会员体验
专利管家（专利管理）
工作空间（专利管理）
风险监控（情报监控）
数据分析（专利分析）
侵权分析（诉讼无效）
联系我们
交流群
官方交流：
QQ群： 891211   
微信请扫码    >>>
现在联系顾问~
首页 / 专利库 / 生物化学 / 次级代谢产物 / 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途

土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途

阅读：707发布：2020-05-14

IPRDB可以提供土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了土曲霉SKL‑001新次级代谢产物LW‑4作为抗菌剂的用途。新次级代谢产物LW‑4制备步骤为：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂SAHA、帕立骨化醇、甘油三酯，发酵培养，用乙酸乙酯、80％的丙酮‑水分别萃取发酵液、菌丝体，发酵浓缩物经柱色谱、薄层色谱分离纯化，得新次级代谢产物LW‑4。有益效果为：本发明使用表观遗传修饰调控剂SAHA对土曲霉SKL‑001进行表观修饰，分离得到一种新的次级代谢产物LW‑4。本发明制得的土曲霉SKL‑001新次级代谢产物LW‑4，对大肠杆菌表现出较好的抑制活性，最小抑制浓度为15μg/mL，可发展为有潜力的制备抗革兰氏阴性菌药物制剂的用途。，下面是土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途专利的具体信息内容。

1.土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述新次级代谢产物LW-4作为有效成分，在制备抗菌剂中的用途，其中，新次级代谢产物LW-4为式I所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，化学结构式为：

2.根据权利要求1所述的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述新次级代谢产物LW-4的制备方法包括如下步骤：

1)菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂SAHA、帕立骨化醇、甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养；

2)次级代谢产物萃取：用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，组织破碎仪破碎，超声萃取30min，过滤得清液，乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；

3)分离纯化：最终发酵萃取物用硅胶柱色谱洗脱，洗脱组分3再用硅胶柱色谱洗脱，洗脱组分12用制备薄层色谱法分离，分离组分2用高效液相色谱分离纯化，即得土曲霉SKL-

001新次级代谢产物LW-4。

3.根据权利要求3所述的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述菌株发酵培养时间为30天。

4.根据权利要求3所述的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述表观遗传修饰调控剂SAHA的终浓度为5-25μM。

5.根据权利要求3所述的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述帕立骨化醇的添加量为0.05-0.1％，甘油三酯添加量为0.05-0.15％。

6.根据权利要求3所述的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-

1.5％。

7.根据权利要求3所述的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，其特征在于，所述硅胶柱色谱、硅胶柱色谱的洗脱剂依次为：石油醚-丙酮-甲醇、石油醚–乙酸乙酯；高效液相色谱的洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:30；制备薄层色谱法的展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1。

说明书全文

土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及药物领域，尤其是涉及一种可作为抗菌剂的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的制备方法及用途。

背景技术

[0002] 众所周知，微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等活性物质的重要来源。微生物由于可以大规模发酵培养，无原料限制，不会破坏环境等优点已成为天然产物研究领域的热点。近年来从陆地微生物中获得新化合物的概率大幅降低，而海洋来源微生物由于其生存环境特异，除可产生与陆地相似的代谢产物之外，有时还会产生一些结构特异的新化合物，显示了巨大的开发利用前景。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体，倍半萜，蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：
生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
[0003] 现有技术如授权公告号为CN 104710396B的中国发明专利，公开了一种柳珊湖来源真菌次级代谢产物衍生物及其作为抗菌剂的应用。其分离得到的化合物对甲氧西林耐药的金黄色葡球菌(MRSA)、万古霉素耐药的肠球菌(VRE)具有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌有一定的抑制作用，最小抑制浓度MIC均小于12.5μM，表明其可发展为有潜力的抗菌药物，但该柳珊湖来源真菌次级代谢产物衍生物对革兰氏阴性菌的抑制活性不明显。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4在抗菌剂中的用途，其新次级代谢产物LW-4是经表观遗传修饰调控剂SAHA修饰土曲霉SKL-001发酵，然后萃取纯化得到。
[0005] 本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
[0006] 新次级代谢产物LW-4作为有效成分，在制备抗菌剂中的用途，其中，新次级代谢产物LW-4为式I所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，化学结构式为：
[0007]
[0008] 所制新次级代谢产物LW-4的制备方法包括如下步骤：
[0009] 菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂SAHA、帕立骨化醇、甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养；
[0010] 次级代谢产物萃取：用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，组织破碎仪破碎，超声萃取30min，过滤得清液，乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
[0011] 分离纯化：最终发酵萃取物用硅胶柱色谱洗脱，洗脱组分3再用硅胶柱色谱洗脱，洗脱组分12用制备薄层色谱法分离，分离组分2用高效液相色谱分离纯化，即得土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4。
[0012] 作为优选，菌株发酵步骤中，发酵培养时间为30天。
[0013] 作为优选，菌株发酵步骤中，表观遗传修饰调控剂SAHA的终浓度为5-25μM。
[0014] 作为优选，菌株发酵步骤中，帕立骨化醇的添加量为0.05-0.1％，甘油三酯添加量为0.05-0.15％；帕立骨化醇、甘油三酯添加到真菌培养基中，可与表观遗传修饰调控剂SAHA协同作用，改变培养基内溶解氧环境，促进菌丝发酵，同时，促进SAHA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物的产量和多样性。
[0015] 作为优选，次级代谢产物萃取步骤中，2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-1.5％；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率。
[0016] 作为优选，分离纯化步骤中，两次硅胶柱色谱洗脱，所用的洗脱剂依次为：石油醚-丙酮-甲醇、石油醚-乙酸乙酯；高效液相色谱的洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:30；制备薄层色谱法的展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明由表观遗传修饰调控剂SAHA修饰制得一种新的化合物，土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4；本发明在培养基中添加帕立骨化醇、甘油三酯，与表观遗传修饰调控剂SAHA产生协同增益作用，促进土曲霉SKL-001产生多样化的次级代谢产物；本发明在菌丝体萃取过程中，加入2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，协同超声波的机械作用、空化作用，破坏细胞壁，加速胞内物质释放，提高发酵物萃取率；本发明制得的土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4及其立体异构体或药学上可接触的盐，具有长效抑菌抗炎作用，能够作为制备防治革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)的制剂的用途。

具体实施方式

[0018] 下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
[0019] 实施例1：
[0020] 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，所制新次级代谢产物LW-4为式I所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，化学结构式为：
[0021]
[0022] 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，所述新次级代谢产物LW-4的制备方法包括菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
[0023] 菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂SAHA，其终浓度为15μM，0.05％帕立骨化醇、0.1％甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天；帕立骨化醇、甘油三酯添加到真菌培养基中，可与表观遗传修饰调控剂SAHA协同作用，改变培养基内溶解氧环境，促进菌丝发酵，同时，促进SAHA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物的产量和多样性。
[0024] 次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率；
[0025] 分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇，得到4个组分；选取第三个组分，用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；选取第12个组分经制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1，分离得到4个组分，选取第二个组分，经高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:
30，得到化合物新次级代谢产物LW-4。
[0026] 实施例2：
[0027] 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，所制新次级代谢产物LW-4为式I所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，化学结构式为：
[0028]
[0029] 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，所制新次级代谢产物LW-4的制备方法包括菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
[0030] 菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂SAHA，其终浓度为10μM，0.08％帕立骨化醇、0.1％甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天；
[0031] 次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
[0032] 分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇，得到4个组分；选取第三个组分，用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；选取第12个组分经制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1，分离得到4个组分，选取第二个组分，经高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:
30，得到化合物新次级代谢产物LW-4。
[0033] 实施例3：
[0034] 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，所制新次级代谢产物LW-4为式I所示的化合物、其立体异构体或药学上可接触的盐，化学结构式为：
[0035]
[0036] 土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途，所述新次级代谢产物LW-4的制备方法包括菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
[0037] 菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂SAHA，其终浓度为10μM，0.1％帕立骨化醇、0.15％甘油三酯，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60L；帕立骨化醇、甘油三酯添加到真菌培养基中，可以增加培养基内溶解氧，降低界面张力和阻遏菌体对气泡的附着，促进菌丝发酵过程，并与表观遗传修饰调控剂SAHA协同作用，促进SAHA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物的产量和多样性；
[0038] 次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、3％2-甲基丙氨酸、1.5％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
[0039] 分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-丙酮-甲醇，得到4个组分；选取第三个组分，用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；选取第12个组分经制备薄层色谱法分离，展开剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为50:1，分离得到4个组分，选取第二个组分，经高效液相色谱分离纯化，洗脱剂为甲醇-水，体积比为70:
30，得到新次级代谢产物LW-4。
[0040] 对比例1：
[0041] 菌株发酵制备步骤中未添加帕立骨化醇、甘油三酯，其余部分和实施例2完全一致。
[0042] 对比例2：
[0043] 菌株发酵制备步骤中未添加表观遗传修饰调控剂SAHA，其余部分和实施例2完全一致。
[0044] 对比例3：
[0045] 次级代谢产物萃取步骤中未添加2-甲基丙氨酸、柠檬酸钙，其余和实施例2完全一致。
[0046] 实施例4：
[0047] 将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2和对比例3分别设为对照组1、对照组2和对照组3，对比制得的最终发酵萃取物和新次级代谢产物LW-4的重量，结果见表1。
[0048] 表1最终发酵萃取物和土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的重量
[0049]组别 最终发酵萃取物(g) 新次级代谢产物LW-4(mg)
试验组 18.1 11
对照组1 13.1 8
对照组2 10.5 0
对照组3 18.1 9.5
[0050] 由表1可知，试验组和对照组3的最终发酵萃取物重量高于对照组1、对照组2，说明帕立骨化醇、甘油三酯、表观遗传修饰调控剂SAHA的加入能够提高土曲霉SKL-001的发酵程度，使其产生更多的次级代谢产物；试验组的新次级代谢产物LW-4的重量高于对照组1、对照组2、对照组3，说明2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙的加入能够提高菌丝体的萃取率，对照组2的新次级代谢产物LW-4为0，说明表观遗传修饰调控剂SAHA的调控使土曲霉SKL-001产生新次级代谢产物LW-4。
[0051] 实施例5：
[0052] 以大肠杆菌、产气杆菌作为致病菌模型，环丙沙星作为细菌模型的阳性对照药，采用滤纸片二倍稀释法对所得化合物的抑菌活性进行初步评价。结果见表2。
[0053] 抑菌活性的检测方法(二倍稀释溶剂扩散法)：
[0054] 将发酵所得代谢产物粗提物和最终分离鉴定的化合物进行抑菌活性的筛选和测试，抑菌活性的筛选采用纸片扩散法，MIC的测试采用二倍稀释法。具体步骤如下：
[0055] 从-80℃冰箱中将指示菌复苏于液体肉汁培养基中37℃发酵24h，制备成种子液。配备好相应的平板固体培养基后，将种子液均匀涂布于平板培养基上备用。取各待测样品(粗浸膏的浓度为10mg/mL，化合物终浓度为0.1mg/mL)10μL滴加于灭菌后的滤纸片上(直径
5mm)，待样品晾干后轻轻贴附于涂布了指示菌的备用平板上，置于恒温培养箱中28℃恒温静置培养24h。培养结束后观察抑菌效果(即抑菌圈大小)。对于有活性的化合物需采用二倍稀释法继续测试其最小抑制浓度(MIC)，直至滤纸片刚好不被侵染时的样品浓度为MIC。
[0056] 表2土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4对耐药菌的抑制活性
[0057]
[0058] 测试结果表明：化合物LW-4对大肠杆菌表现出强的抑制活性，对产气杆菌表现出较强的抑制活性，抑制活性的MIC分别为5μg/mL、19μg/mL，故可用作制备抗菌剂。
[0059] 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
[0060] 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
相关专利内容
标题 发布/更新时间 阅读量
一种提高红曲菌次级代谢产物的方法-专利编号CN107190026A 2020-05-11 1139
一种微生物次级代谢产物盐酸巴马汀及其应用-专利编号CN104561179A 2020-05-15 914
黄曲霉OUCMDZ-2205次级代谢产物的用途-专利编号CN110156807A 2020-05-12 186
一种土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4-专利编号CN109293662A 2020-05-13 817
一种土曲霉新次级代谢产物LW-1的用途-专利编号CN109260206A 2020-05-14 1042
一种提高链霉菌次级代谢产物产量的方法-专利编号CN107805640A 2020-05-15 432
土曲霉SKL-001新次级代谢产物LW-4的用途-专利编号CN109125326A 2020-05-14 702
Aspergillus terreus次级代谢产物提取物的用途-专利编号CN109045020A 2020-05-12 714
改变大豆次级代谢产物含量的方法-专利编号CN109832274A 2020-05-11 544
一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法-专利编号CN110452940A 2020-05-13 870
高效检索全球专利

IPRDB是专利检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，专利查询、专利分析。

电话：13651749426

侵权分析

IPRDB的侵权分析产品是IPRDB结合多位一线专利维权律师和专利侵权分析师的智慧，开发出来的一款特色产品，也是市面上唯一一款帮助企业研发人员、科研工作者、专利律师、专利分析师快速定位侵权分析的产品，极大的减少了用户重复工作量，提升工作效率，降低无效或侵权分析的准入门槛。

立即试用

次级代谢产物热门专利
热门文章

IPRDB

最新中国发明专利 最新美国发明专利 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库

热门服务

会员版试用 API 数据接口 找代理 知嘟嘟专利交易 排行榜 大学排行榜 专利百科

关于我们

平台介绍 战略合作 网站地图

友情链接

知嘟嘟专利交易 国家知识产权局 中国商标网

联系方式


©2019-2023 上海吉码数字技术有限公司 版权所有，并保留所有权利 沪ICP备20016256号-6 沪公网安备31011702005475号