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促进真皮乳头细胞生长的组合物及其医药组合与制备方法

阅读：861发布：2021-03-01

IPRDB可以提供促进真皮乳头细胞生长的组合物及其医药组合与制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种促进真皮乳头细胞(dermal papilla cell)生长的组合物，该组合物是通过不含血清的培养基培养细胞特定天数以获得细胞激素，并经由多次冻融循环来破坏细胞以获得更多的多肽混合物，再浓缩去盐以获得特定分子量的组合物，其中该组合物具有促进真皮乳头细胞生长的效果，且相较于初始未实验的真皮乳头细胞可促进生长速率约5％至50％。，下面是促进真皮乳头细胞生长的组合物及其医药组合与制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种促进真皮乳头细胞生长的组合物的制备方法，其包含：猪脐带组织；

以冲洗液冲洗该猪脐带组织，使血球细胞及体液从该猪脐带组织中移除；

由该猪脐带组织分离细胞并进行继代培养，以获得细胞激素；

将该细胞及该细胞激素进行冻融循环至少2次，以获得多肽混合物；以及将该多肽混合物浓缩去盐，以获得该组合物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该组合物的分子量大于3000道尔顿。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将该多肽混合物浓缩去盐的步骤中，所获得的组合物包含一种或多种选自由血管生成素、血小板衍生生长因子、纤维母细胞生长因子7及其组合所组成的组。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在由该猪脐带组织分离该细胞并进行继代培养以获得该细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养3天至18天，以获得该细胞激素。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在由该猪脐带组织分离该细胞并进行继代培养以获得该细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养6天，以获得细胞激素。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该猪脐带组织来自无特定病原猪。

7.一种如权利要求1至6任一项所述的制备方法所获得的组合物，其特征在于，该组合物具有促进真皮乳头细胞增生的效果。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，该组合物使真皮乳头细胞的生长速率增加5％至50％。

9.一种用于促进真皮乳头细胞生长的医药组合，其包含如权利要求7或8所述的有效剂量的组合物以及其医药可接受的溶剂及/或赋形剂。

10.如权利要求9所述的医药组合，其特征在于，该组合物的有效剂量为每毫升0.05纳克(ng/ml)至20ng/ml。

说明书全文

促进真皮乳头细胞生长的组合物及其医药组合与制备方法

技术领域

[0001] 本发明关于一种用于促进真皮乳头细胞(dermal papilla cell)生长的组合物的制备方法，尤指一种由脐带组织的类纤维母细胞经培养而获得含有特定组份的组合物的制备方法；本发明亦关于一种促进真皮乳头细胞生长的组合物，其具有促进真皮乳头细胞增生的效果。本发明亦关于一种包含有效剂量的前述组合物的医药组合，以达到促进真皮乳头细胞生长的效果。

背景技术

[0002] 现有技术中，藉由培养上皮细胞和间质干细胞等方式获得干细胞因子(stem cell factor，SCF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor，IGF)等生长因子，其缺点在于一般冷冻需渐进降温，较为耗时，且在后续培养过程中，培养基所含的盐类会造成对皮肤毛发的刺激性。

发明内容

[0003] 鉴于现有技术未使用冻融循环方式而导致产量较低、且无同时进行浓缩与去盐类步骤以及整体步骤较为繁复耗时等缺点，本发明的目的在于提供一种促进真皮乳头细胞(dermal papilla cell)生长的组合物的制备方法，该方法通过液态氮冷冻解冻循环方式破坏细胞并收集细胞裂解液(cell lysate)，以获得更多的多肽混合物(polypeptide or protein cocktail)，并经由浓缩去盐以获得特定分子量的组合物。

[0004] 为达上述目的，本发明提供一种促进真皮乳头细胞生长的组合物的制备方法，其包含：提供猪脐带(umbilical cords)组织；以冲洗液冲洗该猪脐带组织，使血球细胞和体液从猪脐带组织中移除；由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素；将细胞及细胞激素进行冻融循环至少2次，以获得多肽混合物；以及将该多肽混合物浓缩去盐，以获得组合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿(dalton,Da)。

[0005] 依据本发明，“冲洗液”如此处所述指对于猪脐带组织为等张的溶液；优选的所述冲洗液为90％氯化钠溶液或磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)。

[0006] 依据本发明，“分离细胞”如此处所述指将猪脐带切成非常小的碎片以形成脐带碎片，并将4块至6块脐带碎片放置于培养皿中，其培养皿中包括10毫升(ml)的生长培养基(含有α-MEM以及10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS))，置于恒温容器培养10天后去除脐带碎片，且每周加两次3ml培养基，其中恒温容器指二氧化碳(CO2)培养箱(含有5％CO2)，以获得细胞。

[0007] 依据本发明，“继代培养”如此处所述指当细胞生长至高密度时，即进行收集细胞，并经稀释后分殖至新的培养皿中，以降低细胞密度并维持细胞生长，其稀释比例依细胞种类而异。

[0008] 依据本发明，“冻融循环”如此处所述指将细胞及其细胞激素放置于液态氮中冷冻，然后再将细胞取出至室温中融化，反复多次而达到破坏细胞膜的效果。如本案所例示，将含有细胞的冷冻管直接浸置于液态氮中，再将含有细胞的冷冻管由液态氮中取出置于37℃水浴解冻，重复以上步骤循环至少2次，并将破裂的细胞于1000G离心15分钟至20分钟。

[0009] 依据本发明，“浓缩去盐”如此处所述指将多肽混合物放置于过滤装置中，并经由离心及去除上清液，使多肽混合物达到浓缩并去除盐类的效果。如本案所例示，将多肽混合物置于超滤装置或离心设备，以减少多肽混合物的体积、增加浓度以及去除杂质(如盐类)，从而获得组合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿(dalton,Da)。

[0010] 优选的，所述组合物包含一种或多种选自于由血管生成素(angiogenin)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、纤维母细胞生长因子7(fibroblast growth factor7，FGF7)及其组合所组成的组。

[0011] 优选的，在所述的由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养3天至18天，以获得细胞激素。

[0012] 优选的，在所述的由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养6天，以获得细胞激素。

[0013] 依据本发明，“猪脐带组织”如此处所述指来自无特定病原(specific pathogen free,SPF)猪。

[0014] 本发明又提供一种以前述制备方法所获得的组合物，该组合物具有促进真皮乳头细胞生长的效果。

[0015] 依据本发明，“促进真皮乳头细胞生长”如此处所述指该组合物使真皮乳头细胞相较于初始未实验或本案所例示的控制组的生长速率成长5％至50％。

[0016] 本发明再提供一种医药组合，其包含有效剂量的前述组合物以及其医药可接受的溶剂及/或赋形剂。

[0017] 优选的，所述的有效剂量的组合物为每毫升0.05纳克(ng/ml)至20ng/ml。

[0018] 依据本发明，“医药可接受的溶剂及/或赋形剂”如此处所述指任意可做为人类或动物内服或外用的溶剂，例如酒精-水共溶剂、水、生理食盐水；更佳的，所述的医药可接受的溶剂及/或赋形剂是水或生理食盐水；其中溶剂加入的量，以能维持组合物的有效剂量为原则。

[0019] 本发明所述的制备方法藉由不含血清的培养基培养细胞特定天数以获得细胞激素，并经由重复冻融以破坏细胞，以获得更多的多肽混合物，再以浓缩去盐以获得特定分子量的组合物，其中该组合物具有促进真皮乳头细胞生长的效果，且相较于初始未实验的真皮乳头细胞的生长速率成长5％至50％。

附图说明

[0020] 图1A为本发明的组合物施于受体额头及发线交界部位并用于促进真皮乳头细胞增生的实验第0天的图片。

[0021] 图1B为本发明的组合物施于受体额头及发线交界部位并用于促进真皮乳头细胞增生的实验约2个月后(即第60天)的图片。

具体实施方式

[0022] 本发明将由下列的实施例做为进一步说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。本领域技术人员可以做些许的改良与修饰，但不脱离本发明的范畴。

[0023] 制备例1 由猪脐带分离细胞

[0024] 提供猪脐带，将猪脐带以75％乙醇清洗20秒至30秒后，再以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗，随后将脐带切成3至4等份并置于已灭菌的培养盘中。以手术刀或镊子沿脐带静脉将脐带打开，并将脐带以两镊子将脐带拉开，小心将动脉移除以避免任何血液泼溅至华通氏胶(Wharton’s jelly，即脐带内的胶状结缔组织)，同时将静脉一并移除。将华通氏胶块从线羊膜(cord amnion)移除并置于新鲜且含有α-MEM的培养皿中以保持其润湿。接着以外科剪刀将脐带切成非常小的碎片以形成脐带碎片，并将4-6块脐带碎片放置于培养盘中，其培养盘中包括10毫升(ml)的生长培养基(含有α-MEM以及10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS))，并置于CO2培养箱(含有5％CO2)。每周加两次3ml培养基。10天后将脐带碎片移除，并以PBS洗涤后加入新鲜的培养基，使细胞培养至80％至90％满，并进行继代培养以增殖细胞。

[0025] 制备例2 继代培养细胞

[0026] 藉由真空抽吸器吸除培养基，并以5ml PBS清洗培养盘中的细胞。再次移除PBS，并将3ml且浓度为0.25％的胰蛋白酶(trypsin)-EDTA加到各培养盘中；将培养盘放置在37℃、5分钟，将分离的细胞收集于15ml离心管中，以400G离心5分钟，去除上清液并加入
2ml培养基。藉由吸量管将细胞重新悬浮，并吸取10μl细胞与10μl刚果蓝(trypan blue)混合，且以自动细胞计数器进行细胞计数。

[0027] 制备例3 制备细胞激素(cytokines)

[0028] 为产生细胞激素，首先将制备例2所得的细胞接种到细胞培养皿中，且每培养皿5 5
生长至3x 10至7x 10 个细胞的密度。将细胞培养在37℃的CO2培养箱中，培养基每周更换两次(约每3天至4天)，直到细胞生长至90％满。

[0029] 当细胞生长至90％满时，以5ml PBS洗涤细胞2次，再将8ml不含血清的培养基加到每个培养皿中，并于37℃的CO2培养箱中培养6天，以获得细胞激素。

[0030] 制备例4 收集多肽混合物

[0031] 一些细胞因子会释放至培养基中，而另一些细胞因子则驻留在细胞内。收集培养基，并将附着的细胞暴露于3ml且浓度为0.2％的胰蛋白酶-EDTA，在37℃处理5分钟，收集细胞并以40G离心5分钟并去除上清液，再以10ml的PBS洗涤已离心沉淀的细胞1次。再次离心并去除上清液，然后将细胞重新悬浮在3ml PBS并置于冷冻管中，再将含有细胞的冷冻管直接浸置于液态氮中。将含有细胞的冷冻管置于37℃水浴解冻，重复以上冻融循环2次以打破细胞。将破裂的细胞于1000G离心15分钟至20分钟。混合收集的上清液和细胞裂解物以获得多肽混合溶液及其总产率，并藉由酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测上清液或含有多肽混合溶液(例如bFGF或PDGF等)的浓度。

[0032] 制备例5 多肽混合物的浓度及去盐(desalting)

[0033] 含有多肽的混合溶液需经浓缩以获得特定浓度的多肽。将制备例4所获得的上清液及细胞裂解物放入超滤装置(型号为Amicon Stir Cell)或离心设备(Amicon Filter Centrifugation Device)以减少含有多肽的混合溶液的体积以及增加浓度，以获得经浓缩的多肽混合溶液。经浓缩的多肽混合溶液由超滤装置或离心设备放入收集管中。取2ml经浓缩的多肽混合溶液以评估多肽混合溶液的浓度。

[0034] 制备例6 冷冻干燥(lyophilization)多肽混合溶液

[0035] 将制备例5所获得的50ml经浓缩的多肽混合溶液置于夹链袋并于-80℃过夜(12小时至16小时)。将含有经浓缩的多肽混合溶液的袋子一同放入冷冻干燥机，冷冻干燥多肽混合溶液(4天至5天)，以获得冻干的多肽混合粉末。将冻干的多肽混合粉末以无菌水再悬浮，以获得多肽溶液，并将多肽溶液以0.22μm过滤膜过滤以获得组合物，并将该组合物储存于-80℃，其中该组合物包含有55ng/ml血管生成素(angiogenin)、6ng/ml血小板衍生生长因子(PDGF)以及4ng/ml纤维母细胞生长因子7(FGF7)。

[0036] 实施例1 毛发增生实验

[0037] 以飞针在欲施用部位制造微创伤口(深度约为0.2毫米(mm)至2.5mm)，再于该部位涂抹制备例6所获得的组合物，每次使用1ml，共使用7次，且施予频率为1周至2周使用1次。结果如图1A所示，将制备例6所获得的组合物施予受体额头与发线交界部位，如图1B所示，由于真皮乳头细胞可形成毛囊且为毛发生长的主要细胞之一，故施用本发明所述的组合物约2个月后，可藉由促进真皮乳头细胞生长而生长出新的毛发，且新的毛发也变较粗。

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