植物经常面临影响它们生存的环境胁迫因子的挑战。不利的生物 和非生物胁迫因子能够减少作物植物的生长和生产力。由于对生物和 非生物胁迫的耐受力对植物生产力(产量和产品质量)有直接影响， 赋予或增强胁迫耐受力的机制已被广泛研究，并且用于赋予环境胁迫 耐受力的各种方法在本领域已有描述。但是，由于大多数研究机制基 于生物或非生物胁迫间相互作用，而在自然界植物要应付和抵抗多重 胁迫因子。
与有利条件下的产量相比，环境胁迫因子据估计可引起作物产量 上高达70％的减值(Boyer，Science 218，443-448，1982)。因此， 作物对环境因子变化的稳定性是育种最有价值的性状之一。但是，传 统的育种被胁迫耐受力性状的复杂性、产量构成的低遗传变异和选择 技术的缺乏效率所阻碍。因此，在育种中，通过标记辅助选择及通过 有更高胁迫耐受力的遗传工程植物来跟踪编码胁迫耐受力构成的特异 性基因可能是有用的。
在作物植物的环境胁迫反应复杂性中，简单模型拟南芥的使用，提 供了一个用于精密遗传分析大多数植物共有的胁迫反应途径的机会。拟 南芥模型的相关性在使用拟南芥中鉴定出的基因在提高耐旱性、耐盐性 和耐冻性的最近的实例(Jaglo-Ottosen等，Science 280，104-106， 1998；Kasuga等，Nat.Biotechnol.17，287-291，1999)中是明显的。 这些基因是ERF/AP2家族的转录因子，在许多异种植物(heterologous plant)中，其调控赋予胁迫抗性的许多下游基因的表达。
世界范围内植物不得不应付的最严重的非生物胁迫之一是干旱胁 迫或脱水胁迫。世界上农业土地的十分之四位于干旱或半干旱区。除 此之外，生长于具有相对高降水量的区域的植物在生长季节也可能遭 受干旱的轮值。许多农业区，特别在发展中国家，具有一致的低降雨 量，并且依赖于灌溉来维持产量。在许多地区水缺乏，并且它的价值 无疑会随着全球变暖而增加，导致对在低的可利用水条件下能够维持 产量水平(或甚至具有更高产量)和产量质量的耐旱作物植物的更大 需求。据估计在灌溉农业中生产1kg棉花需要大约15000升水，1kg大 米需要4000升。增强或设计作物植物对干旱的短或长时间轮值的耐受 力和减少在灌溉农业中作物生长的水分需求显然是非常重要的目标。
虽然对耐旱性的育种(如标记辅助)是可行的，并且在一定范围 的作物物种(主要是谷类，如玉米、高地水稻、小麦、高粱、珍珠粟， 但也有其它物种如豇豆、木豆和绿豆)中正在被追求，但这极度困难 和繁琐，这是因为耐旱性或抗旱性是非常复杂的性状，该性状由许多 基因座和基因-环境相互作用所决定。因此正在寻找能赋予或提高耐 旱性的且可容易的转移到高产量作物变种和育成品系中单独的显性基 因。大部分水由叶子通过蒸腾作用失去，许多转基因方法集中在通过 改变叶子来减轻水分损失。例如WO00/73475描述了来源于玉米的C4 NADP+-苹果酸酶在烟草表皮细胞和保卫细胞中的表达，根据公开内容， 其通过调整气孔开度增加了植物的水分利用效率。其它方法包括，例 如渗透调节剂(osmo-protectants)如植物中糖(如海藻糖生物合成 酶)的表达，以便增加水分胁迫耐受力，参见如WO99/46370。还有 其它方法集中于改变植物的根系结构。
到目前为止另一种增强耐旱性的有前途的方法是CBF/DREB基因 (DREB是指脱水应答元件结合；DRE结合)的过量表达，其编码各种 AP2/ERF(乙烯应答因子)转录因子(WO98/09521)。在拟南芥中 CBF/DREB1蛋白的过量表达导致耐冻性的增加(也可称为冰冻导致的 脱水耐受力)(Jaglo-Ottosen等，Science 280，104-106，1998； Liu等，Plant Cell 10，1391-1406，1998；Kasuga等，Nat.Biotechnol. 17，287-291，1999；Gilmour等，Plant Physiol.124，1854-1865， 2000)，以及增强重组植物对要么是水缺乏引起的脱水，要么是暴露于 高盐度引起的脱水的耐受力(Liu等，1998，见前；Kasuga等，1999， 见前)。另一种CBF转录因子，CBF4，已经被描述为拟南芥中干旱适 应性的调节基因(Haake等2002，Plant Physiology 130，639-648)。
尽管可获得一些已经在许多植物物种中表现出增强的耐旱性的基 因，如十字花科和茄科，仍然有鉴定在作物植物中表达时具有赋予或 提高耐旱性的其它基因的需要。在一个实施方式中，本发明提供了一 种满足这种要求的新基因和相关机制。
生物胁迫如病原体(细菌、真菌、病毒)或害虫(昆虫、线虫)是最 为普遍的，许多机制通常保护植物免受大多数这些威胁。但是，在某些 情况下植物对特异的病原体或害虫表现出易感反应(susceptible reaction)，被认为是特异的病原体或害虫的宿主。宿主-病原体的相 互作用已经用基因对基因的概念很好的表征，其中来自宿主植物和病原 体/害虫的特异基因相互作用，要么表现为易感反应，要么表现为抗病 反应。尽管近年来这种相互作用的分子遗传学已经被很好的表征，这些 简单抗性基因的使用仍然被病原体系统的多变的突变所妨碍，这些突变 产生多样性以克服抗性基因。一般而言，抗性基因属于蛋白质的少数大 类，其包括富亮氨酸重复和额外的结构域。尽管这些基因和基因相互作 用对研究植物病原体相互作用很有趣，利用它们用于保护作物免受广泛 多样性的和一系列的病原体仍然还有一段距离(a ways away)。另一 种能够提供抗性的方法是将涉及保护植物的基因应用至不同系列病原 体，其所用机制不依赖于植物和病原体的识别。这将赋予更广泛的非种 族特异性抗性，这是因为它将赋予对更广泛系列病原体的抗性。
一般定义
术语“核酸序列”(或核酸分子)是指单链或双链形式的DNA或 RNA分子，特别是指编码本发明蛋白质或蛋白质片段的DNA。“分离核 酸序列”是指不再位于从其中分离的自然环境中的核酸序列，如在细 菌宿主细胞中或在植物的核基因组或质体基因组中的核酸序列。
术语“蛋白质”或“多肽”可交换的使用，是指由氨基酸链构成 的分子，而不论其特异性的作用模式、大小、三维结构或起源。这样 蛋白质的“片段”或“部分”仍然被称为“蛋白质”。“分离蛋白” 通常是指不再处于其自然环境的蛋白质，如在体外或在重组细菌或植 物宿主细胞。
术语“基因”是指包含区(转录区)的DNA序列，其在细胞中被 转录成RNA分子(如mRNA)，可操作的连接于合适的调控区(如启动 子)。这样基因可能包含几个可操作的连接序列，如启动子，包含如 涉及翻译起始的序列的5′前导序列，(蛋白质)编码区(cDNA或基因 组DNA)，以及包含如翻译终止位点的3′非翻译序列。
“嵌合基因”(或重组基因)是指在自然界物种中正常不会发现 的任何基因，特别是这样的基因，其核酸序列的一部分或更多部分在 自然界中以相互间不连接的形式存在。例如自然界中启动子不与转录 区的部分或全部或其它调控区连接。术语“嵌合基因”被理解为包括 表达构建体，其中启动子或转录调控序列可操作的连接于一个或多个 编码序列或反义序列(正义链的反向互补)或反向重复序列(正义或反 义，由此RNA转录物通过转录形成双链RNA)。
“基因表达”是指以下过程，可操作的连接于适当的调控区、特 别是启动子上的DNA区转录成RNA，该RNA是有生物活性的，如其可 翻译成生物活性蛋白质或肽(或活性肽片段)，或其自身具有活性(如 在转录后基因沉默或RNAi)。在某些具体实施方式中的活性蛋白是指 由于存在阻遏结构域而具有显性阴性(dominant-negative)功能的蛋 白质。编码序列优选正向并且编码所需的生物活性蛋白质或肽或活性 肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列优选以反义DNA或反向重复DNA 形式存在，包含靶基因的反向或正向和反向的短序列。“异位表达” 是指正常时不表达的基因在组织中的表达。
“转录调控序列”这里定义为能够调控可操作的连接于转录调控 序列的(编码)序列的转录速率的核酸序列。这样这里定义的转录调 控序列包含所有的转录起始(启动元件)、维持和调控转录所必需的 序列元件，包括如弱化子或增强子。虽然通常是指编码序列的上游(5′) 转录调控序列，该定义也包含编码序列下游(3′)发现的调控序列。
这里所用的术语“启动子”是指功能是控制一个或多个基因转录 的核酸片段，位于基因的转录起始位点的转录方向的上游，结构上通 过以下位点的存在来鉴定：DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录 起始位点和任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点，阻 遏子和活化子蛋白结合位点，以及本领域技术人员所知的、直接或间 接用于调控从启动子开始的转录的量的任何其它核苷酸序列。“组成 型”启动子是指在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的 启动子。“诱导型”启动子是指受生理(如外部施用某种化合物)或 发育调控的启动子。“组织特异性”启动子是指仅仅在特定类型的组 织或细胞中有活性的启动子。
这里所用的术语“可操作的连接”是指多核苷酸元件的功能关系 连接。当一个核酸被安置成与另一核酸序列有功能上的关系时，它被 “可操作的连接”。例如，启动子，或更确切的说转录调控序列，如 果它影响编码序列的转录，它就与编码序列“可操作的连接”。可操 作的连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，当连接两个蛋白编 码区为必需时，被连接的DNA序列是在阅读框内且是连续的，以便产 生“嵌合蛋白”。“嵌合蛋白”或“杂合蛋白”由各种蛋白“结构域” (或基序)组成的蛋白，其在自然界不能发现，但是可结合以形成功 能蛋白，这显示了结合结构域的功能性(如DNA结合或抑制导致显性 阴性功能)。嵌合蛋白也可以是自然界存在的两种或多种蛋白的融合 蛋白。这里所用的术语“结构域”是指蛋白的具有特定结构和功能的 任何部分和结构域，其可转移到另一种蛋白，以提供具有至少结构域 功能特性的新杂合蛋白。特异性结构域也可以用来鉴定属于相似转录 因子组的蛋白成员，如来源于其它植物物种的直向同源蛋白 (ortholog)。
术语“靶肽”是指以细胞内的细胞器或细胞外间隙(分泌信号肽) 的蛋白质为目标的氨基酸序列，细胞器官如质体，优选叶绿体、线粒 体。编码靶肽的核酸序列可以融合(在框架上)到编码蛋白的氨基末 端(N-末端)的核酸序列上。
“核酸构建体”或“载体”这里理解为由用重组DNA技术产生的 人造核酸分子，其可用来将外源DNA递送到宿主细胞中。如本领域公 知的或本文别处描述的，载体框架举例而言可以是双元载体或超双元 载体(superbinary vector)(参见如US5591616、US2002138879和 WO950722)，共整合载体或T-DNA载体，其中嵌合基因是整合的，或 如果存在适当的转录调控序列，仅仅所需的核酸序列(如编码序列、 反义序列或反向重复序列)整合到转录调控序列的下游。载体通常包 含进一步的基因元件，以便于在分子克隆中的使用，如筛选标记、多 克隆位点和其它(参见下文)。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化细胞”是指由至 少一种核酸分子引起的新的个体细胞(或微生物)，特别指包含编码 所需蛋白的嵌合基因，或转录时产生用来沉默靶基因/基因家族的反义 RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)的核酸序列的细胞，其中所述嵌合 基因或核酸序列被导入所述细胞。宿主细胞优选植物细胞或细菌细胞。 宿主细胞可以包含作为染色体外的(游离基因的)复制性分子的核酸 构建体，或优选包含整合在宿主细胞的细胞核或质体基因组上的嵌合 基因。
术语“筛选标记”是本领域普通技术人员熟知的术语，本文是指 表达时可用来筛选包含筛选标记的细胞的任何遗传实体。筛选标记基 因产物赋予了如抗生素抗性，或更优选的除草剂抗性或其它筛选性状 如表型性状(如色素沉着的变化)或营养需求。术语“报告子”主要 用来指可见标记，如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、荧光素酶、GUS或 其类似物。
术语基因或蛋白的“直向同源”这里是指在其它物种发现的同源 基因或蛋白，其具有和所述基因或蛋白相同的功能，但是(通常)从 携带有该基因的物种发生趋异时的时间点起序列发生趋异(即从同一 祖先通过物种形成进化的基因)。这样拟南芥基因的“直系同源”可 在其它植物物种上基于序列比较(如基于全序列或特异性结构域的序 列同源性百分比)或功能分析来鉴定。
术语“同源的”或“异源的”是指核酸或氨基酸序列和其宿主细 胞或器官的关系，特别在上下文的转基因生物中。这样同源序列是在 宿主物种中天然存在的(如用西红柿基因转化的西红柿植物)，而异 源序列不是在宿主细胞中天然存在的(如用源于马铃薯植物的序列转 化的西红柿植物)。根据上下文，术语“同源(homolog)”或“同源 的(homologous)”可替换性地指由相同祖先序列派生的序列(如它们 是直系同源)。
“严谨杂交条件”可用来鉴定基本上与给定的核苷酸序列等同的 核苷酸序列。严谨条件是序列依赖性的，并且在不同环境下会不同。 总的来说，严谨条件选定为比特异序列在限定的离子强度和pH下的热 力学熔点(Tm)低大约5℃。Tm是指50％的靶序列与完全匹配探针杂交 时的温度(在限定的离子强度和pH下)。典型的严谨条件选定为pH7 时盐浓度大约为0.02摩尔，温度至少为60℃。降低盐浓度和/或增加 温度可增加严谨性。RNA-DNA杂交(用如100nt探针的northern印迹 杂交)的严谨条件如包括在63℃下、在0.2X SSC中洗涤20min至少一 次或相当的条件。DNA-DNA杂交(用如100nt探针的southern印迹杂 交)的严谨条件如包括在至少50℃、通常约55℃下在0.2X SSC中洗 涤20min至少一次(通常2次)，或相当的条件。也可参见Sambrook 等(1989)和Sambrook和Russell(2001)。
“序列同一性”或“序列相似性”可用通过全部或局部的比对算 法对两种肽或两种核苷酸序列的比对来确定。这样当它们(优选用如 程序GAP或BESTFIT在默认参数下比对)共有至少某一最小序列同一 性百分比(如下文定义)时，序列可以是“实质上等同”或“基本相似”。 GAP用Needleman和Wunsch总体比对算法来比对两个序列的全长，同 时最大化匹配数以及最小化空位数(gap)。总的来说，用GAP默认参数， 同时空位产生罚分(gap creation penalty)＝50(核苷酸)/8(蛋白 质)，空位延伸罚分(gap extension penalty)＝3(核苷酸)/2(蛋 白质)。对核苷酸而言，所用的默认得分矩阵是nwsgapdna，对蛋白 质而言，默认得分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992， PNAS 89，915-919)。序列同一性百分比的序列比对和得分可用计算机 程序来确定，如GCG Wisconsin Package，Version 10.3，可从 Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752美 国获得。另一种相似性或同一性百分比可通过FASTA、BLAST等检索数 据库来确定。
在本文和其权利要求中，动词“包含”及其动词变化形式被用作 其非限定意义，意味着包括在该单词之后的项目，但是未特异提到的 项目也不排除在外。另外，提到用不定冠词“一个”或“一种”的元 件不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求有元件中 的一个或仅仅一个。这样，不定冠词“一个”或“一种”通常意味着 “至少一个”。可进一步理解为，这里当提到“序列”时，通常指真 实的的具有亚单位(如氨基酸)的某种序列的物理分子。
本发明详细描述
用激活标签法，发明人分离和表征了拟南芥基因，这里指 HARDY(HRD)，其过量表达引起植物株型(plant architecture)和相 关内部结构与野生型相比，有许多变化。HRD的激活导致叶子看起来 较厚，具有较小的紧凑强壮的植物结构。植物更难以从地上拉起，这 大概是由于增强的侧根网络。克隆和测序HRD基因，发现其与定义为 AP2/ERF的转录因子相似(Alonso et al.2003，Science 301，653-657)。但是本领域并无HRD功能的描述和HRD基因使用的暗 示。
HRD基因在转基因拟南芥植物中的组成型表达显示出与最初的激 活标签系相同的表型，虽然表型更加严重。最初的过量表达突变体hrd 用来测试对非生物和生物胁迫条件的抗性，发现其明显比野生型对照 抗性更显著。另外，通过使用将HRD融合到糖皮质激素受体上的条件 性过量表达策略，表明表型可以诱导，具有轻微或几乎没有表型的植 物对胁迫测试有抗性。使用全基因组拟南芥微阵列的hrd突变体的微 阵列实验，显示出整套基因的差异表达，该差异表达不同于其它已知 的胁迫抗性AP2/ERF基因如DREB1A的过量表达，这表明在赋予通常的 胁迫抗性上有不同的机制。
根据本发明的核酸序列和蛋白质
在本发明的一个实施方式中提供了HARDY转录因子成员的核酸序 列和蛋白质序列，同时也提供了用于分离或鉴定其它植物物种中 HARDY基因的直系同源物的方法。
蛋白质的功能可用各种现有方法进行测试，优选通过测试组成型 表达待测蛋白质的转化体的表型和相同宿主物种(或变种)的HRD过 量表达转化体的表型(优选包含稳定整合到宿主基因组的嵌合HRD编 码性基因)来比较，从而允许直接比较转化体表型的功能效果。可理 解为在任何转化体实验中，可以看到转化体表型的一定程度的变化， 通常是由于基因组中的位置效应和/或由于拷贝的数量。技术人员知道 如何在转化体间比较，如通过选择单拷贝数量事件(single copy number events)和分析它们的表型。其它确定或确认体内基因/蛋白 质功能的方法包括产生剔除突变体(knock-out mutants)或短暂表达 研究。启动子-报告子基因表达研究也可以提供关于时空的表达图谱和 蛋白质角色的信息。
与野生型或对照转化体相比，HARDY基因成员的组成型(过量) 表达导致一种或多种以下表型变化：
-具有增加层的叶肉层的更厚的叶子
-看起来较小紧凑和强壮的植株
-具有增强侧根的更强壮的根系结构
-对病原体，如非种特异性(黄萎病)的增加抗性
-对干旱的增强耐受力，这通过比野生型更高的存活率来展现。
可以利用这些表型来创造具有改性或改良的农艺学特性转基因植 物或植物组织/器官，如增强耐旱性或这里在别处描述的其它特性。
在一个实施方式中，本发明提供了包含整合在其基因组中的嵌合 基因的转基因作物植物，其特征在于，所述嵌合基因包含植物细胞中 有活性的转录调控序列，其中该调控序列可操作的连接于核酸序列上， 该核酸序列编码具有SEQ ID NO：3序列的蛋白质或与SEQ ID NO：3 有至少70％同一性的蛋白质，或其直系同源蛋白质，或其功能片段。
优选植物具有选自以下组中表型的一种或多种：增强的耐旱性， 增强的抗病性和增强的根系结构。
在进一步优选的实施方式中，所述转录调控序列选自以下组：组 成型启动子、诱导型启动子、组织特异型启动子和发育调控型启动子。
本发明另一实施方式提供了所述转基因植物的种子或果实。
本发明的进一步实施方式提供了包含组织特异型、诱导型或发育 调控型启动子的嵌合基因，该启动子植物细胞中具有活性，且可操作 的连接于核酸序列，该核酸序列编码具有SEQ ID NO：3序列的蛋白 质或至少与SEQ ID NO：3有70％同一性的蛋白质，或直系同源蛋白 质，或其功能片段。
还提供了包含所述嵌合基因的载体。
优选的包含在载体中的编码核酸序列具有SEQ ID NO：1序列。进 一步优选所述编码核酸序列可操作的连接于胁迫诱导型启动子。
在进一步实施方式中，本发明提供了利用核酸序列产生具有增强 的耐旱性、增强的抗病性和/或增强的根系结构的转基因植物方面的用 途，该核酸序列编码具有SEQ ID NO：3序列的蛋白质或与SEQ ID NO： 3有至少70％同一性的蛋白质，或其直系同源蛋白质，或其功能片段。
可用电子手段(in silico)来鉴定与HARDY相似的其它成员，如 在已有的核酸或蛋白质数据库(如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL) 中鉴定核酸或蛋白质序列，以及利用标准序列分析软件，如序列相似 性检索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等)。
根据本发明的HRD蛋白，即SEQ ID NO：3所述的实例，可从自然 资源中分离，通过化学合成重新合成(利用如由Applied Biosystem 公司提供的肽合成器)或由重组宿主细胞产生。可以利用根据本发明 的HRD蛋白来产生单克隆或多克隆抗体，其可例如用于样品中HRD蛋 白的检测(免疫化学分析方法和试剂盒)。
嵌合或杂合HRD蛋白包含AP2结构域的片段和HRD蛋白的其它部 分。结构域可以在HRD蛋白和其它无关的蛋白间交换(结构域交换)， 只要所产生的嵌合蛋白的功能与HRD的功能本质上相似。举例而言， 这样嵌合HRD蛋白包含HRD蛋白，该HRD蛋白包括AP2结构域和另外 的在HRD蛋白中正常不能发现的一种或多种蛋白质结构域，如稳定结 构域，结合结构域(如激素结合结构域，如在糖皮质激素受体中发现 的，导致可诱导性)等。在另一个实施方式中，提供了嵌合HRD基因， 其包含HRD-阻遏子结构域融合，如下面描述的HRD-EAR融合。在转基 因植物中，这些嵌合蛋白的过量表达导致显性阴性表型。HRD-阻遏子 结构域融合还包含额外的结构域融合在其上，如激素结合结构域(参见 如Markel等，2002，Nucl，Acid Res.30，4709-4719)。
还提供了编码HRD蛋白的核酸序列(基因组DNA、cDNA、RNA)， 该HRD蛋白例如上述定义的HRD(包括任何嵌合或杂合HRD蛋白)、 或源自另一物种的任何HRD蛋白。由于基因编码的简并性，不同的核 酸序列可以编码相同的氨基酸序列。提供的核酸序列包括天然存在的、 人工的或合成的核酸序列。编码HRD的核酸序列的实例如SEQ ID NO： 1(源自拟南芥的编码HRD蛋白的序列)和SEQ ID NO：2(源自拟南 芥的基因组HRD序列)所示。可以理解当涉及DNA序列但是指RNA中描 述的序列时，RNA分子的实际碱基序列与DNA分子相同，除了用尿嘧 啶(U)代替胸腺嘧啶(T)的差异。
很显然许多种方法可用来鉴定、合成或分离HRD核酸序列的变体 或片段，如核酸杂交、PCR技术、电子分析和核酸合成，以及其它。
如下所述，编码本发明HRD蛋白的核酸序列，特别是DNA序列， 可以插入到表达载体中以产生高产量的HRD蛋白(或如嵌合HRD蛋白)。 在宿主中HRD DNA序列最优的表达可以通过采用在植物基因中，特别 是植物属或种(Bennetzen & Hall，1982，J.Biol.Chem.257， 3026-3031，Itakura.等，1977 Science 198，1056-1063)的自然基 因中最优选的密码子使用，利用现有的密码子使用表进行密码子优化 (如更适应在棉花、大豆或水稻中的表达)。用于各种植物物种的密码 子使用表如由Ikemura(1993，在“Plant Molecular Biology Labfax”，Croy，ed.，Bios Scientific Publishers Ltd.)和Nakamura 等(2000，Nucl.Acids Res.28，292.)以及在主要的DNA序列数 据库(如在Heidelberg中的EMBL，德国)中公布。因此，可以构建合 成的DNA序列，以便产生相同或本质上相同的蛋白质。在专利和科学 文献中可以发现改造密码子使用以使之在宿主细胞优化的几种技术。 用于修饰密码子使用的确切方法对于本发明并不关键。
如上文所述的DNA序列的小的改造可通过PCR介导的突变形成(Ho 等，1989，Gene 77，51-59.，White等，1989，Trends in Genet. 5，185-189)来常规制造。DNA序列更复杂的改造可利用现有技术通 过重新DNA合成所需的编码区来常规完成。
也可以通过增加或删除蛋白质N-末端的一个或多个氨基酸来改 造HRD核酸序列，以使HRD蛋白的N-末端具有更优的翻译起始环境。 通常本发明蛋白质优选在植物细胞中用Met-Asp或Met-Ala二肽优化 转录起始来表达。Asp或Ala密码子这样可在已有的Met之后插入， 或第二密码子，Val，可用Asp(GAT或GAC)或Ala(GCT，GCC，GCA 或GCG)来代替。DNA序列也可改造以除去不正常的剪切位点。
在本发明的一个实施方式中HRD基因表达通过如在它处描述的 RNAi方法，在宿主细胞、植物或特异性组织中下调。在另一实施方式 中，HRD功能损失型表型(宿主细胞、组织或整株植物)通过表达核 酸序列产生，该核酸序列编码具有(显性)阻遏结构域的HRD蛋白(如 定义的)的蛋白融合子。“功能损失”这里是指HRD蛋白功能在宿主 组织或器官中的损失，包含在分子水平(如HRD转录因子下游靶基因 的转录活性损失)和优选在表型水平的功能。例如，为了提供功能损 失型，HRD蛋白融合子根据Hiratsu等2003(Plant J.34：733-739) 的描述用12氨基酸的“EAR”阻遏结构域制得，在此通过引用并入本 文。这些融合到HRD蛋白(如定义的)中的任何一种的阻遏结构域融 合子，这里术语为“HRD-EAR”融合蛋白，能够引起抑制下游靶基因， 从而导致了有效的功能损失型突变体(显性阴性效应)。这些阻遏融 合子也在还未鉴定出的直系同源基因的异源植物中影响阻遏作用。在 一实施方式中提供编码嵌合阻遏结构域-HRD蛋白融合蛋白的核酸序 列，特别是HRD-EAR融合蛋白。另外还提供包含所述核酸序列的载体 和包含所述嵌合基因的宿主细胞、组织和/或器官。为了产生HRD-阻 遏结构域融合蛋白，编码阻遏结构域的核酸序列可翻译的融合到包含 HRD编码序列的核酸序列。HRD-阻遏结构域融合蛋白的编码核酸序列 (特别是HRD-EAR)，被置于组成型或特异型启动子(如组织特异型 或发育调控型)的控制下。组成型表达在所有HRD或直系同源物被表 达和需要发挥其功能的宿主组织中，提供功能损失。HRD-EAR蛋白的 特异性表达在组织特异或条件特异时提供功能损失，如特异型启动子 可操作的连接在编码HRD-EAR融合蛋白的核酸上。
在植物细胞中可以理解HRD蛋白可操作的融合到现有技术可获得 的且起作用的其它阻遏结构域。这些包括动物蛋白的阻遏结构域，如 果蝇ENGRAILED(En)阻遏结构域。例如N-末端的298个氨基酸可以 融合到根据本发明的HRD蛋白上，创造出显性阴性嵌合蛋白(参见 Markel等.2002，Nucleic Acid Research Vol 30，4709-4719，以 及Chandler和Werr 2003，Trends in Plant Science Vol.8，279-285， 都通过引用并入本文)。已经注意到阻遏结构域可以与HRD蛋白在C- 末端或在N-末端融合，这依赖于结构域。编码显性阴性融合蛋白的核 酸序列可以称为“显性阴性嵌合基因”，当被转移到宿主基因组时被 称为“显性阴性转基因”(稳定的整合到宿主基因组上，或短暂的表 达)。其它植物阻遏接结构域例如AGAMOUS的LEUNG和SEUSS共阻遏 子，FLC和多梳蛋白(polycomb protein)。其它动物阻遏结构域包 括如WT1、eve、c-ErbA和v-ErbA和Kr üppel相关盒(associated box) (参见Chandler和Werr，2003，见前及其参考文献)。
本发明的另一实施方式中，提供了用于检测HRD DNA序列的PCR 引物和/或探针和试剂盒。用于从样品中扩增HRD DNA的简并或特异性 PCR引物对可根据SEQ ID NO 3来合成，这是本领域的已知技术(参 见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson等 (2000)PCRBasics：From Background to Bench，First Edition， Springer Verlag，Germany)。同样的，SEQ ID No 1-2的DNA片段 可用作杂交探针。HRD检测试剂盒包括HRD特异性引物和/或HRD特异 性探针，以及使用引物或探针来检测样品中HRD DNA的相关指南。举 例而言，这样的检测试剂盒可用于检测植物中是否转染了本发明的 HRD基因(或其部分)。由于遗传编码的简并性，一些氨基酸密码子 可在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下被其它密码子代替。
在另一实施方式中，提供了特异结合到根据本发明的HRD蛋白的 抗体。特别的，本文还包括结合到HRD或片段或其变体的单克隆或多 克隆抗体。抗体可利用本领域已知的方法，用根据本发明的HRD蛋白 作为抗原在动物体中制备，如在Harlow和Lane“Using Antibodies： A laboratory manual”(New York：Cold Spring Harbor Press 1998) 和在Liddell和Cryer“A Practical Guide to Monoclonal Antibodies”(Wiley和Sons，1991)中所述的。抗体可进而用来 分离、鉴定、表征或纯化其结合的HRD蛋白，例如，通过如ELISA(酶 联免疫吸附)或免疫印记分析，允许免疫复合物形成和检测免疫复合 物的存在以检测样品中的HRD蛋白。还提供了免疫试剂盒，可用于检 测提供的样品的HRD蛋白、蛋白质片段或表位。样品可以是细胞、细 胞上清液、细胞悬浮液、组织等。这样的试剂盒至少包括结合到HRD 蛋白的抗体和一种或多种免疫检测试剂。抗体也可用来分离/鉴定其它 HRD蛋白，如用ELISA或Western印记。
另外，这里提供了包含HRD启动子的核酸序列。在SEQ ID NO：1 的ATG密码子的上游约1kb序列处发现了转录调控序列。这里提供了 在SEQ ID NO：2中的HRD的转录调控序列，其如1.1kb的5′区所示。 这些转录调控序列可用于构建嵌合基因以及用于表达宿主或宿主细胞 中可操作连接的核酸序列。特别是HRD转录调控序列可用于在种子或 胚胎中表达以用于早期胁迫耐受力的基因表达。可以理解，转录调控 序列的组织特异性可通过分析所提供序列的缺失片段直接表达可操作 连接在其上的核酸序列的能力而改进或特导化。这种缺失分析允许删 除引起非特异性(基础)表达的核酸部分。相似的是，其它类HRD基 因的转录调控序列可用已知的方法如TAIL-PCR，通过ATG密码子上 游基因组DNA的测序来分离。
根据本发明的嵌合基因、载体和重组微生物
本发明的一个实施方式中，编码上文所述的HRD蛋白(包括如 HRD-GR和HRD-EAR等融合蛋白)的核酸序列被用来制备嵌合基因和包 含这些核酸序列的载体，所述载体用来将嵌合基因转化到宿主细胞和 在宿主细胞中产生HRD蛋白，所述宿主细胞如从转化细胞衍生的细胞、 组织、器官或有机体。宿主细胞优选植物细胞，但是微生物宿主(细 菌、酵母、真菌等)也包括在内。任何作物植物都是合适的宿主，如 单子叶植物或双子叶植物，如玉米/谷物(玉米种，如Z.mays，z. diploperennis(chapule)，Zea luxurians(Guatemalan teosinte)， Zea mays subsp.huehuetenangensis(San Antonio Huista teosinte)，Z.mays subsp.mexicana(Mexican teosinte)、Z.mays subsp.parviglumis(Balsas teosinte)，Z.perennis(perennial teosinte)和Z.ramosa)，小麦(Triticum species)、大麦(如 Hordeum vulgare)、燕麦(如Avena sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、 黑麦(Secale cereale)、大豆(Glycine spp，如G.max)，棉花 (Gossypium species，如G.hirsutum，G.barbadense)、芸苔属(如 B.napus，B.juncea，B.oleracea，B.rapa等)，向日葵(Helianthus annus)、西红柿(Nicotiana species)、苜蓿(Medicago sativa)， 水稻(Oryza species，如O.sativa indica cultivar-group或 japonica cultivar-group)，牧草，珍珠粟(Pennisetum.spp.如 P.glaucum)，树种、蔬菜种，如番茄属(如Lycopersicon esculentum)、 马铃薯(Solanum tuberosum，其它马铃薯物种)、茄子(Solanum melongena)，胡椒(Capsicum annuum，Capsicum frutescens)， 豌豆、豆(如Phaseolus species)，肉质果(葡萄、桃子、李子、 草莓、芒果)，观赏物种(如玫瑰、矮牵牛、菊花、百合、非洲菊)、 木本树(如物种杨树(populus)、柳树、栎树、桉树)、纤维物种如 亚麻(Linum usitatissimum)和大麻(Cannabis sativa)。
这里“作物植物“是指人们种植和培育用于特定目的的植物物种。 作物植物可种植用作食物目的(如大田作物)或用作观赏目的(如生 产用来剪下的花，草坪的草等)。这里定义的作物植物也包括收获非 食物产品的植物，如用作燃料的油、塑料聚合物、药用产品、软木以 及其它。
嵌合基因和载体的构建，以将HRD蛋白编码核酸序列导入(优选 稳定的)宿主细胞在本领域是公知的。为了产生嵌合基因，编码HRD 蛋白(或如HRD-GR结构域融合蛋白)的核酸序列用标准分子生物学技 术，可操作的连接于启动子序列，以适于在宿主细胞内的表达。启动 子序列可以在载体中已经存在，这样HRD核苷酸序列简单的插入到载 体启动子序列的下游即可。载体然后被用于转化宿主细胞，嵌合基因 插入到细胞核基因组或质体、线粒体或叶绿体基因组，并用合适的启 动子在那里表达(如Mc Bride等，1995 Bio/Technology 13，362； US 5,693,507)。在一实施方式中，嵌合基因包含用于在植物细胞 或微生物细胞(如细菌)中表达的合适的启动子，该启动子可操作的 连接于编码根据本发明的HRD蛋白或融合蛋白的核酸序列，优选在3′ 非翻译核酸序列之后。
编码功能性HRD蛋白(或在某些实施例中为功能性HRD-GR结构域 融合蛋白)的HRD核酸序列，优选HRD嵌合基因，可用常规方法稳定 的插入到个体植物细胞的核基因组上，这种转化的植物细胞可用常规 方法用于产生转化植物，该转化植物由于HRD蛋白在某些细胞中在某 一时间的存在而具有改变的表型。在这一点上，根癌农杆菌中包含编 码HRD蛋白的核酸序列的T-DNA载体，可用于转化植物细胞，其后， 转化的植物可用之前描述的技术，如在EP 0116718，EP 0270822，PCT 公开WO84/02913和公开的欧洲专利申请EP0242246和Gould等(1991， Plant Physiol，95，426-434)，从转化的植物细胞再生。用于农杆 菌介导的植物转化的T-DNA的构建在本领域是公知的。T-DNA要么是 如在EP0120561和EP0120515中所描述的双元载体，要么是如在 EP0116718中所描述的，通过同源重组可整合到农杆菌Ti质粒上的共 整合载体。
优选的每一T-DNA载体包含可操作的连接于HRD编码核酸序列的 启动子，其位于T-DNA边界序列间，或至少位于右边界序列的左边。 边界序列在Gielen等(1984，EMBO J 3，835-845)中已有描述。当 然，其它类型载体也可用于转化植物细胞，用如直接基因转化(如在 EP 0223247所描述的)、花粉介导转化(如在EP 0270356和WO85/01856 中所描述的)、原生质体转化，如在US4,684,611中所描述的，植物 RNA病毒介导转化(如在EP0067553和US4,407,956中所描述的)， 脂质体介导转化(如在US4,536,475中所描述的)，和其它方法如那 些描述用于特定系的转化谷物(如US6,140,553；Fromm等.，1990， Bio/Technology 8，833-839；Gordon-Kamm等，1990，The Plant Cell 2，603-618)和水稻(Shimamoto等，1989，Nature 338，274-276； Datta等1990，Bio/Technology 8，736-740)的方法，以及用于转 化单子叶植物(PCT公开WO92/09696)的普遍方法。对于棉花转化也 参见WO 00/71733，对于水稻转化也参见在WO 92/09696，WO 94/00977 和WO95/06722中所描述的方法。对于高粱转化参见如Jeoung JM等， 2002，Hereditas 137：20-8或Zhao ZY等2000，Plant Mol Biol.44： 789-98)。同样的，从转化细胞中筛选和再生转化植物在本领域也是公 知的。显然，对不同物种，甚至对单一物种的不同变种或栽种品种， 特异地采用再生高频转化体的方案。
除了核基因组的转化外，本发明还包括质体基因组，优选叶绿体 基因组的转化。质体基因组转化的一个优点是可以降低转基因传播的 风险。可用本领域公知的方法实现质体基因组转化，参见如Sidorov VA等，1999，Plant J.19：209-216或Lutz KA等2004，Plant J.37 (6)：906-13。
得到的转化植物可用于常规植物育种计划，以产生更多的具有相 同特性的转化植物，或将基因部分的引入相同植物的其它变种或相关 植物品种。从转化植物获得的种子，包含作为稳定基因插入的嵌合HRD 基因。转化植物的细胞可用常规方法培育，以产生HRD蛋白，其可以 回收用于如产生抗体的其它用途。
HRD核酸序列插入到植物细胞基因组，以便插入的编码序列在启 动子的控制下，位于启动子的下游(如3′)，该启动子可指引植物细 胞的表达。优选通过插入嵌合基因到植物细胞基因组来实现，特别优 选插入到核基因组或质体(如叶绿体)基因组。
优选的启动子包括：花椰菜花叶病毒(CaMV)的分离株CM 1841(Gardner等，1981，Nucleic Acids Research 9，2871-2887)， CabbB-S(Franck等，1980，Cell 21，285-294)和CabbB-JI(Hull 和Howell，1987，Virology 86，482-493)的强组成型35S启动子 (strong constitutive 35S promoters)或增强型35S启动子(“35S 启动子”)，Odell等(1985，Nature 313，810-812)或在US5164316 中描述的35S启动子，或源自泛素家族的启动子(如玉米泛素启动子， Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.18，675-689，EP 0342926， 也可参见Cornejo等，1993，Plant.Mol.Biol.23，567-581)，gos2 启动子(de Pater等，1992 Plant J.2，834-844)，emu启动子(Last 等，1990，Theor.Appl.Genet.81，581-588)，拟南芥肌动蛋白启动 子如An等(1996，Plant J.10，107。)描述的启动子，水稻肌动蛋 白启动子如Zhang等(1991，The Plant Cell 3，1155-1165)描述 的启动子，以及US5,641,876中描述的启动子和WO070067中描述的水 稻肌动蛋白2启动子；花椰菜花叶病毒启动子(WO97/48819，Verdaguer 等，1998，Plant Mol.Biol.37，1055-1067)，源自地下三叶草侏 儒病毒(Subterranean clover stunt virus)的pPLEX系列启动子 (WO 96/06932，特别是S7启动子)，乙醇脱氢酶启动子，如pAdh1S (GenBank accession number X04049，X00581)，以及TR1′启动子和 TR2′启动子(分别是“TR1′启动子”和“TR2′启动子”)，其可分别 驱动T-DNA的1′和2′基因的表达(Velten等，1984，EMBO J 3， 2723-2730)，US6051753和EP426641描述的玄参花叶病毒启动子，组 蛋白基因启动子，如源自拟南芥(PMB：179-191)的Ph4a748启动子， 或其它。
换句话说，可利用不是组成型的启动子，而是对植物中一种或多 种组织或器官特异的启动子(组织优选/组织特异型，包括诱导发育调 控启动子)，如优选叶子、优选表皮，优选根，优选花的组织如绒毡 层或花粉囊，优选种子，优选豆荚等的启动子，由此HRD基因(包括 如HRD-GR融合蛋白编码基因)仅仅在某些发育阶段和/或仅仅在特异 组织或器官的细胞中表达。例如，通过将编码基因置于植物自身或其 它植物的光诱导启动子的控制下，如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小的 亚单位基因启动子，HRD基因在植物叶子中可选择性的表达，所述植 物为如在US5,254,799中披露的豌豆或在US5034322披露的拟南芥。 启动子的选择由所要达到目标的表型来确定，将在下文中更加详细的 描述。
为了达到耐旱性，组成型、根特异型、胁迫诱导型或病原体诱导 型启动子都适合。合适的非生物诱导型启动子是rd29A启动子(kasuga 等，1999)。
为了在根组织中表达，于根中具有分化活性的启动子在 WO00/29566中描述。另一种根分化表达的启动子是US5,633,363中描 述的ZRP启动子(或其变型)。在本实施方式中提供另一种根系特异型 启动子，其为BOUNTIFUL启动子(Pereira等未发表)。
另一种选择是使用表达为诱导型的启动子。诱导型启动子的实施 例是伤害诱导型启动子，如Cordera等(1994，The Plant Journal 6， 141)所描述的MPI启动子，其可通过伤害(如由昆虫或物理伤害引起) 诱导，或COMPTII启动子(WO 0056897)或US6031151中描述的启动子。 另外，启动子可由化学药品诱导，如由Aoyama和Chua(1997，Plant Journal 11：605-612)以及US6063985描述的地塞米松，和四环素 (TOPFREE或TOP 10 promoter，参见Gatz，1997，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.48：89-108和Love等，2000，Plant J. 21：579-88)诱导。其它诱导型启动子如通过温度变化诱导，如 US5,447,858中描述的热休克启动子，如通过厌氧条件诱导(如玉米 ADH1S启动子)，通过光诱导(US6455760)，通过病原体诱导(如 EP759085或EP309862)或通过衰老诱导(SAG12和SAG13，参见 US5689042)。显然，还有其它范围的启动子可利用。
HRD编码序列(或嵌合HRD蛋白编码序列)插入到植物基因组， 以便编码序列位于合适的3′末端转录调控信号(“3′末端”)(如转 录形成和多聚腺苷酸信号)的上游(如5′)。多聚腺苷酸和转录形成 信号包括下述基因的信号：CaMV 35S基因(“3′35S”)，胭脂碱合 酶基因(“3′nos”)(Depicker等，1982 J.Molec.Appl.Genetics 1，561-573)，章鱼碱合酶基因(“3′ocs”)(Gielen等，1984，EMBO J3，835-845)和T-DNA基因7(“3′基因7”)(Velten和Schell， 1985，Nucleic Acids Research 13，6981-6998)，其作为转化植物 细胞中3′不翻译DNA序列，以及其它。
将T-DNA载体引入农杆菌可用已知方法实现，如电穿孔或三亲融 合。
HRD编码核酸序列可任选的作为杂交基因序列插入植物基因组， 由此HRD序列框架内(US5,254,799；Vaeck等，1987，Nature 328， 33-37)连接于编码选择性或可评估(scorable)标记的基因，如编码卡 那霉素抗性的neo(或nptII)基因(EP0242236)，以便植物表达出 容易检测的融合蛋白。
植物细胞的转化也可用来在植物细胞培养物中大量产生根据本发 明的HRD蛋白，该植物细胞培养物对许多胁迫有抗性，可在培养时用 于生产特异产品。这里当提到制造转基因植物细胞时，这是指分离或 组织培养物中的植物细胞(或也指植物原生质体)、或指包含在植物 或分化的器官或组织中的植物细胞(或原生质体)，这里也特异性包 括两种可能性。因此，说明书或权利要求中提到的植物细胞不仅仅意 味着培养物中分离的细胞，还指任何植物细胞，不论它位于何处或存 在于任何类型的植物组织或器官中。
编码HRD蛋白(或嵌合HRD蛋白)的HRD核酸序列的全部或部分， 还可用于转化微生物，如细菌(如大肠杆菌、假单胞菌、农杆菌、芽孢 杆菌等)、真菌、病毒、藻类或昆虫。用合并到合适的克隆载体上的本 发明的HRD核酸序列的全部或部分来转化细菌，可用常规方法来实现， 优选用Maillon等(1989，FEMS Microbiol.Letters 60，205-210) 和WO 90/06999描述的常规的电穿孔技术。例如在原核宿主细胞中， 核酸序列的密码子的使用可由此(如上文对植物的描述)优化。应该 除去内含子序列，其它优化表达的适应性可用已知方法获得。
为了获得在单子叶植物中的增强表达，如在谷物或水稻等草类物 种，内含子，优选单子叶植物内含子可以加到嵌合基因中。例如，将 玉米Adh1基因的内含子插入到5′调控区，已经显示了在玉米中的增 强表达(Callis等，1987，Genes Develop.1：1183-1200)。同样的， US5,859,347描述的HSP70内含子，可用于增强表达。HRD核酸序列 的DNA序列，可用翻译中性(translationly neualtral)方法进一步 转变，用定点(site-directed)内含子插入和/或通过引入密码子使用 的变化，来修改存在于基因部分中的可能的抑制性DNA序列，如使密 码子利用适应于植物最优选的密码子，所述植物优选如上文所描述的 特异相关植物属。
根据本发明的一个实施方式，HRD蛋白(或嵌合蛋白)的以细胞 内的细胞器为靶标，如质体，优选叶绿体、线粒体，或由细胞分泌， 从而潜在优化蛋白稳定性和/或表达。相似的是，蛋白可以以液泡为靶 标为了这个目的，本发明的一个实施方式中，本发明的嵌合基因包含 编码信号肽或靶肽的编码区，该编码区连接于本发明的HRD蛋白编码 区。更优选的包含于本发明蛋白质中的肽是针对叶绿体或其它质体靶 向的转运肽，特别是源自植物基因的复制转运肽区(该植物基因的基 因产物靶向质体)，优化的如Capellades等的转运肽(US 5,635,618)， 源自菠菜的铁氧化还原蛋白-NADP+氧化还原酶转运肽(Oelmuller等， 1993，Mol.Gen.Genet.237，261-272)，Wong等描述的转运肽(1992， Plant Molec.Biol.20，81-93)和公开的PCT专利申请WO00/26371 中的靶肽。也优选的肽为介导连接至该肽的蛋白分泌至细胞处的肽， 如马铃薯蛋白酶抑制子11的分泌信号，(Keil等，1986，Nucl.Acids Res，14，5641-5650)，水稻的α-淀粉酶3基因分泌信号(Sutliff 等1991，Plant Molec.Biol.16，579-591)以及西红柿PR1蛋白 的分泌信号(Cornelissen等，1986，EMBO J.5，37-40)。本发明 的特别有用的信号肽包括叶绿体转运肽(如Van Den Broeck等，1985， Nature，313，358)，或US5,510,471和US5,635,618中引起蛋白转 运到叶绿体中的优化的叶绿体转运肽，分泌信号肽或将蛋白靶向至其 它质体、线粒体、ER或其它细胞器的肽。靶向至细胞内细胞器的信号 肽或用于植物细胞外分泌或分泌至细胞壁的的信号序列已在自然界中 的靶蛋白或分泌蛋白中发现，优选以下描述的那些：等(1989， Mol.Gen.Genet.217，155-161)、和Weil(1991，Mol.Gen. Genet.225，297-304)，Neuhaus & Rogers(1998，Plant Mol.Biol. 38，127-144)，Bih等(1999，J.Biol.Chem.274，22884-22894)， Morris等(1999，Biochem.BIophys.Res.Commun.255，328-333) Hesse等(1989，EMBO J.8，2453-2461)，Tavladoraki等(1998， FEBS Lett.426，62-66.)，Terashima等(1999，Appl，Microbiol. Biotechnol.52，516-523)，Park等(1997，J.Biol.Chem.272， 6876-6881)，Shcherban等(1995，Proc.Natl.Acad.Sci USA 92， 9245-9249)。
为了允许HRD蛋白分泌到转化宿主细胞外，合适的分泌信号肽可 以融合到HRD蛋白的氨基末端(N-末端)。假定的信号肽可用基于计 算机的分析来检测到，用如Signal Peptide search程序(Signal PV1.1or 2.0)(Von Heijne，Gunnar，1986和Nielsen等，1996)。
在一实施方式中，几种HRD编码核酸序列在单一宿主中共同表达。 共同表达的宿主植物可用转化已经表达本发明HRD蛋白的植物，或使 用本发明的不同的HRD蛋白转化的植物杂交，而很容易的获得。另外， 几种HRD蛋白编码核酸序列可存在于单一转化载体中，或用分离的载 体在同一时间共同转化并选择包含两种嵌合基因的转化体。相似的是， 一种或多种HRD编码基因可在单一植物中与另一种嵌合基因一起表 达，例如编码其它增强耐旱性的蛋白的嵌合基因，如CBF1，DREB1A， 水稻OsDREB基因(Dubouzet等，2003，Plant J.33：751)，SHINE 基因(Aharoni等2004，Plant Cell 16：2463-80)或其它。
可以理解不同蛋白可以在同一植物上表达，或每个都在单独的植 物上表达，然后通过单独的植物间相互杂交来结合在同一植物上。例 如，在杂交育种生产时，每一亲本植物表达单一的蛋白质。将亲本植 物交叉以产生杂交，这样两种蛋白可在杂交植物上结合。
优选的，为了选择的目的，也为了选择控制杂草的目的，本发明 转基因植物也可用能编码赋予除草剂抗性的蛋白的DNA来转化，所述 除草剂如广谱除草剂，例如基于草胺磷作为活性成分的除草剂(如 Liberty或BASTA；抗性由PAT或bar基因赋予；参见EP0242236和 EP0242246)或草甘磷为活性成分的除草剂(如RoundUp；抗性由EPSPS 基因赋予，参见如EP0508909和EP0507698)。利用除草剂抗性基因 (或赋予所需表型的其它基因)作为选择标记进一步具有避免引入抗 生素抗性基因的优点。
另外，可用其它筛选标记基因，如抗生素抗性基因。通常不接受 保持抗生素抗性基因在转化宿主植物中，这些基因可在转化体筛选后 再次除去。存在不同的技术以除去转基因。一种除去方法是通过将脂 氧合酶(lox)位点侧翼于嵌合基因，然后进行选择，之后将转化的植 物与CRE重组酶表达植物杂交(crossing)(参见如EP506763B1)。 位点特异型重组导致标记基因的切除。另一位点特异重组系统是 EP686191和US5527695描述的FLP/FRT系统。也可用如CRE/LOX和 FLP/FRT这些位点特异重组系统来达到基因叠加的目的。还进一步的 描述了一种元件排除系统(one-component excision system)，参 见如WO9737012或WO9500555。
转化植物细胞/植物、种子和根据本发明的核酸序列和蛋白质的应 用
接下来的部分描述了应用根据本发明的HRD序列来产生具有一种 或多种修饰表型的转化植物细胞、植物、植物种子和其任何衍生物/ 后代。
A)具有增强的胁迫耐受力的植物
有胁迫耐受力的转基因植物可用编码HRD蛋白的核酸序列转化植 物宿主细胞，并且从所述细胞中再生转基因植物来产生，所述核酸序 列在如上文所描述的合适的启动子的控制下。优选的启动子为特异性 地由胁迫(非生物和生物)或随化学化合物施用后诱导的启动子。特 别优选以下的启动子：
水稻PR10启动子(Hashimoto等，2004，Plant Cell Physiol.45： 550-559)
拟南芥AtPLA IIA启动子(Narusaka等，2003，Plant Cell Physiol，44：1246-52)
拟南芥CYP83B1启动子(Narusaka等，2004，PMB 55：327-342)
小麦发芽素(germin)gf-2.8启动子(Berna & Bernier，1999， PMB 39：539-549)
这里所用的“耐旱性”或“增强的耐旱性”是指转化体(相对于 野生型或对照转化体)对耐受一定时期干旱(脱水/缺水导致如在对照 植物上可见的叶子萎蔫症状)以及随后恢复的增强的能力，因此导致 减少的总产量损失，这是由于每m2有更多的植物存活和/或存活植物 的产量没有显著下降。耐旱性可在受控的环境(如温室或生长室)中 评定，将每个转化事件的至少约10个转化体和至少10个对照植物放 置到该环境中，不浇水，经过不同的时间阶段(1-4周或更多)，直 到对照植物出现叶子萎蔫或膨压损失，随后又给植物浇水1-2周，同 时分析它们的恢复表型。在相同条件下，不浇水时，具有耐旱性的转 化体比对照转化体(如用空载体转化)或野生型植物多存活至少2、3、 4、5、6、7天，优选至少2-5天，其显示了不可逆的组织伤害。另一 种评定转化体的恢复耐受的方法是比对照组至少高2-5倍(如20％的 对照组恢复，而40-100％的转化体存活)。
这里所用的“抗病性”或“增强的抗病性”是指转化体与野生型 或对照转化体相比，显示了疾病症状减少的增强的能力。疾病抗性筛 选用在野生型上显示易感反应的病原体来完成。在一实施方式中，病 原体是具有如非宿主特异抗性的真菌棉花黄萎病菌(verticillium dahliae)。在拟南芥的筛选中，幼苗种植于生长室中直径10cm的盆 中，22-24℃下12小时光照，盆中含有培养料∶沙子∶珍珠岩(2∶1∶ 1)的混合物。发芽后两个周时，幼苗轻轻的连根拔起，暂时的浸入棉 花黄萎病菌培养物的饱和悬浮液中，然后放回盆中，用土覆盖根。植 物正常浇水，几天后，检查不同时期的疾病症状。植物用每个基因型 的5盆复制体来评分，疾病分数根据成熟时存活的植物频率评定。野 生生态型Wassilewskija在这种试验中无一存活，而抗病基因型显示 有20-100％存活。
表达高水平HRD蛋白的转化体通过如分析拷贝数目(Southern印 记分析)，mRNA转录水平(如RT-PCR，用HRD引物对或侧翼引物 (flanking primer))或分析不同组织HRD蛋白的存在和水平(如 SDS-PAGE，ELISA分析等)而进行选择。为了调控的缘故，优选单拷 贝转化体，分析嵌合基因插入位点的侧翼序列，优选测序以表征“事 件”。选择高HRD表达转基因事件用以进一步的杂交/回交、自交，直 到获得具有稳定HRD基因的高性能良种事件。总的来说，HED基因表 达水平和HRD蛋白水平与耐旱性表型相关。特别在一实施方式中提供 了源自这种植物的转基因种子，其可作为“耐旱性”出售。
表达根据本发明的一种或多种HRD基因的转化体也可包含其它转 基因，如其它赋予耐旱性或赋予对其它生物或非生物胁迫抗性的基因。 为了获得这种具有“叠加”转基因的植物，其它转基因要么基因渗入 到HRD转化体中，要么HRD转化体随后用一种或多种其它基因转化， 或使用几种嵌合基因转化株系或变种。例如，几种嵌合基因可存在于 单一的载体中，或存在于共转化的不同载体中。
在一实施方式中，以下基因与根据本发明的一种或多种HRD基因结 合：编码其它AP2/ERF型转录因子的基因，优选在植物对环境胁迫应答 起作用的基因，如拟南芥CBF1、CBF2、CBF3和/或CBF4编码基因(Jaglo -Ottosen等1998，Kasuga等1999，见前)或源自其它物种的其直向 同源基因(Dubouzet等2003，见前)，SHN基因(Aharoni等，2004， 见前)，具有昆虫抗性的基因，如苏云金芽孢杆菌毒性基因(编码杀虫 蛋白，如cry基因，vip基因等，在http://www.biols.susx.ac.uk/home/ 上有可获得的基因列表)、真菌抗性基因，或其它。
这样叠加转化体可能具有更加广的环境胁迫耐受力，如对盐度、 低温胁迫、昆虫抗性、病原体抗性、热胁迫、水分胁迫等。
将HRD基因导入或渗入已具有相关高耐旱性和/或耐病性的植物 品系，这是可行的，由此这种耐性可由不同的潜在分子机制(如根系 结构)引起。
B)包含修饰表型的非转基因植物
本发明实施方式还使用非转基因方法，例如突变形成系统如 TILLING(定向诱导基因组局部突变，McCallum等，2000，Nat Biotech 18：455，和McCallum等2000，Plant Physiol.123，439-442，在 此通过引用都并入本文))和选择，以产生能生产更高水平的根据本 发明的一种或多种HRD蛋白的株系。不限制本发明的范围的情况下， 相信这种植物可包含在启动子中的点突变/缺失突变，该点突变/缺失 突变即为阻遏子蛋白的结合位点，该阻遏子蛋白使宿主HRD基因为组 成型(constitutive)或更高的表达。优选在突变体或部分突变体中 的HRD蛋白水平比非突变植物增加至少约2、5、10、15％或更高。 TILLING在高通量筛选突变体后(如用Cell 切割突变-野生型DNA 异源双链体并用测序凝胶系统检测)，用常规的化学药品诱变(如EMS 诱变)，参见如Henikoff等，Plant Physiology Preview May 21， 2004。这样，这里就包含了根据本发明的非转基因植物、种子和组织 以及产生并鉴定这种植物的方法，所述非转基因植物、种子或组织包 含有在一种或多种组织中增强的HRD基因表达和包含有一种或多种 HRD表型(如增强的耐旱性、增强的疾病抗性等所有上文描述的)。
在一实施方式中该方法包括以下步骤：诱变植物种子(如EMS诱 变)，集中(pooling)植物个体或DNA，PCR扩增感兴趣的区域，形成 异源双链体和高通量检测、鉴定突变植物，突变PCR产物测序。可以 理解，同样可使用其它突变和选择方法来产生这样的突变植物。种子 可用如辐射或化学处理，并且筛选具有修饰的HRD表型如增强的耐旱 性的植物。
在本发明另一实施方式中，植物材料是物种或相关物种的自然种 群，该物种或相关物种包含在HRD直系同源编码和/或调控序列处的 DNA序列的多态性或变异。在HRD基因靶点处突变体可用ECOTILLING 方法筛选(Henikoff等2004，见前)。在这种方法中，在品系或相 关物种中的天然多态性用上述的TILLING方法筛选出，其中植物个体 或库(pool)用于HRD靶点的PCR扩增，异源双链体的形成和高通量分 析。这可通过选择具有所需突变的个体植物来进行，该个体植物可用 在随后的育种程序中，以纳入所需的HRD直系同源等位基因来培养具 有所需性状的栽培品种。
突变体植物可用分子方法和修饰的表型特性与非突变体区别开， 分子方法如存在于DNA、HRD蛋白水平、HRD RNA水平的突变。
非转基因突变体对赋予增强内源性HRD基因表达的突变或突变体 HRD等位基因来说，可以是纯合的或杂合的。
序列
SEQ ID NO 1：拟南芥HRD编码序列
SEQ ID NO 2：编码HRD的拟南芥基因组DNA
SEQ ID NO 3：拟南芥HRD氨基酸序列
SEQ ID NO 4：糖皮质激素受体(GR)结构域蛋白
SEQ ID NO 5：具有用于克隆的侧翼序列的GR结构域编码序列

图1 hrd突变体和35S::HRD植物表型
A)早期hrd突变体植物表型，显示了暗绿色叶子和减少的株高
B)hrd突变体与野生型叶横截面的比较，显示出hrd突变体有更 多的叶肉细胞层。
图2萌发后3周时hrd突变体与野生型根系结构的比较，显示出 接近于茎附着物(stem attachment或根基处有更丰富的次生根和三 生根，其提供了总的纤维状结构。
图3hrd突变体，表达分析和HRD蛋白结构
A)hrd突变体基因组区域，显示了连续的标签基因(tagged genes)，其被注释为AP2样和醛缩酶，与它们的位于离CaMV增强子 四聚物I-ATag插入处6kb和2.3kb的启动子。
B)连续活化标签插入处的两种基因，AP2样和醛缩酶的RT-PCR 表达分析。所用的RNA源自2株野生型样本和hrd突变体的簇生叶。 醛缩酶基因表达是不变的，而AP2样基因在hrd突变体中过量表达， 所以是赋予该表型的候选物(candidate)。
C)HARDY氨基酸序列，显示了保守AP2结构域。阴影方框的氨基 酸是与AP2结构域相同的，粗体的氨基酸与AP2结构域共有序列相似。
图4用DEX诱导HRD-GR显示hardy突变体表型
HRD-GR转化系与野生型Ws生态型和hrd突变体比较。基因型在 短白昼条件下(8小时光照)种植4周，以增加叶片数目。基因型要 么用类固醇诱导物DEX处理，要么不处理。DEX处理的HRD-GR基因型 显示了与hrd突变体相似的暗绿色叶片表型。
图5使用hrd和野生型的耐旱性试验
使野生型Ws、hrd突变体系后代和阳性对照组rd29-DREB1A系(提 供耐旱性；Kasuga等.1999，见前)的15天幼苗经历9到12天的脱 水。接着，浇灌幼苗，一周后，它们的外观(恢复)呈现在图中(除 了第一行9DOD外，其中图片直接拍摄于脱水阶段的末期)。DOD为脱 水天数。
图6由HRD-GR融合子赋予的类固醇诱导性耐旱性
与hrd突变体和野生Ws生态型测试耐旱性比较，用10μM DEX 处理的35S::HRD-GR系显示了可诱导性。三种基因型的幼苗萌发后 用DEX处理，并与不处理的基因型在干旱试验中比较。野生型出现死 亡的那天计数为1DAWD(野生型死亡后天数)，其它基因型的存活相 对于该天计数。最初两行野生型在所有样本中都显示了死亡的植株， 在每一处理中其它基因型存活超过这的天数显示为1-3DAWD。与- DEX处理相比，DEX诱导后的HRO-GR显示了明显的抗性，与hrd突变 体用+或-DEX处理所显示的相似。
图7hrd突变体与野生型抗病性的比较
hrd突变体(A)与对照植物(B)用黄萎病菌病原体处理(标记为 +V)和不用黄萎病菌处理(-V)的比较。hrd突变体未受黄萎病菌感 染，而对照组显示了易感的萎蔫表型。

以下的非限制性实施例描述了HRD基因用于改性植物表型的应 用。除非另有说明，否则在实施例中，所有重组DNA技术根据以下描 述的标准方案(protocol)实施：Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；以及Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology的第一和第二卷，Current Protocols，USA。 用于植物分子工程的标准材料和方法描述于R.D.D Croy编著的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK共同出版。
实施例1材料和方法
1.1植物材料和耐旱性试验
所有植物，包括活化标签种群(Marsch-Martinez等，2002，Plant Physiol.129：1544-1556)和转基因系种植于约22℃的温室，并且 是在拟南芥生态型Wassilewskija(Ws)中。
对于干旱试验，活化标签突变体hardy与rd29A-DREB-1A系(提供 耐旱性；Kasuga等，1999)比较，二者都在拟南芥生态型Ws中。试验 在22℃的温室中实施，植物种植于包含一份沙子和珍珠岩以及两份培 养料(compost)(由25％粘土和75％具有EC 1/41(氮、磷和钾) 的泥炭(turf)的组成的混合物，Hortimea，Elst，The Netherlands) 的土壤混合物。种子以每个4cm盆6株植物的密度播种(4℃下，三夜 之后)，每个托盘有51盆(Aracon containers；BetaTech，Gent， Belgium)。营养(Hydroagri，Rotterdam，The Netherlands；2.6EC) 于萌发后10天供应，萌发后2个周，把盆转移到干托盘(从外部干燥 每一盆后)，让植物经受干旱(9、10、11或12天)。干旱时每2天 在托盘内移动植物以抵消位置效应。随后，植物复水，并在一周后观 察恢复状况。在野生型、DREB1A和hrd植物间比较耐旱性的试验，在 冬季和夏季重复三次以分别给予短或长的白昼状况。另外，用含有 35S::HRD-GR融合子的植物的干旱试验(具有与以上所述相似的生 长条件)，用如下文所述的DEX诱导来实施。
将诱导剂10μM DEX用三种不同的方法施用到不同的基因型上 (35S::HRD-GR、Ws和hrd)，以诱导不同水平的HRD功能：a)DEX 从托盘中盆的底部施用，b)喷到植物的顶部，c)从盆的底部施用和 顶部喷洒二者都用。DEX在植物最初两片叶子出现时施用，并且每隔 一天施用直到萌发后14天。然后植物经受前面所述的干旱和复水，并 在一周后观察恢复状况。
1.2分离侧翼DNA和序列分析
用根据Pereira和Aarts(1998，Transposon tagging with the En-I system，Totowa，NJ，Humana Press)的方法从两片叶子或花 幼蕾中分离DNA，并且用(Marsch-Martinez等，2002，见前)描述的方 法将10ng基因组DNA用于热不对称交错PCR(TALL PCR)。扩增片段 测序前通常进行re-PCR，并用BlastN算法(Altschul等，1990，J. Mol.Biol.215：403-410)鉴定拟南芥基因组中的插入位置。用 CLUSTAL X(Thompson等.1997，Nucl.Acid Res.25，4876-4882) 和DNASTAR(DNASTAR Inc.Madison，WI)进行多序列比对，而GENEDOC (Nicholas等，1997，EMBNET News 4，1-4)和TreeView(Page， 1996，Comp.Applic.Biosci.12：357-358)程序分别用于编辑比 对，以分别产生系统发育树。包括引导程序(bootstrapping)的系统 发育分析用Lucker等(2002，Eur.J.Biochem.269，3160-3171)描 述的方法实施。
1.3产生植物转化构建体和转基因拟南芥
编码所关心的基因或调控序列的片段用pfu DNA聚合酶从基因组 DNA上扩增。在这些情况下，片段是A尾式的(A-tailed)，并按照 生产商(Promega)所描述的方法导入到pGEM-T Easy载体中，接着 在消化并结合到到双元载体中前从两端测序。用标准方案来进行PCR、 限制性消化、质粒DNA分离和凝胶电泳。
包含全长编码区的片段从基因组DNA(针对HRD，At2g36450)上(用 pfu DNA聚合酶)扩增，以产生过量表达构建体。用于扩增的基因组 DNA源自拟南芥生态型Columbia，并使用HRDF和HRDR引物。
寡核苷酸
HRDf(5′-CGGATCCATGCAAGGAACCTCCAAAGAC-3′)SEQ ID NO：6
HRDr(5′-CGTCGACGGTTTGTTTAACTATCATGG-3′)SEQ ID NO：7
寡核苷酸对分别在扩增片段的5′和3′导入BamHI和SalI限制性 位点，该限制性位点可用于将555bp的编码区片段结合到pNEW1双元 载体(改性的pBI121双元载体，Nayelli Marsch-Martinez和Andy Pereira，未发表)的BamHI和SalI位点上(位于花椰菜花叶病毒(CaMV) 的35S启动子和胭脂碱合酶(NOS)终止子之间)。合成的构建体在 35S启动子的控制下过量表达At2g36450 AP2转录因子。
为了产生启动子::GUS构建体，每个基因的ATG密码子(HRD 的1kb处)上游的片段，用Taq DNA聚合酶和在5′和3′分别导入Xba I NcoI限制性位点的寡核苷酸，从基因组DNA(Columbia生态型)中 扩增。这允许将该片段结合到改性pBinPlus载体(van Engelen等， 1995，Trans.Res.4，288-290)的XbaI和NcoI位点(位于载体位 于β-葡糖苷酸酶(GUS)报告子基因的上游)。
为了产生35S::HRD-GR构建体，包含HRD全长编码区的片段从 拟南芥Columbia生态型的幼叶基因组DNA用寡核苷酸RP6和RP6(用 pfu DNA聚合酶)扩增，以扩增含有HRD全长编码区的0.55kb片段。
RP6 5′-TTATTTCTAGAATGCAAGGAACCTCCAAAGAC-3′SEQ ID NO：8
RP7 5′-TTATTAGATCTTGGAAAATTCCACAAGTAATCG-3′SEQ ID NO：9
寡核苷酸对将XbaI和Bg1II限制性位点分别导入到扩增片段的 5′和3′，其可用于连接。35S::HRD-GR构建体通过多点连接装配 (assemble)，其中具有合适相容的粘性末端的个体片段(启动子、 HRD基因、GR片段、终止子)在一个反应中共同连接到双元载体中。 从-526处延伸到转录起始位点的CaMV 35S启动子片段，可作为源自 pDH51(Pietrzak等，1986，Nucl Acid Res 14：5857-68)的pBS-SK ±衍生物的0.55kb的Hind III-XbaI片段获得。GR片段作为源自 pMTL23(Seq ID 5，编码GR蛋白结构域Seq ID 4)的0.85kb的 Bg1II-XhoI片段获得。CaMV35S终止子片段作为源自pDH51 (Pietrzak等，1986，见前)的pBS-SK±衍生物的0.21kb SalI-EcoRI 片段获得。构建体在双元载体pMOG22(ZENECA-MOGEN，NL)中制得， 其包含嵌合的CaMV 35S-潮霉素磷酸转移酶-tNoS，以用于转化期间 的选择。
所用的rd29A-DREB1A构建体与(Kasuga等，1999，Nat.Biotech. 17，287-291)所描述的相似，除了基因融合子是插入到pBinPlus处 之处(van Engelen等，1995，Trans.Res.4，288-290)。
构建体用浸花转化方法导入植物(Clough和Bent，1998，Plant J. 16，735-743)。种子盘栽于二分之一强度(one half-strength) Murashige and Skoog培养基(1/2MS；Murashige和Skoog，1962， Physiol.15，473-497)，用50mg/L卡那霉素选择的幼苗随后转移到 温室中。
1.4基因表达分析
用于逆转录-PCR(RT-PCR)的总RNA，用TrizolReagent按照生 产商(Invitrogen，Life technologies)所描述的方法，分离自4 周大的hardy活化标签突变体和野生型(WS生态型)植物的成熟的绿 色簇生(rosette)叶。大约1μg的总RNA按照供应商(Invitrogen， Carlsbad，CA)所述的方法，用于DNase I处理和cDNA合成(用 SuperScriptII逆转录酶)。cDNA稀释50倍，并用针对肌动蛋白基 因的特异寡核苷酸来扩增，以补偿cDNA样品的浓度。
RACTP1，5′-GCGGTTTTCCCCAGTGTTGTTG-3′SEQ ID NO：10
RACTP2，5′-TGCCTGGACCTGCTTCATCATACT-3′SEQ ID NO：11
随后，利用稀释的cDNA进行PCR反应，该PCR反应使用为扩增插 入位点侧翼的两个基因设计的特异性寡核苷酸。寡核苷酸HRDf和HRDr 用于扩增At2g36450基因，并用适合At2g36460基因的合适引物。PCR 反应条件包括变性步骤95℃下3min，接着95℃下1min，55℃下1min， 72℃下1.5min这样35个循环，终止于72℃下5min的延伸步骤。对 于对照PCR，用肌动蛋白寡核苷酸，并用30个扩增循环。
1.5 GUS染色和显微镜检查
在体外分析来自不同器官的组织以用于它们的GUS表达模式，所 述器官要么来自土壤生长植物，要么来自种植于1/2MS培养基上的幼 苗。GUS溶液包含100Mm磷酸钠缓冲液，pH7.0，0.5mg/ml 5-溴-4- 氯-3-吲哚β-D葡萄糖醛酸(glucoronic axid)(X-Gluc，Duchefa， The Netherlands)，0.1％Triton，和每种都是0.5mM的铁氰化钾/ 亚铁氰化钾。样品被真空渗入并在37℃下培养16-24h，然后在70％ 乙醇中除净(deplete)叶绿素。要么在双目镜下观察(WILD M3Z of Heerbrugg Switzerland，type-S)，要么用光学显微镜(Zeiss)观 察，并用RS测光(photometric)CoolSNAP相机 (MediaCybernetics)用对应的CoolSNAP软件来照数码相片。
为了用于扫描电镜(SEM)，样品用传导性碳胶(conductive carbon cement)胶合在样品架上(Leit-C，Neubauer Chemikalien，Germany)， 然后在液氮中冰冻。样品在真空下转移到-90℃下的专用的冰冻制备 室(Oxford冰冻系统，CT 1500 HF，Eynsham，UK)中。冰冻断面 (cryo-fracture)在大约150℃下用冷的(-196℃)手术刀片制得。断 裂样品在真空(3X10-7帕)中-90℃下冷冻干燥3min，以除去水蒸气污 染物。在样品表面用10nm铂溅射涂膜后，将其转移到在Cryo-FESEM (JEOL 6300F Field Emission SEM，Japan，Tokyo)的冷的样品阶 段(-190℃)，随后用5kV的加速电压分析。图片为数字化记录(Orion， Belgium)。
1.6 微阵列分析
用TRIZOL试剂(Life Technologies，Inc.)根据生产商说明书 用拟南芥的2-4片簇生叶来分离总RNA，并且用RNeasy Minelute Kit (Qiagen，Carlsbad，CA，USA)来纯化。用Amino Allyl MessageAmp Kit(Ambion，Austin，TX，USA)来进行RNA扩增。简要的说，用3 μg总RNA和1μl T7寡核苷酸(dT)引物通过逆转录来进行第一链cDNA 合成。全长dsDNA用包含1×第二链缓冲液，4μl dNTP混合溶液(dNTP mix)，2μl DNA聚合酶，1μl RNA酶H的反应体系在16℃下培养 2个小时来合成。cDNA通过将其用到平衡过滤器(equilibrated filter cartridge)上来纯化。将纯化的cDNA浓缩，并将其体积调整到14μ l。用T7体外转录的反义RNA扩增，在包含12μl ATP、CTP、GTP混 合物(25mM)，3μl aaUTP溶液(50mM)、3μl UTP溶液(50mM)，4 μl 10×反应缓冲液，4μl T7酶混合物的溶液中在37℃下反应8小 时来完成。然后扩增的aRNA通过将其用到平衡过滤器(equilibrated filter cartridge)上来纯化。
我们用来自亚利桑那州大学的含有拟南芥的29000个基因的高密 度长链寡核苷酸(spotted long oligonucleotide)Operon芯片 (http://www.operon.com/arrays/omad.php)来杂交。aRNA样品与 单活性(mono-reactive)Cy3或Cy5荧光染料(NHS esters)(Amersham Biosciences)结合2个小时。染色结束和纯化后，目标与含有2×SSC， 0.06×液体封闭剂(Liquid Blocking Reagent)(Amersham Biosciences)，0.04％SDS的80μl杂交溶液混合。加热到95℃ 2 分钟后，然后在冰上冷却，将混合物加到位于载玻片和盖玻片 (LifterSlip，Erie Scientific)间的缝隙中。载玻片在烘箱中的杂 交室中56℃下培育9小时。接着载玻片依次在含有0.5％SDS的2× SSC、0.5×SSC和0.05×SSC的溶液中在RT下清洗5分钟，然后在 1000rpm的速度下旋转干燥10min。
杂交载玻片用ScanArray Express HT扫描仪(Perkin Elmer) 扫描，产生Cy3和Cy5背景信号(Cy3 and Cy5 channels)的Tiff 图片。ScanArray PMT电压根据饱和信号的第一信号设定为42-50V。 扫描的图片用软件程序ScanArray Express(Perkin Elmer)来分析。 自适应圆圈方法(adaptive circle method)用于定量，LOWESS方法 用于数据标准化。用默认参数(下限400，乘数1.70)选定信号-背 景方法用于质量测试，结果用于检测试验效率。
为了进一步的数据分析，将数据提取到Excel表格处理软件中， 选择显示中值强度大于2×背景的通道1或通道2(Cy3或Cy5)的基 因表达值。另外，我们过滤出显著的调控基因，该调控基因显示的中 值比率大于1.5或小于0.66(Log2值+/-0.58)。这些基因表达列表为 我们提供了潜在调控序列的长列表，该潜在调控序列可进一步用于其 它试验处理的比对。在特异性处理(如干旱)分析中，至少一个复制 体的表达值大于2倍(fold)(Log2值±1)的基因用来与其它处理比对。
实施例2 hardy突变体和特征表型的鉴别
通过筛选2000个拟南芥转座子活化标签系(Marsch-Martinez等， 2002)，鉴定出一株具有低生长率和暗绿色叶子的突变体植物。突变体 (术语为hardy，hrd)的簇生叶和茎上的叶具有比野生型植物更厚的 叶。突变体随后开花，并具有降低的结实率。最显著的表型是将成熟 植物从土壤中拉出是很困难的，这可能是由于强壮的根系结构。该植 物看上去对温室条件的变化非常有耐受力，因此被取名为hardy。自 体授粉的hrd突变体系的后代显示出显性突变(四分之三的植株表现 hrd表型)。
隔离的突变体植物在在生长模式上表现出不同，其大小从看上去 中等植物到非常小的植物。中等大小的植物与野生型在同一时间开花， 这表明在这些植物中开花事时间没有受影响，然而，在较小的植物中， 开花几乎比野生型晚5-6天，这表明较小的植物开花时间晚。但是， 在突变体中的花蕾要比在其野生型中的开放时间晚的多。在中等大小 的hrd植物中，主干伸长达5-6cm高，并具有与主干差不多相同高度 的更多数量的次生茎(secondary stems)。茎上节间长度减少。植物 看上去更加茂密紧凑。由于节间长度的严重减少伸长不多，较小的hrd 植物(图1A)具有非常短的主干和次生干。中等大小和较小的hrd植 物与野生型相比，开花很多，但是结实率低。
通过用如Example 1.5描述的冷冻断裂扫描电镜(cryofracture SEM)扫描叶子结构来分析叶子结构，显示比野生型具有额外栅栏层的 厚的多的叶子(图1B)。这额外层大概给予了叶子深绿色表型，这是 由于更小的细胞和更多的层数使叶绿素密度更高。
通过将hrd植物种在具有营养作用的沙子中，然后冲洗掉沙子以 露出根系结构来表征根系表型。根系结构通过计数和测量初生根、次 生根和三生根的数目和长度来分析(表1)。hrd突变体最有区别的特 征是分枝为次生根和三生根的根(表1)，非常接近干或根的基部， 且仅仅在沙子下(图2)。与野生型相比，这在根的基部产生了更多 的纵向次生根和三生根，引起更复杂的根系结构，如单子叶植物的纤 维根系系统。这样，这些根系具有更大的表面积以在基部支撑，其增 加了对土壤的锚固力(anchorage capacity)，使它们更抵抗被拔出。 这种接近根系基部有更多分枝的表型是为hrd突变体的更加强壮的根 系表型做贡献的特性。当对用力拉约4周大的hrd突变体和野生型植 物进行测定时，hrd突变体需要更高的根系拉力。从地面被所需的力 拉出时，Hrd突变体需要比野生型大20-50％的力。已经显示根系拉 力与根系倒伏特性(lodging trait)相关，倒伏特性是谷类和树中一 个非常重要特性，其能使植物站直并且抗倒伏(Bruce等，2001，J Exp Biol 52：459-68；Bailey等2002，J Exp Biol 53：333-340)。

实施例3 AP2/ERF转录因子基因负责hrd突变体表型。
DNA凝胶印记分析表明，hrd包含单位点插入(single insertion) (数据未显示)。分离和测序分析侧于翼插入位点的DNA，进一步表 明插入位点位于染色体1的基因间区(图3A)。35S增强子四聚体在 编码未知蛋白的基因(在启动子上游的4025碱基对)和编码转录因子 的植物特异性AP2/ERF家族成员(启动子上游620碱基对)的基因之 间。为了检查与野生型相比，这两种基因是否在hrd中被导入表达， 我们用分离自hrd和野生型叶组织(图3B)的cDNA，进行了逆转录 PCR(RT-PCR)试验。结果表明与野生型叶子相比，在hrd突变体叶子中， 仅仅在从35S增强子四聚体6kb距离处的AP2/ERF基因AT2g36450被 诱导，并且是对表型负责的第一候选者。
转录因子的植物AP2/ERF超家族在拟南芥中包含141个成员 (Alonso等，2003，Science 301，653-657)，并且HRD蛋白包含 AP2/ERF结构域(图3C)。序列同源性搜索和系统发育分析整个AP2/ERF 家族，表明HRD与许多水稻中的蛋白相似(数据未显示)。水稻和拟 南芥蛋白含有AP2结构域，也含有在C-末端相似的氨基酸残基。
实施例4转基因植物过量表达HRD
编码AP2/ERF转录因子的下游基因(At2g36450)，是对hrd突变 体表型起作用的第一候选者。因此，基因的编码区(术语为HRD)被 克隆，并在35S CaMV启动子的控制下在拟南芥中组成型表达。所有培 育的转基因植物(10个个体)显示了与初始活化标签系类似的表型， 特别是植物的hrd暗绿色叶子和较小结构(数据未显示)。大多数35S:: HRD系的表型(起始的转化体和后来的后代)比起始的hrd突变体更严 重。在大多数情况下植物是较小的，在一些情况下甚至矮小(成体大 小为3-5cm)(数据未显示)。
相同的构建体转化到西红柿上，显示了较小的暗绿色叶子表型， 这表明所述的叶子表型可以被赋予到异源植物上。
实施例5 水稻中HRD基因的过量表达
在双元载体pMOG22中制备含有在CaMV35S启动子控制下的HRD 编码区的构建体，以用于水稻转化。转化体用已建立的农杆菌系统在 水稻栽培品种Nipponbare中获得。愈伤组织和再生芽苗(regenerated shoots)在25mg/L的浓度下选择对潮霉素(hygromucin)的抗性。
生根后，转化体转移到温室中，并完成初步表型分析。然后其自 交后代用于完成详细的表型和胁迫耐受试验。用HRD过量表达构建体 转化的水稻系显示了比野生型具有更多侧枝的较长的根系系统。这些 就是已经发现的使水稻或其它谷类对干旱有更高耐性有用的特性。(Li 等，2005，TAG 110：1244-52；Bruce等2001见前)
实施例6 用糖皮质激素基因融合子诱导HRD表达
为了在不同组织和发育阶段中导入HRD基因的表达，我们生成表 达HRD和鼠糖皮质激素受体(GR；在CaMV35S启动子的控制下)的激 素结合结构域的融合子蛋白转基因系(Chang等，1987，Nuc Acids Res， 22：9603)。35S::HRD-GR起始转化体(T1)的种子种于含有培养 基的盘内，培养基中有或无10μM地塞米松(DEX)激素。在补充有DEX 的培养基上种下的幼苗显示了如同在hrd突变体中看到的明显的表 型，该表型具有深绿色叶子的较短幼苗(图4)。
为了表征HRD表达赋予不同表型的机制，在不同的生长阶段和植 物不同的部分进行用地塞米松(DEX)诱导来诱导HRD-GR融合子的试 验。含有35S::HRD-GR转基因的幼苗和成体植物显示了野生型表型， 没有像hrd突变体(图4)的表型。种植于在温室或生长室中的幼苗 在萌发后的不同时间(萌发后1周、10天)用DEX处理，并且要么从 下面灌溉，要么从顶部喷撒，或者喷洒和灌溉都用。用早期处理或喷 洒和灌溉处理产生了具有如在叶子水平监视到的强烈表型的植物。最 强诱导是用10μM DEX，显示了与起始hrd突变体相似的表型。这样， 测试35S::HRD-GR转基因系的不同DEX诱导水平，以用于如下所述 的胁迫诱导的表型。
当用10μM DEX从下面灌溉处理35S::HRD-GR植物时，得到一 轻度(mild)hrd表型，其比初始hrd突变体较大。这些植物表现出 轻微向下的卷曲，具有细长茎的深绿色的簇生叶，有看起来正常的茎 生叶(cauline leaves)和正常的开花时间(图4)。簇生叶的大小 未受太大影响。当从顶部喷洒DEX处理35S::HRD-GR植物时，得到 了与hrd相似的表型，其具有小簇生叶，深绿色的轻微向下卷曲。但 是，主干正常延伸达7-8cm高，开花时间在一些植物中从正常到延迟。 当从底部(灌溉)和顶部喷洒DEX都被采用来处理35S::HRD-GR 植物时，它们表现出非常强烈的hrd突变表型，其具有小的严重卷曲 的深绿色簇生叶和开花较迟。
实施例7 HRD基因的时空表达
为了检测HRD基因的表达，创造出植物转化构建体，其将基因的 预测ATG密码子上游(如在Seq ID 2中所示)的1.0-kb DNA序列， 连接到β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因上。在拟南芥中，在种子和胚 中检测出转化体GUS表达。这与HRD基因表达的公共微阵列数据相符， 表明种子发育中该基因正常发挥功能，提供了种子成熟过程的胁迫耐 受力。
实施例8 植物过量表达HRD显示了增强的耐旱性
为了查明作为HRD过量表达的结果，植物表面的变化影响它的耐 旱能力到什么程度。为了这样做，使起始活化标签hrd系、 rd29A-DREB1A抗性对照和野生型(Wassilewskija生态型)的15天 大的幼苗脱水9-12天(图5)。然后，灌溉幼苗并检测它们的恢复 状况一个周。野生型植物不从长于9天的脱水处理中恢复，而所有衍 生自表达HRD基因的系的幼苗恢复，变得更绿和更强壮。
HRD-GR转化体显示了DEX诱导hardy相关突变表型的暗绿色叶 子，将其用于干旱胁迫试验。基因型WT(野生型)、突变hrd型和35S:: HRD-GR型萌发后并用或不用DEX处理。DEX处理要么从底部灌溉，要 么从顶部喷洒，或从底部灌溉和顶部喷洒都用。生长2个周后，对所 有的处理和基因型限制水分9-15天。每隔一天，植物复水以便能检 测恢复。记录每一处理野生型(WT)死亡之日，其它基因型和处理的 存活是相对于这一日期的。野生型死亡后的天数(DAWD)被记录如表 2所示。图6显示了这次试验的结果。用DEX诱导的HRD-GR型显示了 与hrd突变体相当的耐旱性表型。比较从底部(对根系灌溉)、从顶 部喷洒(叶)DEX处理和下部和顶部都处理的试验结果，表明如叶子 表型所看到的，处理的组合给予了对耐旱性最显著的表型。
表2
  植物系   1DAWD   2DAWD   3DAWD   WT+Dex   0.00   0.00   0.00   WT-Dex   0.00   0.00   0.00   hrd+Dex   93.33   92.31   96.55   hrd-Dex   93.10   96.43   83.33   HRD-GR+Dex   83.33   75.00   71.43   HRD-GR-Dex   0.00   0.00   0.00
类似的，水稻中HRD的过量表达也导致了植物具有增强的耐旱性。 具有35S::HRD构建体的转化体与对照植物相比，能够在脱水作用下 抵抗细长叶的枯萎，如同脱水后恢复所评定的。
实施例9 植物过量表达HRD显示了增强的抗病性。
为了检测HRD过量表达系对生物胁迫的抗性，进行对黄萎病菌抗 性的筛选，作为非宿主特异性抗性的例子。幼苗种于光照12小时、22 -24℃的生长室中的含有培养料∶沙子∶珍珠岩(2∶1∶1)混合物的 直径10cm的盆中。萌发后2个周，幼苗被轻轻的连根拔起，暂时浸入 黄萎病菌培养物的饱和悬浮液中，然后放回盆里，用沙子盖住根系。 几天后植物正常浇水，并在不同时期检查疾病症状。植物用每种基因 型的5盆复制体来打分，疾病分数用成熟时存活的植物频率来获得。 野生生态型Ws在此试验中没有存活，而潜在抗性候选者基因型显示了 20-100％的存活率。
在用黄萎病菌复制感染试验中，hrd突变体显示了高水平的抗性， 其没有显示在对照易感野生型植物(图7)上可见的枯萎症状。为了 确认HRD基因的效果，抗性试验在重演(recapitulated)过量表达系 中重复。在成熟时没有可见枯萎症状或病原体的证据，这表明了完全 的抗性表型。
实施例10 hrd突变体的微阵列分析揭示负责表型的基因
为了理解联合的非生物和生物胁迫应答的机制，用hrd过量表达 突变体来进行微阵列试验。在我们关于筛选耐旱拟南芥基因型的研究 中，野生生态型Wassilewskija(WS)在9天的限水后死亡，而过量 表达型rd29A::DREB1A和hrd系限水12天仍然存活。为了统一检测 植物材料，我们对野生型Ws用8天限水，收获叶子样品用于RNA分离， 同时从野生型Ws对照，规则浇水的rd29A::DREB1A和hrd上取叶子 样品。对于每一对比(野生型对照vs过量表达型)，我们分别使用2 个生物复制体。野生型对照的aRNAs用Cy3标记，野生型干旱或过量 表达型的aRNAs用Cy5在两个生物复制体中标记。许多复制体也进行 染色交换试验以作为技术对照。试验按实施例1.6进行。
在hrd突变体中，考虑到在两个复制体中表达一致的基因，微阵 列试验揭示了142个被诱导的基因和151个被阻遏的基因。下面的表 3显示了与野生型相比，多于双倍的具有诱导/阻遏基因的HRD调节子 (共调控的基因的组)的选择。被诱导基因用红色(或暗影(dark shade))表示，被阻遏基因用绿色(浅影(light shade))表示。
HRD表达模式与DREB1A有部分类似之处，表明赋予胁迫耐受力表 型的基因的调控。然而，许多基因在HRD和DREB1A过量表达型中都被 特异差别性调控，如表3中的被诱导的基因所示。在HRD调节子中特 异性被诱导的基因是一组4TFs、Ca2+信号蛋白、以及海藻糖和肌醇 半乳糖苷代谢基因。生物胁迫相关基因以被诱导的防御素PDF2基因为 代表，其已经显示可在茉莉酮酸酯通道被病原体应答诱导，以及被发 病机理相关的PR-5和Bet v1基因的抑制诱导。HRD和DREB1A在具有 改变的表达模式的基因上的不同表明了这两种AP2/ERF基因的作用或 功能的不同机制。与这些结果和公开的微阵列数据的对比表明，与之 前描述的其它AP2/ERF转录因子相比，HRD基因调控不同组的下游基 因。调控基因的不同组以及模式赋予了hrd突变体和HRD过量表达系 的特异性表型。
表3：与DREB1A型和干旱型(Drought)相比，由于HRD过量表达 引起的基因上调


序列表
<110>Plant Research International B.V.
<120>具有增强的耐干旱性的转基因植物
<130>PCTP176621
<140>
<141>
<160>11
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>555
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>1
atgcaaggaa cctccaaaga caatggcggc cgccaccctt tgtacagggg agtaaggcag 60
cgaaagaact caaacaaatg ggtttctgag atccgtgagc cgagaaaacc taaccgtatc 120
tggttaggaa cattctctac ccccgagatg gcggcaatag cctatgacgt ggcagctcta 180
gccctcaaag gcagtcaagc tgagctcaac ttcccaaact cagtttcctc tttgcctgcc 240
ccaacctcca tgtctccagc agacatccaa gcagcagccg cttcggccgc tgctgctttt 300
ggtgctgcta gggatgcgat tgttatggca aataataaca gccaaacaag tggtgtggct 360
tgcatgaata gtagttatga taatacaaat atgaatggat tcatggacga ggatttggta 420
ttcgacatgc ctaatgtgct catgaatatg gctgaaggaa tgcttcttag cccccctcgt 480
cctactgtct ttgatgctgc ttacgacgct gatggttttc ctggaggaga cgattacttg 540
tggaattttc catga                                                  555
<210>2
<211>2000
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>2
agccaataca ttagttagca tatgaatcta gtacttgttc tgatttattt tctgttaatc 60
aagtttaatt aattagttta caatgtttat gcttgatttt tacatagata tccgacagcc 120
tagtagatca agtgccaacc ggcacgcacc agcagacgta ggtgatagag aaaatttgat 180
ttaattaggt gaatttcttt tttcacacac atacatctat ggtgggaaca aagattccac 240
ggtatatcga gacatgaaat ggatttctta ccctaatcga tttgacaagt ttgaatgaga 300
ataatctaga aaatctatta cattatatta atgtctagtg gggatgataa agcctcaaag 360
aaattgaccc aaacgaaaca gcaatcacac actaacttct tcttagcatt tctaagacac 420
ttttcgatgt gattattcta taaatatccg acccttcacc aagtcaactc tatattcatt 480
tctattctga aataaccatt aaccccaaag taagcaatat ataggaaata catatataca 540
ttatagtctt attatgacat tggagaagtt gtggtttata cccctggaca tggagtgtat 600
atatagcaac attgaaatac agtttcacaa tatgtaaata acacaaaatt ataccaaaaa 660
tattgtaaat cacacaaatg aagtagataa ttttaatttt tattgaagtg ttttcaataa 720
agtggtgtca agatcatgag aacacatgta ttttcatgaa cctgtgatgg cgaaaacgac 780
cactttagat agaaacatat atacatcatt tgcaacttaa ttggccacca cccaaaaaaa 840
cgcgatatcc aacaagagga gcaattaaaa agctgtcttt acagctttag cttcatcatc 900
tctaagctgt gatcaattcc tcccaaacca ttttctaact ggtttgcact ttcttcactc 960
tcttctcttc actcttcact acgtacttca ctctccaact aacttaactg caccataaaa 1020
tggcttcgat ctcttcctct ccttcctcaa actcatcact cttctctact caaaacccta 1080
atactcatta tcaatatgca aggaacctcc aaagacaatg gcggccgcca ccctttgtac 1140
aggggagtaa ggcagcgaaa gaactcaaac aaatgggttt ctgagatccg tgagccgaga 1200
aaacctaacc gtatctggtt aggaacattc tctacccccg agatggcggc aatagcctat 1260
gacgtggcag ctctagccct caaaggcagt caagctgagc tcaacttccc aaactcagtt 1320
tcctctttgc ctgccccaac ctccatgtct ccagcagaca tccaagcagc agccgcttcg 1380
gccgctgctg cttttggtgc tgctagggat gcgattgtta tggcaaataa taacagccaa 1440
acaagtggtg tggcttgcat gaatagtagt tatgataata caaatatgaa tggattcatg 1500
gacgaggatt tggtattcga catgcctaat gtgctcatga atatggctga aggaatgctt 1560
cttagccccc ctcgtcctac tgtctttgat gctgcttacg acgctgatgg ttttcctgga 1620
ggagacgatt acttgtggaa ttttccatga tagttaaaca aaccaaccat ataaatatgt 1680
gattttgtgt gtttctatat atgtatgtat gaaataaata aatatggtgt ctagtgatgc 1740
attgtatgca tggttaggcc cgttaagacc gtaatataag gtcgtactgt attaagtttt 1800
tgtctttaaa ttattctcaa tttacaatct tatctagtct gatgtaatgc caaatgtaat 1860
gaatagtcaa tgccttgact gatactcatt tgtttatttt acagatggat acaattttcg 1920
tagggcttgg tatggttgat atactaatta aatatgtcta atatgattga tatactaatt 1980
aaatatgtct aatatagaca                                             2000
<210>3
<211>184
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>3
Met Gln Gly Thr Ser Lys Asp Asn Gly Gly Arg His Pro Leu Tyr Arg
  1               5              10                      15
Gly Val Arg Gln Arg Lys Asn Ser Asn Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg
             20                  25                  30
Glu Pro Arg Lys Pro Asn Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ser Thr Pro
         35                  40                  45
Glu Met Ala Ala Ile Ala Tyr Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Lys Gly
     50                  55                  60
Ser Gln Ala Glu Leu Asn Phe Pro Asn Ser Val Ser Ser Leu Pro Ala
 65                  70                  75                  80
Pro Thr Ser Met Ser Pro Ala Asp Ile Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ala
                 85                  90                  95
Ala Ala Ala Phe Gly Ala Ala Arg Asp Ala Ile Val Met Ala Asn Asn
            100                 105                 110
Asn Ser Gln Thr Ser Gly Val Ala Cys Met Asn Ser Ser Tyr Asp Asn
        115                 120                 125
Thr Asn Met Asn Gly Phe Met Asp Glu Asp Leu Val Phe Asp Met Pro
    130                 135                 140
Asn Val Leu Met Asn Met Ala Glu Gly Met Leu Leu Ser Pro Pro Arg
145                 150                 155                 160
Pro Thr Val Phe Asp Ala Ala Tyr Asp Ala Asp Gly Phe Pro Gly Gly
                165                 170                 175
Asp Asp Tyr Leu Trp Asn Phe Pro
            180
<210>4
<211>284
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：糖皮质激素受体(GR)结构域蛋白
<400>4
Thr Lys Lys Lys Ile Lys Gly Ile Gln Gln Ala Thr Ala Gly Val Ser
  1               5                  10                 15
Gln Asp Thr Ser Glu Asn Pro Asn Lys Thr Ile Val Pro Ala Ala Leu
             20                  25                  30
Pro Gln Leu Thr Pro Thr Leu Val Ser Leu Leu Glu Val Ile Glu Pro
         35                  40                  45
Glu Val Leu Tyr Ala Gly Tyr Asp Ser Ser Val Pro Asp Ser Ala Trp
     50                  55                  60
Arg Ile Met Thr Thr Leu Asn Met Leu Gly Gly Arg Gln Val Ile Ala
 65                  70                  75                  80
Ala Val Lys Trp Ala Lys Ala Ile Leu Gly Leu Arg Asn Leu His Leu
                 85                  90                  95
Asp Asp Gln Met Thr Leu Leu Gln Tyr Ser Trp Met Phe Leu Met Ala
            100                 105                 110
Phe Ala Leu Gly Trp Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Asn Leu Leu
        115                 120                 125
Cys Phe Ala Pro Asp Leu Ile Ile Asn Glu Gln Arg Met Ser Leu Pro
    130                 135                 140
Cys Met Tyr Asp Gln Cys Lys His Met Leu Phe Val Ser Ser Glu Leu
145                 150                 155                 160
Gln Arg Leu Gln Val Ser Tyr Glu Glu Tyr Leu Cys Met Lys Thr Leu
                165                 170                 175
Leu Leu Leu Ser Ser Val Pro Lys Glu Gly Leu Lys Ser Gln Glu Leu
            180                 185                 190
Phe Asp Glu Ile Arg Met Thr Tyr Ile Lys Glu Leu Gly Lys Ala Ile
        195                 200                 205
Val Lys Arg Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Trp Gln Arg Phe Tyr Gln
    210                 215                 220
Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Met His Glu Val Val Glu Asn Leu Leu
225                 230                 235                 240
Thr Tyr Cys Phe Gln Thr Phe Leu Asp Lys Thr Met Ser Ile Glu Phe
                245                 250                 255
Pro Glu Met Leu Ala Glu Ile Ile Thr Asn Gln Ile Pro Lys Tyr Ser
            260                 265                 270
Asn Gly Asn Ile Lys Lys Leu Leu Phe His Gln Lys
        275                 280
<210>5
<211>874
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：具有用于克隆的侧翼序列的GR结构域的编码序列(coding
     sequence of GR domain with flanking sequences for
     cloning)
<400>5
agatctacaa agaaaaaaat caaagggatt cagcaagcca ctgcaggagt ctcacaagac 60
acttcggaaa atcctaacaa aacaatagtt cctgcagcat taccacagct cacccctacc 120
ttggtgtcac tgctggaggt gattgaaccc gaggtgttgt atgcaggata tgatagctct 180
gttccagatt cagcatggag aattatgacc acactcaaca tgttaggtgg gcgtcaagtg 240
attgcagcag tgaaatgggc aaaggcgata ccaggcttca gaaacttaca cctggatgac 300
caaatgaccc tgctacagta ctcatggatg tttctcatgg catttgccct gggttggaga 360
tcatacagac aatcaagtgg aaacctgctc tgctttgctc ctgatctgat tattaatgag 420
cagagaatgt ctctaccctg catgtatgac caatgtaaac acatgctgtt tgtctcctct 480
gaattacaaa gattgcaggt atcctatgaa gagtatctct gtatgaaaac cttactgctt 540
ctctcctcag ttcctaagga aggtctgaag agccaagagt tatttgatga gattcgaatg 600
acttatatca aagagctagg aaaagccatc gtcaaaaggg aagggaactc cagtcagaac 660
tggcaacggt tttaccaact gacaaagctt ctggactcca tgcatgaggt ggttgagaat 720
ctccttacct actgcttcca gacatttttg gataagacca tgagtattga attcccagag 780
atgttagctg aaatcatcac taatcagata ccaaaatatt caaatggaaa tatcaaaaag 840
cttctgtttc atcaaaaatg actggatcct cgag                             874
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸HRDf
<400>6
cggatccatg caaggaacct ccaaagac    28
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸HRDr
<400>7
cgtcgacggt ttgtttaact atcatgg    27
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸RP6
<400>8
ttatttctag aatgcaagga acctccaaag ac    32
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸RP7
<400>9
ttattagatc ttggaaaatt ccacaagtaa tcg    33
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
     寡核苷酸RACTP1
<400>10
gcggttttcc ccagtgttgt tg    22
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：
寡核苷酸RACTP2
<400>11
tgcctggacc tgcttcatca tact    24