可在约0.5wt%至1.5wt%，更优选在约1.0wt%至1.5wt%的范围内。壳聚糖和葡糖胺的总量是约2.0至2.5wt%。HYTb还含有酶(如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶)、乳酸、多肽和其它碳水化合物。HYTb的比重通常是约1.050-1.054。HYTb中某些氨基酸的平均氨基酸含量在表1中列出。

[0051] 表1

[0052] 干燥粉末水解产物氨基酸分布

[0053] (mg/g干重)

[0054]

[0055]

[0056] HYTb通常通过由生物降解产物形成的发酵产品离心而产生。随着生物降解方法进行，用于生物降解方法的微生物的营养物(例如HQE)耗尽并且由于在发酵期间产生酸而使pH下降。该导致发酵产品中的微生物死亡或休眠。取决于发酵产品离心的g力和次数，这些微生物可以在HYTb中找到。因此，HYTb可以包括以上鉴定的组分(例如壳聚糖和葡糖胺)的任一种或多种与当发酵停止时发酵方法的微生物组分的所有或一部分的组合。或者，离心可以进行到大体上所有微生物组分从HYTb中耗尽的点。在这些情况下，微生物组分可以被离心到HYTc组分中。或者，HYTc可以通过低g离心与HYTb分离。随后HYTb可以被离心形成微生物颗粒和无微生物HYTb水溶液。

[0057] 本文中使用的术语“HYTc”是指从生物降解方法中获得的固体组分。HYTc的主要组分是几丁质。它通常具有约2300道尔顿的平均分子量并且构成组合物约64wt%。约6%的HYTc含有矿物质(包括钙、镁、锌、铜、铁和锰)、约24wt%蛋白质和6%水。它的比重为3
约272Kg/m。HYTc中的几丁质通常具有来自与其结合的发酵产品的微生物。几丁质分解微生物具有与固体几丁质结合的习性。这基于几丁质分解微生物对几丁质底物的亲和力。
因此，除非采取方法除去，否则HYTc还可以含有几丁质分解微生物。就HQE而言，这些几丁质分解微生物包括本文中讨论的一种或多种产生几丁质酶和/或外切几丁质酶的微生物。
这些微生物有机体包括但不限于枯草芽孢杆菌( BS)、苏云金芽孢杆菌HD-1株和
HD-73株( BT)和哈茨木霉菌(TRICHOSIL)。几丁质分解微生物可以通过灭菌、巴
氏灭菌法或用抗微生物化合物如肥皂或氯冲洗几丁质来从固体几丁质除去。由于残留发酵产品的存在或HYTb的离心，HYTc还可以含有存在于生物降解方法末期的其它微生物。

[0058] HQE组

[0059] 以下被认为是生物降解方法中涉及的在HQE中的微生物和其已知的性质。在一些情况下菌株被标识为“Bioderpac,2008”。当物种未知时，这些物种和菌株被标识为“Bioderpac,2008”。

[0060] HQE于2010年4月27日保藏于ATCC并且授予专利保藏名称PTA-10861。

[0061] 枯草芽孢杆菌( BS)是嗜温性的革兰氏阳性细菌并且在25至35℃的最佳温度生长。它是需氧的且可以在厌氧条件中生长，并且利用多种碳源。它含有两种硝酸盐还原酶，其中之一用于氮素同化。它能够分泌淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、几丁质酶、xilanase和脂肪酶。

[0062] 苏云金芽孢杆菌(HD-1株和HD-73株( BT))是革兰氏阳性厌氧兼性细菌，是周生鞭毛的形式。菌株HD-1和HD-73在芽孢期间合成具有各种几何形状的蛋白和杀虫活性的晶体。当在含有几丁质的培养基中时，菌株HD-1和HD-73分泌外切几丁质酶并且可以在甲壳低聚糖的生产期间用于甲壳动物残渣的降解。

[0063] 蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)是需氧兼性细菌，为革兰氏阳性并且形成芽孢。它是嗜温性的并且在20至40℃的最佳温度生长。它产生抗生素双效菌素(zwittermicin A)和kanosamin。

[0064] 地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)是革兰氏阳性、能动型、形成芽孢和兼性厌氧的细菌。它产生杆菌肽、α淀粉酶、内酰胺酶、蛋白酶和碱性磷酸酶。这是植物或植物材料相关的非致病微生物。

[0065] 巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)是一种革兰氏阳性需氧细菌。它被认为是一种腐生菌。它产生葡萄糖脱氢酶、青霉素酰胺酶(penicillin amydase)、β-酰胺酶和中性蛋白酶。

[0066] 嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)是八种乳酸菌物种的成员之一。它是革兰氏阳性、非形成芽孢菌，并且在发酵期间产生乳酸，利用乳糖作为主要碳源产生能量。它在有氧或无氧下在酸性培养基(pH 4-5)中生长。它产生名称为lactacin B的细菌素、有机酸、二乙酰和过氧化氢。

[0067] 干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)是嗜温性、兼性厌氧菌，为革兰氏阳性并且不形成芽孢。它具有适应低温的能力。它生长的最佳pH是5.5。它发酵半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露糖醇和乙酰葡糖胺。该物种可以在广泛的pH和温度下生长。它产生淀粉酶。它通过产生(1)有机酸如醋酸、丙酸或乳酸或(2)过氧化氢使pH降低而抑制致病细菌如幽门螺杆菌(H.pylori)的生长。该微生物分泌细菌素。

[0068] 荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)是具有多鞭毛的细菌，受迫需氧(forced aerobic)并且其生长的最适温度为25至35℃。它产生热稳定的脂肪酶和蛋白酶。它是大量土壤真菌菌株的拮抗剂。它产生次级代谢产物如抗生素、铁螯合物和氰化物。它在具有不同葡萄糖浓度的培养基中产生内切几丁质酶和纤维素酶。

[0069] 哈茨木霉菌(TRICHOSIL)是一种腐生真菌。它显示抗菌作用和生物学竞争并且因此具有生物控制性质。它产生降解细胞壁或这些活性的组合的酶。当它与一些致病真菌如镰刀菌(Fusarium)相互作用时产生葡聚糖酶、几丁质酶、脂肪酶和胞外蛋白酶。

[0070] 大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)是一种固氮细菌。它合成参与氢的再循环以避免其在固氮期间损失的氢化酶系统。

[0071] 棕色固氮菌(Bioderpac,2008)是一种需氧细菌。它产生固氮酶并且能够固氮。

[0072] 巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)是革兰氏阳性细菌，专性厌氧。它产生在蛋白铁的还原中作为直接电子供体起作用的菲咯嗪(ferroxine，一种电子传递蛋白)。

[0073] 普通变形杆菌(Bioderpac,2008)是一种革兰氏阳性细菌，兼性厌氧，在接近23℃的温度生长。它通过它产生的酶将蛋白质经蛋白水解酶降解成游离氨基酸。

[0074] 链霉菌(Bioderpac,2008)是革兰氏阳性土壤细菌。它产生代谢多种营养物的多种酶。它可以在显著变化的温度、湿度和营养源中生存。由这些细菌产生的胞外酶在4.5至6.5的pH和60℃下利用几丁质和壳聚糖作为底物。这些是在生物降解方法中的乳酸发酵开始和最终阶段产生的条件。

[0075] 硝化菌(Bioderpac,2008)是革兰氏阴性细菌，需氧，其将亚硝酸盐转化成硝酸盐。它在6至9的pH和10至34℃之间的温度下生长。所述细菌将有机聚合物如几丁质降解成由其它有机体如荧光假单胞菌()和大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)使用的化合物。

[0076] 微球菌(Bioderpac,2008)是球形革兰氏阳性细菌。该微生物与能够降解胶体几丁质衍生物的链霉菌()结合。

[0077] HQE中的微生物的组和酶活性

[0078] 海洋动物或副产品的组分的生物降解需要水解酶如蛋白酶、脂肪酶和几丁质酶。公开的微生物组合物中含有一种或多种这些酶。

[0079] HQE中的微生物的主要组是嗜酸乳杆菌(Biodepac 2008)、枯草芽孢杆菌( BS)、荧光假单胞菌(Biodepac 2008)、地衣芽孢杆菌(Biodepac 2008)和哈茨
木霉菌(TRICHOSIL)。这些微生物能够生物降解节肢动物或节肢动物副产品。当与来自HQE的其它微生物组合时，该主要组的一种或多种成员还具有协同作用。

[0080] 微生物的第一组包括由于产生有机酸和过氧化氢而引起pH降低并且稳定发酵的微生物。该组包括嗜酸乳杆菌(Biodepac 2008)和干酪乳杆菌(Biodepac 2008)。它们的活性在发酵开始和在发酵最后阶段期间对于产生水解酶的最佳pH是重要的。它们的活性还创造防止非期望的微生物生长的培养环境并且有利于几丁质残渣的脱矿质。嗜酸乳杆菌(Biodepac 2008)是主要组的成员。

[0081] 微生物的第二组包括产生胞外酶的微生物。该第二组包括枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Biodepac 2008)、哈茨木霉菌(Biodepac 2008)、大豆根瘤菌(Biodepac 2008)和棕色固氮菌(Biodepac2008)。在节肢动物或节肢动物副产品中的几丁质链与蛋白质分子相连。这些聚合物的分离需要从由这些微生物产生的几丁质分解酶和蛋白水解酶获得的水解作用。两种类型的酶均破坏在聚合物内部部分的链以产生不同大小的低聚物。当获得适当的pH条件时，来自这些酶的作用在发酵方法的中间和最终阶段中以连续的方式发生。在该组的微生物和它们产生的环境条件促进与这些残渣附着的色素和脂类组分的释放。枯草芽孢杆菌( BS)和哈茨木霉菌(Biodepac 2008)是主要组的
成员。

[0082] 微生物的第三组包括微生物地衣芽孢杆菌(Biodepac 2008)、荧光假单胞菌(Biodepac 2008)、链霉菌属(Sptreptomyces)(Biodepac 2008)和芽孢梭菌属(Biodepac2008)。这些微生物水解低聚物(甲壳低聚糖和肽)产生壳二糖、葡糖胺和游离氨基酸。地衣芽孢杆菌(Biodepac 2008)和荧光假单胞菌(Biodepac 2008)是主要组的成员。

[0083] 在优选实施方案中，所述第一、第二和第三组微生物中的一种或两种可以组合。或者，所有第一、第二和第三组可以组合。

[0084] 微生物的第四组包括苏云金芽孢杆菌(HD-1株和/或HD-73株)、链霉菌属(Bioderpac,2008)、微球菌属(Bioderpac,2008)、硝化杆菌属(Bioderpac,2008)和普通变形杆菌(Bioderpac,2008)。微生物的第四组可以与以下组合：(1)微生物主要组(2)微生物的任何第一、第二和第三组(3)微生物的第一、第二和第三组的一种或两种的组合或(4)所有第一、第二和第三组的组合。该第四组的添加产生增强生物降解方法的协同效应。

[0085] 每个这些组(包括主要组)可单独使用并且可以与现有技术的微生物组合物组合以增强其性能。在这方面，第四组是特别优选的。

[0086] 表2列出一些上述组合物。第1列是被认为在生物降解方法中有活性的在HQE中的已知微生物的列表。第2列列出来自第1列的微生物而没有第四组微生物中的微生物。第3列展示主要微生物的组合而第4、5和6列标识来自第一、第二和第三组的微生物的组合。第4列是组1和2的组合；第5列是组1和3的组合，且第6列是组2和3的组合。其它有用的组合在第7-10列中列出。

[0087] 表2培养组合物

[0088]微生物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[0089]微生物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
枯草芽孢杆菌 X X X X X X X X
蜡样芽孢杆菌 X X X X X X
巨大芽孢杆菌 X X
棕色固氮菌 X X X X X X
嗜酸乳杆菌 X X X X X X X X
干酪乳杆菌 X X X X X X
哈茨木霉菌 X X X X X X X X
大豆根瘤菌 X X X X X X
巴氏芽孢梭菌 X X X X X X
地衣芽孢杆菌 X X X X X X X X
荧光假单胞菌 X X X X X
苏云金芽孢杆菌 X X X X X X
链霉菌属 X X X X X X X
硝化杆菌属 X X X X X
微球菌属 X X X X X
普通变形杆菌 X X X X X

[0090] 由HQE中的微生物产生的酶提取物的活性是复杂的，但是允许降解节肢动物如甲壳动物的几丁质残渣。根据使用的有机体产生的环境HQE中的微生物以连续方式活化。

[0091] HQE中的微生物的鉴定和分离方法

[0092] 在试图表征或鉴定物种之前获得纯的分离物是重要的。虽然少量细菌形态独特并且不分离就可鉴定，但是几乎所有的细菌都需要分离。下面描述了分离来自HQE中含有的以下物种的混合物的纯培养物：枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌
(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(HD-1株和HD-73株)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、普通变形杆菌
(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌( BT)、链霉菌(Bioderpac,2008)、硝化菌
(Bioderpac,2008)和微球菌(Bioderpac,2008)。

[0093] 前几个步骤包括：

[0094] (1)稀释划线和差异性孵育

[0095] (2)鉴定和分离菌落类型

[0096] (3)缩小收集物，和

[0097] (4)确定特定菌落的初始特性和分离物的保存。

[0098] 稀释划线和差异性孵育

[0099] 一旦从HQE样品去除试样，应该将其立即培养。在制备平板之前任何液体样品都必须彻底地涡旋，因为如果非能动细菌与颗粒物质结合时它们可能沉积到样品的底部。遗憾的是，细菌不均匀地分离，来自相同混合物的重复样品可能含有不同量的细菌。彻底旋涡和随后稀释划线的目的是为了散开独立的CFU(菌落形成单位)以便获得可以继代培养(sub-cultured)的离散菌落。

[0100] 除将单独解释的硝化杆菌外，提到的所有微生物均可独立地进行以下鉴定和分离操作。

[0101] 通过无菌方法获得充满来自HQE的彻底涡旋的样品的环并且施加到琼脂表面的一个边缘。通过来回移动，表面的约四分之一应该被划线，同时向平板的中间拖动环。划线不应破坏琼脂的表面，并且应该产生划线(20条或更多条)。为了稀释或散开样品，必须灼烧环以破坏所有有活力的材料，接触琼脂的干净部分以使其冷却，随后垂直于初始接种物划线，与平板的那部分叠加一次或两次。第二部分应该覆盖剩余无菌表面的二分之一。这散开小部分初始接种物，可能将其稀释到在孵育之后足以引起独立菌落的出现。随后垂直于第二部分划线第三部分，灼烧并冷却环并且如前所述与上述部分叠加，以进一步稀释接种物。

[0102] 在来自各批产品的分离物的制备中，下一个阶段是制备重复的划线平板并且以翻转位置在不同条件下孵育它们，以最大可能地区别以下类型的菌落：枯草芽孢杆菌( BS)、蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、嗜酸乳杆菌、(Bioderpac,2008)、干酪乳杆菌
(Bioderpac,2008)、荧光假单胞菌(Bioderpac,2008)、哈茨木霉菌(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)、棕色固氮菌(Bioderpac,2008)、巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)、普通变形杆菌(Bioderpac,2008)、苏云金芽孢杆菌(HD-1株和HD-73株， BT)、链
霉菌(Bioderpac,2008)和微球菌(Bioderpac,2008)。孵育温度不同(通常是25、30和
37℃)并且在需氧和厌氧两种条件下孵育。该方法增加分离个别物种的机会，因为不同物种/细菌具有不同生长最佳温度范围和不同的氧需求。需氧有机体应该在孵育一天之后检查，因为据检测一些我们的特征化细菌生长非常快并且排挤其它细菌。

[0103] 鉴定和分离菌落类型的方法

[0104] 具有透射照明器(trans-illuminator)的解剖显微镜可以用于区分个别的菌落。在检查期间平板应该保持翻转。菌落可通过与先前提到的微生物有关的尺寸、形状、不透明性和质地来分辨。检查时，最好通过在平板底部靠近菌落处留下小的标记来标明抽样的菌落。翻转平板盖子来收集菌落材料将会是必要的。应该提醒的是，只有获得接种物的那一次才能小心地插入无菌环。

[0105] 对于染色、表面特征和剖面(升高、平坦等)，有必要用入射光(通过透明的盖子)检查菌落。应该把盖子留在上面，否则平板会被污染。在翻转平板之前，移去并翻转盖子以除去水分。应该将旧的盖子替换成新的盖子便于观察。

[0106] 如果两种菌落叠加并且仍可区分，那么至少存在两种菌落。菌落通常具有相当简单、均匀的质地。如果有区域类似马赛克(mosaic)，可能有至少两种物种。每个独特类型的菌落均应该通过获取针接种物取样并且在新鲜的平板上进行三线稀释划线。应该注意只能对目标菌落取样。在初始平板孵育的温度下，在需氧条件下孵育每个新的划线平板。

[0107] 物种会显示最适温度，通过在最接近理想的温度下更快的生长和/或较大的菌落来表明。从厌氧孵育的平板取样的任何菌落均可能是兼性厌氧菌。

[0108] 缩小收集物

[0109] 很可能从不同划线平板中分离出相同物种和菌株的复本。许多不同物种和相同物种的不同菌株产生非常相似的菌落类型。为了缩小独特物种/菌株的分离物的数目，在相同平板上培养可疑的分离物复本。在三分之二的表面进行两个“小稀释”以得到每个培养物的单独的菌落，并且在剩余的三分之一的表面将它们混合。孵育之后，如果两个分离物在相同平板上生长和/或混合的接种物产生两个可区分的菌落类型，那么就鉴定出两个独特的分离物。

[0110] 菌落的初始特征和分离物的保存

[0111] 研究中的有机体的大部分特征均应该使用入射光确定，而非透射光。

[0112] 一旦获得分离物并且通过菌落检查和显微检查确定纯度，就应该接种琼脂斜面管并且在适当的温度孵育，并使松动盖子以允许气体交换。生长出现之后，应该描述培养物，将盖子塞紧，并将管子保持在室温作为试验用纯培养物的来源。

[0113] 除了粗略地描述性表征之外，应该将初期(<18h)培养物革兰染色，记录的结果包括细胞形状和尺寸，鞘或荚膜(如果明显)和芽孢或类似结构的任何证据。下一步是与氧气的关系，这将缩小可能的类型。之后，革兰染色结果、细胞类型以及与氧气的关系的特定组合决定了表征分离物的后续一系列步骤。

[0114] 产品中硝化菌群的检测和计数

[0115] 对纯培养物中亚硝酸盐氧化菌的代谢、存活和生长以及其在各种环境中的硝化活性已有若干研究，但是对于天然硝化杆菌属群体的研究较少。虽然亚硝酸盐至硝酸盐的生物学转化是众所周知的过程，但是由于检测和计数方法的缺乏，目前硝化杆菌属群体的研究和操作受到牵制。

[0116] 该失败部分是由于这些细菌的不适宜的生理特征，即缓慢生长、小的生物质和培养物对污染的敏感度。有一种计算土壤中的硝化杆菌属群体的方法，但是耗时并且有选择性。

[0117] 生长过程的详细描述

[0118] 蜡样芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、巨大芽孢杆菌(Bioderpac,2008)、枯草芽孢杆菌( BS)和地衣芽孢杆菌(Bioderpac,2008)

[0119] 培养基成分：净化水和平板培养基营养琼脂。

[0120] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是营养琼脂，(4)在37℃下孵育平板24-48小时，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0121] 荧光假单胞菌和普通变形杆菌

[0122] 培养基成分：净化水和平板培养基营养琼脂。

[0123] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是营养琼脂，(4)在37℃下孵育平板24-48小时，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0124] 嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌

[0125] 为了提供可以显示乳酸杆菌属和其它乳酸菌良好生长的方法，由Man、Rogosa和Sharpe开发了Agar M.R.S.。所述培养基允许所有乳酸杆菌属物种的充分发育。蛋白胨和葡萄糖构成供细菌生长的氮源、碳源和其它必需元素。山梨醇单油酸酯、镁、锰和醋酸盐提供辅因子并且可以抑制一些微生物的发育。柠檬酸铵作为革兰氏阴性细菌生长的抑制剂起作用。参见表3。

[0126] 表3

[0127]

[0128] 培养基成分：净化水和平板培养基营养琼脂M.R.S基质。

[0129] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)在具有5-10%CO2的需氧培养室中孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是琼脂M.R.S.，(4)在33-37℃下孵育平板72小时或在30℃下孵育平板5天，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0130] 结果。菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0131] 菌落特征：通常是小的、灰白色、光滑或粗糙的。

[0132] 培养基特征：制备的培养基是黄色的。

[0133] 乳酸杆菌鉴定：

[0134] 表4

[0135]

[0136] 棕色固氮菌(Bioderpac,2008)

[0137] 培养基成分：净化水和平板培养基营养琼脂基质(Burk’s,Asbhy,Jensen′s)。

[0138] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)将该溶液在25℃下孵育48小时，(3)进行高达1-10范围内的连续稀释，(4)孵育具有1mL稀释范围的重复平板(具有营养琼脂基质)系列，所述平板培养基是营养琼脂，(5)在25℃下孵育平板48-72小时，(6)菌落形成单位应该是每1mL产品1,0000,000个。

[0139] 巴氏芽孢梭菌(Bioderpac,2008)

[0140] 培养基成分：磷酸盐缓冲水溶液和平板培养基标准方法琼脂基质(TYG)。

[0141] 操作：(1)在9.9mL磷酸盐缓冲水溶液中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行适当的连续稀释，(3)将按期望稀释的适当的小份涂布到培养皿中，(4)添加调合的标准方法琼脂并且在培养皿中混合，(5)将翻转的干燥平板放入厌氧培养室中，(6)在35-37℃下孵育平板48-72小时，(7)孵育期之后从厌氧培养室取出平板并且计算平板，记录使用的稀释和计算每个稀释菌落的总数，(8)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0142] 该芽孢梭菌属物种的鉴定使用菌落的典型的显微形态，其允许一些经常分离的芽孢梭菌属物种快速和基于推测的鉴定。此外，连同使用简单的生物化学试验如通过快速方法(p-二甲基(dimetil)-氨基-肉桂醛)对在琼脂蛋黄中lecitinase和脂肪酶的产生、凝胶和脲的水解和吲哚的产生的研究，建立用于鉴定的容易和廉价的方法，对于它们中的一些甚至是确定的。

[0143] 微球菌(Bioderpac,2008)

[0144] 培养基成分：净化水和平板培养基营养琼脂。

[0145] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是营养琼脂，(4)在37℃下孵育平板24小时，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0146] 如果发现革兰球菌，进行抗生素敏感试验。微球菌属对杆菌肽敏感并且对呋喃唑酮有抗性。

[0147] 大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)

[0148] 培养基成分：净化水和平板培养基ALM(琼脂酵母提取物甘露醇)。

[0149] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是ALM(琼脂酵母提取物甘露醇)，(4)在28℃下孵育平板96小时，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0150] 为了确认大豆根瘤菌(Bioderpac,2008)，分离的菌落用于无菌感染豆科以引起根瘤的形成。

[0151] 哈茨木霉菌(TRICHOSIL)

[0152] 培养基成分：净化水和麦芽提取物琼脂培养基(2%wt/vol)基质，补充有氯霉素、硫酸链霉素和制霉菌素。

[0153] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是麦芽提取物琼脂，(4)在25℃下孵育平板4天，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0154] 苏云金芽孢杆菌(HD-1株和HD-73株( BT))

[0155] 培养基成分：净化水和平板超级肉汤(Superbroth)培养基琼脂基质，补充有2g/升D-葡萄糖和50μg/ml红霉素。

[0156] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是超级肉汤琼脂，(4)在28℃下孵育平板10-14天，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0157] 链霉菌(Bioderpac,2008)

[0158] 培养基成分：净化水和平板放线菌分离琼脂培养基。

[0159] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是放线菌分离琼脂，(4)在28℃下孵育平板2-3天，(5)菌落形成单位应该是每1mL产品1,000,000个。

[0160] 硝化杆菌(Bioderpac,2008)

[0161] 培养基成分：净化水和平板培养基营养琼脂基质。

[0162] 操作：(1)在9.9mL净化水中放入0.1mL HQE液体样品，(2)进行高达1-10范围内的连续稀释，(3)孵育具有1mL稀释范围的重复平板系列，所述平板培养基是平板营养琼脂基质，(4)在30℃下孵育平板10-14天。

[0163] 生物降解方法

[0164] 在一个优选实施方案中，海洋节肢动物是甲壳动物并且优选的甲壳动物是虾。虾副产品包含虾头胸部和/或外骨骼。

[0165] 在生物降解方法中，优选发酵是兼性需氧发酵。还优选发酵在约30℃至40℃的温度进行。优选pH小于约6，更优选小于约5.5。然而，pH应该保持在约4.3以上。发酵进行约24-96小时。在一些实施方案中，发酵进行约24-48小时并且更优选24-36小时。为了实现大体上相同的消化量，即使不形成可检测的壳聚糖和葡糖胺，这些发酵时间比10至15天的典型的现有技术发酵时间进一步缩短。

[0166] 混合物的分离优选通过离心(例如约920g)。还可以使用重力分离，但不是优选的，由于实现分离需要的时间。

[0167] 混合物被分离成三种组分：固体、水溶液和脂类。固体组分包含几丁质并且命名为HYTc。水溶液组分包含蛋白质水解产物、氨基酸、壳聚糖和葡糖胺并且命名为HYTb。脂类组分包含甾醇、维生素A和E以及类胡萝卜素色素如虾青素。

[0168] 本文中鉴定的任何微生物组合物均可在生物降解方法中使用。在一些实施方案中，优选在生物降解方法中使用HQE。在其它实施方案中，优选将HYTb加入HQE或发酵肉汤。如上所述，HYTb含有氨基酸、壳聚糖、葡糖胺和痕量元素(包括钙、镁、锌、铜、铁和锰)。HYTb还含有酶(如乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶)、乳酸、多肽和其它碳水化合物。HYTb还可能含有来自先前的生物降解方法的休眠微生物。这些微生物可以复活并且与HQE组合，与本文中另外描述的单独使用HQE相比促进更强健的生物降解方法。

[0169] 更具体地讲，所述方法包括以下步骤：

[0170] a．在糖基溶液中活化微生物细胞以增强其生长和生物质形成。

[0171] b.碾磨虾副产品(头胸部和外骨骼)以获得均匀的浆状物。

[0172] c.将虾副产品浆状物与至少10%的活化接种物均匀混合。

[0173] d.使用柠檬酸溶液将混合物中的pH值调节至小于6.0以抑制微型有机体的生长并且促进构成接种物的微生物细胞的发育。

[0174] e.在不连续的搅拌系统中，保持pH小于5.0，在30至40℃范围内的温度下，使混合物发酵至少96小时。定期监测pH。如果pH升至5.0以上，添加一定量的柠檬酸缓冲液使pH保持在5.0以下。

[0175] f.离心发酵物以分离三种主要组分：几丁质、液体水解产物和有颜色的浆状物。

[0176] g.冲洗粗制的几丁质并且再收集冲洗水以回收精细固体或矿物质。

[0177] h.干燥几丁质并储存。

[0178] i.干燥并储存液体水解产物。

[0179] j.将有颜色的浆状物(脂类组分)储存在密闭容器供保藏。

[0180] 参考图1和以下详细描述可更透彻地理解所述方法和操作原理。

[0181] 微生物细胞的活化

[0182] 使用本文中公开的微生物组合物作为接种物。HQE接种物具有约2.5至3.0%(w/v)的微生物浓度。通过在甘蔗溶液中稀释至5%(3.75%的甘蔗最终浓度)来活化HQE，并且在37℃下孵育5天。优选添加HYTb(每升培养物10mL)以提供矿物质源和天然来源氨基酸。通过在540nm测量光密度来评价微生物的细胞生长。在约1.7的光密度下活化是完全的。活化之后的微生物浓度是约1.9至3.0%(w/v)。

[0183] 样品制备

[0184] 虾副产品样品从虾加工厂中获得。将稍微解冻和粉碎的残渣(一批1500g)与99克甘蔗(最终浓度6.6%wt%)和85.5mL活化的HQE5%(v/w)混合(细胞光密度=1.7)。随后使用2M柠檬酸将pH调节至5.5。

[0185] 发酵控制

[0186] 将混合物在36℃下不连续搅动下孵育96h。在发酵过程期间，使用电位计监测pH，并且用0.1N NaOH滴定直到获得8.5的pH来确定总的可滴定酸度(TTA，%)。TTA可表示为乳酸的百分数。

[0187] 分离条件

[0188] 由于虾青素的存在，发酵产物是具有浓橙黄色的粘性青贮料(silage)。将青贮料以1250rpm(930g)离心(5℃)15min以得到几丁质、液体水解产物和色素浆状物。人工分离上层(色素浆状物)。通过倾析分离液体水解产物，将构成粗制几丁质的沉积物用蒸馏水冲洗以分离精细固体。收集并干燥所得液体。在60℃下干燥粗制的几丁质、液体水解产物和精细固体。储存所有组分以使它们避光。

[0189] 以上方案如以下实施例中阐述使用HQE在三个发酵批次中一式两份地进行。

[0190] 实施例1

[0191] 通过测量pH和总可滴定酸度(TTA，%)控制发酵。

[0192] pH和TTA的平均初始值分别是7.31±0.10和0.53±0.09。如图2所示，通过添加2M柠檬酸pH最初降低到6.5。随后，由于蛋白质水解和氨的释放，在开始2h期间pH再次升高至7.11±0.08，随后，在12小时的发酵期间pH减少至28%(高达5.28±0.01)。在大约24小时的发酵时，最终pH是4.57±0.15。和pH的降低相似的是，TTA的平均值观察到类似的情形。如图2所示，在开始2小时期间TTA的平均值是1%，随后这些数值在24小时时逐渐地升高至3.33±0.23的平均值。

[0193] 实施例2

[0194] 发酵产品和化学组合物

[0195] 发酵过程之后，将青贮料离心以分离成三种主要产品(几丁质、液体水解产物和色素浆状物)。冲洗粗制的几丁质保留其它产品、精细固体。表5展示每种组分中的回收比例。按干重计，较大组分对应于液体水解产物(55%)，随后是精细固体(29%)、粗制的几丁质(10%)和色素浆状物(5%)。在发酵批次中，干重的平均值是32%(481.1±5.6g)。

[0196] 表6展示通过发酵获得的四种主要产品各自的化学表征。几丁质产品(几丁质)显示表现为灰分的部分脱矿质。还显示在液体水解产物中定量的高蛋白含量(42.34%)。这便于色素浆状物(主要由总脂质组成，42.67%)的回收，并且在精细固体中产生有丰富的灰分(16.72%)的组分。

[0197] 表5从发酵分离的产品

[0198]

[0199] 表6发酵产品的化学组合物(干重)

[0200]

[0201] 实施例3

[0202] 干燥粉末水解产物中氨基酸的分布

[0203] 干燥水解产物的氨基酸含量根据Lopez-Cervantes等，“Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquidchromatography”,Journal of Chromatography A,第1105卷,1(2006)所描述测定。表
6展示干燥粉末水解产物的总氨基酸分布。必需氨基酸相对干燥粉末水解产物的比例是
52.5%。

[0204] 表7干燥粉末水解产物的氨基酸分布(mg/g干重)

[0205]

[0206] 实施例4

[0207] 粗制几丁质中葡糖胺的定量

[0208] 在几丁质中，葡糖胺的含量作为纯度的指标来定量。几丁质中葡糖胺的含量是516、619和640mg/g(干重)，这些数值对应于一式两份进行的三个发酵批次的结果。因此，在该研究中的葡糖胺的平均量是591mg/g几丁质干重。用于葡糖胺定量的方法由Lopez-Cervantes等“Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HPLC”Journal of Chromatographic Science,第45卷,1(2007)报道。

[0209] 实施例5

[0210] 色素浆状物中的虾青素含量和脂肪酸分布

[0211] 虾青素是从发酵的虾废弃物中获得的脂类浆状物中的主要色素。虾青素的含量在-1 -1干燥脂类浆状物的1.98至2.25mg g 范围内，平均是干燥脂类浆状物的2.11mg g 。虾青素根据Lopez-Cervantes等“Quantiﬁcation of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC”Biomedical Chromatography,第20卷,981(2006)的方法的形式测定。

[0212] 在色素浆状物中，鉴定出十四种脂肪酸。发现棕榈酸(C16:0)和油酸(C18:1n9)的量较高。

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节肢动物驱除剂-专利编号CN1117519C	2020-05-11	541
杀节肢动物涂料-专利编号CN1251260A	2020-05-13	745
节肢动物控制剂-专利编号CN1781374A	2020-05-11	1049
节肢动物驱除剂-专利编号CN1217633A	2020-05-14	813
杀节肢动物组合物-专利编号CN1028345C	2020-05-15	495
节肢动物控制剂-专利编号CN102763673A	2020-05-12	595
杀节肢动物涂料-专利编号CN1104839C	2020-05-12	230
节肢动物控制剂-专利编号CN102763673B	2020-05-13	458
防治节肢动物的组合物-专利编号CN1247089C	2020-05-16	1129
控制动物中的节肢动物-专利编号CN1402713A	2020-05-14	704

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