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真菌抗性植物和它们的用途

阅读：150发布：2021-02-28

IPRDB可以提供真菌抗性植物和它们的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，优选马铃薯和番茄对卵菌门(Oomycetes)的植物病原体的抗性的新方法，所述方法包括增加本发明多肽的活性。本发明还涉及多核苷酸和包含这些多核苷酸的载体。本发明还涉及相应的载体、细胞、转基因植物和来自它们的转基因繁殖材料，涉及产生它们的方法，还涉及它们用于产生粮食、饲料、种子、药物或者精细化学品的用途。，下面是真菌抗性植物和它们的用途专利的具体信息内容。

1.产生或者增加植物对卵菌门植物病原体的抗性的方法，其包括通过表达编码重组Rpi-blb2蛋白质的核酸分子而增加植物或植物组织、器官或细胞或植物部分中Rpi-blb2蛋白质的活性，其中所述Rpi-blb2蛋白质由核酸分子编码，所述核酸分子选自：(a)编码SEQ ID NO：2中描述的多肽的核酸分子；

(b)编码所述多肽的核酸分子，其序列在SEQ ID NO：1或3或5或6中描绘；

(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；

或者(a)到(c)任一项的互补链；

其中所述多核苷酸不由GenBan k数据库检索号AF039681、AF039682或U81378所示的序列组成。

2.权利要求1的方法，其还包括增加另一种抗性蛋白质的活性。

3.权利要求1或2任一项的方法，其导致与野生型相比用致病疫霉感染后孢子形成指数减小至少30％。

4.权利要求1或2任一项的方法，其中编码Rpi-blb2蛋白质或编码所述另一种抗性蛋白的多核苷酸有效连接表达控制序列和/或有效连接编码转基因表达调节信号的核酸序列，所述调节信号允许在原核或者真核宿主细胞中表达。

5.权利要求1或2任一项的方法，其中编码Rpi-blb2蛋白质或者编码另一抗性蛋白质的多核苷酸有效连接与所述编码Rpi-blb2蛋白质或者所述另一抗性蛋白质的多核苷酸相同物种来源的表达控制序列。

6.权利要求1或2任一项的方法，其中所述植物病原体是腐霉目(Pythiales)或者霜霉目(Peronosperales)病原体。

7.权利要求1或2任一项的方法，其中所述植物病原体是致病疫霉、红腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种、莴苣盘梗霉、烟草霜霉(Peronospora tabaci)或者葡萄生单轴霉。

8.权利要求2的方法，其中所述另一抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

9.权利要求2的方法，其中所述另一种抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。

10.权利要求1或2任一项的方法，其中所述植物、植物细胞或植物组织选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

11.权利要求10的方法，其中所述植物、植物细胞或植物组织来自茄科。

12.权利要求11的方法，其中所述植物、植物细胞或植物组织来自S.bulbocastanum、马 铃 薯 (S.tuberosum)、番 茄(S.lycopersicum 和 Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten exFarwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄 子(S.melongena)。

13.编码Rpi-blb2蛋白质的多核苷酸，其由选自如下的核酸分子组成：(a)编码SEQ ID NO：2中描述的多肽的核酸分子；

(b)编码所述多肽的核酸分子，其序列在SEQ ID NO：1或3或5或6中描绘；

(c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；

或者(a)到(c)任一个的互补链；

其中所述多核苷酸不由GenBank数据库检索号AF039681、AF039682或U81378所示的序列组成。

14.权利要求13的多核苷酸，其是DNA或RNA。

15.产生重组载体的方法，其包括将权利要求13或14任一项的多核苷酸插入到载体中或者插入所述多核苷酸和编码另一抗性蛋白质的核酸到载体中。

16.权利要求15的方法，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

17.权利要求15的方法，其中所述另一抗性基因是编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因。

18.权利要求15的方法，其中另一抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。

19.载体，其含有权利要求13或14任一项的多核苷酸或者包含所述多核苷酸和另一抗性基因或者所述载体通过制备重组载体的方法产生，该方法包括将所述多核苷酸插入到载体中或者插入所述多核苷酸和编码另一抗性蛋白质的核酸到载体中。

20.权利要求19的载体，其中编码Rpi-blb2蛋白质或者编码所述另一抗性蛋白质的多核苷酸有效连接表达控制序列和/或有效连接编码转基因表达调节信号的核酸序列，所述调节信号允许在原核或者真核宿主细胞中表达。

21.权利要求20的载体，其中表达控制序列与编码Rpi-blb2蛋白质或者另一抗性蛋白质的多核苷酸为相同物种来源。

22.权利要求19的载体，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

23.权利要求19的载体，其中所述另一抗性基因是编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因。

24.权利要求19的载体，其中所述另一抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。

25.权利要求20的载体，其中所述宿主细胞选自根据SystemaNaturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

26.权利要求20的载体，其中所述宿主细胞来自茄科。

27.权利要求26的载体，其中所述宿主细胞来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

28.产生重组宿主细胞的方法，其包括向宿主细胞导入权利要求19的载体或者导入所述载体和表达另一抗性蛋白质的载体。

29.权利要求28的方法，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

30.权利要求28的方法，其中用于表达所述另一抗性蛋白质的载体包含编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因。

31.权利要求28的方法，其中所述另一抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。

32.权利要求28的方法，其中所述细胞选自根据Systema Naturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

33.权利要求28的方法，其中所述宿主细胞来自茄科。

34.权利要求33的方法，其中所述宿主细胞来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

35.宿主细胞，其通过权利要求28的方法产生。

36.宿主细胞，其用权利要求13的多核苷酸基因工程化或者用所述多核苷酸和表达另一抗性蛋白质的多核苷酸基因工程化。

37.宿主细胞，其用权利要求19的载体基因工程化或者用所述载体和表达另一抗性蛋白质的载体基因工程化。

38.权利要求35到37任一项的宿主细胞，其是大肠杆菌、杆状病毒、农杆菌或者植物细胞。

39.权利要求35到37任一项的宿主细胞，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

40.权利要求35到37任一项的宿主细胞，其中所述另一抗性基因是编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因。

41.权利要求35到37任一项的宿主细胞，其中所述另一抗性蛋白是Rpi-blb蛋白。

42.权利要求38的宿主细胞，其中所述植物细胞选自根据SystemaNaturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

43.权利要求35到37任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自茄科。

44.权利要求43的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

45.产生Rpi-blb2多肽的方法，其包括培养权利要求35到37任一项的宿主细胞并从培养基或者宿主细胞回收所述多核苷酸编码并通过所述宿主细胞表达的多肽。

46.多肽，其由权利要求13或14的多核苷酸编码的氨基酸序列组成或者可以通过这样的方法得到并且具有Rpi-blb2活性，所述方法包括培养权利要求35到37任一项的宿主细胞并且从培养基或者宿主细胞回收所述多核苷酸编码并通过所述宿主细胞表达的多肽。

47.抗体，其特异结合权利要求46的多肽。

48.反义核酸分子，其由权利要求13或14的多核苷酸的互补序列组成。

49.产生转基因植物、植物细胞或者植物组织或植物部分的方法，该方法包括向所述植物、植物组织或者植物细胞或植物部分的基因组导入权利要求13或14的多核苷酸或者所述多核苷酸和编码另一抗性蛋白质的多核苷酸，或者权利要求19的载体。

50.权利要求49的方法，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

51.权利要求49的方法，其中另一抗性基因由编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的多核苷酸组成。

52.权利要求49的方法，其中所述另一抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。

53.权利要求49的方法，其中所述植物细胞、植物组织或植物选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

54.权利要求53的方法，其中所述植物细胞、植物组织或植物来自茄科。

55.权利要求54的方法，其中所述植物细胞、植物组织或植物来自S.bulbocastanum、马 铃 薯 (S.tuberosum)、番 茄 (S.lycopersicum或 Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten exFarwell)、矮牵 牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄 子(S.melongena)。

56.植物细胞，其包含权利要求13的多核苷酸、或包含所述多核苷酸或者包含所述多核苷酸和另一抗性基因的载体，或者通过制备重组载体的方法得到，该方法包括将所述多核苷酸插入到载体中或者插入所述多核苷酸和编码另一抗性蛋白质的核酸到载体中。

57.通过权利要求49的方法得到的植物细胞。

58.根据权利要求56或57任一项的植物细胞，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

59.根据权利要求56或57任一项的植物细胞，其中所述另一抗性基因是编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因。

60.根据权利要求56或57任一项的植物细胞，其中所述另一抗性蛋白是Rpi-blb蛋白。

61.根据权利要求56或57任一项的植物细胞，其中所述植物细胞选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

62.权利要求61的植物细胞，其中所述植物细胞来自茄科。

63.权利要求62的植物细胞，其中所述植物细胞来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

64.产生抗卵菌门植物病原体的植物或其部分的方法，该方法包括步骤：

在所述植物或其部分中表达权利要求46的多肽和另一抗性蛋白质。

65.产生对疫霉具有持久抗性的植物或其部分的方法，该方法包括在植物或者其部分中共表达Rpi-blb和Rpi-blb2蛋白质或者权利要求46的多肽。

66.权利要求64的方法，其中所述植物病原体是腐霉目(Pythiales)或者霜霉目(Peronosperales)的病原体。

67.权利要求66的方法，其中所述植物病原体是致病疫霉、红腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种、莴苣盘梗霉、烟草霜霉(Peronospora tabaci)或者葡萄生单轴霉。

68.权利要求64或66或67任一项的方法，其中所述抗性蛋白质的特征是P-环和NBS结构域。

69.权利要求64或66或67任一项的方法，其中所述另一抗性蛋白质由编码Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因编码。

70.权利要求64或66或67任一项的方法，其中所述另一抗性蛋白质是Rpi-blb蛋白质。

71.权利要求64或65任一项的方法，其中所述植物选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

72.权利要求71的方法，其中所述植物来自茄科。

73.权利要求72的方法，其中所述植物来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersiconlycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

74.权利要求13或14任一项的多核苷酸、权利要求19的载体，或者权利要求46的多肽的用途，用于产生抗卵菌门植物病原体的植物或植物组织、植物器官或植物细胞或其部分。

75.权利要求74的用途，其中所述植物病原体是腐霉目(Pythiales)或者霜霉目(Peronosperales)病原体。

76.权利要求75的用途，其中所述植物病原体是致病疫霉、红腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种、莴苣盘梗霉、烟草霜霉(Peronospora tabaci)或者葡萄生单轴霉。

77.权利要求74的用途，其中所述植物、植物细胞或植物组织选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

78.权利要求77的用途，其中所述植物、植物细胞或植物组织来自茄科。

79.权利要求78的用途，其中所述植物、植物细胞或植物组织来自S.bulbocastanum、马 铃 薯(S.tuberosum)、番 茄(S.lycopersicum 和Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten exFarwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨 瓜(S.muricatum)或茄 子(S.melongena)。

80.鉴定刺激针对卵菌门植物病原体的抗性的化合物的方法，其包括：

a)在细胞培养条件下将表达权利要求46的多肽或者其mRNA的细胞与候选化合物接触；

b)测定所述多肽或者所述mRNA表达的增加；

c)比较不存在所述候选化合物时，做出的对标准应答的表达水平；

从而相对于标准增加的表达表明所述化合物刺激抗性。

81.权利要求80的方法，其中所述植物病原体是腐霉目(Pythiales)或者霜霉目(Peronosperales)病原体。

82.权利要求81的方法，其中所述植物病原体是致病疫霉、红腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种、莴苣盘梗霉、烟草霜霉(Peronospora tabaci)或者葡萄生单轴霉。

83.权利要求13或14的多核苷酸、权利要求19的载体、权利要求46的多肽或者权利要求47的抗体的用途，用于鉴定和/或产生激活或者刺激植物对卵菌门植物病原体的抗性的化合物。

84.权利要求83的用途，其中所述植物病原体是腐霉目(Pythiales)或者霜霉目(Peronosperales)病原体。

85.权利要求84的用途，其中所述植物病原体是致病疫霉、红腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、寄生疫霉烟草致病变种、莴苣盘梗霉、烟草霜霉(Peronospora tabaci)或者葡萄生单轴霉。

86.权利要求83的用途，其中所述植物选自根据Systema Naturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

87.权利要求86的用途，其中所述植物来自茄科。

88.权利要求87的用途，其中所述植物来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersiconlycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

89.诊断组合物，其包含权利要求13或14的多核苷酸、权利要求19的载体、权利要求

47的抗体或者权利要求48的反义核酸。

90.试剂盒，其包含权利要求13或14的多核苷酸、权利要求19的载体、权利要求35到

37的宿主细胞、权利要求46的多肽、权利要求48的反义核酸、权利要求47的抗体、权利要求56或57的植物细胞、和任选编码Rpi-blb的多核苷酸、Rpi-blb蛋白质或者针对Rpi-blb的抗体。

91.权利要求90的试剂盒，其中所述植物细胞选自根据SystemaNaturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

92.权利要求91的试剂盒，其中所述植物细胞来自茄科。

93.权利要求92的试剂盒，所述宿主细胞来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番 茄 (S.lycopersicum或Lycopersiconlycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

94.产生提供权利要求13或14的多核苷酸、权利要求19的载体或权利要求46的多肽的植物作物保护剂的方法，其包括权利要求80到82任一项的方法的步骤；和以农业组合物可以应用的形式配制权利要求13或14的多核苷酸、权利要求19的载体、或权利要求46的多肽或权利要求80的步骤(c)中鉴定的化合物。

95.权利要求94的方法，其中所述植物选自根据Systema Naturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、印茄树科(Goetzeaceae)、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科构成的组。

96.权利要求95的方法，其中所述植物细胞来自茄科。

97.权利要求96的方法，其中所述植物细胞来自S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersicon lycopersicum(L.)Karsten ex Farwell)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、梨瓜(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。

说明书全文

真菌抗性植物和它们的用途

[0001] 本发明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，优选马铃薯和番茄对卵菌(Oomycetes)门的植物病原体的抗性的新方法，所述方法包括增加本发明多肽的活性。本发明还涉及多核苷酸和包含这些多核苷酸的载体。本发明还涉及相应的载体、细胞、转基因植物和来自它们的转基因繁殖材料，涉及产生它们的方法，还涉及它们用于生产粮食、饲料、种子、药物或者精细化学品的用途。
[0002] 植物生物技术工作的目的是产生具有有益的新性质的植物，例如，用于增加农业生产力，增加粮食质量，或者产生特定化学品或者药物(DunwellJM(2000)J Exp Bot51 Spec No：487-96)。植物对于病原体的天然防御机制通常是不足的。仅真菌病就导致每年几亿美元的产量损失。导入来自植物、动物或者微生物来源的外来基因可以增加防御。实例是通过表达处于35SCaMV启动子控制下的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素保护烟草免于昆虫的摄食损害(Vaeck等人(1987)Nature328：33-37)或者通过表达处于CaMV启动子控制下的豆几丁质酶保护烟草免于真菌感染(Broglie等人(1991)Science254：1194-1197)。然而，所描述的多数方法仅仅提供了对一种病原体或者窄范围病原体的抗性。
[0003] 尽管19世纪中叶众所周知的爱尔兰马铃薯饥荒，晚疫仍然是农作物植物中所有疾病最具破坏性的疾病之一。晚疫由卵菌真菌致病疫霉(Phytophthora infestans)导致，致病疫霉是一种特化病原体，其主要在许多茄科物种，尤其马铃薯和番茄的叶子和果实上导致疾病。首次在墨西哥观察到该真菌，由于几种原因，认为墨西哥是该真菌的起源中心。在例如Toluca地区提取永久存在两种交配型A1和A2。而且，有报导在墨西哥的偏远地区的当地茄属物种上存在致病疫霉。此外，在墨西哥发现具有块茎茄属的许多种具有对晚疫的高水平抗性。预防农作物死亡或者产量减小的主流措施意味着应用杀真菌剂防止或者治疗致病疫霉导致的感染。代替化学杀虫剂的大量使用用于控制晚疫的备选方法是有益的：
使用栽培种，其具有对晚疫的部分或者完全抗性。为了得到晚疫抗性，培育者在过去专注于来自墨西哥本地一种野生马铃薯种Solanum demissum的显性R基因的渐渗现象。已经鉴定了11种此类基因，它们的一些已经定位到马铃薯的遗传学图的特定基因座(Gebhardt和Valkonen，2001中综述)并且最近已经克隆了R1基因。R1和R2分别位于5号和4号染色体。
R3、R6和R7位于11号染色体上。赋予对晚疫的品种特异抗性的未知R基因也已经在马铃薯andigena亚种(S.tuberosum ssp.andigena)和S.berthaultii与S.pinnatisectum中描述。在任何情况下，这些R基因诱导的抗性(几乎)是完全的但是似乎不能持久。因为高水平抗性和容易转移，所以许多栽培种含有S.demissum衍生的抗性。不幸的是，S.demissum衍生的品种特异抗性尽管几乎是完全的，但是不是持久的。一旦在商业田间中以大规模生长新近培育的马铃薯栽培种，就出现致病疫霉的新毒性，其使得该病原体能够克服渐渗的抗性。在一些墨西哥和中南美洲茄属种中可以发现对晚疫的更持久的田间抗性，其通常可以在本质上定量并且认为是品种非特异的。然而，通过杂交和表型选择通常难以将该类型的抗性转移到马铃薯栽培种中。
[0004] 来自墨西哥和危地马拉的二倍体S.bulbocastanum是一种具有块茎的物种，很久以来就知道它对晚疫具有高水平抗性。不幸的是，由于倍性和胚乳平衡数(EBN)中的困难，通常不能实施将抗性从茄属物种转移到培育的马铃薯的经典转移。尽管有这些困难，但是S.bulbocastanum抗性性状的渐渗已经取得了成功。最近，发现S.bulbocastanum和马铃薯的体细胞杂种和回交的种质即使在极大的疾病压力下也对晚疫是高度抗性的(Helgeson等人，1998)。尽管有重组抑制的报导，但是回交材料中的抗性似乎在8号染色体内RFLP标记CP53和CT64之间的约6cM间隔上。来自番茄RFLP探针CT88的CAPS标记与抗性共分离。
[0005] 因此，近年来，对卵菌门病原体抗性植物的开发稳步前进。然而，对可用的种质的40年的深入和持续的研究和育种工作仍然没有导致在市场上引入抗性栽培种。近年来鉴定的多数基因仅仅是品种特异抗性。此外，所实现的抗性不是持久的。此外，普遍认为植物保护剂的应用造成环境负担。从而，在一些西方国家，法律变得更严格并且部分禁止应用特定杀真菌剂，使得疾病的化学控制更加困难。此外，化学控制是昂贵的。最后，另一个限制是世界上许多国家已经报导真菌产生了对特定杀真菌剂如甲霜灵的抗性。因此，本发明的根本问题是提供有效保护植物免于晚疫和相关疾病的新手段和方法。
[0006] 通过提供权利要求中表征的实施方案解决了技术问题。
[0007] 因此，本发明涉及产生或者增加植物对卵菌门植物病原体的抗性的方法，其包括增加植物或植物或其部分中组织、器官或细胞中Rpi-blb2蛋白质的活性。
[0008] Rpi-blb2是LZ-NBS-LRR型R基因并且显示出与赋予对三种根结线虫(Meloidogyne spp.)的抗性的番茄基因Mi-1以及与马铃薯蚜虫马铃薯长管蚜
(Macrosiphum euphorbiae)(Vos等人，1998；Rossi等人，1998；Milligan等人，1998)和与粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci))(Nombela等人，2003)的B-和Q-生物型的序列同源性。
如对于Rpi-blb所发现的，Rpi-blb2也赋予对携带多种毒性因子的一系列致病疫霉分离物的完全抗性，并且还没有表现出品种特异性。
[0009] 术语“Rpi-blb2”指编码具有本文提到的Rpi-blb2蛋白质活性的多肽的多核苷酸或者具有所述Rpi-blb2蛋白质活性的多肽。下文中术语“Rpi-blb2”涉及多肽还是多核苷酸可以从其使用的上下文中明确。
[0010] 术语“产生”或“增加”或“刺激”“植物的抗性”指与参照相比，增加或产生或刺激了植物或其部分的抗性。
[0011] “赋予”、“现有”、“产生”、“刺激”或“增加”病原体抗性指在相同条件(例如，气候条件、生长条件、病原体种类等等)下，与没有应用根据本发明方法的野生型植物相比，由于应用了根据本发明的方法，特定植物种或者变种的防御机制对一种或多种病原体的抗性增加。增加的抗性优选表现在疾病症状表现的减小，疾病症状除了包括上面提到的不利效果外还包括例如病原体进入植物或者植物细胞的穿透效率或者病原体在植物或植物细胞内部或者上面的繁殖效率。在该上下文中，疾病症状优选减小至少10％或至少20％，尤其优选至少40％或60％，非常特别优选至少70％或80％，最优选至少90％或95％。
[0012] 术语“增加的”在此指基因产物活性比参照中的活性高。从而，术语“增加的”包括如果在参照中没有发现活性(例如，本文描述的Rpi-blb2活性)，那么重新产生的该活性(例如，Rpi-blb2基因产物或者另一种基因产物的活性)。术语“增加的”还涉及基因产物活性的刺激。可以以多种方法刺激基因的增加的表达，即它的活性，所述方法为例如对生物应用化学品或者通过生物应激。例如，通过用寄生虫，例如，用致病疫霉感染可以激活针对感染性寄生虫介导基因的抗性并且该抗性赋予对相同和/或其他病原体的增加的抗性。
[0013] 从而，在下文中，术语“增加”还包括术语“刺激”和“产生”。
[0014] “病原体抗性”表示病原体感染后植物的疾病症状的减轻或者减弱。症状可以是多样的，但是优选包括对植物的质量、产量、用作饲料或粮食的适宜性直接或间接具有不利影响，或者使得播种、种植、收获或加工农作物困难的那些症状。
[0015] 在本发明范围内“病原体”作为实例但不作为限制指病毒或者类病毒、细菌、真菌、动物害虫，如昆虫或者线虫。
[0016] 术语“Rpi-blb2”蛋白质涉及蛋白质或多肽，其在植物或植物部分中的表达与非抗性株系相比赋予该植物或植物部分对本文描述的病原体的抗性。
[0017] 与具有相同遗传背景但是没有允许Rpi-blb2的表达必需的遗传元件的植物或者其部分(本文称作“野生型”或者“参照”)相比，包含Rpi-blb2蛋白质的增加的活性的植物或植物组织、或者细胞或者植物部分对于病原体，尤其卵菌门病原体，优选对于致病疫霉的敏感性较低。测试植物或者其部分的抗性的测定法是本领域技术人员熟知的。对致病疫霉的抗性可以定义为根据Flier，2001的孢子形成指数。Flier将孢子形成指数描述为每2 2
1cm 孢子形成水平。从而，与野生型相比每1cm 孢子形成的20％减少在本文定义为抗性。
在阐明本发明的实施例中，孢子形成指数定义为每个病灶孢子形成的水平。从而，术语“抗性”可以备选地指与野生型相比每个病灶孢子形成减少20％。优选后一定义。
[0018] 在优选实施方案中，在测定中孢子形成减少30％，更优选减少50％，甚至更优选减少70％，更优选减少80％以上，更优选减少85％和90％。最优选减少95％或以上。
[0019] 因此，在本发明中，Rpi-blb2蛋白质的“活性”指蛋白质表达赋予孢子形成指数的所述减少。此外，观察到含有Rpi-blb2的植物对致病疫霉感染的典型应答是在生长期结束时存在小病灶，没有明显的孢子形成。从而，在一个实施方案中，Rpi-blb2的活性定义为在所描述的实验中存在没有任何明显孢子形成的小病灶。Rpi-blb2抗性表现出坏死区域，其含有低水平孢予形成。用离脱叶进行的实验例证了Rpi-blb2的活性。该实验在实施例17和图18中描述。Rpi-blb2和其他致病疫霉抗性基因之间的差异是Rpi-blb2允许低水平孢子形成(图18)。在其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在病灶的离脱叶测定显示了低水平孢子囊，而含有S.demissum基因R2的基因型上完全没有孢子囊。孢子形成指数为敏感表型(cv.Bintje)的仅1.1％。
[0020] 田间实验也表明Rpi-blb2允许低水平感染。在生长期期间(图3，ARF87-801)或者生长期结束时(图2，ARF87-601；图3，ARF87-507和ARF87-601)产生晚疫症状。
[0021] 从而，在一个实施方案中，Rpi-blb2的活性还定义为在植物中表达后导致坏死区中含有如所述实验中描述的低水平孢子形成。
[0022] 从而，在一个实施方案中，本发明的方法产生显示出含有低水平孢子形成或更低水平孢予形成的坏死区的植物。
[0023] 术语“参照”涉及生物或者其部分，例如，细胞，所述生物或者其部分在基因组、蛋白质组和/或代谢组与相关生物或者其部分，例如细胞，例如，与本发明的植物基本相同。
[0024] 从而，术语“参照”涉及例如生物或者其部分，例如，细胞，所述生物或者其部分在遗传、蛋白质组和/或代谢上与本发明的生物或者其部分基本相同，但是由于在参照的基因组、蛋白质组或者代谢组中存在相关差异，不能观察到它的特定基因产物(例如，Rpi-blb2)的活性。从而，参照可以是不表达或者表达很少相关活性基因产物的植物或者其部分，例如，它不编码Rpi-blb2或者不转录Rpi-blb2编码基因或者不翻译活性Rpi-blb2mRNA。从而，参照不提供产生足量活性基因产物而导致所述表型的修饰。两种植物是否基本上在遗传上相同可以用本领域技术人员已知的测定法测试，例如，如用Roldan-Ruiz，Theor.Appl.Genet.，2001，1138-1150描述的指纹分析测试。可以如本领域描述的测试蛋白质的表达模式，例如，用通过凝胶电泳(一维、二维、三维)、质谱分析和例如，在www.waters.com，www.proteine.org.au，www.proteomesci.com，www.sdu.dk/Nat/CPA中描述的其他方法进行。技术人员按照本领域描述的可以分析代谢组，例如，通过HPLC、GC、OPLC、LC-MS、GC-MS、LC-MS-MS和例如，在www.metabolic-explorer.com，www.ki.se/icsb2002/pdf/ICSB_209.pdf，www.genomics.rug.nl/technologies.htm，Fiehn等人，Nature Biotech，18(2000)，1157，Raamsdonk等人，Nature Biotech，19(2991)，45-50，Buchholz，Anal.Biochem，295(2001)129-137，Soga等人，Anal Chem.74(2002)2233-2239中描述的其他方法实施所述分析。
[0025] 为了增加对病原体的抗性，参照生物或者其部分对于病原体，例如植物病原体，例如，致病疫霉的感染是敏感的。
[0026] 优选地，参照是生物的克隆，该克隆中例如，已经导入相关多核苷酸，例如，本发明的多核苷酸，或者激活剂，例如，介导活性的相关基因产物的激活剂，例如，增加相关多核苷酸或者所述多核苷酸衍生物的表达的激活剂，或者相关多肽，例如本发明多肽的激活剂，和/或相应的相关基因产物编码载体。例如，本发明方法中的优选参照是生物或者其部分，其是生物的克隆或者其部分，例如，细胞，所述克隆或者其部分已经用本发明的多核苷酸或者载体转染或者转化。
[0027] 如果不能鉴定所述克隆，本领域技术水平是切除或者敲除或者关闭基本上介导相关活性的那些元件，所述相关活性为例如介导增加的Rpi-blb2活性，例如，介导生物，例如植物中增加的表达。本领域技术人员公知怎样减小或者抑制相关基因产物的活性，例如通过减小或者抑制例如Rpi-blb2的表达。然后此类克隆可以与根据本发明的方法产生的生物，例如，与致病疫霉抗性、表达Rpi-blb2的基因型生物比较。
[0028] 本文所用的术语“植物”指植物界的高等和低等植物的所有属和种。该术语包括成熟植物、种子、芽和幼苗和它们的衍生部分、繁殖材料、植物器官、组织、原生质体、愈伤组织和其他培养物，例如，细胞培养物，和给予功能或结构单位的任意其他类型的植物细胞分组。“成熟植物”指幼苗之外的任意希望的发育阶段的植物。幼苗指在早期发育阶段的幼小的不成熟植物。“植物”包括所有一年生和多年生单子叶植物和双子叶植物。本发明范围内优选为用作粮食或者饲料的那些植物，例如，单子叶或者双子叶属，尤其种，像上述种，例如，分别谷类种或者茄科的成员，最优选马铃薯和番茄。
[0029] 如本领域技术人员已知的，本发明的方法还包括选择那些植物，在所述植物中与参照植物相反或相比，对至少一种所述病原体的抗性已经存在或者增加。
[0030] 关于其中与参照植物相反或相比，对至少一种所述病原体的抗性已经存在或者增加的植物的“选择”指适于识别针对病原体的现有或者增加的抗性的所有那些方法。这些可以是病原体感染的症状，但是也可以包括本文描述的症状，其涉及植物的质量、产量、用作饲料或者粮食的适宜性等等。
[0031] 因此，在本发明方法的一个实施方案中，Rpi-blb2蛋白质由包含核酸分子的多核苷酸编码，所述核酸分子选自：
[0032] a)编码SEQ ID NO：2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；
[0033] b)核酸分子，其包含编码所述多肽的至少成熟形式的如SEQ IDNO：1或3，或5或6中描绘的编码序列；
[0034] c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；
[0035] d)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列的一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽衍生；
[0036] e)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)或(b)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有70％或以上的同一性；
[0037] f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表位的部分；
[0038] g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARF1 F和ARF1 R从核酸文库扩增的核酸分子的序列；
[0039] h)核酸分子，其编码(a)到(g)任一项编码的多肽的以氨基酸：1、30、50、100、200、300、500或1000开始并以氨基酸1276、1000、500、300、200、50、30、或1结束的片段；
[0040] i)包含(a)或(d)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；
[0041] j)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(h)任一项的核酸分子编码的多肽产生的单克隆抗体识别；
[0042] k)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(j)任一项的核酸分子或者其至少15个，优选30、60、100或更多核苷酸的片段的序列的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和[0043] l)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(k)任一项的核酸分子杂交；
[0044] 或者(a)到(l)任一项的互补链；
[0045] 或者表达Solanum bulbocastanum的连锁群6的区段编码的多肽，所述区段与选自表3A的标记共分离，并且所述多肽介导对病原体，尤其选自卵菌门病原体的抗性。
[0046] 在一个实施方案中，本发明方法的多核苷酸不由Seq.ID NO.：7和/或9中描述的序列组成和/或不由编码Seq.ID NO.：8和/或10中描述的蛋白质的核酸分子的序列组成。
[0047] 在一个实施方案中，本发明方法的多核苷酸不由Mil.1或者Mil.2的核酸分子的序列组成和/或不由编码Mil.1或者Mil.2蛋白质的核酸分子的序列组成。
[0048] 从而，在一个实施方案中，本发明方法的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA95：9750-9754，Milligan等人，1998.Plant Cell 10：1307-1319；和/或WO9806750中所示的序列组成。在图15和17中显示了Rpi-blb2、Mil.1和Mil.2的序列比较。
[0049] 本文所用术语“连锁群”涉及两种或多种性状和/或基因座和/或基因和/或标记，它们由于所述性状和/或基因座和/或基因和/或标记之间的关联而倾向于一起遗传。性状和/或基因座和/或基因和/或标记越密切，在DNA修复或者复制过程，如真核生物中有丝分裂或减数分裂期间它们分离的概率越低，从而它们将一起遗传的概率越大。连锁群与染色体的同源对一样多。
[0050] 术语“连锁群6”涉及与6号染色体关联的马铃薯或番茄的连锁群，通过基于Bernatzky和Tanksley(1986)和Tanksley等人(1992)发表的工作鉴定已知染色体位置的标记建立此类关联。连锁群具有与它们的各自染色体相同的编号。在番茄中，根据粗线期测量的染色体的长度对染色体编号。此类编号已经由Barton(1950)采用；1号染色体是最长的，12号染色体是最短的。除了长度，诸如着丝粒的位置和异染色质的量和分布的特征用于鉴定每个染色体。短臂通过“S”表示，长臂用“L”表示；从而如在Barton，D.W.(1950)American Journal of Botany.37，639-643，Bernatzky，R. 和 Tanksley，S.D.(1986)Genetics 112，887-898，Tanksley，S.D.，等人，(1992)Genetics 132，1141-1160中，“1S””表示1号染色体的短臂。
[0051] 本文所用术语“共分离”涉及两种或多种紧密连锁的性状和/或基因座和/或基因和/或标记倾向于一起遗传。
[0052] 例如，6号染色体的与Rpi-blb2共分离的更具体的区域是短臂，其在番茄中具有形态学标记Mi。
[0053] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的方法，其中Rpi-blb2蛋白质由本发明的多核苷酸编码，例如，由Seq.ID.1或3或5或6中所示的多核苷酸或者其片段编码。
[0054] 基于BLASTX检索，与所鉴定的Rpi-blb2序列具有最高同源性的所鉴定基因是Mil.1和Mil.2基因和蛋白质；见图15和17。两种基因都与Seq.ID.1或3或5或6中描述的序列具有高同一性但是不赋予对卵菌门植物病原体的抗性。因此，Mil.1和Mil.2的活性不同于本发明多肽活性。Mil.1和Mil.2ORF的序列和编码蛋白质在本文中以Seq.ID NO.：7到10显示。此外，申请EP401764.4涉及Mi-基因。现有技术Mil.1-和Mil.2-基因的序列排除在本发明多核苷酸之外，具体排除Seq.ID NO.：7和9。还包括编码Seq.ID NO.：8或10的多肽的多核苷酸序列。从而，在一个实施方案中，还排除编码Mil.1和Mil.2蛋白质的序列。与本发明的多核苷酸编码的多肽具有较低同源性的蛋白质是Hero抗性蛋白质
1和2(Genbank检索号：gi26190252和gi26190254)、番茄斑萎病毒(Tospovirus)抗性蛋白质A、B、C、D和E[Genbank检索号：gi15418709、gi15418710、gi15418712、gi15418713、gi15418714]；R1[Genbank检索号：gi17432423]和Prf[Genbank检索号：gi8547237]，它们的序列或者编码的序列也排除在本发明的序列之外。
[0055] 本文中所用术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或者“核酸分子”指任意长度的核苷酸的聚合形式，可以为核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。
[0056] 从而，该术语包括双链和单链DNA和RNA。它还包括已知类型的修饰，例如，甲基化、一个或多个天然发生的核苷酸用类似物的“帽”替代。优选地，本发明的DNA序列包含编码本文定义的多肽的编码序列。
[0057] “编码序列”是核苷酸序列，当置于适宜的调节序列的控制下时，所述核苷酸序列转录成mRNA和/或翻译成多肽。由5’末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码子决定编码序列的界限。编码序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或者基因组DNA，而在某些条件下也可以存在内含子。
[0058] “杂交”指此类核酸分子在常规杂交条件下，优选在如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))描述的严格条件下杂交。此类严格杂交条件的一个实例是在4×SSC65℃下杂交，然后在0.1×SSC65℃下洗涤1小时。备选地，代表性严格杂交条件是在50％甲酰胺，4×SSC中，42℃下。此外，洗涤步骤期间的条件可以选自低严格条件(约
2×SSC50℃下)和高严格条件(约0.2×SSC50℃，优选65℃下)界定的条件范围(20×SSC：
0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH7.0)。此外，洗涤步骤期间的温度可以从室温，约22℃的低严格条件升高到约65℃的高严格条件。两种参数：盐浓度和温度可以同时改变或者两个参数之一可以保持恒定而仅另一个改变。在杂交期间可以使用变性剂，如甲酰胺或者SDS。在50％甲酰胺存在下，优选在42℃实现杂交。下面显示了杂交和洗涤步骤条件的一些其他实例：
[0059] (1)例如，可以从下面的条件选择杂交条件：
[0060] a)4×SSC 65℃，
[0061] b)6×SSC 45℃，
[0062] c)6×SSC，100mg/ml变性片段化鱼精DNA，68℃
[0063] d)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性鲑精DNA，68℃，
[0064] e)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，42℃，[0065] f)50％甲酰胺，4×SSC42℃，
[0066] g)50％(体积/体积)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃，
[0067] h)2×或4×SSC，50℃(低严格条件)，或
[0068] i)30到40％甲酰胺，2×或4×SSC，42℃(低严格条件)。
[0069] (2)例如，可以从下面的条件选择步骤：
[0070] a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃，
[0071] b)0.1×SSC 65℃，
[0072] c)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃，
[0073] d)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，42℃，
[0074] e)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃，
[0075] f)0.2×SSC65℃(低严格条件)。
[0076] 在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含多核苷酸，其与包含或者由具有Seq ID No.1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子组成的核酸分子杂交。所述片段包含或者优选由Seq ID No.1或3或5或6的15、20、30、40、70、100、300、500、700、1000或更多残基组成。
[0077] 在优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含在“严格”杂交条件下与包含或者由具有Seq ID No.1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子组成的核酸分子杂交的多核苷酸。
[0078] 本文所用的术语“在严格杂交条件下”指任一种本文提到的严格杂交条件。在另一实施方案中，术语“在严格杂交条件下”指在实施例中提及或在Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)中所用的杂交条件。
[0079] 在一个优选实施方案中，本文所用的术语“在严格杂交条件下”指所有本文提到的严格杂交条件，表示多核苷酸在所有提到的严格条件下杂交。
[0080] 来自其他生物的Rpi-blb2可以由其他DNA序列编码，所述序列在松弛杂交条件下与Seq ID No.1或3或5或6中所示序列杂交并且表达时编码具有Rpi-blb2的活性的肽。此外，一些应用必须在低严格杂交条件下进行，对杂交的特异性没有任何影响。例如，可以用本发明的多核苷酸探测总DNA的DNA印迹分析并在低严格条件(55℃，2×SSPE，0.1％SDS中)下洗涤。杂交分析可以揭示仅编码Rpi-blb2的基因的简单模式。此类低严格杂交条件的另一实例是4×SSC 50℃下，或者用30到40％甲酰胺在42℃杂交。此类分子包含本发明的Rpi-blb2的片段、类似物或者衍生物并且例如通过单独或组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、替代、加入和/或重组或本领域已知的任何其他修饰而与上述氨基酸序列或者它们潜在的核苷酸序列不同。然而，优选使用高严格杂交条件。
[0081] 术语“同源”指各自核酸分子或者编码的蛋白质在功能和/或结构上等价。与上述核酸分子同源并且是所述核酸分子衍生物的核酸分子为例如，所述核酸分子代表修饰的变异，其具有相同的生物功能，尤其编码具有相同或基本上相同生物功能的蛋白质。它们可以是天然发生的变异，如来自其他植物变种或品种的序列，或者突变。这些突变可以天然发生或者可以通过诱变技术得到。等位基因变异可以是天然发生的等位基因变体以及合成产生或者基因工程化的变体。通过例如，测试所述多肽与抗体的结合可以鉴定结构等价物。结构等价物具有相似的免疫学特征，例如，包含相似的表位。
[0082] 术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”指所指的最初序列的截短的序列。截短的序列(核酸或者蛋白质序列)可以在长度上变化很大；最小尺寸是提供具有所指最初序列的相当功能和/或活性的序列的足够大小的序列；而最大尺寸不是关键的。在一些应用中，最大尺寸通常不显著大于提供最初序列的所希望的活性和/或功能所需的尺寸。
[0083] 通常，截短的氨基酸序列将长为约5到约1260个氨基酸。然而，更典型地，该序列将最大长约1000个氨基酸，优选最大约500或100个氨基酸。通常希望选择具有至少约10、12或15个氨基酸，多达最大约20到约25个氨基酸的序列。
[0084] 术语“表位”涉及抗原内的特异免疫反应位点，也称作抗原决定簇。这些表位可以是聚合成分中单体的线阵-如蛋白质中的氨基酸-或者组成为或者包含更复杂的二级或者三级结构。技术人员将认识到所有免疫原(即，能够引起免疫应答的物质)都是抗原；然而，一些抗原(如半抗原)不是免疫原，但是通过偶联载体分子可以称为免疫原性的。术语“抗原”包括对物质的参考，可以产生针对该物质的抗体和/或该抗体对该物质是特异免疫反应的。在一个实施方案中，本发明涉及Rpi-blb2的表位。
[0085] 术语“一个或几个氨基酸”涉及至少一个氨基酸但是不多于将导致低于70％同一性的同源性的氨基酸数。优选地，同一性多于75％或80％，更优选为85％、90％或95％，甚至更优选为96％、97％、98％或99％同一性。
[0086] 术语“多核苷酸”和“核酸分子”还涉及“分离的”多核苷酸或者核酸分子。“分离的”核酸分子是与存在于该核酸的天然来源的其他核酸分子分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸没有这样的序列，其天然地在所述核酸所来源的生物的基因组DNA中所述核酸的侧翼(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)。例如，在多种实施方案中，本发明的多核苷酸可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb或更少的核苷酸序列，其天然位于所述核酸所来源的生物的基因组DNA中所述核酸分子的侧翼。此外，本发明的多核苷酸，尤其“分离的”核酸分子，如cDNA分子，当通过重组技术产生时可以基本上无其他细胞材料，或者培养基，或者当化学合成时可以基本上无化学前体或者其他化学品。
[0087] 此外，本发明的多核苷酸包含与上述多核苷酸的核苷酸序列之一或者其部分互补的核酸分子。与Seq ID No.1或3或5或6中所示核苷酸序列之一互补的核酸分子是与Seq ID No.1或3或5或6中所示核苷酸序列之一足够互补的序列，从而它可以与Seq ID No.1或3或5或6中所示核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。
[0088] 本发明的多核苷酸还包含与Seq ID No.1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分至少约70％，优选至少约75％，更优选至少约80％、90％或95％，甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或以上同源的核苷酸序列。本发明的多核苷酸包含与Seq ID No.1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分杂交，优选在本文定义的严格条件下杂交的核苷酸序列。
[0089] 此外，本发明的多核苷酸可以包含SEQ ID No：1或3或5或6的序列之一的编码区的仅一部分，例如，可以用作探针或者引物的片段或者编码Rpi-blb2蛋白质编码基因的生物活性部分的片段。从当前Rpi-blb2蛋白质编码基因克隆确定的核苷酸序列允许产生探针和引物，它们设计用于鉴定和/或克隆它在其他细胞类型和生物中的同源物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列区，其在严格条件下与例如，SEQ ID No：1或3或5或6中提出的序列之一的反义链的至少约12、15个，优选约20或25个，更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交，例如与SEQ ID No：1或3或5或6中给出的序列之一的反义序列或者其天然发生的突变体杂交。基于本发明核苷酸的引物可以用于PCR反应中克隆Rpi-blb2同源物，例如，使用本发明的实施例中描述的引物，如表3a或3b中所示的引物，优选引物ARF1 F和ARF1 R。用引物univ24R和univ14L进行的PCR将导致Rpi-blb2的片段，其可以如本文描述的使用。所述引物组可以互换。本领域技术人员已知组合所述引物以得到所希望的产物，例如，得到全长克隆或者部分序列。基于Rpi-blb2核苷酸序列的探针可以用于检测编码相同或者同源蛋白质的转录物或者基因组序列。探针可以还包含连接该探针的标记物组，例如，标记物组可以是放射性同位素、荧光化合物、酶、或者酶辅因子。此类探针可以用作基因组标记测试试剂盒的部分用以鉴定表达Rpi-blb2的细胞，如通过测量细胞样品中Rpi-blb2编码核酸的水平，例如，通过检测Rpi-blb2 mRNA水平或者测定基因组Rpi-blb2基因是否已经突变或者缺失进行所述鉴定。
[0090] 本发明的多核苷酸编码多肽或者其部分，所述多肽或者其部分包括与SEQ ID No：2或4的氨基酸足够同源的氨基酸序列从而蛋白质或者其部分保持参与对病原体抗性，尤其植物中实施例中所描述的Rpi-blb2蛋白质活性的能力。如本文所用的，术语“足够同源的”指蛋白质或者其部分的氨基酸序列包括最小数目的与SEQ ID No：2或4的氨基酸序列相同或等价(例如，氨基酸残基与本发明的多肽序列之一中的氨基酸残基具有相似侧链)氨基酸残基，从而所述蛋白质或者其部分能够参与植物对所述病原体的抗性。在本文描述了Rpi-blb2蛋白质活性的实例。从而，Rpi-blb2蛋白质的功能直接或者间接有助于对植物病原体，优选对本文提到的病原体，更优选对致病疫霉的抗性。
[0091] 所述蛋白质至少约70％，优选至少约75％，更优选至少约80％、90％、95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或以上同源于SEQ ID No：2或4的完整氨基酸序列。
[0092] 本发明的多核苷酸编码的蛋白质的部分优选具有生物活性。
[0093] 如本文提到的，术语“生物活性部分”意在包括部分，例如，结构域/基序，所述部分赋予对卵菌植物病原体和/或烟粉虱(Bemisia tabaci)和/或蚜虫的抗性或者具有免疫学活性从而它结合特异结合Rpi-blb2蛋白质的抗体或者它具有实施例中给出或者本文描述的活性。
[0094] 通过分离SEQ ID No：1或3或5或6中序列之一的一部分，表达Rpi-blb2蛋白质或者肽的编码部分(例如，通过体外重组表达)并评估蛋白质的编码部分的活性可以制备编码本发明多肽的生物活性部分的额外的核酸片段。
[0095] 本发明还包括由于遗传密码简并性而与SEQ ID No：1或3或5或6(和其部分)中所示核苷酸序列之一不同从而编码SEQ ID No：2或4中所示序列编码的Rpi-blb2多肽的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸具有编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID No：2或4中所示氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸编码全长蛋白质，其与SEQ ID No：2或4中所示氨基酸序列基本上同源。
[0096] 此外，本领域技术人员将理解在群体(例如，S.bulbocastanum群体)内可以存在DNA序列多态性，其导致氨基酸序列中的改变。由于自然变异，Rpi-blb2基因中此类遗传多态性可以存在于群体内的个体间。
[0097] 如本文所用的，术语“基因”和“重组基因”指包含编码Rpi-blb2，优选S.bulbocastanum Rpi-blb2的可读框的核酸分子。此类天然变异通常可以导致Rpi-blb2基因的核苷酸序列中1-5％变异。本发明范围内意在包括由于天然变异导致并且不改变Rpi-blb2的功能活性的Rpi-blb2中的任意和所有此类核苷酸变异和所得氨基酸多态性。
[0098] 使用本发明的多核苷酸或者其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术，在严格杂交条件下，可以基于与本文公开的S.bulbocastanum Rpi-blb2多核苷酸的同源性分离相应于Rpi-blb2 cDNA的天然变体和非S.bulbocastanum同源物的多核苷酸。因此，在另一实施方案中，本发明的多核苷酸长为至少20个核苷酸。优选地，它在严格条件下与包含本发明多核苷酸的核苷酸序列，例如，SEQ ID No：1或3或5或6的核酸分子杂交。在其他实施方案中，所述核酸长为至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸。术语“在严格条件下杂交”如上定义并且意在描述杂交和洗涤条件，在该条件下相互至少65％同一的核苷酸序列通常保持相互杂交。优选地，所述条件使得相互至少约70％，更优选至少约75％或80％，甚至更优选至少约85％、90％或95％或以上同一的序列通常保持相互杂交。优选地，在严格条件下与SEQ ID No：1或3或5或6的序列杂交的本发明的多核苷酸相应于天然发生的核酸分子。
[0099] 如本文所用的，“天然发生的”核酸分子指具有天然发生的核苷酸序列的RNA或者DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。优选地，所述多核苷酸编码天然的S.bulbocastanum Rpi-blb2。
[0100] 除了可能存在于群体中的Rpi-blb2序列的天然发生的变体外，技术人员将还理解通过突变可以向编码Rpi-blb2的多核苷酸的核苷酸序列中引入改变，从而导致所编码的Rpi-blb2的氨基酸序列的改变，而不改变Rpi-blb2的功能能力。例如，可以在编码Rpi-blb2的核苷酸的序列中，例如，在SEQID No：1或3或5或6中进行导致在“非必需”氨基酸残基处氨基酸替代的核苷酸替代。“非必需”氨基酸残基是可以从Rpi-blb2蛋白质的野生型序列改变而不改变所述Rpi-blb2蛋白质活性的残基，而“必需”氨基酸残基是Rpi-blb2蛋白质活性所需的。然而，其他氨基酸残基(例如，在具有Rpi-blb2活性的结构域中不保守或者仅半保守的那些残基)可能对活性不是必需的，从而可能顺从改变而不改变Rpi-blb2活性。
[0101] 因此，本领域技术人员已知生物之间的密码子选择可以不同。因此，他将使得本发明的多核苷酸的密码子选择适于所述多核苷酸或者多肽在其中表达的生物的选择。
[0102] 因此，本发明涉及编码Rpi-blb2的多核苷酸，所述Rpi-blb2含有对Rpi-blb2活性不是必需的氨基酸中的改变。此类Rpi-blb2的氨基酸序列与SEQ ID No：2或4中所含序列不同，但是仍然保持本文所述的Rpi-blb2活性。所述多核苷酸可以包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与SEQ ID No：2或4的氨基酸具有至少约70％同一性的氨基酸序列并且能够参与对植物病原体的抗性。优选地，所述核酸分子编码的蛋白质与SEQ IDNo：2或4中的序列具有至少约70％同一性，更优选与SEQ ID No：2或4中序列之一具有至少约75％同一性，甚至更优选与SEQ ID No：2或4中序列具有至少约80％、90％、95％同源性，最优选与SEQ ID No：2或4中序列具有至少约96％、97％、98％或99％同一性。
[0103] 为了确定两条氨基酸序列(例如，SEQ ID No：2或4的序列之一和其突变形式)或者两条核酸之间的百分数同一性，为了最优比较目的将序列进行比对(例如，在一个蛋白质或者核酸的序列中引入缺口以与另一蛋白质或者核酸进行最优比对)。然后比较相应氨基酸位置或者核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当一条序列(例如，SEQ ID No：2或4的序列之一)中的位置被与另一条序列(例如，所选序列的突变形式)中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这两个分子在该位置同源(即，本文所用的氨基酸或者核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”)。两条序列之间百分数同源性是所述序列共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)。
[0104] 借助于程序算法GAP(Wisconsin Package版本10.0，University ofWisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA；Altschul 等 人 (1997)Nucleic Acids Res.25：3389，参照以下)通过比较可以计算同源性，设置下面的参数：
[0105] 缺口权重：50 长度权重：3
[0106] 平均匹配：10 平均错配：0
[0107] 例如，在核酸水平与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％同源性的序列理解为指一个序列，其当通过上面的程序算法使用上面的参数设置与SEQ ID NO：1的序列比较时，具有至少80％同源性。
[0108] 两条多肽之间的同源性理解为指借助于程序算法GAP(WisconsinPackage版本10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)，设置下面的参数：
[0109] 缺口权重：8 长度权重：2
[0110] 平均匹配：2912 平均错配：-2003，
[0111] 通过比较计算的每条完整序列长度上氨基酸序列的同一性。
[0112] 例如在蛋白质水平与序列SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的序列理解为指一个序列，其当通过上面的程序算法使用上面的参数设置与SEQID NO：2的序列比较时，具有至少80％同源性。
[0113] 在本申请中，用可以在www.ebi.ac.uk/tools找到的程序clustalW，选择序列分析并选择选项clustalW(多序列比对)确定同源性。所有选项在标准条件下进行，如下：
[0114] 比对：完全；输出格式：aln w/numbers；输出顺序：对准的；颜色调整：无；ktup(字号)：def；窗口长：def；得分类型：百分数；topdiag：def；pairgap：def；矩阵：
def；缺口打开：def；结束缺口：def；缺口延伸：def；延伸距离：def；cpu模式：单个；树图/类型：进化树；树图/距离：隐藏；种系发生树/树类型：无；种系发生树/校正距离：关；种系发生树/忽略缺口：关。因此，优选根据clustalW的同源性计算。
[0115] 通过替代、插入或者缺失，从根据本发明的SEQ ID No：2或4所示的多肽之一衍生的功能等价物与根据本发明的SEQ ID No：2或4所示的多肽之一具有至少70％，优选至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％，非常特别优选至少98％同一性并且通过具有与SEQ ID No：2或4中所示多肽基本上相同的性质区别开来。
[0116] 通过替代、插入或者缺失从根据本发明的SEQ ID No：1或3或5或6所示的核苷酸序列衍生的功能等价物与根据本发明的SEQ ID No：2或4所示的多肽之一具有至少70％，优选至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％，非常特别优选至少98％同一性并且编码具有与SEQ ID No：2或4中所示多肽基本上相同的性质的多肽。
[0117] 功能等价物的“基本上相同的性质”尤其理解为指赋予病原体抗性表型或者赋予或者增加对至少一种病原体的抗性而增加所述功能Rpi-blb2等价物在植物或者植物组织、部分或细胞中的蛋白质的量、活性或者功能。感染后孢子形成和病灶表型联合功能等价物的蛋白质量、活性或功能的所述增加理解为基本性质。
[0118] 编码与SEQ ID No：2或4的蛋白质序列同源的Rpi-blb2的核酸分子可以通过在本发明的多核苷酸的核苷酸序列，尤其SEQ ID No：1或3或5或6中引入一个或多个核苷酸替代、加入或缺失来产生，从而向所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸替代、加入或缺失。通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变可以向例如SEQ ID No：1或3或5或6的序列中引入突变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的替代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，Rpi-blb2中预测的非必需氨基酸残基优选用来自相同家族的另一氨基酸残基替换。备选地，在另一实施方案中，例如，通过饱和诱变可以沿着Rpi-blb2编码序列的所有或部分随机导入突变，并且可以对所得突变体筛选本文描述的Rpi-blb2活性以鉴定保持Rpi-blb2活性的突变体。SEQ ID No：1或3或5或6的序列之一诱变后，可以重组表达所编码的蛋白质并且可以使用例如，本文描述的测定法(见实施例)测定所述蛋白质的活性。
[0119] 在一个实施方案中，在本发明的方法中，Rpi-blb2蛋白质和另一抗性蛋白质的活性增加了。
[0120] 预计在田间条件下一种以上的抗性基因，尤其赋予对相同病原体的抗性的基因的存在是有益的。对于存在能够克服一种R-基因的抗性的病原体分离物(例如，致病疫霉品种)的情况下，其他一种或多种R基因仍然是有功能的，使得所述病原体不能感染植物。两种未打败的R基因的存在大大减小了病原体，尤其致病疫霉品种能够突变成克服两种或多种R基因的品种的机会。
[0121] 在下文中“抗性多肽”或者“抗性蛋白质”涉及多肽，其(增加的)活性将赋予对敏感基因型(“野生型”或“参照”)的抗性。因此，Rpi-blb2是抗性蛋白质以及例如，Rpi-blb(或者RB或Sbu1)。“另一种抗性蛋白质”涉及不同于本发明蛋白质的另一种抗性蛋白质，而术语“抗性蛋白质”包含本发明的多肽以及一种或多种抗性蛋白质。还理解术语“和另一种抗性蛋白质”涉及一种或多种其他抗性蛋白质。从而，可以增加一种或多种抗性蛋白质的活性。在下文中描述了其他抗性蛋白质。然而，通常任意其他已知的抗性蛋白质可以与本发明的多肽共表达或者可以通过本文描述的关于Rpi-blb2的任意方法增加它的活性。
[0122] 在优选实施方案中，另一种抗性蛋白质包含LRR结构域和P环。
[0123] 超过30种以上赋予对细菌、真菌、卵菌、病毒、线虫或者昆虫抗性的植物疾病抗性(R)基因的克隆和分子表征允许不管病原体特异性而对它们在结构类别中进行分类(Dangl和Jones，2001中综述)。预测所表征的R基因的最丰富的类别(包含拟南芥属基因组中预测的基因的约0.5％)编码细胞外蛋白质，其携带在其他受体和信号转导蛋白质中也发现的富含亮氨酸重复单位(LRR)和核苷酸结合位点(NBS)结构域、基序。NBS-LRR R蛋白质主要在N-末端不同，所述N-末端显示出与果蝇Toll蛋白质和哺乳动物白介素-1受体结构域(TIR-NBS-LRR)的序列相似性，或者编码卷曲螺旋结构(CC-NBS-LRR)，有时为亮氨酸拉链(LZ-NBS-LRR)的形式。尽管可能是膜结合的，但是预测NBS-LRR蛋白质为细胞质的。相比，预测携带LRR的R蛋白质的两个其他类别跨越细胞膜，具有胞外LRR结构域：LRR-跨膜(LRR-TM)Cf蛋白质和LRR-TM-激酶Xa21蛋白质。所表征的缺少LRR的R蛋白质pro-1
是来自番茄的Pto基因、来自甜菜的Hs1 基因、来自大麦的mlo基因、来自拟南芥的Rpw8基因和来自大麦的Rpg1基因。
[0124] 根据基因对基因(gene-for-gene)假说，疾病抗性遵循具有无毒性(Avr)功能的病原体效应分子的植物R蛋白质的观点，其中通过某种引发子(elicitor)识别复合体引发信号转导途径，导致超敏反应(HR)。与其他受体一起，通常认为NBS-LRR R蛋白质具有调节结构，其具有分开的识别和发信号结构域，其中LRR是候选识别结构域并且N-末端区包括NBS——主要的发信号结构域。重组R蛋白质的功能分析表明识别特异性实际上存在于LRR中。此外，LRR是与相关NBS-LRR蛋白质紧密相关的最多变区并且处于分叉选择下。然而，不断积累的证据表明LRR也通过涉及推定的分子内相互作用的负向调节有助于信号转导。当前，已经从马铃薯克隆了5种R基因，包括赋予对晚疫抗性的两种R基因，并且所有基因都属于植物R基因的CC/LZ-NBS-LRR类。尽管S.demissum来源的R1基因赋予对晚疫的品种特异抗性，但是最近克隆的S.bulbocastanum来源的基因Rpi-blb(或者RB或者Sbu1)赋予对携带多种毒性因子的一系列致病疫霉分离物的完全抗性，并且还没有表现品种特异性。此外，如前描述，在墨西哥的田间实验中，含有Rpi-blb的体细胞杂种的子代植物不受晚疫的影响，在所述田间中发现几乎每个品种的真菌。阐明了通过培养的马铃薯和番茄中敏感表型的互补，通过用单一克隆的R基因可能实现广谱晚疫抗性从两性不相容的宿主物种向培养的茄科的种间转移的可能性。US6,127,607描述了具有LRR结构域和P环的抗性蛋白质。本文引用US6,127,607的内容作为参考。具体地，6到8列和11列描述了LRR结构域和P环。此外，Song，2003，PNAS100(16)，9128-9133说明了图4中Rpi-blb LRR基序的比较并且在第9132上给出关于LRR结构域的概述。在图14以及图15中显示了本发明多肽的结构域。
[0125] 优选地，选自Rpi-blb(同义词RB或Sbu1)、Rpi-ABPT1、Rpi-blb3、Rpi-mcd、R1、R-ber(同义词R12)、Rpi1、R2、R3a、R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和Ph-3构成的组的一种或多种抗性蛋白质的活性增加了。优选除了Rpi-blb2之外，至少Rpi-blb的活性也增加了。
[0126] 在本发明的一个实施方案中，例如，转基因的Rpi-blb2蛋白质的表达增加了，并且另一转基因抗性基因的表达增加了。与Rpi-blb2(或者RB或者Sbu1)共表达的抗性蛋白质优选为本文提到的抗性蛋白质之一，尤其Rpi-blb、Rpi-ABPT1、Rpi-blb3、R1、Rpil、R-ber、Rpi-mcd、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph-1、Ph-2或Ph-3，但是也可以是本领域技术人员已知的赋予对植物病原体的其他抗性之一的蛋白质。
[0127] 如所提到的，根据本发明的术语“增加的表达”也包括多核苷酸或者多肽的重新表达。
[0128] 最优选的是通过本发明多肽与Rpi-blb的共表达增加抗性。如在实施例和Song2003，PNAS100(16)，9128中描述的，Rpi-blb和Rpi-blb2在离脱叶测定中提供了对致病疫霉分离物的完全抗性。
[0129] 所述抗性赋予基因例如描述于：
[0130] RB或者Sbu1(Rpi-blb的同义词)：AY336128[gi：32693280]，(Song等人，2003)。包含Rpi-blb基因的BAC克隆177013和CB3A14已经保藏在GenBank，检索号AY303171和AY303170；
[0131] R1：AF447489[gi：9117432422]，(Ballvora等人，2002)；
[0132] Rpi1：Kuhl，J.C.，Hanneman，R.E，和Havey，M.J，(2201)Characterization and mapping of Rpi1，a late blight resistance locus fromdiploid(1EBN)Mexican Solanum pinnatisectum.Molecular genet.Genomics 265：977-985；
[0133] R-ber：Ewing，E.E.，Simko，I.，Smart，C.D.，Bonierbale，M.W，Mizubuti，E.S.G，May，G.D，和Fry，W.E，(2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii.Molecular breeding 6：25-36；
[0134] R2：Li，X.，vanEck，H.J.，vanderVoort，J.N.A.M，Huigen，D.J，Stam，P， 和Jacobsen，E.(1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers：the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8)：1121-112；
[0135] R3、R6、R7：Elkharbotly，A，Palominosanchez，C，Salamini，F，Jacobsen，E，和Gebhardt，C.(1996)R6 and R7 alleles of potato conferringrace-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont) de Baryidentified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI.Theoretical and Applied.Genetics 92(7)：880-884；
[0136] Ph-1：Bonde和Murphy(1952) Main Agric.Exp.Stn.Bull.No 497；
[0137] Ph-2：Moreau，P，Thoquet，P.，Olivier，J，Laterrot，H，和Grimsley，N.H.(1998) Genetic mapping of Ph-2，a single locus controlling partialresistance to Phytophthora infestans in tomato.Molecular Plant MicrobeInteractions 11(4)：259-269；
[0138] Ph-3：Chunwongse，J，Chunwongse，C.，Black，L.，和Hanson，P.(2002)Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato.Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77(3)：281-286；
[0139] Rpi-blb3、Rpi-ABPT1和Rpi-mcd：Park，T.H，Van der Vossen，E，Vleeshouwers，V.G.A.A，Tan，A，Visser，R.G.F. 和 Van Eck，H.J.2004.Major resistanee genes for tuber and leaf resistance to Phytophthorainfestans in potato：An outline of a PhD project.Crop FunctionalGenomics 2004，July 2004，Jeju，Korea，93页；
[0140] R3a和R3b：Huang，S.，Vleeshouwers，V.G.A.A，Werij，J.S，Hutten，R.C.B，Van Eck，H.J，Visser，R.G.F，和 Jacobsen，E.(2004).The R3resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closelylinked R genes with distinct specificities.MPMI 17(4)，428-435；
[0141] 在一个实施方案中，根据本发明，Rpi-blb2的活性增加了，例如，本发明多核苷酸的表达增加了并且编码Rpi-blb、Rpi-ABPT1、Rpi-blb3、Rpi-mcd R1、R-ber、Rpi1、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的至少一种核酸分子的表达增加了，其中所述核酸分子选自：
[0142] a)核酸分子，其编码至少如下的至少成熟形式：
[0143] Rpi-blb(或者RB-或者Sbu1-)多肽，优选由GenBank检索号AY336128[gi：32693280]中所示的序列编码；
[0144] R1多肽，优选由GenBank检索号AF447489[gi9117432422]中所示的序列编码；
[0145] Rpi-blb3、Rpi-ABPT1和/或Rpi-mcd多肽，优选由Park，T.H，Vander Vossen，E.，Vleeshouwers，V.G.A.A，Tan，A，Visser，R.G.F.和VanEck，H.J.2004.Major resistance genes for tuber and leaf resistance toPhytophthora infestans in potato：An outline of a PhD project.CropFunctional Genomics 2004，July 2004，Jeju，Korea，93页中所示或者其中的信息可以推导的序列编码；
[0146] R3a和/或R3b多肽，优选由Huang，S.，Vleeshouwers，V.G.A.A，Werij，J.S.，Hutten，R.C.B，Van Eck，H.J，Visser，R.G.F，和Jacobsen，E.(2004).The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato isconferred by two closely linked R genes with distinct specificities.MPMI17(4)，428-435中所示或者其中的信息可以推导的序列编码；和/或
[0147] 病原体，优选致病疫霉抗性赋予蛋白质，其如所描述的作图和表征，例如，[0148] 对于Rpi1在Kuhl，J.C，Hanneman，R.E，和Havey，M.J，(2001)Characterization and mapping of Rpi1，a late blight resistance locus fromdiploid(1 EBN)Mexican Solanum pinnatisectum.Molecular genet.Genomics 265：977-985中；
[0149] 对于R-ber在Ewing，E.E，Simko，I.，Smart，C.D.，Bonierbale，M.W，Mizubuti，E.S.G，May，G.D，和Fry，W.E，(2000)Genetic mapping fromfield tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthorainfestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanumberthaultii.Molecular breeding 6：25-36中；
[0150] 对于R2在Li，X.，vanEck，H.J.，vanderVoort，J.N.A.M，Huigen，D.J.，Stam，P，和Jacobsen，E.(1998)Autotetraploids and genetic mapping usingcommon AFLP markers：the R2 allele conferring resistance toPhytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theoretical andApplied Genetics 96(8)：1121-1128中；
[0151] 对于R3、R6、R7在Elkharbotly，A，Palominosanchez，C，Salamini，F，Jacobsen，E.，和 Gebhardt，C.(1996)R6 and R7 alleles of potatoconferring race-specific resistance to Phytophthora infestans(Mont)deBary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome Xi.Theoretical and Applied.Genetics92(7)：880-884中；
[0152] 对于Ph-1在Bonde和Murphy(1952)Main Agric.Exp.Stn.Bull.No497；或
[0153] 对于Ph-2在Moreau，P，Thoquet，P.，Olivier，J，Laterrot，H，和Grimsley，N.H.(1998)Genetic mapping of Ph-2，a single locus controllingpartial resistance to Phytophthora infestans in tomato.Molecular PlantMicrobe Interactions 11(4)：259-269中；和/或
[0154] 对于Ph-3在Chunwongse，J，Chunwongse，C.，Black，L.，和Hanson，P.(2002)Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance intomato.Journal of Horticultural Science&Biotechnology 77(3)：281-286中；
[0155] 或者赋予病原体抗性的多肽，优选从所述出版物可以推导的赋予致病疫霉抗性的多肽；
[0156] b)核酸分子，其核苷酸序列是(a)的核苷酸序列由于遗传密码简并导致的序列；
[0157] c)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列的一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽衍生；
[0158] d)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有70％或以上的同一性；
[0159] e)核酸分子，其包含(a)到(d)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表位的部分；
[0160] f)核酸分子，其编码(a)到(e)任一项编码的多肽的以氨基酸：1、30、50、100、200、300、500或1000开始并以氨基酸1276、1000、500、300、200、50、30、或1结束的片段；
[0161] g)包含(a)或(b)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；
[0162] h)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(f)任一项的核酸分子编码的多肽产生的单克隆抗体识别；
[0163] i)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(h)任一项的核酸分子或者其至少20个，优选30或更多核苷酸的片段的序列的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和
[0164] j)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(i)任一项的核酸分子杂交；
[0165] 或者(a)到(j)任一项的互补链。
[0166] 因此，本发明的方法赋予本发明的所述植物之一、植物组织或者植物细胞对卵菌门植物病原体的抗性，优选对腐霉目(Pythiales)或者Peronosperales，更优选对腐霉科或者霜霉科(Peronosporaceae)，更优选对疫霉属(Phytophthora)或者盘梗霉属(Bremia)或者霜霉属(Peronospera)或者单轴霉属(Plasmopara)病原体的抗性，最优选地，其中病原体为寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae)(导致烟草黑柄等)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)(导致大豆中疫霉根部腐烂)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)(导致胡椒、葫芦和番茄中腐烂)、红腐疫霉(Phytophthora erythroseptica)(导致马铃薯中粉红色腐烂)、葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)(导致葡萄藤霜霉病)、莴苣盘梗霉(Bremia lactuca)(导致莴苣中霜霉病)或者Peronospora tabaci(导致烟草中蓝色霉)的物种。
[0167] 通过本领域技术人员公知和例如，在Sambrook等人，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，1989中描述的方法可以在根据本发明的植物、植物细胞、植物组织、植物器官或植物部分中增加、产生或者刺激Rpi-blb2的活性。
[0168] 从而，在优选实施方案中，本发明涉及本发明的方法，其中表达是重新表达。
[0169] 术语细胞、组织或者生物或者其部分中的“重新表达”在本文理解为涉及基因产物的表达，而以前所述基因产物或者所述基因产物的活性，尤其相应多肽或者多核苷酸在细胞、组织、或者生物或者其部分中是不可检测的。优选地，编码细胞、组织、或者生物或者其部分中的多肽或者多核苷酸并且应该重新表达的基因不存在于细胞、组织、或者生物或者其部分中的基因组中。如果在细胞、组织、或者生物或者其部分中不能检测到基因产物的表达，那么通常认为在细胞、组织、或者生物或者其部分中没有发生表达。因此，如果不能检测到活性，那么通常认为没有相应活性存在。然而，本领域技术人员已知检测方法和手段发展到更高灵敏性。从而，在优选实施方案中，术语“重新表达”涉及系统中新的和额外的表达，其中例如由于低水平表达或者表达几乎无活性的基因产物而活性水平太低以致不能赋予对植物病原体，尤其对致病疫霉的抗性。敲除株系和低和/和高表达株系表型的比较可以表明是否可以观察到针对本文提到的病原体的抗性中的差异。
[0170] 因此，在本发明的另一实施方案中，Rpi-blb2和/或另一种抗性蛋白质的内源活性增加了。
[0171] 通过本领域技术人员已知的方法可以增加细胞中表达水平。本文描述了几种技术，例如，本发明的多核苷酸或者多肽的转基因表达。多核苷酸或者多肽可以是外源来源。优选地，导入与宿主细胞、植物细胞、植物组织或者植物相同遗传起源的多核苷酸。
[0172] 通过一些方法可以增加活性，尤其内源活性，还增加转基因表达的Rpi-blb2的活性。因此，在优选实施方案中，通过一个或多个下面的步骤增加本文描述的抗性蛋白质的活性：
[0173] a)稳定抗性蛋白质；
[0174] b)稳定编码抗性蛋白质的mRNA；
[0175] c)增加抗性蛋白质的比活；
[0176] d)表达用于抗性表达的同源或者人工转录因子或者增加用于抗性表达的同源或者人工转录因子的表达；
[0177] e)通过外源诱导因子刺激抗性蛋白质活性；
[0178] f)表达转基因抗性基因；和/或
[0179] g)增加抗性编码基因的拷贝数。
[0180] 通常，通过增加生物中特定蛋白质，即抗性蛋白质的量可以增加所述生物，尤其植物细胞、植物、或者植物组织中的活性。“蛋白质的量”理解为生物、组织、细胞或者细胞隔室中多肽，优选Rpi-blb2的量。蛋白质的量的“增加”指在相同条件下(例如，培养条件、植物年龄等等)，与没有应用该方法的相同属和种的野生型相比，生物、组织、细胞或者细胞隔室中蛋白质的量的数量增加(例如，通过下文描述的方法之一)。所述增加达到至少10％，优选至少20％或至少50％，尤其优选至少70％或90％，非常特别优选至少100％，最优选至少200％或以上。
[0181] 活性的“增加”理解为指在相同条件下(例如，培养条件、植物年龄等等)，与没有应用该方法的相同属和种的野生型相比，生物、组织、细胞或者细胞隔室中蛋白质的总活性的增加。所述增加达到至少10％，优选至少20％或至少50％，尤其优选至少70％或90％，非常特别优选至少100％，最优选至少200％或以上。
[0182] 在该上下文中，与当增加SEQ ID NO：2或4中所示Rpi-blb2蛋白质之一所得值相比，病原体抗性的功效可以向下或者向上偏离。优选的功能等价物为其中病原体抗性功效(例如，通过病原体的穿透功效或者如本文描述的测量)与通过减去如SEQ ID NO：2或4中所示Rpi-blb2蛋白质所得的比较值相差不超过50％，优选不超过25％，尤其优选不超过10％的功能等价物。特别优选的是那些序列，其中基于减去如SEQ ID NO：2或4中所示Rpi-blb2蛋白质之一所得的比较值，所述增加将病原体抗性的功效定量增加50％以上，优选100％，尤其优选500％，非常特别优选1000％。
[0183] 优选在类似条件下进行比较。“类似条件”指所有条件，如培养或生长条件、测定条件(如缓冲液、温度、底物、病原体浓度等等)在待比较的实验间保持相同并且设置仅在待比较的Rpi-blb2多肽的序列、它们的生物来源，如果适宜，和病原体方面不同。当选择病原体时，每个比较需要所选的病原体最相似于其他等价物，考虑物种专一性。
[0184] 由于增加的Rpi-blb2活性，植物或者其部分的抗性增加了。在优选实施方案中，本发明的方法导致与野生型相比，用致病疫霉感染后孢子形成指数减小至少30％，更优选减小50％，甚至更优选为70％，甚至更优选大于80％，最优选为85％和90％。最优选为95％或以上。
[0185] 因此，本发明还涉及如上定义的编码Rpi-blb2蛋白质的本发明的所述多核苷酸，其包含核酸分子，所述核酸分子选自：
[0186] a)编码SEQ ID NO：2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；
[0187] b)核酸分子，其包含如SEQ ID NO：1或3或5或6中描绘的编码序列编码所述多肽的至少成熟形式；
[0188] c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遗传密码简并产生；
[0189] d)核酸分子，其编码的多肽通过从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列的一个或几个氨基酸的替代、缺失和/或加入从(a)到(c)的多核苷酸编码的多肽衍生；
[0190] e)核酸分子，其编码的多肽的序列与(a)或(b)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有70％或以上的同一性；
[0191] f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一项的核酸分子编码的多肽的片段或者具有表位的部分；
[0192] g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARF1 F和ARF1 R从核酸文库扩增的核酸分子的序列；
[0193] h)核酸分子，其编码(a)到(g)任一项编码的多肽的以氨基酸：1、30、50、100、200、300、500或1000开始并以氨基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1结束的片段；
[0194] i)包含(a)或(d)任一项的多核苷酸的至少20个核苷酸的核酸分子；
[0195] j)核酸分子，其编码的多肽被针对(a)到(h)任一项的核酸分子编码的多肽产生的单克隆抗体识别；
[0196] k)核酸分子，其可以通过用具有(a)到(j)任一项的核酸分子或者其至少15个，优选30、60、90或更多个核苷酸的片段的序列的探针在严格条件下筛选适宜文库得到；和[0197] l)核酸分子，其互补链在严格条件下与(a)或(k)任一项的核酸分子杂交；
[0198] 或者(a)到(l)任一项的互补链；
[0199] 或者编码Solanum bulbocastanum的6号染色体或连锁群6的区段编码的多肽，所述区段与选自表3a或3b的标记共分离，并且所述多肽介导对植物病原体，尤其选自卵菌门病原体的抗性。
[0200] 在一个实施方案中，本发明多核苷酸不由Seq.ID NO.：7和/或9中描述的序列组成和/或不由编码Seq.ID NO.：8和/或10中描述的蛋白质的核酸分子的序列组成。
[0201] 在一个实施方案中，本发明的多核苷酸不由Mil.1或者Mil.2的核酸分子的序列组成和/或不由编码Mil.1或者Mil.2蛋白质的核酸分子组成。
[0202] 从而，在一个实施方案中，本发明的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNAS USA95：9750-9754，Milligan等人，1998.Plant Cell 10：1307-1319；和/或WO9806750中所示的序列组成。
[0203] 在另一实施方案中，本发明的多核苷酸来自或者分离自生物的基因组，所述生物选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科(Menyanthaceae)、茄科、厚壳树科(Sclerophylacaceae)、核果茄科(Duckeodendraceae)Goetzeaceae、旋花科(Convolvulaceae)、菟丝子科(Cuscutaceae)、花荵科(Polemoniaceae)和田基麻科(Hydrophyllaceae)构成的组或者具有其来源，更优选选自由根据Systema Naturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的颠茄属(Atropa)、Browallia、番茉莉属(Brunfelsia)、辣椒属(Capsicum)、夜香树属(Cestrum)、Cyphomandra、曼陀罗属(Datura)、Fabiana、Frariciscea、天仙子属(Hyoscyamus)、枸杞属(Lycium)、茄参属(Mandragora)、假酸浆属(Nicandra)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、酸浆属(Physalis)、Schizanthus和茄属(Solanum)构成的组或者具有其来源，甚至更优选地选择茄科，优选S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、pearmelon(S.muricatum)和茄子(S.melongena)。甚至更优选地，将番茄或者马铃薯或者S.bulbocastanum作为本发明多核苷酸来源。最优选地，将S.bulbocastanum作为来源。
[0204] 已经从来自ABPT的马铃薯材料分离Rpi-blb2。从而，从分类学观点，所描述的Rpi-blb2也是马铃薯来源的。然而，所述基因存在于可能来自S.bulbocastanum的渐渗片段上。许多马铃薯变种含有相关茄属的渐渗片段，但是仍然是马铃薯。因此，根据分类学系统，马铃薯也可以是本发明的多核苷酸的来源，尤其ABPT来源的马铃薯，以及以类似方式衍生的其他茄属变种的其他变种。
[0205] 因此，在另一实施方案中，本发明的多核苷酸来自马铃薯。
[0206] 使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息可以分离本发明的多核苷酸，例如，具有Seq ID NO：1或3或5或6的核苷酸序列或者其部分的核酸分子。例如，使用本发明多核苷酸的序列之一的所有或者部分作为杂交探针和标准杂交技术(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述)可以从文库分离Rpi-blb2 cDNA。此外，通过聚合酶链反应，使用基于该序列(例如，包含本发明的多核苷酸序列之一的所有或部分的核酸分子)设计的寡核苷酸引物可以分离包含本发明的多核苷酸序列之一的所有或部分的多核苷酸。例如，可以从例如，S.bulbocastanum或者另一种植物分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人(1979)Biochemistry18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)，并且使用逆转录酶(例如，Moloney MLV逆转录酶，可以从Gibco/BRL，Bethesda，MD得到，或者AMV逆转录酶，可以从SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，FL得到)可以制备cDNA。基于SEQ ID No：1或3或5或6中所示核苷酸序列之一可以设计用于聚合酶链反应扩增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，备选地，使用基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术可以扩增本发明的多核苷酸。可以将如此扩增的多核苷酸克隆到适宜的载体中并通过DNA序列分析鉴定。此外，通过标准合成技术，例如，使用自动化DNA合成仪可以制备相应于Rpi-blb2核苷酸的寡核苷酸。
[0207] 在本发明的一个实施方案中，由Solanum bulbocastanum或者马铃薯的6号染色体或者连锁群6的区段编码Rpi-blb2蛋白质。
[0208] 此外，本发明包含Solanum bulbocastanum或者马铃薯的6号染色体或者连锁群6的区段。在本发明方法的一个优选实施方案中，所表达的Rpi-blb2蛋白质由多核苷酸编码，其包含S.bulbocastanum的6号染色体或者连锁群6的区段。优选地，所述区段还包含顺式作用元件，例如，启动子、增强子、结合位点等等，或者反式作用元件，像辅因子、激活剂或者其他抗性蛋白质，其赋予增加的抗性。在Seq.ID NO.：5和6中描绘了包含Rpi-blb2基因和其他调节元件的基因组片段。
[0209] 本领域技术人员已知怎样得到染色体区段，例如，通过将染色体片段克隆到BAC，如Song，2003，.PNAS100(16)，9128或者本文和所引用的参考文献中描述。
[0210] 因此，在另一实施方案中，本发明的多核苷酸或者编码Rpi-blb2蛋白质的多核苷酸与选自表3a的标记共分离或者包含所述标记的复制位点或杂交位点。如实施例中详细描述的，用表3a或者3b中描绘的标记可以对致病疫霉抗性作图。由于标记距离基因越近，品系，即子代克隆中所述基因与所述标记共分离的百分数越高。因此，在优选实施方案中，本发明的多核苷酸与标记E40M58、CT119和/或CT216共分离。
[0211] 在另一实施方案中，本发明涉及制备重组载体的方法，其包括将本发明的多核苷酸插入到载体中或者将所述多核苷酸和另一抗性蛋白质插入到载体中。
[0212] 因此，在另一实施方案中，本发明涉及含有本发明的多核苷酸或者所述多核苷酸和通过本发明的方法产生的另一抗性基因的载体。
[0213] 如本文所用的术语“载体”指能够运输其所连接的多核苷酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中可用将额外的DNA或者RNA区段连接到病毒基因组中。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)当引入宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组DNA技术所用的表达载体通常是质粒形式的。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用的形式。然而，本发明意在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起等价功能。
[0214] 本发明还涉及通常用于基因工程的粘粒、病毒、噬菌粒和其他载体，它们含有根据本发明的核酸分子。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建多种质粒和载体；见，例 如，Sambrook，Molecular Cloning A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.(1989)中描述的技术。备选地，可以将本发明的核酸分子和载体重构到脂质体中用以递送到靶细胞。
[0215] 在另一实施方案中，本发明的载体或者本发明的方法的特征在于编码Rpi-blb2蛋白质的多核苷酸或者另一抗性蛋白质有效连接表达控制序列和/或连接编码转基因表达调节信号的核酸序列，所述调节信号允许在原核或者真核宿主细胞中表达。
[0216] 在优选实施方案中，本发明涉及本发明的载体或者本发明的方法，其中编码Rpi-blb2蛋白质和/或另一抗性蛋白质的多核苷酸有效连接与所述编码Rpi-blb2蛋白质和/或另一抗性蛋白质的多核苷酸具有相同物种来源的表达控制序列。
[0217] 对于根据本发明的核酸分子在细胞中表达的情况，原则上可能如此修饰编码序列使得蛋白质位于植物细胞的任意希望的隔室中。这些隔室包括细胞核、内质网、液泡、线粒体、质体样造粉体、叶绿体、色质体、质外体、细胞质、细胞外空间、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其他隔室(综述见，Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423和其中引用的参考文献)。然后多核苷酸可以有效融合适宜的多核苷酸(例如，载体)，其编码用于转运到所希望的隔室的信号。
[0218] 本发明的另一优选实施方案涉及载体，其中本发明的多核苷酸有效连接表达控制序列，其允许在原核或真核宿主细胞中表达。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，一般的控制序列包括启动子、终止子和在一些情况中，包括增强子、反式作用子或者转录因子。
[0219] 术语“控制序列”意在至少包括表达必需的组分，并且可以还包括额外的有益组分。
[0220] 术语“有效连接”指并列，其中所描述的组分处于允许它们以它们的所希望的方式发挥功能的关系中。“有效连接”编码序列的控制序列以如此方式连接使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。对于控制序列是启动子的情况，对于技术人员显然的是使用双链核酸。
[0221] 有效连接将理解为指例如，启动子与待表达的核酸序列和如果适宜，其他调节元件，如终止子以如此方式顺序排列使得当核酸序列重组表达时，每个调节元件都可以实现其功能，这取决于核酸序列关于有义或者反义RNA的排列。为此，不一定需要化学意义上的直接键合。遗传控制序列，如增强子序列在距离他DNA分子遥远的位置上也可以对靶序列发挥它们的功能。优选排列为其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列之后，从而两个序列相互共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。
[0222] 通过例如在Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)，Silhavy TJ，Berman ML 和 Enquist LW(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)，Ausubel FM等人(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience和Gelvin等人(1990)Plant Molecular Biology Manual中描述的常规重组和克隆技术可以产生有效连接和表达盒。然而，作为具有限制酶的特异切割位点的接头，或者作为信号肽的其他序列也可以位于两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白质的表达。优选地，由启动子和待表达的核酸序列连接组成的表达盒可以以载体整合的形式存在并且可以例如通过转化插入到植物基因组中。
[0223] 此类调节序列描述于例如，Goeddel：Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)或参见Gruber和Crosby，：Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，CRC Press，Boca Raton，Florida，编者：Glick和Thomson，第7章，89-108，包括其中的参考文献。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中表达的那些序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞或者在某些条件下表达的那些序列。本领域技术人员将理解表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，从而产生本文描述的多核苷酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白质或者肽。
[0224] 可以设计本发明的重组表达载体用于所述抗性蛋白质，优选Rpi-blb2在原核或真核细胞中的表达。例如，编码本发明的多核苷酸的基因可以在细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli)、百合棒杆菌(C.glutamicum)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其他真菌细胞(见Romanos，(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，(1991)J.W.Bennet&L.L.Lasure，编者，396-428页：Academic Press：San Diego；和van den Hondel，(1991)：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，编者，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge))、藻类(Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology.1，3：239-251)和多细胞植物细胞(见Schmidt，R.(1988)，Plant Cell Rep.：583-586)；Plant Molecular Biology andBiotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，6/7 章，S.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenes 等人，Techniques for Gene Transfer，：Transgenic Plants， 卷 1，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225(和其中引用的参考文献)或者哺乳动物细胞中表达。适宜的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。备选地，可以在体外转录和翻译重组表达载体，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
[0225] 通常用载体实施蛋白质在原核生物中的表达，所述载体含有指导融合或者非融合蛋白质表达的组成型或者可诱导的启动子。融合载体向其中编码的蛋白质加入许多氨基酸，通常加在重组蛋白质的氨基末端，但是也加在C-末端或者与所述蛋白质的适宜区域融合。此类融合载体通常起三种目的：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解性；和3)通过作为亲和纯化中的配体帮助纯化重组蛋白质。此外，融合载体可以还编码额外的蛋白质，其表达支持Rpi-blb2活性的增加或者针对植物病原体的植物抗性的增加，例如，所述额外的蛋白质为其他抗性蛋白质。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白质的接点引入蛋白酶剪切位点以便使得可以在纯化融合蛋白质后分离重组蛋白质与所述融合部分。此类酶和它们的同族识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
[0226] 典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA) 和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
[0227] 适宜的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann(1988)Gene69：301-315) 和 pET11d(Studier 等 人，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89。
[0228] 最大化重组蛋白质表达的一种策略是在蛋白酶剪切所述重组蛋白质的能力受损的宿主细菌中表达所述蛋白质(Gottesman，S，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一种策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列从而每个氨基酸的各个密码子是选择用于表达的细菌(如大肠杆菌或者百合棒杆菌)中优先使用的密码子(Wada等人(1992)Nucleic AcidsRes.20：2111-2118)。可以通过标准DNA合成技术实施本发明的核酸序列的此类改变。
[0229] 此外，载体可以是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S.cerivisae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari，等人，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
[0230] 优选地，本发明或者本文描述的多核苷酸有效连接植物表达控制序列，例如表达盒。植物表达盒优选含有能够驱动植物细胞中基因表达的调节序列，并且所述调节序列有效连接从而每个序列都可以完成其功能，如转录终止，如多腺苷酸化信号。优选的多腺苷酸化信号为来自根癌农杆菌t-DNA的多腺苷酸化信号，如已知为Ti质粒pTiACH5的章鱼碱合酶的基因3(Gielen等人，EMBO J.3(1984)，835ff)或者其功能等价物，在植物中具有功能活性的所有其他终止子也是适宜的。
[0231] 植物基因表达通常不限于转录水平，因为植物表达盒优选含有其他有效连接的序列，像翻译增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’-未翻译的前导序列的超驱动序列，其增强蛋白质/RNA比率(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research15：8693-8711)。
[0232] 因此，本文描述的多核苷酸可以有效连接适宜的启动子，其赋予适时、细胞或组织特异的方式的基因表达。优选为驱动组成型表达的启动子(Benfey等人，EMBO J.8(1989)2195-2202)，像来自植物病毒如35S CAMV(Franck等人，Cell21(1980)285-294)、19S CaMV(s也见US5352605和WO8402913)的启动子，或者植物启动子，像US4962028中描述的来自Rubisco小亚基的启动子。
[0233] 术语“植物特异启动子”理解为指原则上能够控制基因，尤其外来基因在植物、或植物部分、植物细胞、植物组织或者植物培养物中表达的启动子。在该上下文中，表达可以为例如，组成型的、可诱导的或者依赖发育的。
[0234] 优选下面的启动子：
[0235] a)组成型启动子
[0236] 优选的载体为使得可以在植物中组成型表达的那些载体(Benfey等人(1989)EMBO J8：2195-2202)。“组成型”启动子理解为指在植物发育的重要时期内，优选植物发育的所有阶段，确保在许多，优选所有组织中表达的那些启动子。具体地，优选使用植物启动子或者来自植物病毒的启动子。尤其优选CaMV花椰菜花叶病毒35S转录物的启动子(Franck等人(1980)Cell21：285-294；Odell等人(1985)Nature313：810-812；Shewmaker等人(1985)Virology140：281-288；Gardner等人(1986)Plant Mol Biol6：221-228)或者19S CaMV启动子(US5,352,605；WO84/02913；Benfey等人(1989)EMBO J8：2195-2202)。
另一适宜的组成型启动子是“Rubisco小亚基(SSU)”启动子(US4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank检索号X03677)、农杆菌胭脂氨酸合成酶启动子、TR二元启动子、农杆菌OCS(章鱼碱合成酶)启动子、泛蛋白启动子(Holtorf S等人(1995)Plant Mol Biol29：
637-649)、泛蛋白1启动子(Christensen等人(1992)Plant Mol Biol18：675-689；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：9692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US5,683,439)、液泡ATP酶亚基的启动子或者来自小麦的富含脯氨酸蛋白质的启动子(WO91/13991)，和基因的其他启动子，其中所述基因在植物中的组成型表达是技术人员已知的。
[0237] b)组织特异性启动子
[0238] 还优选对花药、子房、花、叶、茎干、根和种子具有特异性的启动子。
[0239] 种子特异启动子
[0240] 例如，菜豆蛋白启动子(US5,504,200；Bustos MM等人(1989)PlantCell 1(9)：839-53)、2S白蛋白基因启动子(Joseffson LG等人(1987)J BiolChem262：12196-12201)、豆球蛋白启动子(ShirsatA等人(1989)Mol GenGenet215(2)：326-331)、USP(未知的种子蛋白质)启动子( H等人(1991)Mol Gen Genet225(3)：459-67)、油菜籽蛋白
基因启动子(US5,608,152；Stalberg K等人(1996)L Planta199：515-519)、蔗糖结合蛋白质启动子(WO00/26388)或者豆球蛋白B4启动子(LeB4； H等人(1991)Mol
Gen Genet225：121-128；Baeumlein等人(1992)Plant Journal2(2)：233-9；Fiedler U等人(1995)Biotechnology(NY)13(10)：1090f)、拟南芥油质蛋白启动子(WO98/45461)、芸苔(Brassica)Bce4启动子(WO91/13980)。其他适宜的种子特异启动子为编码高分子量麦谷蛋白(HMWG)、麦醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)或者淀粉合酶的基因的启动子。还优选允许在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中种子特异表达的启动子。可以有利地使用下面的：Ipt2或者Ipt1基因的启动子(WO95/15389、WO95/23230)或者WO99/16890中描述的启动子(大麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或者裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。
[0241] 块茎-、贮藏根-、或者根-特异启动子，如I类patatin启动子(B33)、马铃薯组织蛋白酶D抑制剂启动子。
[0242] 叶特异启动子
[0243] 如马铃薯胞质溶胶FBPase启动子(WO97/05900)、马铃薯的Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU(小亚基)启动子或者ST-LSI启动子(Stockhaus等人(1989)EMBO J8：2445-2451)。非常特别优选的是表皮特异启动子，如OXLP基因(草酸氧化酶样蛋白质)启动子(Wei等人(1998)Plant Mol.Biol.36：101-112)。
[0244] 花特异启动子
[0245] 例如，八氢番茄红素合酶启动子(WO92/16635)或者P-rr基因的启动子(WO98/22593)。
[0246] 花药特异启动子
[0247] 如5126启动子(US5,689,049、US5,689,051)、glob-I启动子和γ-玉米醇溶蛋白启动子。
[0248] c)化学可诱导的启动子
[0249] 表达盒还可以包含化学可诱导的启动子(综述文章：Gatz等人(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol48：89-108)，通过所述启动子可以控制植物中的外源基因在特定时间点表达。同样可以使用诸如，PRP1启动子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol22：361-366)、水杨酸可诱导的启动子(WO95/19443)、苯磺酰胺可诱导的启动子(EP 0 388
186)、四环素可诱导的启动子(Gatz等人(1992)Plant J2：397-404)、脱落酸可诱导的启动子(EP 0 335 528)或者乙醇或者环己酮可诱导的启动子(WO93/21334)的启动子。
[0250] d)胁迫-或者病原体可诱导的启动子
[0251] 其他优选的启动子为通过有生命或者无生命的胁迫可以诱导的启动子，如PRP1基因的病原体可诱导的启动子(Ward等人(1993)Plant MolBiol 22：361-366)、番茄高温可诱导的hsp70或者hsp80启动子(US5,187,267)、马铃薯低温可诱导的α-淀粉酶启动子(WO96/12814)、光可诱导的PPDK启动子，或者创伤可诱导的pinII启动子(EP375091)。
[0252] 病原体可诱导的启动子包括由于病原体感染诱导的基因的启动子，所述基因为例如，PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的基因(例如，Redolfi等人(1983)Neth J Plant Pathol89：245-254；Uknes，等人(1992)The Plant Cell4：645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Virol4：111-116；Marineau等人(1987)Plant Mol Biol9：335-342；Matton等人(1987)Molecular Plant-Microbe Interactions2：325-342；
Somssich等人(1986)ProcNatl Acad Sci USA83：2427-2430；Somssich等人(1988)MolGen Genetics 2：93-98；Chen等人(1996)Plant J 10：955-966；Zhang和Sing(1994)Proc Natl Acad Sci USA91：2507-2511；Warner等人(1993)Plant J3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1：961-968(1989)。
[0253] 还包括创伤可诱导的启动子，如pinII基因的启动子(Ryan(1990)AnnRev Phytopath28：425-449；Duan等人(1996)Nat Biotech14：494-498)、wun1和wun2基因的启动子(US5,428,148)、win1和win2基因的启动子(Stanford等人(1989)Mol Gen Genet215：200-208)、系统素的启动子(McGurl等人(1992)Science225：1570-1573)、WIP1基因的启动子(Rohmeier等人(1993)Plant Mol Biol22：783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters323：73-76)、MPI基因的启动子(Corderok等人(1994)ThePlant J6(2)：141-150)等等。
[0254] e)发育依赖性启动子
[0255] 其他适宜的启动子为例如，果实成熟特异启动子，如番茄果实成熟特异启动子(WO94/21794、EP409625)。发育依赖性启动子部分包括组织特异启动子，因为个体组织本质上以发育依赖性方式发育。
[0256] 本发明的多肽仅在本文提到的病原体感染或者穿透的组织中具有活性或者具有增加的活性是有利的。特别优选组成型启动子和叶和/或茎干-特异的、病原体可诱导和表皮特异的启动子，最优选病原体可诱导的和表皮特异的启动子。还优选天然启动子，其例如包含在Seq.ID NO.：5和6中描绘的基因组片段中。
[0257] 此外，其他启动子可以有效连接待表达的核酸序列，所述启动子使得可能在其他植物组织或者其他生物，例如，大肠杆菌细菌中表达。适宜的植物启动子原则上为所有上述启动子。
[0258] 术语“遗传控制序列”在广义上理解并且指对根据本发明的表达盒的实体化或者功能具有影响的所有那些序列。例如，遗传控制序列修饰原核或者真核生物中转录和翻译。优选地，根据本发明的表达盒包含待重组表达的所述核酸序列的5’上游的对胚表皮和/或花具有特异性的启动子，和3’下游终止子序列作为额外的遗传控制序列和，如果适宜，其他常规调节元件，在每种情况中，它们都有效连接待重组表达的核酸序列。
[0259] 遗传控制序列还包含其他启动子、启动子元件、或者最小启动子，它们都可以修饰表达控制性质。从而，例如，由于遗传控制序列，组织特异表达还可以额外地依赖于某些应激子。已经关于例如，水胁迫、脱落酸(LamE和Chua NH，J Biol Chem1991；266(26)：17131-17135)和热胁迫(SchofflF等人，Molecular&General Genetics217(2-3)：246-53，
1989)描述了此类元件。
[0260] 其他有利的控制序列为例如，革兰氏阳性启动子amy和SPO2，酵母或者真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
[0261] 原则上，它们的调节序列像上述调节序列的所有天然启动子都可以用于根据本发明的方法。此外，也可以有利地使用合成启动子。
[0262] 遗传控制序列还包括基因的5’非翻译区、内含子和非编码3’区，如肌动蛋白-1内含子或者Adh1-S内含子1、2和6(一般参考：The MaizeHandbook，第116章，Freeling和Walbot，编著，Springer，New York(1994))。已经阐明它们在基因表达的调节中起重要作用。从而，已经阐明5’非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。可以提及的翻译增强子的实例为烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res15：8693-8711)等等。此外，它们可以促进组织特异性(Rouster J等人(1998)Plant J15：435-440)。
[0263] 表达盒可以有利地包含一个或多个所称作的增强子序列，其有效连接启动子，使得核酸序列的增强的重组表达成为可能。额外有利的序列，如其他调节序列或者终止子也可以插入待重组表达的核酸序列的3’末端。基因构建体中可以存在待重组表达的核酸序列的一个或多个拷贝。
[0264] 在一个实施方案中，使用Seq ID No.：5和/或6中描绘的基因组片段中包含的天然终止子序列。
[0265] 适宜作为控制序列的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选基本上相应于来自根癌农杆菌的T-DNA多腺苷酸化信号的多腺苷酸化信号，尤其Ti质粒pTiACHS(Gielen等人(1984)EMBO J3：835et seq.)的T-DNA(章鱼碱合酶)3’的基因或者其功能等价物。特别适宜的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。
[0266] 控制序列还进一步被理解为使得可以同源重组或者插入到宿主生物的基因组或者允许从基因组除去的控制序列。对于同源重组，例如，具体基因的天然启动子可以与对胚表皮和/或花具有特异性的启动子交换。诸如cre/lox技术的方法允许组织特异性，如果适宜可诱导地从宿主生物的基因组除去表达盒(Sauer B(1998)Methods.14(4)：381-92)。在该方法中，特定侧翼序列(lox序列)附着到靶基因，所述侧翼序列以后允许通过cre重组酶除去。
[0267] 表达盒和从其衍生的载体可以包含其他功能元件。术语功能元件将在广义上理解并且指对根据本发明的表达盒、载体或者转基因生物的产生、扩增或功能具有影响的所有那些元件。作为实例但不作为限制，可以提及下面的：
[0268] a)选择标记，其赋予对代谢抑制剂，诸如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO98/45456)、抗生素或者杀生物剂，优选除草剂，如卡那霉素、G418、博来霉素或者潮霉素，或者膦丝菌素等等的抗性。特别优选的选择标记是赋予除草剂抗性的那些选择标记。可以提及的实例为：编码膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)和失活谷氨酰胺合酶抑制剂(bar和pat基因)的DNA序列；5-烯醇-丙酮酸基莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSN合酶基因)，其赋予对草苷膦(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)的抗性；gox基因，其编码草苷膦降解酶(草苷膦氧化还原酶)；deh基因(编码失活茅草枯的脱卤素酶)；失活磺酰脲和咪唑啉酮的乳酸乙酰合酶；和bxn基因，其编码降解溴草腈的腈水解酶；aasa基因，其赋予对抗生素apectinomycin的抗性；
链霉素磷酸转移酶(SPT)基因，其允许对链霉素的抗性；新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因，其赋予对卡那霉素或者geneticidin的抗性；潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因，其介导对潮霉素的抗性；乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予对磺酰脲除草剂的抗性(例如，具有S4和/或Hra突变的突变ALS变体)。
[0269] b)报道基因，其编码容易定量的蛋白质和，通过它们的颜色或者酶活性，使得可能评估转化功效、表达部位或者表达时间。在该上下文中非常特别优选的是编码报道蛋白的基因(Schenborn E，Groskreutz D.MolBio-technol.1999；13(1)：29-44)，所述报道蛋白为例如，绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen等人(1995)Plant Journal8(5)：777-784；Haseloff等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA94(6)：2122-2127；Reichel等人(1996)Proc NatlAcad Sci USA93(12)：5888-5893；Tian等人(1997)Plant Cell Rep16：267-271；WO97/41228；Chui WL等人(1996)Curr Biol6：325-330；Leffel SM等人(1997)Biotechniques.23(5)：
912-8)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow等人(1986)Science234：856-859；Millar等人(1992)Plant Mol Biol Rep10：324-414)，和水母发光蛋白基因(Prasher等人(1985)Biochem Biophys Res Commun126(3)：1259-1268)、β-半乳糖苷酶R基因座基因(其编码调节植物组织中产生花色素苷色素(红色)的蛋白质从而使得可以直接分析启动子活性而不加入额外的辅助物质或者显色底物；Dellaporta等人：Chromosome Structure and Function：Impact of NewConcepts，18th Stadler Genetics Symposium，11：263-282，
1988)，特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人，EMBO J.1987，6，3901-3907)。
[0270] c)复制起点，其确保根据本发明的表达盒或者载体在例如大肠杆菌中的扩增。所提及的实例为ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或者P15A ori(Sambrook等人：Molecular Cloning.A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
[0271] d)农杆菌介导的植物转化必需的元件，如T-DNA或者vir区的右边界或者左边界。
[0272] 为了选择成功经历同源重组的细胞，或者选择经转化的细胞，通常必须还导入选择标记，其赋予已经成功经历重组的细胞对杀生物剂(例如，除草剂)、代谢抑制剂(如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(WO98/45456))或者抗生素的抗性。选择标记允许从未转化的细胞选择转化的细胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5：81-84)。
[0273] 可以有利地使用包含表达盒的载体实现根据本发明的表达盒向生物或者其细胞、组织、器官、部分或者种子的导入(优选导入植物或植物细胞、组织、器官、部分或者种子中)。可以通过适宜的限制性切割位点将表达盒导入载体(例如，质粒)中。首先将所形成的质粒导入大肠杆菌中。选择、生长正确转化的大肠杆菌并通过技术人员熟悉的方法得到重组质粒。限制性分析和测序可以用于验证克隆步骤。
[0274] 用于在特定植物部分中表达的其他启动子为例如，来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(WO9845461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US5504200)，来自芸苔的Bce4-启动子(WO9113980)或者豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)以及在像玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等的单子叶植物中赋予种子特异表达的启动子。所提及的适宜启动子为来自大麦的Ipt2或者Ipt1基因启动子(WO9515389和WO9523230)或者在WO9916890中描绘的那些启动子(来自大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高梁kasirin基因、黑麦黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。
[0275] 此外，可以将本发明的多核苷酸以反义方向克隆到表达载体中。即，DNA分子有效连接调节序列，所述连接的方式允许表达(通过DNA分子的转录)本发明的多核苷酸编码的mRNA反义的RNA分子。可以选择有效连接以反义方向克隆的核酸的调节序列，其指导所述反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达，例如，可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异的或者细胞类型特异表达的病毒启动子和/或增强子，或调节序列。反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒或者减毒病毒的形式，其中所产生的反义核酸分子处于高效率调节区的控制下，所述调节区的活性可以通过确定载体所导入的细胞类型确定。关于使用反义基因调节基因表达的讨论，见Weintraub，H.等人，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986和Mol等人，1990，FEBS Letters268：427-430。
[0276] 在一个实施方案中，本发明涉及产生重组宿主细胞的方法，其包括向宿主细胞导入本发明的载体或者多核苷酸或者所述载体或所述多核苷酸和表达另一种抗性蛋白质的载体。
[0277] 可以通过常规转化或转染技术向原核或真核细胞导入载体DNA。本文所用的术语“转化”和“转染”、接合和转导意在指多种本领域已知的将外源核酸(例如，DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移，或者电穿孔。转化或者转染宿主细胞(包括植物细胞)的适宜的方法可以参见Sambrook，等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)和其他实验室手册，如Methods in MolecularBiology，1995，卷44，Agrobacterium protocols，编者：Garland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。
[0278] 为了稳定转染真核细胞，已知取决于所用的表达载体和转染技术，仅一小部分细胞可以将外来DNA整合到它们的基因组。为了鉴定和选择这些整合体，通常将选择性标记(例如，对抗生素的抗性)随目的基因导入宿主细胞。优选的选择性标记包括赋予对药物(如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的那些选择性标记或者在植物中为赋予对除草剂如草苷膦或草铵膦的抗性的选择性标记。可以将编码选择性标记的核酸导入宿主细胞中与编码本发明多肽相同的载体上或者导入单独的载体。用所导入的核酸稳定转染的细胞可以通过例如，药物选择鉴定(例如，具有所掺入的选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
[0279] 可以产生其他宿主细胞，其含有允许所导入的基因的受调节的表达的选择系统。例如，将本发明的多核苷酸包括在载体中处于lac操纵子控制下允许仅在存在IPTC时表达该多核苷酸。此类调节系统是本领域公知的。
[0280] 优选地，所导入的核酸分子是宿主细胞外来的。
[0281] “外来的”指核酸分子关于宿主细胞是异源的，这意味着来自具有不同基因组背景的细胞或者生物，或者所述核酸分子关于宿主细胞是同源的但是位于不同于所述核酸分子的天然发生的对应物的基因组环境中。这意味着，如果核酸分子关于所述宿主细胞是同源的，其不位于所述宿主细胞的基因组中的天然位置，尤其它被不同的基因包围。在该情况中，核酸分子可以处于其自身启动子控制下或者处于异源启动子控制下。宿主细胞中存在的根据本发明的载体或者核酸可以整合到宿主细胞的基因组或者可以以某种形式保持在染色体外。在该方面，还理解本发明的核酸分子可以用于通过同源重组恢复或者产生突变基因(Paszkowski(编者)，HomologousRecombination and Gene Silencing in Plants.Kluwer Academic Publishers(1994))。
[0282] 因此，在另一实施方案中，本发明涉及用本发明的多核苷酸或者本发明的载体，或者用所述载体或所述多核苷酸和用于表达另一种抗性蛋白质的载体或者多核苷酸基因工程化的宿主细胞。
[0283] 术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用。将理解此类术语不仅指具体受试者细胞，而且指此类细胞的后代或者潜在后代。因为由于某些突变或者环境影响，在连续世代中可以发生某些修饰，所以此类后代可能实际上不与亲代细胞相同，但是仍然包括在本文所用的术语的范围内。
[0284] 例如，可以将本发明的多核苷酸导入细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞或者哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞或者真菌中。适宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。优选大肠杆菌、杆状病毒、农杆菌或者植物细胞。
[0285] 此外，还可以转化宿主细胞从而(过)表达其他酶和蛋白质，所述表达支持植物对病原体抗性的增加。优选地，还表达另一抗性基因，优选还表达一种或多种抗性基因，优选本文提及的基因。最优选地是Rpi-blb2和Rpi-blb的共表达。
[0286] 进一步优选的是本文提及的植物之一，尤其上面提及的茄科植物之一的细胞，最优选马铃薯、番茄、矮牵牛、树番茄、pear melon或者茄子的细胞。
[0287] 在另一实施方案中，本发明涉及产生本发明的多肽，尤其具有Rpi-blb2活性的蛋白质的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并从培养基或细胞回收所述多核苷酸编码并且宿主细胞表达的所述多肽。
[0288] 术语“表达”指在细胞中产生蛋白质或者核苷酸序列。然而，所述术语还包括在无细胞体系中表达蛋白质。它包括从编码产物的DNA转录成RNA产物，转录后修饰和/或翻译成蛋白质产物或者多肽，以及可能的翻译后修饰。
[0289] 取决于所用的特定构建体和条件，可用从细胞、培养基或者两者回收蛋白质。对于本领域技术人员，公知不仅可以表达天然蛋白质，而且可以表达作为融合多肽的蛋白质或者加入指导蛋白质到达宿主细胞的特定隔室，例如，确保蛋白质分泌到培养基等等的信号肽。此外，此类蛋白质和其片段可以经化学合成和/或根据例如下文描述的标准方法修饰。
[0290] 本发明的宿主细胞，如培养中的原核或者真核宿主细胞可以用于产生(即表达)本发明的多核苷酸编码的多肽，优选具有Rpi-blb2活性的多肽。此外，通过电穿孔或者农杆菌介导的基因转移通过直接转移DNA到正发育的花中也可以应用备选方法。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞产生Rpi-blb2的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在适宜的培养基中培养本发明的宿主细胞从而产生本发明的多肽。此外，所述方法包括从培养基或者宿主细胞分离和/或回收所述多肽。
[0291] 优选通过重组DNA技术产生本发明的多肽。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆到表达载体(如上述)中，将表达载体导入宿主细胞(如上述)并且在该宿主细胞中表达所述多肽。然后通过适宜的纯化方案，使用标准蛋白质纯化技术从细胞分离所述多肽。重组表达的备选方案是可以使用标准肽合成技术化学合成本发明的多肽或者肽。此外，例如，使用下文描述的本发明的抗体，尤其抗Rpi-blb2抗体从细胞(例如，内皮细胞)分离天然Rpi-blb2，通过标准技术，使用本发明的多肽或者其片段，即本发明的多肽可以产生所述抗体。
[0292] 在一个实施方案中，本发明涉及Rpi-blb2蛋白质或者具有Rpi-blb2活性的蛋白质。
[0293] 在一个实施方案中，本发明涉及具有本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列或者可以通过本发明的方法得到的多肽。
[0294] 在一个实施方案中，所述多肽不由Seq.ID NO.：8和/或10中描绘的序列组成和/或不由Seq.ID NO.：7和/或9中描绘的核酸分子编码的序列组成。
[0295] 在一个实施方案中，本发明的多肽不由Mil.1或者Mil.2蛋白质的序列组成和/或不由编码Mil.1或者Mil.2蛋白质的核酸分子编码的蛋白质组成。
[0296] 从而，在一个实施方案中，本发明的多肽可以不由Rossi等人1998，PNAS USA95：9750-9754，Milligan等人，1998.Plant Cell 10：1307-1319；和/或WO9806750中所示的序列组成。
[0297] 用于本申请中的术语“蛋白质”和“多肽”是可以互换的。“多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不涉及分子的特定长度。从而多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语还指或者包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。所述定义包括例如，含有氨基酸的一个或多个类似物(包括例如，非天然氨基酸等等)的多肽、具有取代的连接的多肽，以及本领域已知的天然发生和非天然发生的其他修饰。
[0298] 优选地，所述多肽是分离的。“分离的”或者“纯化的”蛋白质或者其生物活性部分当通过重组DNA技术产生时基本上细胞材料，或者当化学合成时基本上无化学前体或者其他化学品。
[0299] 术语“基本上无细胞材料”包括本发明多肽的制备物，其中所述蛋白质与天然或者重组产生该蛋白质的细胞中的细胞组分分离。在一个实施方案中，术语“基本上无细胞材料”包括具有小于约30％(按照干重)“污染性蛋白质”，更优选小于约20％“污染性蛋白质”，更优选小于约10％“污染性蛋白质”，最优选小于约5％“污染性蛋白质”的制备物。术语“污染性蛋白质”涉及不是本发明的多肽的多肽。当重组产生本发明的多肽或者其生物活性部分时，还优选基本上无培养基，即，培养基为蛋白质制备物体积的约20％以下，更优选约10％以下，最优选约5％以下。术语“基本上无化学前体或者其他化学品”包括制备物，其中本发明的主题，例如，本发明的多肽与涉及该蛋白质合成的化学前体或者其他化学品分离。术语“基本上无化学前体或者其他化学品”包括制备物，其具有小于约30％(按干重计)化学前体或者非Rpi-blb2化学品，更优选小于约20％化学前体或者非Rpi-blb2化学品，更优选小于约10％化学前体或者非Rpi-blb2化学品，最优选小于约5％化学前体或者非Rpi-blb2化学品。在优选实施方案中，分离的蛋白质或者其生物活性部分缺少污染性蛋白质，其中所述污染性蛋白质与本发明的多肽来自相同生物。通常，通过重组DNA技术产生此类蛋白质。
[0300] 本发明的多肽或者其部分可以优选包含与SEQID No：2或4的氨基酸序列足够同源的氨基酸序列，从而所述蛋白质或者其部分保持赋予本发明的抗性的能力。所述蛋白质的部分优选为本文描述的生物活性部分。优选地，本发明的多肽具有与SEQID No：2或4中所示相同的氨基酸序列。此外，所述多肽可以具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与本发明的多核苷酸的核苷酸序列杂交，优选在上文描述的严格杂交条件下杂交。因此，所述多肽具有核苷酸序列编码的氨基酸序列，其与SEQ IDNo：2或4的氨基酸序列之一具有至少约70％，优选至少约75％，更优选至少约80％、90％、95％，甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或以上的同源性。本发明的优选的多肽优选具有本文描述的至少一种Rpi-blb2蛋白质活性，例如，其抗性或者免疫活性。本发明的优选多肽包括核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与SEQID No：1或3或5或6的核苷酸序列杂交，优选在严格条件下与所述核苷酸序列杂交，或者与所述核苷酸序列同源(如上定义的)。
[0301] 因此，如本文详述，本发明的多肽可以由于天然变异或者诱变在氨基酸序列中与SEQID No：2或4不同。因此，所述多肽可以包含与SEQ ID No：1或3或5或6的完整氨基酸至少约70％，优选至少约75％，更优选至少约80％、90％、95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或以上同源的氨基酸序列。
[0302] 本发明多肽的生物活性部分包括包含来源于Rpi-blb2蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，SEQ ID No：2或4中所示的氨基酸序列或者与其同源的蛋白质的氨基酸序列，其包括的氨基酸少于全长Rpi-blb2蛋白质的氨基酸或者少于如下全长蛋白质的氨基酸，所述全长蛋白质与本文描绘的Rpi-blb2蛋白质同源并且显示出Rpi-blb2蛋白质的至少一种活性。通常，生物(或者免疫学)活性部分，即肽，例如，长为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽包含具有Rpi-blb2蛋白质的至少一种活性或表位的结构域或者基序。此外，其中缺失多肽的其他区域的其他生物活性部分可以通过重组技术制备并且评估本文描述的一种或多种活性。
[0303] 本发明的Rpi-blb2多核苷酸的操作可以导致产生具有与野生型Rpi-blb2蛋白质功能不同的Rpi-blb2。这些蛋白质可以在效率或者活性方面得到提高，可以以比通常更大的数目存在于细胞中，或者效率或活性减小。
[0304] Rpi-blb2的诱变策略导致所述化合物的所述抗性增加或者对另一种植物病原体种或者前述提到的植物病原体种的另一种株系的抗性增加，所述诱变策略不意在限制；这些策略的变通方案是本领域技术人员显而易见的。使用此类策略，并且整合本文公开的机制，可以用本发明的多核苷酸和多肽产生植物或其部分，其表达野生型Rpi-blb2或者突变的Rpi-blb2多核苷酸和蛋白质分子从而所希望的化合物的生产的产率、产量和/或效率提高了。该所希望的化合物可以是植物的任意天然产物，其包括生物合成途径的终产物和天然发生的代谢途径的中间物，以及在所述细胞的代谢中不天然发生的分子，但是其通过本发明的所述细胞产生。
[0305] 本发明还提供了嵌合或融合蛋白质。
[0306] 本文所用的“嵌合蛋白质”或者“融合蛋白质”包含有效连接非Rpi-blb2多肽的多肽。
[0307] “Rpi-blb2多肽”指具有相应于具有Rpi-blb2活性的多肽的氨基酸序列的多肽，而“非Rpi-blb2多肽”指具有相应于不基本上同源于Rpi-blb2的蛋白质的氨基酸序列的多肽，例如，不赋予本文描述的抗性，尤其不赋予对致病疫霉抗性和来源于相同或不同生物的蛋白质。在融合蛋白质中，术语“有效连接”意在表示Rpi-blb2多肽和非Rpi-blb2多肽相互融合，从而两条序列都完成所用序列的计划的功能。非Rpi-blb2多肽可以与Rpi-blb2多肽的N-末端或者C-末端融合。例如，在一个实施方案中，融合蛋白质是GST-LMRP融合蛋白质，其中Rpi-blb2序列融合GST序列的C-末端。此类融合蛋白质可以方便重组Rpi-blb2的纯化。在另一实施方案中，融合蛋白质是在其N-末端含有异源信号序列的Rpi-blb2。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可以增加Rpi-blb2的表达和/或分泌。
[0308] 优选地，通过标准重组DNA技术产生本发明的Rpi-blb2嵌合或者融合蛋白质。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段连接在框内，例如，通过平末端或者交错末端用于连接，用限制酶消化以提供适宜的末端，如果适宜，填充粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，和酶连接。通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)可以合成融合基因。备选地，可以用锚定引物实施基因片段的PCR扩增，所述引物在两个连续基因片段之间形成互补突出端，所述基因片段可以随后退火并再扩增产生嵌合基因序列(见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，编者：Ausubel等人，John Wiley&Sons：1992)。此外，可以通过商业途径得到已经编码融合部分(例如，GST多肽)的许多表达载体。可以将本发明的多核苷酸克隆到此类表达载体中从而融合部分在框内连接所编码的蛋白质。
[0309] 此外，使用适宜的计算机程序可以进行本发明蛋白质的结构基序的折叠模拟和 计 算 机 再 设 计(Olszewski，Protein 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11(1995)，675-679)。蛋白质折叠的计算机建模可以用于详细的肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。具体地，可以用适宜的程序鉴定促有丝分裂的cyplin及其受体的相互作用位点，并通过互补肽序列的计算机辅助搜索鉴定它的配体或者其他相互作用蛋白质(Fassina，Immunomethods(1994)，114-120。用于设计蛋白质和肽的其他适宜的计算机系统描述于现有技术，例如，Berry，Biochem，Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann.N.Y.Acad.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry25(1986)，5987-5991。从上述计算机分析得到的结果可用于例如，制备本发明蛋白质或者其片段的肽模拟物。所述蛋白质的天然氨基酸序列的此类假肽类似物可以非常有效地模拟母蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，容易得到的非手性Q-氨基酸残基向本发明蛋白质或者其片段的掺入导致脂肪族链的聚亚乙基单位对酰胺键的取代，从而提供构建假肽的方便的策略(Banerjee，Biopolymers39(1996)，769-777)。
[0310] 在现有技术中描述了其他系统中小肽激素的强效肽模拟类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。通过连续酰胺烷基化合成肽模拟物组合文库，并测试所得化合物的例如，结合和免疫活性，也鉴定了本发明蛋白质的适宜的肽模拟物。产生和使用肽模拟物组合文库的方法在现有技术，例如，在Ostresh，Methods in Enzymology267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述。
[0311] 此外，可以用本发明蛋白质的三维和/或晶体结构设计本发明蛋白质的生物活性的肽模拟物抑制剂(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
[0312] 在另一实施方案中，本发明涉及特异结合本发明的多肽或者部分，即此类蛋白质的特定片段或者表位的抗体。
[0313] 本发明的抗体可以用于鉴定和分离任意生物中的Rpi-blb和基因，优选以本文中描述的植物制备的植物中的Rpi-blb和基因。这些抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体或者合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或者scFv片段等等。例如，通过最初在 和Milstein，Nature256(1975)，495，和Galfr6，Meth.Enzymol.73(1981)，3中描述的技术制备单克隆抗体，所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞与来自经免疫的哺乳动物的脾细胞融合。
[0314] 此外，通过使用例如，Harlow和Lane″Antibodies，A LaboratoryManual″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中描述的方法可以得到针对前述肽的抗体或者其片段。这些抗体可以例如，用于根据本发明的蛋白质的免疫沉淀和免疫定位，以及用于监视例如，重组生物中此类蛋白质的合成，和用于鉴定与根据本发明的蛋白质相互作用的化合物。例如，用于BlAcore系统中的表面等离子体共振可以用于增加噬菌体抗体选择的效率，从结合本发明蛋白质表位的噬菌体抗体的单个文库产生亲和力的高度增加(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，
7-13)。在许多情况中，抗体对抗原的结合现象等价于其他配体/抗配体结合。
[0315] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的多肽的互补序列的反义核酸分子。
[0316] 修饰表达水平和/或活性的方法是本领域技术人员已知的并且包括例如过表达、共抑制、使用核酶、有义和反义策略、基因沉默方法。“有义链”指双链DNA分子的链，其与其mRNA转录物同源。“反义链”含有与“有义链”的序列互补的倒置序列。
[0317] “反义”核酸分子包含与编码蛋白质的“有义”核酸分子互补，例如，与双链cDNA分子的编码链互补或者与mRNA序列互补的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可以通过氢键结合有义核酸分子。反义核酸分子可以与整个Rpi-blb2编码链互补，或者仅与其一部分互补。因此，反义核酸分子可以为本发明多核苷酸的核苷酸序列的编码链的“编码区”的反义序列。术语“编码区”指包含密码子的核苷酸序列区，所述密码子翻译成氨基酸残基。此外，反义核酸分子是编码Rpi-blb2的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义的。术语“非编码区”指编码区侧翼的5’和3’序列，其不翻译成多肽，即也称作5’和3’非翻译区(5’-UTR或者3’-UTR)。
[0318] 考虑到编码本文公开的Rpi-blb2的编码链序列，可以根据Watson和Crick碱基配对法则设计本发明的反义核酸分子。反义核酸分子可以与Rpi-blb2mRNA的完整编码区互补，但是也可以是与Rpi-blb2mRNA的编码或者非编码区的仅一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与Rpi-blb2mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸可以长为例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个核苷酸。使用化学合成和酶促连接反应，用本领域公知的方法可以构建本发明的反义核酸分子。例如，使用天然发生的核苷酸或者设计用于增加分子的生物学稳定性或者增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的多种经修饰的核苷酸可以化学合成反义核酸分子(例如，反义寡核苷酸)，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例可以用于产生反义核酸，包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、
1-甲基鸟嘌呤、1-甲基-肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、
5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基-乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、和2，6-二氨基嘌呤。备选地，可以使用表达载体通过生物学方法产生反义核酸，其中已经以反义方向将多核苷酸亚克隆到所述表达载体(即，从所插入的多核苷酸转录的RNA将为与目的靶多核苷酸反义方向，在下面的小节中进一步描述)。
[0319] 通常将本发明的反义核酸分子施用于细胞或者原位产生从而它们与编码Rpi-blb2的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或者结合，从而例如，通过抑制转录和/或翻译抑制蛋白质的表达。杂交可以通过常规核苷酸互补形成稳定的双链体，或者例如，对于结合DNA双链体的反义核酸分子，通过双螺旋的大沟中的特异相互作用。可以修饰反义分子从而其特异结合表达于所选细胞表面上的受体或者抗原，例如，通过将反义核酸分子连接到结合细胞表面受体或者抗原的肽或者抗体实现所述特异结合。使用本文描述的载体也可以递送反义核酸分子。为了实现反义分子的足够细胞内浓度，优选其中反义核酸分子置于强原核生物、病毒或者真核生物(包括植物)启动子的控制下的载体构建体。
[0320] 在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子可以是异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异双链杂合分子，其中与常规单位相反，所述链相互平行(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包含2’-O-甲基-核糖核苷酸(Inoue等人(1987)NucleicAcids Res.15：6131-6148)或者嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
[0321] 此外，本发明的反义核酸分子可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性DNA分子，其能够切割与其有互补区的单链核酸，如mRNA。从而，核酶(例如，锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591)中描述)可以用于催化性切割Rpi-blb2mRNA转录物从而抑制mRNA的翻译。可以基于本文公开的Rpi-blb2cDNA的核苷酸序列或者基于将根据本发明中教导的方法分离的异源序列设计对编码Rpi-blb2的核酸分子具有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与编码mRNA中待切割的核苷酸序列互补。见，例如，Cech等人美国专利号4,987,071和Cech等人美国专利号5,116,742。备选地，可以用Rpi-blb2mRNA从RNA分子库选择具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA。见，例如，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science261：1411-1418。本发明的反义分子还包含多核苷酸，其包含与Rpi-blb2核苷酸序列的调节区(例如，其启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，例如，以形成三螺旋结构，其防止靶细胞中基因的转录。一般见，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：
569-84；Helene，C.等 人 (1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和 Maher，L.J.(1992)Bioassays14(12)：807-15。
[0322] 此外，在一个实施方案中，本发明涉及产生转基因植物、植物细胞或者植物组织的方法，其包括将本发明的多核苷酸或者载体导入所述植物、植物组织或者植物细胞的基因组。在优选实施方案中，所述载体或者所述多核苷酸在用于表达另一抗性基因，尤其Rpi-blb的载体或多核苷酸之前、之后或一起导入所述植物、植物组织或者植物细胞的基因组。
[0323] 为了在植物细胞中以有义或者反义方向表达根据本发明的核酸分子，将分子置于确保在植物细胞中表达的调节元件的控制下。这些调节元件可以关于待表达的核酸分子以及关于待转化的植物种类是异源或同源的并且在上文中详细描述。
[0324] 通常，此类调节元件包含在植物细胞中有活性的启动子。为了得到转基因植物的所有组织中的表达，例如，使用组成型启动子，如CaMV的35S启动子(Odell，Nature313(1985)，810-812)或者玉米的聚泛蛋白(polyubiquitin)基因的启动子(Christensen，Plant Mol.Biol.18(1982)，675-689)。为了实现转基因植物中特定组织的表达，可能使用组织特异启动子(见，例如，Stockhaus，EMBO J.8(1989)，2245-2251)。还已知在马铃薯的块茎或者不同植物种，如玉米、蚕豆、小麦、大麦等的种子中具有特异活性的启动子。可以用诱导型启动子以便能够精确控制表达。诱导型启动子也包含通过植物的感染诱导的启动子。其他实施方案在上文描述。
[0325] 在一个实施方案中，本发明涉及产生抗卵菌门病原体的植物或其部分的方法，其包括步骤：在植物或其部分中表达本发明的多肽和另一抗性蛋白质。
[0326] 因此，在另一实施方案中，本发明涉及本发明的或者根据本发明方法产生的转基因植物或植物组织，其当存在所述多核苷酸或载体时抗所述病原体。
[0327] 经转化的生物(或者转化的细胞或组织)的产生需要向相关宿主细胞导入所述DNA、RNA或者蛋白质。许多方法可用于该步骤，其称作转化(或者转导或转染)(Keown等人(1990)Methods in Enzymology 185：527-537)。例如，通过微注射或者用DNA包被的微粒轰击可以直接导入DNA或RNA。而且，例如，使用聚乙二醇可以化学透化细胞，从而DNA可以通过扩散进入细胞。还可以通过原生质体与其他含有DNA的单位，如小细胞(minicell)、细胞、溶菌酶或者脂质体融合导入DNA。导入DNA的另一种适宜的方法是电穿孔，其中通过电脉冲可逆地透化细胞。已经描述了适宜的方法(例如，Bilang等人(1991)Gene 100：247-250；Scheid等人(1991)Mol Gen Genet 228：104-112；Guerche等人(1987)Plant Science52：111-116；Neuhause等 人(1987)Theor Appl Genet 75：30-36；Klein 等 人(1987)Nature 327：70-73；Howell等人(1980)Science 208：1265；Horsch等人(1985)Science 227：1229-1231；DeBlock等人(1989)Plant Physiology 91：694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach，编著)Academic Press Inc.(1988)；和Methods in Plant MolecularBiology(Schuler和Zielinski，编著)Academic Press Inc.(1989))。
[0328] 在植物中，上述从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法用于瞬时和稳定转化。适宜的方法特别为通过聚乙二醇诱导的DNA摄入的原生质体转化、使用基因枪的生物射弹方法(其也称作微粒轰击方法)、电穿孔、将干燥胚胎在含有DNA的溶液中孵育，和微注射。
[0329] 除了这些“直接”转化技术，通过根癌农杆菌或者毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的细菌感染也可以实现转化。农杆菌介导的转化最适于双子叶植物细胞。所述方法由例如，Horsch RB等人(1985)Science225：1229f描述。
[0330] 当使用农杆菌时，表达盒必需整合到特定质粒中，可以整合到穿梭载体或者中间载体，或者整合到双元载体中。如果用Ti或者Ri质粒进行转化，Ti或者Ri质粒T-DNA的至少右边界，但是在多数情况中，右边界和左边界以侧翼区的形式连接待导入的表达盒。
[0331] 优选使用双元载体。双元载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。通常，它们包含选择标记基因和接头或多接头，其侧翼是右和左T-DNA边界序列。可以将它们直接转移到农杆菌中(Holsters等人(1978)Mol Gen Genet163：181-187)。选择标记基因允许选择所转化的农杆菌并且为，例如，nptII基因，其赋予对卡那霉素的抗性。作为宿主生物的农杆菌在该情况中应该已经含有具有vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移到植物细胞所需的。以这种方法转化的农杆菌可以用于转化植物细胞。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经详细研究和描述(EP120516；Hoekema，The Binary PlantVector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，V章；An等人(1985)EMBO J4：277-287)。多种双元载体是已知的，它们的一些可以通过商业途径得到，如pBI101.2或者pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。
[0332] 已经描述了适宜在植物中表达的其他启动子(Rogers等人(1987)MethinEnzymol153：253-277；Schardl等人(1987)Gene61：1-11；Berger等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：8402-8406)。
[0333] 直接转化技术适于任意生物和细胞类型。
[0334] 对于DNA或者RNA注射或者电穿孔到植物细胞的情况，所用的质粒不必满足任何具体要求。可以使用简单质粒，如pUC系列的质粒。如果将从所转化的细胞再生完整植物，必需额外的选择标记基因位于质粒上。
[0335] 选择标记是所导入的DNA的部分时，可以从未转化的细胞选择稳定转化的细胞，即含有整合到宿主细胞的DNA的所导入DNA的那些细胞。可以作为标记的基因的实例为能够赋予抗生素或者除草剂(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或者膦丝菌素)抗性的基因(见上文)。表达此类标记基因的转化细胞能够在相应抗生素或除草剂的一定浓度存在下存活，而所述抗生素或除草剂杀死未转化的野生型。实例在上文描述并且优选包含bar基因，其赋予对除草剂膦丝菌素的抗性(Rathore KS等人(1993)PlantMol Biol 21(5)：871-884)，还包括nptII基因，其赋予卡那霉素抗性；hpt基因，其赋予潮霉素抗性，或者EPSP基因，其赋予除草剂草甘膦抗性。选择标记允许从未转化的细胞选择经转化的细胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84)。可以以常规方式培育和杂交所得植物。为了确保基因组整合是稳定和可遗传的，应该生长两代或更多代。
[0336] 上述方法描述于例如，SD Kung和R Wu编著的Jenes B等人(1993)Techniques for Gene Transfer：Transgenic Plants，卷1，Engineering andUtilization，Academic Press，128-143 页 和 Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol PlantMolec Biol 42：205-225)。优选将待表达的构建体克隆到适于农杆菌转化的载体，例如，pBin19中(Bevan等人(1984)Nucl Acids Res12：8711f)。
[0337] 一旦已经产生了经转化的植物细胞，就可以使用技术人员已知的方法得到完整植物。例如，愈伤组织培养物用作起始材料。可以用该还未分化的细胞生物量以已知方式诱导芽和根的发育。所得的芽可以移植到户外并繁殖。
[0338] 技术人员熟悉从植物细胞和植物部分再生完整植物的方法。再生方法描述于例如，Fennell等人(1992)Plant Cell Rep.11：567-570；Stoeger等人(1995)Plant Cell Rep.14：273-278；Jahne等人(1994)Theor Appl Genet89：525-533。
[0339] 根据本发明的方法可以有利地与产生病原体抗性(例如，对昆虫、真菌、细菌、线虫等的抗性)、胁迫抗性和植物性质的另一种改善的其他方法联合使用。实例由Dunwell JM，Transgenic approaches to crop improvement，JExp Bot.2000；51 Spec No；487-96页提及。
[0340] 农杆菌的适宜株系和载体以及农杆菌的转化和适宜的生长和选择培养基是技术人员公知的并且描述于现有技术中(GV3101(pMK90RK)，Koncz，Mol.Gen.Genet.204(1986)，383-396；C58C1(pGV 3850kan)，Deblaere，Nucl.Acid Res.13(1985)，4777；Bevan，Nucleic.Acid Res.12(1984)，8711；Koncz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)，
8467-8471；Koncz，Plant Mol.Biol.20(1992)，963-976；Koncz，Specialized vectors for gene tagging andexpression studies.In：Plant Molecular Biology Manual卷2，Gelvin和Schilperoort(Eds.)，Dordrecht，荷兰：Kluwer AcademicPubl.(1994)，1-22；
EP-A-120516；Hoekema：The Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，Chapter V，Fraley，Crit.Rev.Plant.Sci.，4，1-46；An，EMBO J.4(1985)，277-287)。
[0341] 尽管在本发明方法中优选使用根癌农杆菌，但是如果希望所述株系赋予的表型，也可以使用其他农杆菌株系，如毛根农杆菌。
[0342] 使用上述方法可能转化多数双子叶植物。但是对于单子叶植物的转化，也已经开发了一些成功的转化技术。这些技术包括使用例如，上述生物射弹方法转化以及原生质体转化、部分透化细胞的电穿孔、使用玻璃纤维导入DNA，等等。
[0343] 本文所用的术语“转化”指将外源多核苷酸转移到宿主细胞，而不管用于转移的方法。可以将多核苷酸瞬时或者稳定导入宿主细胞并且可以例如作为质粒或者作为嵌合连接保持不整合，或者备选地，可以整合到宿主基因组。然后所得转化的植物细胞可以用于以技术人员已知的方式再生经转化的植物。
[0344] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及植物细胞，其包含本发明的或者通过本发明方法可以得到的多核苷酸或载体。优选地，细胞包含赋予另一抗性的多核苷酸或者载体，更优选地，为编码Rpi-blb的载体或者多核苷酸。
[0345] 从而，本发明还涉及转基因植物细胞，其含有(优选稳定整合到基因组)根据本发明的多核苷酸，其连接到允许在植物细胞中表达所述多核苷酸的调节元件，并且其中所述多核苷酸是转基因植物细胞外来的。对于外来的含义，见上文。
[0346] 从而，本发明还涉及包含根据本发明的转基因植物细胞的转基因植物和转基因植物组织。由于本发明多肽的(过)表达，所述植物或植物组织抗植物病原体，尤其抗卵菌。优选地，所述植物还抗其他病原体，例如，抗吮吸性植物病原体。本文描述了其他病原体。优选所述植物或者植物组织抗疫霉种，最优选地抗致病疫霉。
[0347] 例如，为了得到表达Rpi-blb2基因的转基因植物，可以将其编码区克隆到例如，pBinAR载体( 和Willmitzer，Plant-Science，66，1990，221-230)中。例如，根据聚合酶链反应(PCR)技术，可以用实施例和附图，例如，表3b中所示引物，尤其用ARF1F和ARF1R扩增Rpi-blb2的编码区。可以纯化所得PCR片段并随后将该片段克隆到载体中。可以将所得载体转移到根癌农杆菌中。该株系可以用于转化并且可以选择转基因植物。在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的植物细胞的转基因植物或者植物组织。
[0348] 例如，关于核酸序列、包含所述核酸序列的表达盒或者载体或者用所述核酸序列、表达盒或者载体转化的生物，“转基因的”指通过重组方法产生的所有那些构建体，在所述构建体中，
[0349] a)Rpi-blb2核酸序列，或者
[0350] b)有效连接Rpi-blb2核酸序列的遗传控制序列，例如，启动子，或
[0351] c)(a)和(b)
[0352] 不位于它们的天然遗传环境中或者已经通过重组方法修饰，修饰的一个实例是替代、加入、缺失、倒置或者插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指最初生物中天然染色体基因座，或者指存在于基因组文库中。对于基因组文库，优选保持，至少部分保持核酸序列的天然遗传环境。所述环境在核酸序列侧翼的至少一边并且具有长为至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，非常特别优选至少5000bp的序列。天然发生的表达盒-例如，Rpi-blb2启动子与相应Rpi-blb2基因的天然发生的组合-当用非天然的、合成的“人工“方法如诱变修饰时，变成转基因表达盒。已经描述了此类方法(US5,565,350；WO00/15815；也见上文)。
[0353] 此外，还可以转化植物细胞、植物组织或者植物，从而(过)表达其他酶和蛋白质，所述表达支持植物或者植物组织抗性的增加，例如，Rpi-blb(同义词Rpi-blb1、RB或Sbu1)、R1、Rpi-mcd、R-ber(同义词R12)、Rpi1、Rpi-blb3、Rpi-ABPT1、R2、R3a或R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3-蛋白质。优选Rpi-blb和Rpi-blb2共表达。
[0354] 本发明还涉及包含如上述的转基因植物细胞的培养的植物组织，所述植物细胞显示出根据本发明的蛋白质的表达。根据上面的定义，优选作为转基因生物的宿主和起始生物主要是植物。本发明的范围内包括植物界高等和低等植物的所有属和种。还包括具有增加的Rpi-blb2活性的成熟植物、种子、芽和幼苗，和部分、繁殖材料和从中得到的培养物，例如，细胞培养物。成熟植物指幼苗之外的任意发育阶段的植物。术语幼苗指早期发育阶段的年幼的不成熟的植物。
[0355] 根据本发明得到的任意转化的植物可以用于常规育种方案中或者用于体外植物繁殖以产生更多具有相同特征的经转化的植物和/或可以用于在相同或相关种的其他品种中引入相同特征。此类植物也是本发明的部分。从经转化植物得到的种子在遗传上也含有相同的特征并且是本发明的部分。如前面提到的，本发明原则上可以应用于可以用本领域技术人员已知的任意转化方法转化的任意植物和农作物。
[0356] 通常，可以根据本发明修饰并且显示出根据本发明的蛋白质的过表达或者此类蛋白质合成减少的植物可以来自任意希望的植物种。它们可以是单子叶植物或者双子叶植物，优选它们属于在农业、林业或者园艺上重要的植物种，如农作物植物(例如，玉米、稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦等等)、马铃薯、产油植物(例如，油菜籽、向日葵、花生、大豆等等)、棉花、甜菜、甘蔗、豆科植物(例如，豆类、豌豆等等)、产木材植物，优选树等等。然而，优选可以受疫霉种感染的植物。
[0357] 因此，在一个实施方案中，本发明的或者根据本发明方法产生的植物、植物细胞或者植物组织选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚壳树科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟丝子科、花荵科和田基麻科(Hydrophyllaceae)构成的组或者具有其来源。优选地，本发明的或者根据本发明方法产生的所述植物、植物细胞或者植物组织为茄科，优选选自根据Systema Naturae 2000，Brands，S.J，Amsterdam的由颠茄属、Browallia、番茉莉属、辣椒属(Capsicum)、夜香树属、Cyphomandra、曼陀罗属(Datura)、Fabiana、Franciscea、天仙子属(Hyoscyamus)、枸杞属(Lycium)、茄参属(Mandragora)、假酸浆属(Nicandra)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、酸浆属(Physalis)、Schizanthus和茄属(Solanum)构成的组或者具有其来源。
[0358] 更优选地，本发明的或者根据本发明方法产生的植物、植物细胞或者植物组织为S.bulbocastanum、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum)、矮牵牛、树番茄(S.betaceum)、pear melon(S.muricatum)和茄子(S.melongena)。甚至更优选地，所述植物、植物组织或植物细胞是马铃薯或番茄。最优选地为马铃薯。在其他系统中，分类将是类似的。本领域技术人员已知所述差异，例如，更通常，番茄被系统命名为Lycopersicon lycopesicum(L.)Karsten ex Farwell。
[0359] 在再一方面，本发明还涉及根据本发明的转基因植物的可收获部分和繁殖材料，其含有表达根据本发明的核酸分子和/或多肽的转基因植物细胞或者含有显示出本发明多肽的增加的水平的细胞。
[0360] 可收获部分原则上可以为植物的任意有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、块茎、叶子、茎干、果实、种子、根等等。繁殖材料包括例如，种子、果实、插条、幼苗、块茎、根茎等等。优选马铃薯、番茄、eggfruits或者pear melons作为可收获的或者繁殖材料。对于本发明的植物为矮牵牛的情况，本发明在一个实施方案中涉及矮牵牛的花作为可收获的部分。
[0361] 本发明还涉及根据本发明的转基因生物和(对于转基因植物生物)从它们来源的细胞、细胞培养物、部分，例如，根、叶等等，和转基因繁殖材料(如种子或果实)的用途，用于生产食品或饲料、药物或者精细化学品。具体地，马铃薯可以用于产生精细化学品。
[0362] 因此，在另一实施方案中，本发明涉及本发明的多核苷酸、植物、植物细胞或者植物组织、载体或者多肽的用途，用于制备脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、蜡酯、(多)糖和/或聚羟基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺素、甘油三酯、胆汁酸和/或酮体产生细胞、组织、和/或植物。有许多机制，通过这些机制可以实现脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、蜡酯、脂类、(多)糖和/或聚羟基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、胆固醇、甘油三酯、前列腺素、胆汁酸和/或酮体或者掺入此类经改变的蛋白质的上面定义的精细化学品的产生、生产和/或生产效率。对于植物，例如，通过增加乙酰辅酶A的表达，可能增加所产生的所述化合物的量，从而允许更容易收获和纯化，或者对于植物，更有效分配，乙酰辅酶A是细胞中许多产物的基础，所述产物为例如，脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、(多)糖、蜡酯、和/或聚羟基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其前列腺素、类固醇激素、胆固醇、甘油三酯、胆汁酸和/或酮体。此外，可能需要一种或多种所述代谢产物、增量辅因子、前体分子，和适宜的生物合成途径的中间化合物。因此，通过增加参与营养(如碳源(即糖)、氮源(即，氨基酸、铵盐)、磷酸和硫)输入的转运蛋白的数目和/或活性，由于除去了对生物合成过程的营养供给限制，可以提高如上所述的乙酰辅酶A和其代谢产物的产生。具体地，可以提高植物中所述化合物的产生、生产和/或生产效率，所述化合物为例如，脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、(多)糖、和/或聚羟基链烷酸酯，和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺素、甘油三酯、胆汁酸和/或酮体分子。
[0363] 进一步优选的是在宿主生物中重组产生药物或者精细化学品的方法，其中用上述表达盒之一转化宿主生物，并且该表达盒包含一种或多种结构基因，其编码所希望的精细化学品或者催化所希望的精细化学品的生物合成，培养所转化的宿主生物，并从培养基分离所希望的精细化学品。该方法可以广泛应用于精细化学品如酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸，和天然和合成调味剂、香料物质和着色剂。特别优选的是产生生育酚和生育三烯酸和类胡萝卜素类。培养所转化的生物并通过技术人员公知的方法从宿主生物或者培养基分离产物。药物，如抗体或者疫苗的产生由Hood EE，Jilka JM.Curr Opin Biotechnol.1999 Aug；10(4)：382-6；Ma JK，Vine ND.Curr Top Microbiol Immunol.1999；236：275-92描述。
[0364] 在一个实施方案中，本发明还涉及本发明的多核苷酸、载体或者多肽的用途，用于产生具有所述抗性的植物或植物或其部分的组织、器官或者细胞。
[0365] 此外，在一个实施方案中，本发明涉及鉴定刺激对所述植物病原体的抗性的化合物的方法，其包括：
[0366] a)在细胞培养条件下将表达本发明多肽或者其mRNA的细胞与候选化合物接触；
[0367] b)测定所述多肽或者所述mRNA的表达的增加；
[0368] c)比较不存在所述候选化合物时，做出的对标准应答的表达水平；其中相对于标准增加的表达表明所述化合物刺激抗性。
[0369] 所述化合物可以化学合成或者经微生物产生和/或包含于例如来自例如，植物、动物或者微生物，例如，病原体的的样品中，例如，细胞提取物中。此外，所述化合物可以是本领域已知的但是迄今为止还不知道能够抑制或者激活Rpi-blb2。反应混合物可以是无细胞提取物或者可以包含细胞或者组织培养物。本发明方法的适宜的构成是本领域技术人员已知的并且例如，通常描述于Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，尤其第17章。化合物可以例如，加到反应混合物、培养基、注射到细胞或者喷雾到植物上。
[0370] 如果以本发明的方法鉴定了含有化合物的样品，那么可能从鉴定为含有能够激活或者增加对所述病原体抗性的化合物的原始样品分离所述化合物，或者可以进一步细分原始样品(例如，如果它由许多不同化合物组成)以便减小每个样品不同物质数并用原始样品的细分样品重复所述方法。取决于所述样品的复杂性，上述步骤可以进行数次，优选直到根据本发明鉴定的样品仅包含有限数目的或者仅一种物质。优选地，所述样品包含具有相似化学和/或物理性质的物质，最优选地，所述物质是相同的。优选地，根据上述方法鉴定化合物或者其衍生物进一步以适于应用于植物育种或者植物细胞或组织培养的形式配制。
[0371] 可以根据本发明的方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库，例如，cDNA表达文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小有机化合物、激素、肽模拟物、PNA等等(Milner，Nature Medicine1(1995)，879-880；Hupp，Cell83(1995)，237-245；Gibbs，Cell79(1994)，193-198和如上引用的参考文献)。所述化合物还可以是已知抑制剂或者激活剂的功能衍生物或者类似物。制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员公知的并且描述于例如，Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer edition New YorkInc.，175 Fifth Avenue，New York，N.Y.10010 U.S.A.和OrganicSynthesis，Wiley，New York，USA。此外，可以根据本领域已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。此外，例如，根据上述方法，可以使用肽模拟物和/或计算机辅助设计适宜的衍生物和类似物。可以用于本发明方法中的细胞或者组织优选为上文实施方案中描述的本发明的宿主细胞、植物细胞或者植物组织。
[0372] 可以如实施例中描述的，尤其通过孢子形成指数测定可以确定化合物是否能够抑制或者激活所述物质。通过上述方法鉴定的激活剂可以证明用作杀真菌剂或者植物保护剂。从而，在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明方法得到或鉴定的化合物，所述化合物为Rpi-blb2的激动剂。
[0373] 因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过本发明方法鉴定的化合物。
[0374] 所述化合物为例如，Rpi-blb2的同源物。通过诱变，例如Rpi-blb2的离散点突变或者截短可以产生本发明多肽的同源物。如本文所用的，术语“同源物”指作为Rpi-blb2的活性激动剂的蛋白质的变体形式。所述蛋白质的激动剂可以基本上保持Rpi-blb2的相同生物活性或者其一部分。
[0375] 在一个实施方案中，本发明涉及特异识别本发明化合物的抗体。
[0376] 本发明还涉及诊断组合物，其包含至少一种前述多核苷酸、核酸分子、载体、蛋白质、本发明的抗体或者化合物和任选适宜的检测方法。
[0377] 本发明的诊断组合物适于从细胞分离mRNA并在杂交条件下将所得到的mRNA与包含如上述的核酸探针的探针接触，检测与所述探针杂交的mRNA的存在，从而检测细胞中所述蛋白质的表达。检测根据本发明的蛋白质的存在的其他方法包括本领域公知的免疫技术，例如，酶联免疫吸附测定。此外，可能使用根据本发明的核酸分子，尤其实施例，例如表3a或3b中描述的标记作为植物育种中的分子标记或者引物。
[0378] 适宜检测方法是本领域技术人员公知的，例如，用于杂交测定的缓冲液和溶液，例如，前述融合和缓冲液，和例如Sambrook等人中描述的DNA印迹、蛋白质印迹、RNA印迹等是已知的。
[0379] 在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞、多肽、反义核酸、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料或者化合物。
[0380] 本发明的试剂盒的化合物可以包装在诸如瓶子的容器中，任选使用缓冲液和/或溶液。如果适宜，可以将一种或多种所述组分包装在一个和相同容器中。额外或备选地，可以将一种或多种所述组分吸附到固相支持体，如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或者尼龙膜或者微量滴定板的孔。所述试剂盒可以用于任一种本文描述的方法和实施方案中，例如，用以产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗剂或激动剂等等。
[0381] 此外，试剂盒可以还包含关于试剂盒用于任意所述实施方案，尤其用于增加植物细胞、植物组织或植物对一种或多种所述病原体的抗性的使用说明。
[0382] 在优选实施方案中，所述试剂盒还包含多核苷酸，其编码一种或多种前述抗性蛋白质，优选Rpi-blb，和/或与所述抗性蛋白质，优选与Rpi-blb相关的抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织和/或植物。
[0383] 在另一实施方案中，本发明涉及产生植物保护剂的方法，所述植物保护剂提供本发明的多核苷酸、载体或者多肽，所述方法包括本发明方法的步骤；和以可以用作植物农业组合物的形式配制本发明的多核苷酸、载体或者多肽或者所述方法的步骤(c)中鉴定的化合物。
[0384] 在另一实施方案中，本发明涉及产生植物保护剂组合物的方法，其包括本发明方法的步骤；和
[0385] (a)以可以作为农业组合物接受的形式配制步骤(c)中鉴定的化合物。
[0386] “可以作为农业组合物接受”理解为此类组合物符合规定杀真菌剂、植物营养、除草剂等的含量的法律。优选地，此类组合物对所保护的植物和用该植物饲养的动物(包括人)没有任何害处。
[0387] 本发明还涉及与此类用途和方法有关的一些实施方案。可以以一种或多种下面的方法使用本文描述的多核苷酸、多肽、蛋白质同源物、融合蛋白质、引物、载体、宿主细胞：鉴定抗所提及的植物病原体和相关生物的的植物；基因组作图；鉴定和定位目的序列；进化研究；确定功能所需区域；活性的调节。
[0388] 因此，本发明的多核苷酸具有许多用途。首先，它们可以用于鉴定生物为S.bulbocastanum或者其亲戚。而且它们可以用于鉴定混合植物群体中S.bulbocastanum或者其亲戚的存在。通过在严格条件下用跨该S.bulbocastanum独特的本发明基因的区域的探针探测从植物的单一或者混合群体培养物所提取的基因组DNA，可以确定本发明是否使用了S.bulbocastanum或者其亲戚，例如近亲，或者是否存在S.bulbocastanum或者其亲戚，例如，近亲。
[0389] 此外，本发明的多核苷酸可以与相关物种的序列足够同源从而这些核酸分子可以作为构建相关生物中基因组图谱的标记。
[0390] 本发明的多核苷酸还可以用于进化和蛋白质结构研究。通过比较本发明的Rpi-blb2的序列与编码来自其他生物的相似酶的序列，可以评估生物的进化相关性。类似地，此类比较允许评估所述序列的哪些区是保守的，哪些不是保守的，这可以有助于确定蛋白质的对于所述酶功能必要的那些区。这种确定对于蛋白质工程化研究是有价值的并且可以指示在诱变而不丧失功能方面，所述蛋白质可以耐受什么。
[0391] 本发明的描述和实施例公开并包括这些和其他实施方案。关于按照本发明使用的方法、用途和化合物任一种的其他文献可以使用例如电子装置从公共图书馆检索。例如，可以利用公共数据库“Medline”，其可以在因特网上以http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html提供。其他数据库和网址，如http://www.ncbi.nim.nih.gov/，http://www.infobiogen.fr/，http://www.fmi.ch/biology/research-tools.html，http://www.tigr.org/是本领域技术人员已知的并且可以使用例如，http://www.lycos.com得到。在Berks，TIBTECH12(1994)，352-364中给出了生物技术专利信息综述和可用于回溯检索和最新文献通报的专利信息的相关来源的调查。
[0392] 表：
[0393] 表1：序列：
[0394] 表2.2000年在荷兰的Marknesse进行的田间试验中BC4作图群ARG95-3和ARP96-11的2851个子代克隆中抗性的分离。用括号中的百分数表示分类为具有抗性、敏感或者未知表型的克隆数。
[0395]
[0396] 表3A.用于Rpiblb2作图的标记概述
[0397]
[0398]
[0399] 1)Ori：引物方向；F：正向引物；R：反向引物
[0400] 2)a：ARG95-3，b：ARP96-11，c：B6a
[0401] 表3B：用于Rpi-blb2作图的引物概述
[0402]
[0403] 1)N＝A+T+G+C，S＝G+C，W＝A+T
[0404] 表4.马铃薯中晚疫敏感性的互补
[0405]
[0406] 1R0基因型是用含有Rpi-blb2基因候选者RGC1到RGC8和RGC24L或者空pBINPLUS载体的T-DNA构建体转化敏感马铃薯栽培种Impala或者Kondor得到的原代转化株。根癌a b农杆菌株系UlA143 或AGL0 用于转化致病疫霉敏感的马铃薯栽培种Impala和Kondor。
[0407] 表5.用于TAIL-PCR的循环条件
[0408]
[0409] a这些是9-部分超级循环，每个由两个高严格和一个低严格循环组成。
[0410] 表6通过Rpi-blb2对番茄栽培种MoneyMaker中晚疫敏感性的互补
[0411]Bac-文库 来源Bac 基因型 含有RGC的 R植物/含有
植物/转化株 RGC的植物
Blb2002 SPB39 R0(RGC5) 24/25 22/24
[0412] R0基因型是用含有Rpi-blb2基因RGC5的T-DNA构建体转化敏感番茄栽培种aMoneymaker得到的原代转化株。根癌农杆菌株系UIA143 用于转化致病疫霉敏感的番茄栽培种。
[0413] 附图如下：
[0414] 图1.开发称作“ABPT”(1a)的复杂种间杂种克隆和来自这些克隆的两种：ABPT克隆55和ABTP克隆60(1b到d)的马铃薯作图群的图示。A：Solanum acaule；B：
S.bulbocastanum，P：S.pureja，T：马铃薯，2x：二倍体(2n＝2x＝24)，3x：三倍体，4x：四倍体，6x：六倍体，cv：栽培种。斜体代码表示作图群。
[0415] 图2.1991年在墨西哥的Toluca Valley田间试验克隆ARF87-601和敏感对照栽培种(cv)Bildtstar、Eersteling和部分抗性对照栽培种Pimpernel叶子对晚疫抗性的疾病发展曲线。在栽培后8个时间点，以1到9CIP等级(Estrada-Ramos，1983)对由于自然晚疫感染导致的枯萎叶百分数打分。
[0416] 图3.1992年在菲律宾的Benguet省田间试验克隆ARF87-507、ARF87-601、ARF87-801、敏感对照栽培种(cv)Granola和部分抗性育种克隆AR85-96-13叶子对晚疫抗性的疾病发展曲线。在8月25日到11月24日的6个时间点，以1到9CIP等级(Estrada-Ramos，1983)对由于自然晚疫感染导致的疫病叶百分数打分。
[0417] 图4.在荷兰Marknesse的每年田间试验中用致病疫霉的分离物IPO82001接种约6周后对Rpi-blb2介导的晚疫抗性分离的四倍体抗性和敏感亲代克隆和子代克隆的典型表型。具有显示出抗性表型(黑色实线内)的克隆的6株植物图不表现或几乎不表现出任何孢子形成病灶，具有敏感表型(白色虚线内)的一个克隆表现出完全患疫病的叶子。
[0418] 图5.基于马铃薯作图群ARG95-15的109个子代克隆的遗传学图，其表明7个AFLP标记与Rpi-blb2基因座共分离。垂直线左边的数字表示侧翼标记或者Rpi-blb2基因座之间的遗传距离(厘摩(cm))。
[0419] 图6.基于马铃薯作图群ARG95-3的137个子代克隆的遗传学图，其表明15个AFLP标记和RGA标记S1E00与Rpi-blb2基因座共分离。用离脱叶测定得到了子代克隆的表型。垂直线左边的数字表示侧翼标记或者Rpi-blb2基因座之间的遗传距离(厘摩(cm))。
[0420] 图7.基于马铃薯作图群ARG95-3的178个子代克隆的遗传学图，其表明5个标记与马铃薯的连锁群6上的Rpi-blb2基因座共分离。1998年在荷兰的Marknesse用田间试验确定了子代克隆的表型。标记E40M58和E46M52得分为AFLP、CAPS、SCAR或者延伸(后缀：e)标记(表3A)。部分地，将标记CT119打分为CT119N(表3a)。标记CT216得分为SCAR标记。垂直线左边的数字表示侧翼标记或者Rpi-blb2基因座之间的遗传距离(厘摩(cm))。对于每种标记，标记和表型之间重组体的数目和打分的子代克隆的总数在括号中给出。
[0421] 图8.基于马铃薯作图群ARG95-3的886个子代克隆和马铃薯作图群ARP96-11的170个子代克隆的遗传学图，表明有标记与马铃薯的连锁群6上Rpi-blb2基因座共分离。
2000年在荷兰的Marknesse用田间试验确定了子代克隆的表型。垂直线左边的数字表示侧翼标记之间的遗传距离(厘摩(cm))。限定Rpi-blb2基因的位置的标记间隔(基于子代克隆中检测的重组事件)通过双箭头线指出。
[0422] 图9.含有马铃薯(上面的水平线)和S.bulbocastanum(下面的水平线)中Rpi-blb2的基因组区的物理图。垂直线表示与抗性连锁的标记的相对位置。水平线上的数字为分别来自复杂种杂种“ABPT”(图1)的马铃薯的1056个子代植物和1899个S.bulbocastanum子代植物中侧翼标记之间鉴定的重组体数。ABTP-来源的子代包含来自作图群ARG95-3和ARP96-11两者的克隆。长方形代表除了具有前缀“Blb”的BAC克隆之外的来自ARD1197-16BAC文库的酵母人工染色体(BAC)，具有前缀“Blb”的BAC克隆来自S.bulbocastanum Blb2002BAC克隆。限定Rpi-blb2基因的位置的标记间隔(基于子代克隆中检测的重组事件)通过双箭头线指出。小箭头指出抗性基因候选者(RGC)的位置。
[0423] 图10.开发S.bulbocastanum的二倍体、种内作图群B6的图示。斜体代码指示作图群。
[0424] 图11.基于S.bulbocastanum作图群B6的1899个子代克隆的遗传学图，显示了发现与S.bulbocastanum的6号染色体上Rpi-blb2基因座共分离的标记。通过离脱叶测定法确定子代克隆的表型。垂直线左边的数字指出侧翼标记之间的遗传距离(厘摩(cM))。限定Rpi-blb2基因的位置的标记间隔(基于子代克隆中检测的重组事件)通过双箭头线指出。
[0425] 图12.晚疫敏感性的遗传互补。用致病疫霉分离物655-2A的胞囊孢子悬浮物接种后6天马铃薯叶子的典型疾病表型。用pBINPLUS转化的卡那霉素抗性cv Kondor植物得到的叶子(对照；A)，从含有BAC SPB39衍生的(B)或者BAC211衍生(C)的RGC5的cv Kondor植物得到的叶子，从用pBINPLUS转化的卡那霉素抗性cv Impala植物得到的叶子(对照；D)，从含有BAC SPB39衍生的(E)或BAC211衍生的RGC5(F)的cv Impala植物得到的叶子。小图A和D描绘典型的敏感性应答，具有致病疫霉的广泛孢子形成病灶。小图B、C、E和F描绘在含有Rpi-blb2的转基因马铃薯植物上接种位点观察到的典型的抗性反应。
[0426] 图13.编码Rpi-blb2基因的核酸序列。A.Rpi-blb2基因的编码核酸序列。B.包括内含子序列(43-128位)的Rpi-blb2基因的编码核酸序列。C.p211F-C12中存在的ARD1197-16BAC211的7967bp Sau3AI基因组DNA片段的序列，两种遗传构建体之一用于晚疫抗性的遗传互补。所述基因组片段含有Rpi-blb2基因，包括该基因的正确表达所需的天然调节元件。用下划线标出起始密码子(1546-1548位ATG)和终止密码子(5433-5435位TAG)。D.pSP39-20中存在的S.bulbocastanum2002BAC BlbSP39的9949bp Sau3AI基因组DNA片段的序列，两种遗传构建体之一用于晚疫抗性的遗传互补。所述基因组片段含有Rpi-blb2基因，包括该基因的正确表达所需的天然调节元件。用下划线标出起始密码子(1413-1415位ATG)和终止密码子(5300-5303位TAG)。
[0427] 图14.推定的Rpi-blb2基因结构和推导的Rpi-blb2蛋白质序列。A.Rpi-blb2基因结构的图示。水平线指出外显子。开放框代表编码序列。角度向下的线指出内含子序列的位置。B.推导的Rpi-blb2蛋白质序列。从Rpi-blb2的DNA序列推导的氨基酸序列分成三个结构域(LZ、NBS和LRR)。结构域A中形成潜在亮氨酸拉链(LZ)结构域的七残基重复序列的第一个残基的疏水残基以下划线指出。R蛋白质中保守基序以小写字母写出，NBS结构域中的保守基序以斜体表示。LRR结构域中匹配细胞质LRR的共有序列的残基以粗体表示。已经引入序列中的点以比对该序列与胞质LRR的共有LRR序列。
[0428] 图15.Rpi-blb2、Mi-1.1和Mi-1.2的所推导的编码蛋白质产物的比对。显示了Rpi-blb2的完整氨基酸序列和Mi-1.1和Mi-1.2中与Rpi-blb2中相应残基不同的氨基酸残基。破折号表示为保持最佳比对而插入的缺口。当与Mi-1.1和Mi-1.2中相应位置的氨基酸残基比较时，对Rpi-blb2特异的氨基酸残基以粗体和红色高亮显示。对LRR的相应于β-链/β-转角基序xxLxLxxxx的区域加下划线。NBS结构域中的保守基序以小写字母表示。垂直线指出CC-NBS和LRR区之间的分界。VLDL基序中在许多植物R蛋白质的第三个LRR中保守但是在Rpi-blb2中不保守的位置通过具阴影的长方形表示。
[0429] 图16.Mi1.1、Mi1.2和Rpi-blb2核酸的CLUSTAL W(1.82)多序列比对。
[0430] 图17.Mi1.1、Mi1.2和Rpi-blb2蛋白质的CLUSTAL W(1.82)多序列比对。
[0431] 图18.与cv.Bintje(C)的敏感表型相比抗性基因R2(A)和Rpi-blb2(B)的典型表型。小图A描绘了典型的超敏应答反应，其具有非常小的坏死斑点，而小图B显示了大坏死区，其含有低水平孢子形成。小图C描绘了典型的敏感反应，其具有清晰的孢子形成。
[0432] 通过下面的实施例进一步阐明本发明，这些实施例不应被理解为限制。
[0433] 实施例
[0434] 实施例1：评估ABPT来源的回交克隆和群体中抗性
[0435] BC2-克隆ARF87-507和ARF87-801选自用晚疫(LB)敏感马铃薯栽培种Oberarnbacher Fruhe作为第一种亲本和马铃薯栽培种Arkula(图1b)和Blanka(图1c)分别作为第二种亲本对复杂种杂种ABPT-克隆号55(图1a)进行两轮回交后所得BC2-后代。类似地，通过用BL敏感马铃薯栽培种Alcmaria和Blanka(图1d)对ABPT-克隆60连续杂交得到BC2-克隆ARF87-601。
[0436] 1991年在墨西哥的Toluca地区作为田间试验的一部分测试克隆ARF87-601以筛选LB抗性。一小块土地上克隆ARF87-601的7株植物图与具有9株植物的几小块土地比较进行评估，这几小块土地每块上的9株植物分别是对照栽培种Bildtstar、Eersteling和Pimpernel。根据1988年荷兰国家推荐马铃薯栽培种表中晚疫抗性的等级评定，以从3到8的递增抗性的尺度将这些对照栽培种分别打分为3、3和8。认为栽培种Pimpernel是部分抗性来源(Colon等人，1985)。种植后约40天，建立致病疫霉的天然感染。然后在从7月16日到9月2日期间监视叶子中LB的发育8次(图2)。ARF87-601的疾病发展曲线与对照栽培种相比存在明显不同。种植后第74天，对照栽培种的叶子完全或者接近完全患疫病，而克隆ARF87-601没有显示出可观察到的症状(图2)。1992年在菲律宾的Benguet省筛选LB-抗性的田间试验中，克隆ARF87-507、ARF87-801和克隆ARF87-601显示出相当的结果(图3)。3种BC2克隆、对照栽培种Granola和中等LB抗性育种克隆AR85-96-13(其用作雌性亲本以得到AR92-1197(图1d)每种10株植物在8月25日种植。发生致病疫霉的天然感染后对疫病叶子百分数6次打分。当与栽培种Granola和克隆AR85-96-13相比时，ABTP来源的BC2-克隆的疾病发展曲线显著不同(图3)。在打分期间，BC2-克隆不显示或者几乎不显示症状并且没有清楚的疾病发展，而栽培种Granola在第三次打分日具有几乎完全患疫病的叶子。
[0437] 克隆ARF87-601、ARF87-507和ARF87-801用于与LB敏感栽培种和马铃薯的育种克隆进一步回交(图1b到1d)。该育种工作产生四种不同的作图群：四倍体BC3-群体ARG95-15、四倍体BC4-群体ARG95-3和ARP96-11和二倍体BC4-群体DP1。在该育种工作的连续步骤期间，基于通常实践的育种评价中农学性能以及通过在荷兰Marknesse的田间试验中对用致病疫霉的复杂分离物IPO82001接种的它们的亲代和相关后代筛选以选择抗性克隆ARF87-507、ARF87-601、ARF87-801、AR91-1263、AR91-1292和AR92-1197。在AR92-1197x Phu81-101(图1d)杂交的子代中选择二倍体(2n＝2x＝24)克隆ARD1197-16，已知Phu81-101亲代克隆能够在雌性亲本中诱导孤雌生殖种子组(Hermsen和Verdenius，1973)。最初，使用致病疫霉分离物IPO82001、IPO655-2A和IPO428-2进行重复离脱叶测定后发现了ARD1197-16中对LB的抗性，并且在1998年在Marknesse的田间试验中验证。通过流式细胞术(Plant cytometry services，Schijndel，荷兰)证实克隆ARD1197-16的二倍体状态。
[0438] 用致病疫霉分离物IPO82001接种后约6周，在Marknesse的试验点的田间试验的连续几年里，观察到ABPT-来源的子代和作图群中LB抗性性状的明显分离。通常，抗性克隆不显示或几乎无任何孢子形成病灶，而敏感克隆显示出完全患疫病的叶子(图4)。在2000年，以单个植物地块对来自作图群ARG95-3和ARP96-11的共2851个克隆筛选。平均24％克隆表现出不能清楚地归类为抗性或敏感的表型。对于群体ARG95-3和ARP96-11，可以分为此类的克隆显示出抗性对敏感表型分别为1∶1和1∶1.5的分离比(表2)。
[0439] 发现用ABPT-来源的子代和作图群进行的离脱叶测定对于确定表型没有田间条件下准确。然而，认为离脱叶测定结果适于初步确定个体克隆的表型，从而可以用于构建作图群。
[0440] 实施例2：ABTP来源的回交群体中Rpi-blb2抗性基因座的遗传作图
[0441] 在所有四种作图群(图1)中，抗性如对于单基因性状预期的分离，表明在单个基因座上存在显性抗性等位基因(表2)。将该基因座称作Rpi-blb2基因座。
[0442] 为了鉴定与Rpi-blb2连锁的标记，基于离脱叶测定，对10株抗性和10株敏感ARG95-15子代植物(包括亲代克隆)的DNA进行初步AFLP分析，使用14个引物组合(pc)。对额外的89株植物的21种潜在连锁标记的测试鉴定了与抗性连锁的一些标记(图5)。随后用160个pc，对2个抗性和2个敏感DNA库进行的大批分离子分析(BSA)鉴定了共58种可能与抗性连锁的AFLP标记(图5)，其中所述DNA库每种含有8种抗性或敏感ARG95-15子代植物的基因组DNA。当对ARG95-3的137株子代植物测试许多这些标记时，它们也与该群体中的抗性连锁，表明通过相同基因座确定两个群体中的抗性(图6)。这些共分离标记分别定位于ARG95-15和ARG95-3中基因座一边的2到28厘摩(cM)和1到7.2cM，表明Rpi-blb2可以位于染色体的远端位置。
[0443] 为了确定马铃薯的遗传学图上Rpi-blb2的位置，将两种共分离标记AFLP标记E40M58和E46M52(图6)克隆到pGEM-T载体(Promega，荷兰)并测序。对所克隆的AFLP片段的序列末端设计的引物(表3)用于开发切割的经扩增的多态序列(CAPS)标记E40M58，发现其与ARG95-3的25个抗性和25个敏感克隆的抗性性状共分离。随后对CxE作图群的46个子代植物测试CAPS标记E40M58(van Eck等人，1995)。将这些数据加到CxE群体的现有标记得分。Joinmap(Stam，1993)连锁分析将E40M58定位到GP79远端8cM(Gebhardt等人，1991)，将Rpi-blb2定位于6号染色体的短臂上。在群体ARG95-3的178个子代植物中，没有观察到Rpi-blb2和AFLP标记E40M58、E40M60和CAPS标记CT119之间的重组。AFLP标记E46M52和序列表征的扩增区(SCAR)标记CT216定位于所述基因近端2.2cM(图7)。
[0444] 实施例3：鉴定与Rpi-blb2连锁的RGA标记
[0445] 在鉴定与抗性连锁的功能相关标记的尝试中，基于植物R基因(Leister等人，1996)的NBS结构域的保守基序设计的引物用于改编AFLP方案(RGA-AFLP)用以鉴定抗性基因类似物(RGA)特异标记。
[0446] 使用Leister等人(1996)的基于P-环的引物S1联合Eco00 AFLP引物，开发了RGA特异标记S1E00，其与ARG95-3作图群中的抗性和标记E40M58和CT119共分离(图6和7)。
[0447] 实施例4：开发用于重组筛选的E40M58e和E46M52e SCAR标记
[0448] 使用AR91-1263的基因组DNA作为模板，通过TAIL-PCR延伸AFLP标记E46M52的克隆的片段。使用引物ARO77(sp1)和ARO94(AD)进行初次TAIL-PCR。随后，用ARO128(sp2)与引物AD联合进行二次PCR，用ARO129(sp3)联合引物AD进行三次PCR。这导致E46M52e片段，其在5’末端延伸约500bp。在pGEM-T中克隆E46M52e片段并测序。用该序列设计新的正向引物并且PCR联合引物ARO77导致SCAR标记E46M52e，其与四个马铃薯作图群中的抗性表型共分离，并且在群体B6中也作为CAPS标记。
[0449] 使用ARD1197-16的基因组DNA作为模板，还通过TAIL-PCR延伸AFLP标记E40M58的克隆片段。使用sp1引物ARO73(3′)和74(5′)联合引物AD在5’和3’方向进行初次TAIL-PCR。随后分别用sp2ARO82或79进行二次PCR。将从二次PCR得到的片段：从3’末端750bp和从5’末端400bp克隆到pGEM-T中并测序。基于两个序列，设计了两种新引物，导致SCAR标记，其与作图群ARG95-3和DP1中的抗性共分离(表3)。可以在作图群ARG95-3和DP1的抗性亲代中扩增SCAR标记E40M58e的片段，作图群ARG95-3和DP1都来自ABPT克隆55(图1)，但是作图群ARP96-11和ARG95-15(都来自ABPT克隆60)的亲代或子代克隆中PCR扩增不产生任何可检测的PCR产物。假设这可能由基因组序列中的微小差异导致，因此，使用克隆AR91-1292的基因组DNA作为模板通过TAIL-PCR延伸AFLP片段。得到约300bp的E40M58e2片段，将其克隆并测序。将所述序列与AFLP标记E40M58的最初片段比较表明仅延伸片段的前37bp是相同的。用根据E40M58e2的序列设计的引物进行的PCR没有得到多态性标记。对S.bulbocastanum的5个抗性或者敏感克隆(BGRC8005和8006)测试了延伸标记E40M48e和E40M58e2两者。仅SCAR标记E40M58e的片段可以在S.bulbocastanum克隆中扩增，表明E40M58e2的序列部分不来自S.bulbocastanum。该观察表明E40M58e位于克隆AR91-1292中S.bulbocastanum基因渗入片段的边缘，并且Rpi-blb2基因座的位置接近标记E40M58e。
[0450] 实施例5：来自ABTP材料的二倍体作图群中Rpi-blb2的作图
[0451] 用标记E40M58e和E46M52e筛选二倍体作图群DP1的共149个子代克隆。当与四倍体作图群ARG95-3比较时，在这些标记之间没有发现重组，表明所研究的基因组区中受抑制的重组(图7)。以部分重复的离脱叶测定对112个克隆的子集筛选对致病疫霉分离物IPO82001、IPO655-2A和IPO428-2的抗性。11个克隆(11％)显示出中间反应并且归类为具有未知表型。另外51和50个克隆分别归类为抗性和敏感型。鉴定了三个子代克隆DP1-28、DP1-79和DP1-81，推定它们在Rpi-blb2基因座和标记E40M58e和E46M52e之间重组。在2000年，在Marknesse试验点在田间试验112个表型确定的克隆中50个克隆组成的子集对LB的抗性。这50个克隆的33个得到了关于LB抗性表型的结论性结果。用离脱叶测定法确定的克隆28和81的表型似乎是错误的。从而，断定这些克隆不代表Rpi-blb2和所用的标记之间的重组事件。在田间条件下不能决定性验证克隆DP1-79的表型并且该克隆可能代表DP1的101个子代克隆中Rpi-blb2基因座和标记E40M58e和E46M52e之间的唯一重组事件(1cM)。因为证明与ARG95-15、ARG95-3和ARP96-11中抗性性状连锁的两种标记与DP1中LB-抗性的相同基因座共分离，断定DP1亲代克隆ARD1197-16适宜作为基于克隆方法的图中Rpi-blb2基因分离的来源。
[0452] 实施例6：ABPT来源的Rpi-blb2基因座的物理作图
[0453] 对Rpi-blb2基因座杂合的抗性克隆ARD1197-16用作构建BAC文库的源DNA(下文中称作ARD1197-16BAC文库)。如Rouppe van der Voort等人(1999)中描述的实施高分子量DNA制备和BAC文库构建。最初，将具有100kb的平均插入片段大小的共67968个克隆(其相应于约7个基因组当量)单独在-80℃保存在177个384孔微量滴定板中。如Rouppe van derVoort等人(1999)中描述的实施ARD1197-16BAC文库的标记筛选。基本上，通过PCR，用与Rpi-blb2基因座连锁的SCAR或者CAPS标记筛选为每个384孔板产生的DNA库以便构建跨越Rpi-blb2基因座的BAC重叠群。
[0454] 用标记E40M58e、S1E00和CT119筛选ARD1197-16BAC文库鉴定了一些阳性BAC克隆，其用作种子BAC，从其开始跨越Rpi-blb2基因座的染色体步查。标记E40M58e用于分离BAC克隆69和141，而BAC克隆14、24、123和133对于标记S1E00是阳性的。标记CT119用于分离BAC67。测序这些BAC克隆的左(L)和右(R)边界后，开发了一组新的标记：14L、24L、24R、69L、69R、141R、123L、123R、133R和67L。用这些标记筛选所分离的BAC克隆表明下面的BAC克隆对共有重叠：123的右边与133的左边重叠、14完全与24重叠、69的左边与
141的右边重叠。BAC67不与其他BAC克隆具有重叠。S1E00阳性BAC克隆14、24、123和133不形成单个重叠群这一发现表明S1E00是重复序列。该发现与BAC克隆24和123的右BAC末端序列显示出与来自番茄的Mi1抗性基因的不同区域的同源性(Milligan等人，1998，Simons等人，1998)这一发现一起表明Rpi-blb2基因座含有一个以上的RGA。用标记141R、
24L、24R和123L筛选最初的ARD1197-16BAC文库不导致重叠群延伸。然而，用标记123R和
133R筛选该文库导致BAC克隆99和113的分离，从而以一个方向延伸BAC123/133。这两个BAC克隆的BAC末端测序导致开发了两个新标记99L和113R。用69R筛选ARD1197-16BAC文库导致141/69重叠群的延伸。用来自BAC克隆的标记连续筛选BAC文库进一步延伸该重叠群，导致BAC克隆36、41和112的分离，和标记36L、41L和112L开发。
[0455] 在完成跨越Rpi-blb2基因座的BAC重叠群的尝试中，用～100kb的额外的38864个BAC克隆(384孔板编号178-273)扩大ARD1197-16BAC文库。用标记24L、24R、123L和141R筛选该第二个文库，导致鉴定对24R和123L都为阳性的BAC克隆(例如，191)和对
24L阳性的BAC克隆(211、242)。这样，克隆了BAC24和123之间的缺口并且24/14重叠群向BAC克隆141延伸。在延伸的ARD1197-16文库中没有对标记141R阳性的新克隆。
[0456] 实施例7：构建BAC123/133区中额外的标记
[0457] 在从BAC123和133开发额外的多态标记的尝试中，构建了BAC123和133的10kb亚克隆文库。将BAC DNA用Sau3AI部分切割，并且在载体pBINPLUS的BamHI位点中克隆约10kbp的片段。为了选择含有最初BAC末尾序列的克隆，用BAC末尾标记123L或133R筛选BAC123的288个亚克隆和BAC133的192个亚克隆。共14个亚克隆对标记123L阳性，11个亚克隆对标记133R阳性。随后，使用相关BAC末端标记的正向或反向引物联合引物M13F或M13R(表3)，通过数次PCR确定BAC末端阳性克隆的定向。对于标记123L，选择了
3个亚克隆，对于标记133R，选择了2个亚克隆，并对不含有123L或者133R标记的末端测序(约500bp)。基于该新序列，设计了两种新引物用于亚克隆123，导致标记123L2，对于亚克隆133设计了两种新引物，导致标记123R2。SCAR标记123L2(其位于标记123L近端
10kbp处)似乎在作图群ARG95-3、ARP96-11中是多态的，并且如B6中的CAPS。SCAR标记
133R2(其位于标记133R远端10kbp)在作图群ARG95-3和ARP96-11中是唯一多态的。
[0458] 实施例8：ABPT来源的作图群中Rpi-blb2基因座的精细作图
[0459] 为了对ABPT来源的作图群中Rpi-blb2基因进行精确作图，2000年在Marknesse的试验点在田间试验了作图群ARG95-3的2283个新子代克隆和作图群ARP96-11的598个克隆对LB的抗性(表2)。在群体ARG95-3中，846个克隆(37％)得分为敏感的，886个克隆为抗性的(39％)。剩余的551个克隆的表型不清楚。在群体ARP96-11中，256个克隆(45％)得分为敏感的，170个克隆(30％)为抗性的。剩余的142个(25％)的表型不清楚(表2)。来自作图群ARG 95-3和ARP96-11的846个和170个抗性克隆选择用于分别用SCAR标记CT216和CAPS标记41L或36L进行重组筛选。在作图群ARG95-3和ARP96-11中分别得到了共85(9.6cM)和22个(12.9cM)个重组体，将它们随后用CAPS标记67L筛选，对于作图群ARG95-3，将在标记间隔67L-36L重组体的数目减小到5个(0.56cM)，对于作图群ARP96-11，在标记间隔67L-41L中减小到4个重组体(2.35cM)(图8)。用SCAR和CAPS标记113R、99L、133R、133R2、123R、123L、24R、14L、24L、141R、69L、E40M58e和69R进一步分析这些剩余的9个重组体。后两个标记仅在作图群ARG95-3中打分。
[0460] 在群体ARG95-3中，两个克隆显示出在标记E40M58e和69L之间的重组，将Rpi-blb2基因置于标记E40M58e近端0.23cM处。两个其他克隆在标记113R和67L之间重组，一个克隆在标记133R2和133R之间重组，将Rpi-blb2基因置于标记133R远端0.11cM处。
[0461] 在群体ARP96-11中，在标记41L和69L之间没有检测到重组，将Rpi-blb2基因置于标记36L近端0.58cM处。两个子代克隆在标记113R和67L之间重组，一个克隆在标记99L和133R之间重组，将Rpi-blb2基因置于标记99L远端0.58cM处(图8；图9)。
[0462] 实施例9：S.bulbocastanum种内作图群中晚疫抗性的评估和遗传作图
[0463] 为了产生S.bulbocastanum种内作图群，从inter accession cross(图10)得到抗性克隆Blb2002：该克隆与敏感克隆Bib48-5正反交，Blb48-5也在从inter accession cross产生的子代中选择(图10)。所得群体称作B6，其具有别名B6a、Blb99-229、Blb00-7和Blb00-8。
[0464] 最初，使用致病疫霉的分离物IPO655-2A的胞囊孢子溶液作为接种物，在部分重复的离脱叶测定中筛选B6群体的47个子代植物构成的小组对致病疫霉的抗性。接种后6到9天具有明显显示出孢子形成病灶的叶子的植物被认为是敏感表型，而不存在清楚的孢子形成下具有在接种边没有可见的症状或者坏死的叶子的植物被认为是抗性的。在47个幼苗中，23个得分为抗性，24个为敏感的。这些数据表明作图群B6的子代在离脱叶测定中得到抗性性状的明显分离，并且该抗性可以是由于单个显性基因或者紧密连锁的基因簇。为了确定该基因座的染色体位置，用标记112L和E46M52e分析46个幼苗。发现标记112L与抗性表型互斥连锁，因为在该标记和46个幼苗的表型之间仅得到了两个重组体(4cM)。
而且，发现标记E46M52e与抗性表型互斥连锁。这里，在标记E46M52e和所述表型之间得到了5个重组体(11cM)。此外，用标记69R、69L和141R分别用额外的组6、15和14非重组幼苗分析标记112L和E40M58e之间的7个重组体，并且发现以偶联(标记69R)或者互斥相(标记69L和141R)与抗性完全连锁，表明该抗性基因位于与例如ABPT来源的作图群中相同的基因座，即，Rpi-blb2上。
[0465] 为了更精确地确定Rpi-blb2相对于可利用标记的位置，培养B6作图群的另外849个幼苗和来自正反交(图10)的1054个幼苗并分析标记E46M52e和112L之间的重组。从而，除了最初47个幼苗，还筛选了B6群体的共1903个个体后代克隆。在共138个这些幼苗中检测到标记E46M52e和112L之间的重组(7,25cM)。以两步实施Rpi-blb2基因座的精确作图。首先，用将从RD1197-16BAC文库分离的BAC克隆的左(L)和右(R)边界序列来源的标记14Lb、113R、123L2、24L、141R和69L(表3)通过额外筛选将138个重组体组成的组减小到19个，然后对在标记113R和69L之间重组的所有幼苗进行选择。可能由于双重组，四个重组体的标记图谱得分偏离所研究的遗传间距中单次重组事件并且假定标记的共线性时所预计的得分。将这些抽取用于进一步分析。其次，用从Blb2002文库分离的BAC克隆的边界序列的标记SPB39L和SPB30L，或者用MiGA标记24L9spec、24Lspec和14L24L(表3)分析剩余的15个重组体。这剩余的15个重组体(它们给出清楚的可解释的标记得分和表型)的标记分析的结果将Rpi-blb2基因座置于标记69L和24L之间0.11cM(n＝1899)的遗传间隔上(图11)。
[0466] 实施例10：MiGA标记
[0467] 用标记123R、14L或者24L作为探针对BAC克隆14、24、123和133的BAC克隆的DNA印迹分析表明这些BAC克隆含有一些抗性基因类似物(RGA)。考虑到标记14L、24L和123R与来自番茄的Mil基因的序列之间的同源性，在下文中将Rpi-blb2区内的RGA称作Mi基因类似物(MiGA)。在开发Rpi-blb2间隔内的额外的多态性标记的尝试中，将用引物组合14LR和24LF从BAC克隆24和123产生的PCR片段克隆到pGEM-T载体(Promega，荷兰)并部分测序。基于这些部分序列的比对，设计了一组通用引物univ14L和univ24L(表
3)，目的是在Rpi-blb2间隔内尽可能多地扩增MiGA的相应区。该通用引物组随后用于开发与Rpi-blb2连锁的MiGA特异SCAR/CAPS标记(例如，标记14L24L、24Lspec、24L9spec；
图9)。
[0468] 实施例11：S.bulbocastanum来源的Rpi-blb2基因座的物理作图
[0469] 对Rpi-blb2基因座杂合的抗性克隆Blb2002用作源DNA以构建S.bulbocastanum BAC文库，其在下文中称作Blb2002BAC文库。如以前描述的实施高分子量DNA制备和BAC文库构建。产生了共约100,000个克隆并保存为50个细菌库，其含有约2000个白色菌落。通过用无菌玻璃涂布器，将来自琼脂板的菌落刮除到含有18％甘油和12.5μg/ml氯霉素的Luria Broth培养基产生这些细菌库。为了筛选Blb2002BAC文库，用标准碱裂解方案从每个克隆库分离质粒DNA，并实施PCR以鉴定阳性库。将相应于阳性库的细菌稀释并涂布在含有氯霉素(12.5μg/ml)的LuriaBroth琼脂板上。随后挑选单个白色菌落到384孔微量滴定板中并如前述鉴定单个阳性BAC克隆。从Blb2002BAC文库分离的BAC克隆的名称带有前缀BlbSP。
[0470] 为了建立跨越Rpi-blb2遗传标记间隔(69L-24L)的Blb2002来源的BAC重叠群，用标记141R和24L筛选Blb2002BAC文库。这导致BAC克隆BlbSP39和BlbSP30的分离，它们相互重叠并且跨141R-24L标记间隔。两个BAC克隆的BAC末端序列用于开发标记SPB30L和SPB39L(图9)。
[0471] 实施例12：互补分析
[0472] 为了互补，靶定所有Rpi-blb2基因候选者，即存在于BAC克隆BlbSP30、BlbSP39、24、242和211上的所有MiGA用以亚克隆到双元载体pBINPLUS(van Engelen等人，1996)。
这如下进行。将约1μg BAC DNA的等分试样用1U、0.1U或者0.01U Sau3AI限制酶消化30分钟。部分消化的BAC DNA进行4℃0.5×TBE中的轮廓夹紧的均匀电场(contour-clamped homogeneous electric field)(CHEF)电泳，使用1-10秒的线性增加脉冲时间和6V/cm的场强持续16小时。电泳后，用溴化乙锭对琼脂糖凝胶染色以定位含有大小约10kbp的DNA片段的凝胶区。从凝胶切除该区并用GELASE(Epicentre Technologies，USA)根据生产商的方法处理。将大小选择的DNA连接到BamHI消化并脱磷酸化的双元载体pBINPLUS(van Engelen等人，1995)中，然后转化到ElectroMAX大肠杆菌DH10B感受态细胞(Life Technologies，UK)。每个BAC克隆，使用引物univ24L和univ14L(表3)对共384个克隆筛选MiGA序列的存在。选择阳性克隆用于进一步表征。基于用酶RsaI、TaqI、AluI、DpnII或者Msel消化的14L24L片段的限制图，鉴定了MiGA的不同组。用通用引物univ14L和univ24L没有检测到含有标记24L的MiGA，标记24L完全存在于BAC克隆BIbSP39、211和
242上。
[0473] 通过PCR，对于5’末端使用内部引物123Mi和14L2和对于3’末端使用univ14L和24L2联合来自pBINPLUS载体序列的引物(ARO295和296；表3)确定10kbp亚克隆中MiGA序列的相对位置。对每个BAC文库每个RGA选择两个亚克隆用于转化。
[0474] 对于互补分析，通过农杆菌介导的转化，使用分离物UIA143(Farrand等人，1989)或AGLO(Lazo等人，1991)将所选亚克隆转移到敏感马铃薯栽培种Impala和Kondor。以离脱叶测定法，使用分离物IPO655-2A和IPO82001(表4)测试含有目的转基因的原代转化体对致病疫霉的抗性。仅含有RGC5的基因构建体(都来自马铃薯和S.bulbocastanum)能够互补栽培种Impala和Kondor中的敏感表型；在19个含有RGC5的原代转化体中共18个是抗性的(表4，图12)，而所有含有RGC1、RGC2、RGC3、RGC4、RGC6、RGC7或RGC8基因的原代转化体都对致病疫霉是敏感的。由于RGC5转化体显示出与作图群B6的抗性S.bulbocastanum亲代类似的抗性表型，所以将RGC5称作Rpi-blb2基因。还可以将同源物RGC24L转移到所描述的敏感马铃薯栽培种中并以离脱叶测定法测试对致病疫霉的抗性。
[0475] 通过DNA印迹分析法分析一组含有RGC5的原代转化体的拷贝数。将EcoRI消化的基因组DNA与nptII探针杂交(表3)。基于nptII杂交片段数的存在，原代转化体含有至少1到11个转基因插入片段。共观察到栽培种Impala中4个单一拷贝整合，在栽培种Kondor中观察到6个单一拷贝整合，其中一个栽培种Kondor转化体似乎具有致病疫霉敏感表型。
[0476] 为研究Rpi-blb2是否也可以互补番茄中的敏感表型，产生含有Rpi-blb2基因构建体的栽培种Moneymaker的原代转化体并用番茄来源的分离物IPO82001和IPO655-2A测试。疾病抗性测定揭示RGC5也能够互补敏感番茄表型(表6)。
[0477] 实施例13：Rpi-blb2基因构建体和推定的氨基酸序列
[0478] 通过引物行走(primer walk)策略对含有RGC5的双元亚克隆211F/C12和SP39-20的插入片段测序，其中用一组嵌套引物实施连续轮的测序，所述嵌套引物设计为延伸相邻序列。用M13F和M13R引物产生第一组序列。克隆211F/C12和SP39-20的插入片段的完整序列分别由7967和9949个核苷酸(nt)组成(图13)。克隆211F/C12的序列与克隆SP39-20的相应序列相同。用GENSCAN(Burge和Karlin，1997)、GeneMark(Lukashin和Borodovsky1998)并通过与Mil.1和Mil.2的基因序列比对预测Rpi-blb2的位置和推定结构。
[0479] 用GeneRacerTM试剂盒(InvitrogenTM，Groningen，荷兰)，通过cDNA末端的5’和3’快速扩增(RACE)确定编码序列的精确长度和结构。RACE鉴定5’和3’Rpi-blb2特异cDNA片段，其分别包含767和201个核苷酸(nt)的5’和3’未翻译区(UTR)。Rpi-blb2基因含有2个内含子。内含子1为626nt长并且位于ATG起始密码子上游5’URT末端32个核苷酸内。内含子2长为86nt，从基因的ATG起始密码子上游42个核苷酸开始。Rpi-blb2转录物的编码序列为3804个核苷酸。
[0480] Rpi-blb2基因的推导的可读框编码所预测的1267个氨基酸的多肽，估计其具有146kDa的分子量(图14)。植物R基因的NBS-LRR类的R基因中存在的一些功能基序在所编码的蛋白质中是明显的。如图14中阐明，Rpi-blb2蛋白质属于NBS-LRR抗性蛋白质的亮氨酸拉链(LZ)子集。Rpi-blb2蛋白质的N-末端半部分含有氨基酸413和434之间的潜在LZ区和指示核苷酸结合位点的6个保守的基序(van der Biezen和Jones，1998)。Rpi-blb的C-末端半部分包含一系列15个不规则的LRRs，它们可以根据在其他细胞质R蛋白质中观察到的共有序列hxxhxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx比对，其中h可以为L、I、M、V或F，x为任意氨基酸残基(Jones和Jones，1997)。
[0481] 实施例14：与本领域已知状态的R基因序列的同源性
[0482] 为鉴定Rpi-blb2基因的计算机芯片上(in silico)同源性，用Rpi-blb2基因的编码序列实施BLAST检索(Altschul等人，1990)。BLASTN检索鉴定了具有与Rpi-blb2基因显著同源性的许多序列。使用DNAStar软件包中的比对程序ClustalW(标准设置)，我们确定Rpi-blb2编码序列与Mi-1.1(89.8％)和Mi-1.2(89.7％)的最高同源性(Genbank检索号分别为AF039681和AF039682)。后一序列相应于番茄的Mi基因，其赋予对根结线虫(Meloidogyne spp.)的三种最具破坏性的种的抗性(Milligan等人，1998)。此外，Rpi-blb2编码序列的核苷酸2410-3461与龙葵(Solanumnigrum)的部分NBS-LRR序列(Genbank检索号AY055116.1)共有87.8％序列同源性。在氨基酸水平，推定的Rpi-blb2蛋白质序列与Mi-1.1(82％同一性)和Mi-1.2(81％同一性)具有最高同源性(Genbank检索号AF039681和AF039682)。
[0483] 通过Rpi-blb2、Mi-1.1和Mi-1.2的推导的氨基酸序列的ClustalW比对，我们鉴定了Rpi-blb2独特的200个氨基酸(aa)残基(图15)。其中，发现31个在高变位置，即，该位置的残基在所有三种序列中都不同并且11个由小插入编码(一个3aa残基插入和一个8aa残基插入)。剩下的为Rpi-blb2特异的，因为在Mi-1.1和Mi-1.2的相应位置遇到的aa残基与Rpi-blb2残基不同但是在两个Mi蛋白质序列中保守(图15)。有趣地，在包括Mi(Axtell等人，2001；Banerjee等人，2001)的许多NBS-LRR蛋白质的三个LRR中保守的VLDL基序不在Rpi-blb2中保守(图15)。
[0484] 实施例15：野生茄树物种中Rpi-blb2等位基因mining
[0485] 使用关于Rpi-blb2基因的起始和终止密码子设计的引物ARF1F和ARF1 R(表3B)，可能通过PCR从任意茄科物种扩增Rpi-blb2的等位基因。可以用双元质粒克隆转录调节序列之间的扩增产物并将其通过农杆菌介导的转化或者本领域技术人员已知的任意方法转移到马铃薯。可以随后分析所得原代转化体对致病疫霉或者其中马铃薯作为其宿主植物的任意病原体的抗性。
[0486] 实施例16：材料和方法
[0487] 植物材料和(1)马铃薯中作图群的开发。由Hermsen和同事(Hermsen，1966；Hermsen和Ramanna，1969；Ramanna和Hermsen，1971；Hermsen和Ramanna，1973；Hermsen，
1983；Hermsen，1994)制备称作ABPT的复杂种间杂种克隆(图1a)。Hermsen(1966)和Hermsen和De Boer(1971)描述了用秋水仙素进行染色体加倍步骤。认为某些ABTP克隆中对致病疫霉的抗性是来自S.bulbocastanum BGRC8007(CGN21306；Pi275196)和BGRC8008(CGN17693；Pi275198)的accessions的之一或者两者，S.bulbocastanum BGRC8007和BGRC8008用于最初的杂交中以产生S.acaule和S.bulbocastanum之间的杂种，因为用于ABPT克隆的育种方案中所有其他亲本在离脱叶测定中都对致病疫霉敏感或者仅部分抗性(Hermsen和Ramanna，1973)。在1988年从前Department of PlantBreeding of the Wageningen Agricultural University(Wageningen，荷兰)接受群体[(ABPT克隆数55×栽培种(cv)Oberarnbacher Frühe)x cvArkula]的19个克隆的块茎、群体[(ABPT克隆数55cv OberarnbacherFrühe)x cv Blanka]的7个克隆的块茎、群体[(ABPT克隆数60x cvAlcmaria)x cv Blanka]的5个克隆的块茎。克隆ARF87-507、ARF87-801和ARF87-601分别选自这些群体。它们代表与复杂种间ABPT克隆的第二次回交(BC2)的后代并用于进一步回交，其导致一个四倍体BC3群体、两个四倍体BC4群体和一个二倍体BC4群体，这些群体用于Rpi-bib2基因的遗传作图(图1)。通过致病疫霉抗性克隆ARF87-507与敏感栽培种Alkon杂交产生四倍体马铃薯作图群。通过致病疫霉抗性克隆AR91-1263与敏感栽培种Cosmos杂交产生四倍体群体ARG95-3。通过抗性克隆AR92-1292与敏感栽培种Celeste杂交产生四倍体群体ARP96-11。通过抗性克隆ARD1197-16与敏感克隆ARD93-2090杂交得到二倍体群体DP1(图1)。
[0488] 植物材料和在(2)Solanum bulbocastanum中作图群的开发
[0489] 通过致病疫霉抗性克隆Blb2002(别名M94-81-C)与敏感克隆Blb48-5杂交产生称作B6(别名B6a、Blb99-229、Blb00-7和Blb00-8)的二倍体S.bulbocastanum作图群。合并从群体B6的正反交得到的结果。从作为雌性亲本的S.bulbocastanum克隆 Blb93-D26-3(accession BGRC8002；CGN17690；Pi275187)和作 为 雄 性亲 本 的S.bulbocastanum克隆Blb93-60-10(accession BGRC8006；Pi275194)之间杂交得到群体B6的抗性亲代克隆。从来自accessions BGRC8005(CGN17692，PI275193)和BGRC8006的S.bulbocastanum克隆之间的杂交得到群体B6的敏感亲代克隆。
[0490] 疾病测定：(1)致病疫霉分离物
[0491] 从Plant Research International B.V.(Wageningen，荷兰)得到三种不同的致病疫霉分离物。分离物具有如下不同的品种结构和交配型：IPO82001：品种结构1.2.3.4.5.6.7.10.11，交配型A2；IPO655-2A：品种结构1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11，交配型A1；IPO428-2：品种结构1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11，交配型A2(Flier等人，2003)。
[0492] 疾病测定：(2)田间试验
[0493] 从1985到2002在荷兰的Marknesse、1991年在墨西哥的Toluca地区或者1992年在菲律宾的Benguet省在试验点种植温室生长的幼苗块茎或者田间生长的种子马铃薯。对于单个克隆，小块土地种植由1到10个块茎。种植后约8周，Marknesse的田间用致病疫霉IPO82001的胞囊孢子溶液接种并在接种后3到6周收集疾病得分。没有或者几乎没有晚疫的克隆分类为具有抗性表型而具有完全或几乎完全患疫病的叶子的克隆分类为敏感型。对晚疫具有中间反应的克隆分类为具有未知表型。在墨西哥和菲律宾的田间试验中，发生天然感染。一旦建立致病疫霉的该天然感染，分别在8和6天以1-9等级对每小块土地上植物的患疫病叶子的百分数打分，所述1-9等级为患疫病叶子的估计百分数，它们为：0、3、
10、25、50、75、90、97和100(Estrada-Ramos等人，1983)。
[0494] 疾病测定：(3)离脱叶
[0495] 对于离脱叶测定，将在温室中生长6到12周的植物的叶子以小片置于水饱和的约35×4×4cm的florists foam中，并置于有孔底部的盘子(40cm宽，60cm长，6cm高)中。
用两滴(每滴25μl)孢囊孢子溶液在远轴边接种每个叶片。随后，将盘子置于盘顶的塑料包中，其中放置水饱和的滤纸，并在人工气象室(climate room)中17℃中和使用荧光的
16h/8h/白天/黑夜光周期下(Philips TLD50W/84HF和OSRAM L58W/21-840)孵育。6-9天后，对叶子评估致病疫霉疾病症状的发展。
[0496] 评估：
[0497] 认为接种后6到9天具有明显显示孢子形成病灶的植物具有敏感表型，而认为具有在接种侧不存在明显孢子形成、不表现可见症状或者坏死的叶子的植物是抗性的。
[0498] 植物DNA标记筛选
[0499] 根据Bendahmane等人(1997)等人的方法从幼叶提取基因组DNA。对于PCR分析，制备15μl反应混合物，其含有0.5μg DNA、15ng每种引物、0.2mM每种dNTP、0.6单位Taq聚合酶(15U/μl，SphaeroQ，Leiden，荷兰)，10mM Tris-HCl pH9，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.1％TritonX-100和0.01％(w/v)明胶。使用下面的循环方案进行PCR：94℃下25秒DNA变性、30秒退火和72℃下延伸40秒。由于PCR扩增DNA的第一步是94℃变性5分钟，最后是72℃额外的5分钟延长步骤。以 T-Gradient或 Uno-II热循
环仪(Westburg，Leusden，荷兰)进行扩增反应。取决于标记，将PCR产物用适宜的限制酶消化。在表3中给出标记概述，包括引物序列、退火温度和限制酶(如果适宜)。随后，用电泳在琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶中分析(切割的)PCR产物。对于丙烯酰胺凝胶分析，使用CleanGel DNA Analysis Kit和DNA Silver StainingKit(Amersham Pharmacia Biotech Benelux，Roosendaal，荷兰)。
[0500] 通过热不对称交错(TAIL)-PCR延伸AFLP片段
[0501] 根据Liu和Whittier(1995)通过TAIL-PCR进行AFLP片段的序列延伸。简言之，使用2或3种嵌套特异引物(sp)联合任意简并(AD)引物进行AFLP片段的延伸。根据表5中所描述的方案，用引物sp1和AD进行第一次PCR，用sp2和AD进行第二次PCR，用sp3和AD进行第三次PCR。用含有如前描述的标准PCR混合物的25μl反应物进行PCR，只是使用30ng引物AD。用pGEM-T(Promega，荷兰)克隆延伸的片段并测序。
[0502] BAC文库构建和测序
[0503] 对Rpi-blb2基因座杂合的抗性克隆ARD1197-16用作构建马铃薯BAC文库的源DNA。对Rpi-blb2基因座杂合的抗性克隆Blb2002用作构建S.bulbocastanum BAC文库的源DNA。如Rouppe van der Voort等人(1999)中所述进行高分子量DNA制备和BAC文库构建。对于马铃薯BAC文库，最终得到了平均插入大小100kb的约120,000个克隆，其对应8到10个基因组当量。将总共约70,000个克隆单独在177个384孔微量滴定板中-80℃保存。另外50,000个克隆以含有约4000个白色菌落的14个细菌库保存。通过用无菌玻璃涂布器将所述克隆从琼脂板刮除到含有18％甘油和12.5μg/ml氯霉素的Luria Broth培养基得到这些克隆。这些所称作的超级库(super pool)也保存在-80℃。最后，将另外
37,000个克隆加入马铃薯BAC文库。S.bulbocastanum BAC文库由约2,000个菌落的48个超级库组成。
[0504] 如Rouppe van der Voort等人(1999)中描述的进行含有单独保存的BAC克隆的BAC文库的标记筛选。为了筛选以超级库保存的BAC文库，用标准碱裂解方案从每个克隆库分离质粒DNA并实施PCR以鉴定阳性库。将相应于阳性库的细菌稀释并在含有氯霉素(12.5μg/ml)的LuriaBroth琼脂板上铺板。随后挑选单个白色菌落置于384孔微量滴定板中并随后如上述鉴定单个阳性BAC克隆。从超级库分离的BAC克隆的名称带有前缀SP(例如，SP39)。
[0505] 候选基因的亚克隆
[0506] 如下从BAC克隆24、211、242、BLBSP39和BLBSP30亚克隆候选RGA。将约1μg BAC DNA的等分试样用1U、0.1U或者0.01U Sau3AI限制酶消化30分钟。将部分切割的BAC DNA进行4℃下0.5×TBE中CHEF电泳，使用1-10秒的线性增加的脉冲时间，场强为6V/cm，电泳16小时。电泳后，用溴化乙锭对琼脂糖凝胶染色以定位含有约10kbp大小的DNA片段的凝胶区。从凝胶切割该区并用GELASE(EpicentreTechnologies，USA)根据生产商的说明处理。将大小选择的DNA连接到BamHI切割并脱磷酸化的双元载体pBINPLUS(van Engelen等人，1995)，然后转化到ElectroMAX大肠杆菌DH10B感受态细胞(Life Technologies，UK)。用标记24L14L(表3)的引物对总共192个克隆通过PCR筛选RGC序列的存在。选择阳性克隆用于进一步表征。通过对来自阳性克隆的14L24L PCR片段测序实施含有RGC1、RGC2、RGC3、RG4、RGC5、RGC6、RGC7、RGC8和RGC24L的克隆的鉴定。通过PCR分析，使用内部引物(24L2，123Mi)联合pBINPLUS特异引物(表3)确定亚克隆内RGA的相对位置。
[0507] 马铃薯的根癌农杆菌介导的转化
[0508] 将含有候选基因的双元质粒转化到根癌农杆菌株系AGL0(Lazo等人，1991)或UIA143(Farrand等人，1989)中，后者含有辅助质粒pCH32(Hamilton等人，1996)。所转化的根癌农杆菌株系的过夜培养物用于根据标准方案(Hoekema等人，1989；Fillati等人，1987)转化马铃薯块茎圆片(discs)(栽培种Impala和Kondor)。简言之，将栽培种Impala和Kondor的检定种子马铃薯去皮并在含有0.1％Tween20的1％次氯酸钠溶液中消毒30分钟。然后以大量无菌蒸馏水充分洗涤块茎(4次，10分钟)。从用木塞钻孔器制备的块茎组织柱体切割厚约2mm和直径为7mm的圆片。将块茎圆片转移到含有根癌农杆菌的液体MS30培养基中并孵育15分钟。除去根癌农杆菌溶液后，将块茎圆片转移到含有MS30、0.9mg/l IAA、3.6mg/lzeatine riboside和8g/l琼脂的再生培养基(Hoekema等人，1989)中。将平板在24℃16小时昼长下孵育(Philips TLD50W/84HF)。共培养48小时后，将块茎圆片在包含抗生素：200mg/l万古霉素、250mg/l头孢噻肟和75mg/l卡那霉素的液体MS培养基中冲洗5分钟并转移到补加相同抗生素的再生培养基中。将平板在24℃16小时昼长下孵育(Philips TLD50W/84HF)。每三周将块茎圆片转移到新鲜培养基中。将再生枝条转移到含有75mg/l卡那霉素的MS30培养基中。体外繁殖生根的枝条并通过将一小片茎干在3mL Luria Broth培养基孵育(3周，37℃，400转/分钟)检测根癌农杆菌的缺乏。将一棵每种转化的再生植物转移到温室中。
[0509] 番茄的根癌农杆菌介导的转化
[0510] 用70％乙醇冲洗敏感番茄品种Moneymaker的种子以溶解种皮并用无菌水洗涤。随后，将种子用1.5％次氯酸钠表面消毒15分钟，用无菌水冲洗3分钟并置于含有补加
10g/l蔗糖(MS10)和160ml蛭石的140ml MS培养基pH6.0(Murashige和Skoog，1962)的
2
容器中。让种子在25℃和0.5W/M 光下发芽8天。
[0511] 将8天龄的子叶外植体在培养皿中预培养24小时，其中所述培养皿含有铺在共培养培养基(补加Nitsch维生素(Duchefa Biochemie BV，Haarlem，荷兰)，0.5g/l MES缓冲液和8g/l Daichin琼脂的MS30，pH5.8))上的烟草悬浮细胞的2周龄滋养层。
[0512] 将根癌农杆菌的过夜培养物离心并将沉淀重悬浮在含有200μM乙酰丁香酮的细胞悬浮培养基(补加Nitsch维生素、0.5g/l MES缓冲液，pH5.8的MS30，pH5.8)中至最终O.D.600为0.25。然后用含有pBINRGC5的根癌农杆菌UIA143的稀释的过夜培养物感染外植体25分钟，在无菌滤纸上印迹干燥并在最初滋养层平板上共培养48小时。培养条件如上述。
[0513] 共培养后，将子叶外植体转移到具有选择性芽诱导培养基(补加10g/l蔗糖的MS pH5.8，包括Nitsch维生素、0.5g/l MES缓冲液、5g/l琼脂凝胶、2mg/l zeatine riboside、2
400mg/l羧苄青霉素、100mg/l卡那霉素、0.1mg/lIAA)的培养皿并在25℃，3-5W/m 光下培养。外植体每3周在新鲜培养基上传代培养。将出现的芽从下面的愈伤组织解剖并转移到具有选择性根诱导培养基(MS pH5.8，补加Nitsch维生素、0.5g/l MES缓冲液、5g/l琼脂凝胶、0.25mg/l IBA、200mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素)的容器中。
[0514] RNA提取
[0515] 用 根据生产商(InvitrogenTM，Groningen，荷兰)提供的方案(具有小的改动)分离总RNA。简言之，将0.5g幼叶组织在液氮中研磨并将粉末悬浮在5ml中。室温(RT)下孵育5分钟后，加入0.5ml氯仿，涡旋悬浮物并孵育2分钟。离心(15分钟，11404×g，4℃)后，将上清液转移到新管中并加入2.5ml异丙醇。室温下10分钟后，沉淀核酸(10分钟，11404×g，4℃)。用5ml70％乙醇洗涤沉淀(5分钟，室温)并离心(5分TM
钟，6415×g，4℃)后，干燥沉淀并重悬浮在100μl无菌蒸馏水中。用Oligotex mRNA midi试剂盒(Qiagen，GmbH，德国)从总RNA提取PolyA+RNA。
[0516] cDNA末端的快速扩增TM TM
[0517] 使用GeneRacer 试剂盒(Invitrogen ，Groningen，荷兰)通过cDNA末端的快速扩增(RACE)确定Rpi-blb2 cDNA的5’和3’末端并证实推定的内含子位置。对用引TM物GSP4(ARO772)合成的cDNA实施5’RACE。随后，引物GSP6(ARO774)与GeneRacer 5’TM
引物联合使用并且将GSP6与GeneRacer 5’嵌套引物联合实施最后扩增。用嵌套引物TM
GSP1(ARO769)和GSP2(ARO770)联合GeneRacer 3’引物实施3’RACE。用GSP3(ARO771)联TM
合GeneRacer 嵌套3’引物实施最后扩增。
TM TM
[0518] 用Accuprime(vitrogen ，Groningen，荷兰)代替GeneRacer 试剂盒提供的Taq聚合酶实施3’和5’RACE扩增步骤。
[0519] AFLP指纹法和AFLP片段的克隆
[0520] 基本上如Vos等人(1995)中描述的进行模板制备和AFLP指纹法。为了克隆特异片段，通过重叠聚丙烯酰胺凝胶，在Whatmann 3MM纸上干燥，用放射自显影图从丙烯酰胺33
凝胶切除 P-标记的AFLP片段。切除目的带下的凝胶/纸片并转移到200μl TE中并在室温孵育1小时。使用PCR，用5微升上清液再扩增片段，其中EcoRI+0联合MseI+0用作引物。将再扩散的AFLP片段随后克隆到pGEM-T克隆载体(Promega，荷兰)并对一些克隆的插入片段测序。
[0521] 切除的AFLP带的DNA序列用于设计基因座特异引物。使用限制酶，对用此类引物得到的扩增产物筛选内部多态性。限制性酶切后，将片段在含有溴化乙锭的2-3％琼脂糖凝胶上分离。
[0522] RGA-AFLP分析
[0523] 基本上如Vos等人(1995)中描述进行模板制备。然而，用Leister等人(1996)的基于P-环的引物S1联合EcoRI+0 AFLP引物进行第二次扩增步骤。将10μl反应33
混合物[0.5μl P-标记的S1引物(10ng/μl)；0.5μlEcoRI+0引 物(10ng/μl)；
TM
0.8μl dNTPs(5mM)；2μl10×Goldstar PCR 缓 冲 液 (Eurogenetc，Belgium)；1.2μl TM
MgCl2(25mM)；0.06μl Goldstar DNA聚合酶(5U/μl)(Eurogenetc，Belgium)；14.94μl MQ水]加入到10μl稀释的模板(在MQ水中稀释20倍)并使用下面的循环方案进行PCR反应：94℃下45秒DNA变性，49℃下45秒引物退火和72℃下2分钟的延伸步骤(35个循环)。循环前，将模板DNA在94℃变性2分钟并在72℃进行额外的5分钟延伸步骤完成PCR。扩增反应在Perkin Elmer9600热循环仪中进行。标记的PCR产物片段在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过放射自显影根据标准步骤对各个带显色。
[0524] 实施例17：Rpi-blb2表达的表型
[0525] 材料和方法
[0526] 用3ml H2O冲洗受感染小叶(IPO82001)的四个病灶(在标准条件下接种后6天)。用血细胞计数器Fuchs-Rosenthal(W.Schreck Hofheim/Ts.)确定浓度。
[0527] 定义：
[0528] 孢子形成指数是在受感染的小叶的病灶上检测的每ml孢子囊的量。
[0529] 表7：在离脱叶测定中用致病疫霉感染后不同基因型的孢子形成指数
[0530]基因型 孢子形成指数 孢子囊/ml
cv.Bintje 1,840,000
ARD92-1197-16 20,000
R2-differential 0
[0531] Rpi-blb2和其他致病疫霉抗性基因之间的差别是Rpi-blb2允许低水平孢子形成(图18)。这通过离脱叶测定阐明，其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在的病灶显示出低水平孢子囊，相比在含有S.demissum基因R2的基因型上完全不存在孢子囊。然而，孢子形成指数为敏感表型(cv.Bintje)的仅1.1％(表7和图18)。
[0532] 田间实验也表明Rpi-blb2允许低水平感染。在生长期(图3，ARF87-801)或者在生长期结束(图2，ARF87-601；图3，ARF87-507和ARF87-601)时产生低水平晚疫症状。
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有机植物肥-专利编号CN101891531A 2020-05-13 534
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