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磷灰石预处理

阅读：360发布：2020-05-11

IPRDB可以提供磷灰石预处理专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供磷灰石预处理方法。在第一色谱使用前将所述方法应用于磷灰石固体表面。在一个实施方式中，可通过以下方式实现所述方法：将磷灰石固体表面与pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲的溶液接触，并将所述磷灰石固体表面与含有氢氧化物的溶液接触。，下面是磷灰石预处理专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种在色谱过程中使用之前处理磷灰石固体表面的方法，所述方法包括：(a)提供磷灰石固体表面，该磷灰石固体表面不曾在色谱过程中使用过，且不曾与样品接触过；

(b)在pH至少为6.5时，将所述磷灰石固体表面与磷酸盐缓冲的溶液接触；以及然后(c)将步骤(b)中所得的磷灰石固体表面与含有碱性氢氧化物的溶液接触；然后(d)用步骤(c)中所得的磷灰石固体表面从样品中纯化蛋白质；

其中步骤(b)和(c)使钙浸出最小化，同时水合羟基磷灰石固体表面。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)在步骤(b)前进行。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液是含有0.1-1.0M磷酸盐、pH为6.5至10的溶液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液是400mM磷酸盐，pH为

8.0。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述碱性氢氧化物是氢氧化钠或氢氧化钾。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的纯化包括：将所述磷灰石固体表面与所述样品接触，从而将所述蛋白质从一种或多种污染物中分离；

(e)收集所述蛋白质；以及然后

(f)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：

(i)将所述磷灰石固体表面与包含浓度至少为5mM的钙离子和两性离子缓冲剂的缓冲的钙溶液接触，所述两性离子缓冲剂浓度与所述钙离子浓度的比例至少为2，所述溶液的pH至少为6.5；

(ii)在pH至少为6.5时，将所述磷灰石固体表面与磷酸盐缓冲的溶液接触；以及(iii)将所述磷灰石固体表面与含有碱性氢氧化物的溶液接触；

其中步骤(i)至(iii)提高了所述磷灰石固体表面的树脂质量和/或颗粒强度。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法(d)包括将所述蛋白质与所述磷灰石固体表面结合，以及(e)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述蛋白质。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法(d)包括将所述磷灰石固体表面与所述样品接触，从而将所述蛋白质流动通过所述磷灰石固体表面，以及(e)包括在流动通过物中收集所述蛋白质。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两性离子缓冲剂是含磺酸的缓冲剂。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含磺酸的缓冲剂是MES、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含磺酸的缓冲剂是MES。

12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述钙离子至少为25mM，或至少为50mM。

13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两性离子缓冲剂浓度与所述钙离子浓度的比例至少为2.5、3或4。

14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述缓冲的钙溶液包含氯化钙或硝酸钙。

15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含pH为6.5至8、含有0.1至1.0M磷酸盐的溶液。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲的溶液包含400mM磷酸盐，pH为7.0。

17.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱性氢氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。

18.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述再生步骤逆转或消除了在蛋白质纯化或柱清洁步骤期间发生的柱的降解。

19.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述再生步骤在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤之前进行或替代所述磷酸盐清洁/剥离步骤。

20.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述再生步骤在蛋白质洗脱之后进行。

21.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(f)(ii)还包括：用含有磷酸盐浓度为10mM，或小于10mM，pH至少为6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面；以及随后用含有磷酸盐浓度至少为100mM，pH至少为6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面。

22.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述再生步骤由(i)、清洗、(ii)和(iii)组成。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质是抗体。

24.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两性离子缓冲剂是N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸或Tris。

说明书全文

磷灰石预处理

[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 本申请要求于2014年6月23日提交的美国临时申请第62/015,894号、2014年11月19日提交的美国临时申请第62/082,017号；以及2015年4月23日提交的美国临时申请第62/
151,882号的优先权，三者的全部内容通过引用纳入本文。

[0003] 背景

[0004] 在其它磷灰石固体表面之中，将磷灰石固体支持面，包括羟基磷灰石、陶瓷磷灰石、氟磷灰石和氟强化磷灰石(fluoride enhanced apatite)，用于各种目标分析物的纯化。磷灰石最常用于生物分析物纯化，所述生物分析物包括蛋白质、碳水化合物、多核苷酸和病毒颗粒。磷灰石具有作为纯化支持物的独特性质，因为其在单一支持物中提供亲和性、离子交换和/或水合氢离子相互反应的形式。

[0005] 磷灰石恢复方法恢复了磷灰石纯化过程后的质量损失。不过，质量损失可以在磷灰石纯化过程之前发生，即在干磷灰石树脂的水合作用、柱填充过程中和在样品加载前发生。

发明内容

[0006] 本文公开了磷灰石预处理方法。还公开了磷灰石再生方法。

[0007] 在一个实施方式中，在使用前处理磷灰石固体表面的方法包括(a)将所述磷灰石固体表面与pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲的溶液接触；以及(b)将所述磷灰石固体表面与含有氢氧化物的溶液接触。在一些实施方式中，步骤(a)在步骤(b)之前进行。在一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲的溶液是含有约0.1至约1.0M磷酸盐、pH为约6.5至约10的溶液。在一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲的溶液是400mM磷酸盐，pH为8.0。在某些实施方式中，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。在一些实施方式中，所述碱性氢氧化物是氢氧化钠或氢氧化钾。

[0008] 在一些实施方式中，所述方法还包括用磷灰石固体表面纯化目标分析物，所述纯化包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而从一种或多种污染物中分离目标分析物；(b)收集所述目标分析物；以及(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：(i)用缓冲钙溶液(包含浓度至少约为10mM的钙离子和两性离子缓冲剂)接触所述磷灰石固体表面，其中两性离子缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约2，所述溶液的pH至少为约6.5；(ii)用pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲的溶液与所述磷灰石固体表面接触；以及(iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。

[0009] 在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，所述方法(a)包括将所述目标分析物与磷灰石固体表面结合，以及(b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析物。在另一个实施方式中，所述方法(a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及(b)包括在流动通过物中收集所述目标分析物。

[0010] 在一个实施方式中，所述两性离子缓冲剂是含磺酸的缓冲剂。在一些情况中，所述含磺酸的缓冲剂是MES、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。在一些情况中，所述含磺酸的缓冲剂是MES。

[0011] 在一个实施方式中，所述钙离子至少为约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM(例如10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM或10.5mM),20mM、25mM或至少为约50mM。在另一个实施方式中，两性离子缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约2.5、3或4。在另一个实施方式中，所述缓冲的钙溶液包含氯化钙或硝酸钙。在另一个实施方式中，所述磷酸盐缓冲的溶液包含含有从约0.1M或0.2M至约1.0M磷酸盐，或从约0.1M或0.2M至约0.5M磷酸盐，pH为约6.5-8的溶液。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲的溶液包含400mM磷酸盐，pH为7.0。

[0012] 在一个实施方式中，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。在一些情况中，所述碱性氢氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。在一个实施方式中，所述再生逆转或消除在蛋白质纯化或柱清洁步骤中发生的所述柱的降解。在另一个实施方式中，所述再生将磷灰石固体表面的强度增加了至少约1％、5％、10％、15％、20％或更多。

[0013] 在一个实施方式中，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤之前进行或替代该步骤进行。在一些情况中，所述再生步骤在洗脱目标分析物之后进行。

[0014] 在一个实施方式中，所述用含有磷酸盐，pH至少为约6.5的溶液接触所述磷灰石固体表面的步骤(ii)还包括：用含有磷酸盐浓度为10mM或低于约10mM，pH值至少为约6.5或7的溶液接触所述磷灰石固体表面；随后用含有磷酸盐浓度至少为约100mM、200mM、400mM或500mM，pH值至少为约6.5或7的溶液与所述磷灰石固体表面接触。

[0015] 在一个实施方式中，所述再生包括(i)、清洗、(ii)和(iii)。

[0016] 发明详述

[0017] 本文公开了用于预处理磷灰石固体表面的方法。已发现，预处理方法防止或减少了在用于从样品中纯化目标分子的色谱过程中第一次使用之前的磷灰石固体表面的劣化(即质量损失)。在结合和洗脱或流动通过纯化过程之前，可应用磷酸盐缓冲的溶液，随后应用碱性氢氧化物。

[0018] 本文还公开了用于再生磷灰石固体表面的方法。已发现，通过用缓冲的钙溶液处理所述磷灰石固体表面、随后用磷酸盐缓冲的溶液处理、随后用碱性氢氧化物处理，再生方法能减少、消除或逆转在至少一个色谱过程中使用后的磷灰石固体表面的劣化。所述缓冲的钙溶液、磷酸盐缓冲的溶液和碱性氢氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。

[0019] 定义

[0020] “磷灰石”是指通式为Ca5(PO4)3(X)的磷酸盐和钙的矿物，其中X为带负电荷的离子。通常X是F、Cl或OH。不过磷灰石的结构和化学性质允许有多种替代，包括替代结构中Ca的各种金属阳离子(例如K、Na、Mn、Ni、Cu、Co、Zn、Sr、Ba、Pb、Cd、Sb、Y、U或各种稀土元素中的-3 -3 -2 -2 -4一种或多种)，以及替代结构中PO4 的阴离子复合物(例如AsO4 、SO4 、CO3 、SiO4 等)。

[0021] “羟基磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物的混合式固体支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基磷灰石是市售可得的，其可有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。复合材料形式包含包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的羟基磷灰石微晶。

[0022] “氟磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6F2的不可溶的磷酸钙的加氟(fluoridated)矿物的混合式支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。氟化磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。

[0023] “磷灰石固体表面”是指稠合的纳米晶体(陶瓷磷灰石)、微晶或化合的磷灰石的微晶。磷灰石固体表面包括但不限于羟基磷灰石或氟磷灰石。陶瓷磷灰石包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(例如CHTTM)或陶瓷氟磷灰石。陶瓷磷灰石是磷灰石矿物的一种形式，其中纳米晶体团聚成颗粒并在高温下熔凝以形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的微晶包括但不限于HA (珀尔公司(Pall Corp.))。微晶包括但不限于Bio-Gel HTP、HT、DNA级HT(伯乐公司(Bio-Rad))和Hypatite C(克拉克森色谱公司(Clarkson
Chromatography))。

[0024] “样品”是指含有感兴趣的目标分子或颗粒的任何组合物。样品可以未纯化或部分纯化。样品可包括生物来源的样品，包括但不限于：血液或血液组分(包括但不限于血清)、尿液、唾液、排泄物以及组织。样品可来源于未纯化的、部分纯化的或纯化的细胞裂解物或用过的细胞生长介质。

[0025] “目标分子”或“目标分析物”是指样品中待检测的分子或分析物。在一些实施方式中，该目标分子是肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节因子、凝血因子或磷蛋白)、多核苷酸(例如DNA(如dsDNA或ssDNA)；RNA(如mRNA或miRNA)；或DNA-RNA杂交体)、适体、粘合素(affimer)、肽核酸、碳水化合物、病毒、病毒样颗粒、药物化合物、代谢物或细胞。

[0026] 在树脂水合和柱填充过程中发生的树脂劣化可引起钙损失、树脂颗粒强度损失和颗粒断裂的增加。在一些实施方式中，这样的影响可通过本文所述的方法防止或减少。

[0027] 色谱过程中使用后发生的树脂劣化可造成树脂颗粒失去其强度，并因而断裂成导致柱内阻塞的较小颗粒。劣化也可以磷灰石的化学破损形式出现，造成质量损失，这可转而导致出现柱体积损失、颗粒强度损失、颗粒断裂增加或其组合。在一些实施方式中，这样的影响可通过本文所述的方法逆转。可通过实践本发明的方法而实现的劣化的逆转可导致较低的树脂质量损失速率、较低的颗粒强度减弱速率，或同时导致上述两者。在许多情况中，劣化的逆转可伴随树脂质量增加、颗粒强度增加或两者均有。

[0028] 可通过例如称重干燥的磷灰石样品，例如清洗掉缓冲液组分和吸附的生物化合物后的样品，来测定磷灰石固体表面的质量。可通过例如测定对搅动力(例如搅拌)、超声处理或压缩(例如单轴压缩力的应用)的耐受性来测定磷灰石介质强度。可通过处理后的磷灰石固体表面的检查以测量细小物质的生成来测定对超声处理或搅动力的耐受性。可通过测量将给定质量的磷灰石压缩到设定的恒定终端力所需的力并测定压缩距离来测量对压缩的耐受性。可相对于没有经受过磷灰石纯化(即使用磷灰石的目标分子的纯化)或磷灰石再生过程的样品来测定磷灰石劣化或降解。

[0029] “碱性氢氧化物”是指包含元素周期表第1族中任何阳离子元素(包括例如锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)和钫(Fr))的碱金属氢氧化物。因此，示例性的碱性氢氧化物包括但不限于NaOH、LiOH和KOH。

[0030] 两性离子缓冲剂是一种可同时含有带正电荷和带负电荷的缓冲剂。示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于含磺酸基团的缓冲剂。如本文中所用的，“磺酸”是指具有通式RS(＝O)2–OH的一类有机硫化合物中的一种，其中R是有机基团(例如烷基或烯基或芳基)，S(＝O)2–OH是磺酰基氢氧化物。

[0031] 包含磺酸基团的示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于氨基烷基磺酸(aminoalkanesulfonic acids)。示例性的氨基烷基磺酸可包括但不限于在氨基和磺酸基团之间具有最少2个碳的氨基烷基磺酸。包含磺酸基团的示例性的两性离子缓冲剂可包括但不限于N,N-二烷基氨基甲烷磺酸(N,N-dialkylaminomethanesulfonic acids)。

[0032] 包含磺酸基团的示例性的两性离子缓冲液可包括但不限于：MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、ACES(2-(氨基甲酰甲烷氨基)乙磺酸)、MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙磺酸)、MOPS(3-吗啉代丙烷-1-磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸),HEPES(2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)、DIPSO(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟丙磺酸)、TAPS(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]丙-1-磺酸)、TAPSO(3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟丙-1-磺酸)、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟丙磺酸))或HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟丙磺酸))、EPPS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸))、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸)、CHES(2-(环己基氨基)乙磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、TABS(N-三(羟甲基-4-氨基丁磺酸)，或AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)。

[0033] 本文所述方法中用作恢复材料的钙离子可通过氢氧化钙或可溶性钙盐(通常是可溶于水的盐)提供。卤化钙和硝酸钙是可采用的钙盐的例子。示例性的卤化钙是氯化钙。在一些情况中，当在流动通过纯化过程中的色谱缓冲液中或在结合和洗脱纯化过程中的洗脱缓冲液中含有碱金属氯化物时，氯化钙是优选的。

[0034] 如本文所述，文中缓冲的钙溶液中的术语“缓冲剂”、“缓冲的”等是指与钙相容(例如基本不与钙相互反应或基本不在混合物中沉淀)的缓冲液，并且用于将水溶液的pH稳定在特定值上或特定值附近，或在特定范围内的目的。同样地，通常，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不可以是水。在一些实施方式中，缓冲的钙溶液中的“缓冲剂”不是磷酸盐。

[0035] 磷酸盐可在用于磷灰石平衡、色谱、洗脱、清洁/剥离、或磷灰石再生的各种缓冲液中使用。磷酸盐可由任何可溶性的磷酸盐供给，通常是溶于水的盐。例子是碱金属或碱土金属磷酸盐，而磷酸钠或磷酸钾是特别适宜的例子。碱金属磷酸盐或碱土金属的磷酸盐可以一元碱和二元碱形式或它们的组合形式使用。

[0036] 如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，约“5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。

[0037] I.引言

[0038] 在通常用于所述磷灰石固体表面组分的缓冲剂中存在离子类物质(常用离子)可抑制从磷灰石固体表面浸出该组分。因此，在磷灰石平衡(例如水合作用和柱填充)、加载、流动通过、洗脱、或清洁/剥离过程中，钙和/或磷酸盐缓冲液通常是优选的。在磷灰石表面上水合氢离子的累积可在平衡、加载、流动通过、和清洗步骤中由于各种机理发生。具体地，碱金属盐的存在可增加或促进水合氢离子的累积。足够浓度(例如100mM、200mM、300mM、400mM或更高)的高pH的磷酸盐溶液(例如pH为约6.5或更高的磷酸盐溶液)可提供缓冲能力以减弱在水合氢离子释放过程中常发生的pH偏移，因而减少磷灰石的酸溶解。碱金属盐与具有合适pH和浓度的磷酸盐缓冲液同时使用通常将质量损失减少至显著程度。不过，介质强度仍然会明显下降。累积的水合氢离子的中和可减少聚集的水合氢离子的量，从而在后续磷酸盐缓冲液清洗阶段中减少降解。

[0039] 申请人发现，可在色谱步骤中使用之前，可通过用缓冲的磷酸盐溶液处理磷灰石固体表面来进行预处理。将磷酸盐缓冲的溶液与磷灰石固体表面接触后，所述磷灰石固体表面可进一步用氢氧化物处理。本文所述的方法提供了显著且令人惊讶的预处理程度。所述显著且令人惊讶的预处理程度可用劣化的减少或消除来显示，并通过钙损失测量。

[0040] 申请人还发现，本文所述的预处理方法可与再生方法联用。预处理后，在色谱过程中使用后，可通过用缓冲的钙溶液处理显著再生所述磷灰石固体表面。在一些实施方式中，所述再生方法间歇地应用于所述磷灰石固体表面，即在第一个色谱过程后应用所述再生方法，然后在两个、三个或更多个色谱过程后应用所述再生方法。在一些实施方式中，所述再生方法在每个色谱过程后应用于所述磷灰石固体表面。通常，所述缓冲的钙溶液在目标分子被纯化和收集后应用。在一些情况中，所述缓冲的钙溶液在所述磷灰石固体表面被清洁/剥离(例如用高摩尔浓度磷酸盐缓冲液，例如400mM磷酸盐)和/或消毒之后应用。可任选地将所述缓冲的钙溶液清洗掉，随后用磷酸盐缓冲的溶液处理所述磷灰石。将磷酸盐缓冲的溶液与磷灰石固体表面接触后，可进一步用氢氧化物处理所述磷灰石固体表面。本文所述的再生方法提供了明显且令人惊讶的再生程度。这样明显且令人吃惊的再生程度可由降解的减少、消除或逆转来显示，通过磷灰石质量的变化或磷灰石强度损失来测量。

[0041] II.预处理方法

[0042] 本文所述的是用于通过用磷酸盐缓冲的溶液预处理所述磷灰石固体表面，随后用碱性氢氧化物预处理所述磷灰石固体表面来减少或防止磷灰石劣化的磷灰石预处理方法。所述磷酸盐缓冲的溶液和碱性氢氧化物在蛋白质纯化过程之前应用。

[0043] A.磷酸盐缓冲的溶液

[0044] 通过将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触来开始所述预处理方法。所述含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能防止或减少在磷灰石使用前(例如在纯化前)发生的树脂劣化的任何量。不希望受理论限制，相信含磷酸盐的缓冲液与磷灰石固体表面相互反应以在所述磷灰石固体表面上形成松散结合(例如非共价结合)的磷酸盐层。因此，磷酸盐的量、体积、浓度等，或会防止或减少在纯化过程前发生的树脂劣化的含磷酸盐的缓冲液的任何其它组分或方面，可以是允许足够形成松散结合的磷酸盐层的量。

[0045] 含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度通常选择低于在缓冲液的pH和温度下磷酸盐的溶解度极限。此外，所述浓度可基于缓冲液其它组分的存在或不存在，或任何前述缓冲液的所选组成而改变。在此概念的某些实施方式中，采用以下磷酸盐浓度将获得最佳结果：从约10mM至约1、1.5或2M；约20mM-1.5M；或约25mM-1M；或约50mM-1M；包括至少约，或约10mM、
15mM、20mM、25mM,30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、
300mM、500mM、750mM、1M或更高。在一些情况下，所述磷酸盐浓度为10mM、15mM、20mM、25mM、
30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、500mM、
750mM、1M或更高。在一些情况中，将所述柱与低浓度磷酸盐缓冲液(例如2、5、10、15、20或
25mM)接触，随后与高浓度磷酸盐缓冲液(例如30、50、75、100、250、500、750、1,000、1,500或
2,000mM)接触。

[0046] 所述含磷酸盐的缓冲液的pH和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能防止或减少在磷灰石使用前(例如在纯化前)发生的树脂劣化的任何pH。适用于采用含磷酸盐的缓冲液的磷灰石预处理的示例性的pH值包括以下任何pH值：至少为约5、至少为约5.5、至少为约6、至少为约6.5、至少为约7、至少为约7.5、至少为约8、或至少为约8.5或更高。在一些情况中，含磷酸盐的缓冲液的pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或更高。

[0047] 为了获得所述预处理所需的溶液体积可根据磷酸根离子浓度改变，但在大多数情况中，采用约1.0-10.0树脂体积的溶液会获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或约3树脂体积溶液来获得最佳结果。所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5树脂体积。在一些情况中，可使用的高磷酸盐浓度的体积小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)。

[0048] 在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱，所述含磷酸盐的缓冲液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可改变，但通常会选择能防止或减少在磷灰石使用前(例如纯化前)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速包括通常在磷灰石平衡或加载过程使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液之间的接触时间更长。当磷酸盐的浓度或含磷酸盐的缓冲液的体积较低时，可特别优选低流速。当含磷酸盐的缓冲液是粘性的时也优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时。在一些情况下，磷酸盐的松散结合层的形成是快速的，高流速可有利于减少磷灰石预处理所需的时间。在一些情况中，所述磷酸盐的松散结合层的形成应用于直径为5厘米或更小的柱。

[0049] 在一些实施方式中，以批次形式将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。在批次形式中，可通过将所述含磷酸盐的缓冲液倒在所述磷灰石固体表面上，或将所述磷灰石固体表面倒入含磷酸盐的缓冲液中来施加含磷酸盐的缓冲液。所述接触时间可改变，但通常会选择能防止或减少在磷灰石使用前(例如纯化前)发生的树脂劣化的任何时间。

[0050] 在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。在其它实施方式中，用含磷酸盐的缓冲液预处理后不再清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的磷酸根离子。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述磷酸盐缓冲的溶液接触过程中形成的任何松散结合的磷酸盐层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡的缓冲液组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约
5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。

[0051] B.氢氧化物

[0052] 氢氧根离子处理作为磷灰石固体表面预处理的最后一步应用(例如在磷酸盐缓冲的溶液之后将氢氧根离子应用到所述磷灰石固体表面)。可使用任何可溶形式的氢氧根离子，优选使用水溶性的形式。在一些情况中，碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钾是特别合适的。如同磷酸根离子的情况那样，氢氧根离子溶液的浓度和量可改变。不希望受理论限制，相信氢氧化物与所述磷灰石固体表面，或与松散结合的(例如非共价结合)钙层、磷酸盐层或钙和磷酸盐层相互反应，以将松散结合的(例如非共价结合)矿物质转换为磷灰石，从而提供预处理的表面。会防止或减少在纯化步骤前发生的树脂劣化的氢氧化物的量、体积、浓度等，可以是允许足够将松散结合的钙、磷酸盐或磷酸钙转换至磷灰石的量。因此，在一些实施方式中，所述氢氧根离子溶液不含有钙或磷酸盐。

[0053] 氢氧根离子的浓度可从约0.005或0.01M至约5M；约0.1至约4.0M，在很多情况中为约0.3至约3.0M，包括0.2M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、2.0M或2.5M。含氢氧根离子的处理溶液的合适的体积为约1.0-20.0树脂体积，在很多情况中为约1.5-10.0树脂体积，包括2、3、4、4.5、5、6、7、8或9体积。在一些情况中，可使用的高氢氧化物浓度的体积小于一个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)。

[0054] 氢氧化物处理后，所述树脂可用合适的缓冲液清洗或平衡。在一些情况中，将所述树脂平衡或清洗，随后用加载缓冲液平衡。例如，所述树脂可用10mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5平衡，以平衡用于蛋白质纯化的柱。在一些情况中，将所述树脂平衡或清洗，随后用储存缓冲液平衡。例如，可将所述树脂用0.1M NaOH、10mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5平衡，随后储存。

[0055] III.再生方法

[0056] 在一些实施方式中，每次在色谱步骤中使用后，将再生方法应用于预处理的磷灰石固体表面。在一些实施方式中，在色谱步骤之后，将所述再生方法间歇地应用到预处理的磷灰石固体表面，即在两次或更多次纯化步骤之后，将所述再生方法应用到预处理的磷灰石固体表面。在一些实施方式中，在第一次纯化步骤之后将所述再生方法应用到所述预处理的磷灰石固体表面，随后在两次或更多次纯化步骤之后将所述再生方法应用到所述预处理的磷灰石固体表面。

[0057] 使用磷灰石树脂的蛋白质纯化通常可以两种方式进行：(i)流动通过纯化；和(ii)结合和洗脱纯化。通常，对于流动通过纯化，操作人员(a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条件下向柱中加入样品，在所述条件中杂质与柱结合而目标分子流动通过并被收集；(c)用清洁/剥离溶液(例如高摩尔浓度磷酸盐溶液)清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及(d)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，用低摩尔浓度的清洗液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新平衡。

[0058] 通常，对于结合和洗脱纯化，操作人员(a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条件下向柱中加入样品，在所述条件中目标分子与柱结合；(c)洗脱所述目标分子(例如用高摩尔浓度磷酸盐溶液和/或碱性卤化物溶液)；(d)用清洁溶液(例如高摩尔浓度磷酸盐溶液)清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及(e)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，用低摩尔浓度的清洗液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新平衡。

[0059] 这些传统的磷灰石纯化方法的缺点在于差的再现性和/或过早的磷灰石劣化。在一些情况下，这样的劣化是由于在暴露于平衡、加载或色谱缓冲液的过程中在磷灰石表面水合氢离子(H3O+)的累积。水合氢离子的累积可在暴露于碱金属盐，pH等于或低于8.0的过程中发生。水合氢离子的累积也可在暴露于磷酸盐缓冲液，pH小于约6.5的过程中发生。其它缓冲组合物也可引起水合氢离子累积。当暴露于后续缓冲液，例如洗脱缓冲液(例如在结合和洗脱纯化过程中)或清洁/剥离缓冲液(例如流动通过纯化之后)时这些水合氢离子随后解吸。所述解吸导致树脂随时间劣化，导致树脂质量损失和/或树脂的颗粒强度降低。

[0060] 在一些实施方式中，将样品与用合适的缓冲液平衡的预处理的磷灰石固体表面接触(例如平衡的磷灰石固体表面)。随后收集目标分子(例如在流动通过纯化过程中，或在洗脱之后)，并通过将所述磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液接触，随后将所述磷灰石固体表面依次与磷酸盐缓冲的溶液和碱性氢氧化物接触来再生所述磷灰石。在一些情况中，所述磷灰石固体表面在进行本文所述的一个或多个再生步骤之前已多次用于目标分析物的纯化(即至少2次)。

[0061] 在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在再生前清洗或冲洗。在其它实施方式中，所述磷灰石固体表面在再生前不清洗或冲洗。在一些情况中，用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸盐或氢氧根离子。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲液组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。示例性的清洗缓冲液的pH为5.5、6或6.5。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。

[0062] 随后可再生所述磷灰石固体表面。在一些情况中，可在例如洗脱之后、流动通过之后、中和之后、清洁/剥离之后、冲洗之后或储存之后再生所述磷灰石固体表面。在一些情况中，可在清洗之后(例如在施加水缓冲液以去除流动通过、洗脱、中和、冲洗、储存或清洁/剥离缓冲液之后)再生所述磷灰石固体表面。

[0063] A.缓冲的钙溶液

[0064] 以用缓冲的钙溶液接触所述磷灰石固体表面开始所述再生。虽然，磷灰石固体表面的再生倾向于采用未缓冲的钙溶液，但是本发明人发现采用缓冲的钙溶液似乎能显著且令人惊讶地提高获得的再生程度。所述缓冲的钙溶液的钙离子浓度和通过树脂的缓冲的钙溶液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。

[0065] 不希望受理论限制，相信缓冲的钙溶液与磷灰石固体表面相互反应以在磷灰石固体表面上形成松散的结合(例如非共价结合)的钙层。在一些情况中，所述钙层替代了一些或全部(或更多)的在之前纯化步骤中的钙损失。因此，钙离子的量、体积、浓度等，或会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的缓冲的钙溶液的任何其它组分或方面，可以是允许足够形成松散结合的钙层的量。

[0066] 通常，所述钙离子浓度选择低于在缓冲的钙溶液的pH值和温度下钙离子的溶解度极限。此外，所述浓度可以基于缓冲的钙溶液中存在或不存在其它组分或其它组分(例如选择的缓冲剂)的浓度而改变，或基于任何前述缓冲液的选择组成改变。在本文概念的某些实施方式中，钙离子浓度为从约5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.5mM或11mM至约15mM、
20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、75mM、100mM或250mM时会获得最佳结果。在某些实施方式中，在所述缓冲的钙溶液中的钙离子浓度为约5-10mM、约5-25mM、约20-100mM、或从约25mM至约
50-75mM，包括5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、
6.5mM、7,mM、8mM、9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.5mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、
20mM、25mM、30mM、40mM、60mM、70mM、80mM、90mM、110mM、150mM、200mM、300mM或更高。

[0067] 为了获得恢复所需的溶液体积可根据钙离子浓度改变，但在大多数情况中，可由约1.0至约10.0树脂体积的溶液获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2树脂体积的溶液来获得最佳结果。在一些情况中，所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5树脂体积。在一些情况中，所述体积小于3柱体积。在一些情况中，可以小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)的体积使用高钙离子浓度。

[0068] 各种缓冲液都适用于用于磷灰石再生的缓冲的钙溶液。在一些实施方式中，用于在溶液中不明显形成金属络合物(例如在缓冲溶液的pH值下不形成与钙的络合物)的缓冲的钙溶液的缓冲剂可包含缓冲的钙溶液的缓冲组分。在一些实施方式中，不含有伯胺或仲胺(即R2-N，其中R不是H)的缓冲剂可包含缓冲的钙溶液的缓冲组分。在一些实施方式中，优选两性离子缓冲剂。在一些实施方式中，优选含有磺酸部分的缓冲剂(例如两性离子缓冲剂)。在一些实施方式中，优选含有磺酸和叔胺(即R3-N，其中R不是H)的缓冲剂。适用于作为缓冲的钙溶液中的缓冲剂的示例性的两性离子缓冲剂包括但不限于以下物质：MES、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、POPSO或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO、CHES、MOBS、TABS或AMPSO。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂含有伯胺、仲胺或叔胺。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂含有伯胺、仲胺或叔胺以及一个或多个羧酸酯/盐基团或羟甲基。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸或Tris。在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是二(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷)或1,3-二(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷。

[0069] 缓冲的钙溶液中的缓冲剂浓度可改变，但通常会选择的浓度至少与溶液的钙离子浓度一样高。此外，所述浓度可基于选择的缓冲剂，或任何前述缓冲液的所选组成的改变。因此，所述缓冲液浓度与钙离子浓度之比通常至少为约1，例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、
1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，也选择所述缓冲剂浓度，从而使其低于缓冲剂的溶解度极限。在一些情况中，优选的缓冲剂包括那些具有高溶解度极限的缓冲剂。

[0070] 缓冲的钙溶液的pH可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量。此外，所述pH值可基于选择的磷灰石固体表面、选择的缓冲剂、选择的一种或多种组分的浓度、或选择的任何前述缓冲液的组成改变。通常，所述pH至少为约5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、
5.6、6、6.2、6.5、7、7.5或8。在一些实施方式中，所述pH为，或至少为约5.5、6、6.5、7、7.5或
8。在一些实施方式中，所述pH为5.5、6、6.5、7、7.5或8。在一些实施方式中，所述pH为5.1、
5.2、5.3或5.4。在一些情况中，所述pH为5.3。在一些情况中，所述pH为5.5、5.6、5.7、5.8、
5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。在一些情况中，所述pH为7.0。在一些情况中，所述pH为5.6。在一些情况中，所述pH为6.2。在一些情况中，所述pH为5.4。

[0071] 在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。在这些情况下，可选择所述钙和磷酸盐的浓度以及溶液的pH以提供再生，同时避免沉淀形成，或避免过饱和溶液。例如，磷酸盐缓冲的钙溶液的pH可选择足够低(例如，pH为约，或低于约6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5)。在一些实施方式中，所述pH为5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在一些情况中，所述pH为5.3。作为另一实施例，磷酸盐缓冲的钙溶液的钙浓度可为约，或低于约50mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、7mM、6mM、
5.9mM、5.8mM、5.7mM、5.6mM、5.5mM、5.4mM、5.3mM、5.2mM、5.1mM或5mM。在一些情况下，所述磷酸盐缓冲的溶液的钙浓度为，或约为15mM、14mM、13mM、12mM、11mM、10.5mM、10.4mM、
10.3mM、10.2mM、10.1mM、10mM或9.5mM。在一些情况下，所述钙浓度为10或10.2mM。在一些情况下，所述钙浓度为10mM。作为另一实施例，磷酸盐缓冲的钙溶液的磷酸盐浓度可为约，或低于约50mM、40mM、35mM、30mM、29mM、28mM、27mM、26mM、25mM、24mM、23mM、21mM、20mM、18mM、
17mM、16mM或15mM。在一些情况下，磷酸盐缓冲的钙溶液的使用提供了具有或不具有前述或后续高摩尔浓度的(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1M)磷酸盐缓冲步骤的再生。

[0072] 在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱，所述缓冲的钙溶液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速，包括在磷灰石的平衡、加载、洗脱、清洁/剥离、消毒或冲洗过程中通常使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液之间的接触时间更长。当钙或缓冲剂的浓度较低或缓冲的钙溶液的体积较小时，可特别优选低流速。当缓冲的钙溶液或前述溶液是粘性的或所述柱被吸附的生物化合物污染时，也可优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时。在一些情况下，钙的松散结合层的形成是快速的，高流速有利于减少磷灰石再生所需的时间。

[0073] 在一些实施方式中，以批次形式将所述磷灰石固体表面与缓冲的钙溶液接触。在批次形式中，可通过将所述缓冲的钙溶液倒在所述磷灰石固体表面上，或将所述磷灰石固体表面的浆料倒入缓冲的钙溶液中来施加缓冲的钙溶液。所述接触时间可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何时间。

[0074] 在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，在独立再生处理之间用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸盐或氢氧根离子。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述缓冲的钙溶液接触过程中形成的任何松散结合的钙层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲液组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。

[0075] B.磷酸盐缓冲的溶液

[0076] 当所述磷灰石与缓冲的钙溶液接触后，可将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。或者，在所述磷灰石与缓冲的钙溶液接触之前，可将含磷酸盐的缓冲液与磷灰石接触。在一些情况中，在缓冲的钙溶液和含磷酸盐的缓冲液之间可施加插入的清洗步骤。所述含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何量，并且可以是允许足够形成松散结合的磷酸盐层的量。

[0077] 含磷酸盐的缓冲液的磷酸盐浓度通常选择低于在缓冲液的pH和温度下磷酸盐的溶解度极限。此外，所述浓度可基于缓冲液其它组分的存在或不存在，或任何前述缓冲液的所选组成而改变。在此概念的某些实施方式中，采用以下磷酸盐浓度将获得最佳结果：从约10mM至约1、1.5或2M；约20mM至约1.5M；或约25mM至约1M；或约50mM至约1M；包括至少约，或约10mM、15mM、20mM、25mM,30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、
200mM、300mM、500mM、750mM、1M或更高。在一些情况下，所述磷酸盐浓度为10mM、15mM、20mM、
25mM、30mM、40mM、50mM、60ppm、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、150mM、200mM、300mM、500mM、
750mM、1M或更高。在一些情况中，所述磷酸盐浓度从或从约0.1或2M至或至约0.4M、0.5M、或
1M。在一些情况中，将所述柱与低浓度磷酸盐缓冲液(例如2、5、10、15、20或25mM)接触，随后与高浓度磷酸盐缓冲液(例如30、50、75、100、250、500、750、1000、1500或2000mM)接触。在一些情况中，在高浓度磷酸盐缓冲液之前使用低浓度磷酸盐缓冲液可避免缓冲的钙溶液和高浓度磷酸盐缓冲液之间潜在的不相容性(例如沉淀)。

[0078] 所述含磷酸盐的缓冲液的pH值和通过树脂的含磷酸盐的缓冲液的量可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在使用磷灰石的过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何pH值。适用于用含磷酸盐的缓冲液进行磷灰石再生的示例性的pH值包括以下任何pH值：至少为约5、至少为约5.5、至少为约6、至少为约6.5、至少为约7、至少为约7.5、至少为约8、或至少为约8.5或更高。在一些情况中，含磷酸盐的缓冲液的pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或更高。

[0079] 为了获得所述恢复所需溶液的体积可根据磷酸根离子浓度改变，但在大多数情况中，采用约1.0至约10.0树脂体积的溶液会获得最佳结果，在很多情况中，可用约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2树脂体积来获得最佳结果。所述体积可达约6树脂体积，包括2、3、4或5树脂体积。在一些情况中，可以小于1个树脂体积(例如小于约0.9、
0.7、0.5体积)的体积使用高磷酸盐浓度。

[0080] 在一些实施方式中，所述磷灰石固体表面在柱中，例如色谱柱，所述含磷酸盐的缓冲液可以一定流速施加到所述磷灰石固体表面上。所述流速可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何速率。合适的流速，包括在磷灰石的平衡、加载、洗脱、清洁/剥离、消毒或冲洗过程中通常使用的速率。示例性的流速为400厘米/小时。在一些情况中，所述流速基本低于400厘米/小时(例如，300、200、100或50厘米/小时或更低)。低流速的使用可允许磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液之间的接触时间更长。当磷酸盐的浓度较低或含磷酸盐的缓冲液的体积较小时，可特别优选低流速。当含磷酸盐的缓冲液或前述溶液是粘性的或所述柱被吸附的生物化合物污染时，也可优选低流速。或者，所述流速可高于400厘米/小时。在一些情况下，磷酸盐的松散结合层的形成是快速的，高流速有利于减少磷灰石再生所需的时间。

[0081] 在一些实施方式中，以批次形式将所述磷灰石固体表面与含磷酸盐的缓冲液接触。在批次形式中，可通过将所述含磷酸盐的缓冲液倒在所述磷灰石固体表面上，或将所述磷灰石固体表面的浆料倒入含磷酸盐的缓冲液中来施加含磷酸盐的缓冲液。所述接触时间可变化，但通常会选择能减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中(例如在纯化过程中，在洗脱过程中，或在清洁/剥离过程中)发生的树脂劣化的任何时间。

[0082] 在一些实施方式中，随后清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。在其它实施方式中，用含磷酸盐的缓冲液再生处理后不再清洗或冲洗所述磷灰石固体表面。本领域技术人员可容易地选择合适的清洗缓冲液。在一些情况中，用清洗溶液处理所述树脂以去除任何过量的钙、磷酸盐或氢氧根离子。通常，所述清洗缓冲液可以具有基本不浸出磷灰石表面组分、不释放累积的水合氢离子或不形成不希望的沉淀的pH值、组成和浓度。例如，所述清洗缓冲液可以是与前述和后续缓冲液相容的，从而当混合时不产生沉淀。如另一个实施例，可选择所述清洗缓冲液，从而不浸出在将所述磷灰石固体表面与所述缓冲的钙溶液接触过程中形成的任何松散结合的钙层。合适的清洗缓冲液可包括通常用于磷灰石的平衡、加载、或流动通过的缓冲组合物。在一些情况中，用低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液(例如磷酸盐的浓度小于约100mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM)清洗所述磷灰石固体表面。清洗缓冲液的pH可至少为约5，至少为约5.5，至少为约6，或至少为约6.5、7或8。在一些情况中，进行水清洗，并且水的量可广泛变化。典型的水清洗至少为约0.2树脂体积，在大多数情况下水清洗为约0.2-
1.5树脂体积，或为约0.2-2树脂体积。

[0083] 可通过在含磷酸盐的缓冲液处理之前的缓冲的钙溶液处理，或通过在缓冲的钙溶液处理之前的含磷酸盐的缓冲液处理来获得一定程度的树脂再生。在一些实施方式中，可通过首先施加缓冲的钙溶液处理，随后施加含磷酸盐的缓冲液处理来实现较大程度的再生。在一些实施方式中，可通过在进行一个或多个步骤的含磷酸盐的缓冲液处理之后或之前进行一个或多个步骤的缓冲的钙溶液处理来实现优选的再生程度。在一些情况中，在一个或多个多步骤的缓冲的钙溶液处理或含磷酸盐的缓冲液处理之前或之后进行清洗。

[0084] 在一些实施方式中，所述缓冲的钙溶液处理和/或含磷酸盐的缓冲液处理在目标分析物的洗脱或流动通过后进行。例如，磷灰石表面可用目标分析物平衡、接触，所述目标分析物可在流动通过过程中洗脱或收集，随后可进行再生方案。如本文所述，示例性的再生方案可包括但不限于将缓冲的钙溶液与所述磷灰石固体表面接触，随后将磷酸盐缓冲液与所述磷灰石固体表面接触的那些。示例性的再生方案还可包括但不限于将磷酸盐再生缓冲液与所述磷灰石固体表面接触，随后将缓冲的钙再生溶液与所述磷灰石固体表面接触的那些。当所述磷灰石与缓冲的钙和磷酸盐再生溶液接触后，可施加碱性氢氧化物处理。

[0085] C.氢氧化物

[0086] 将氢氧根离子处理作为所述磷灰石固体表面再生的最后处理步骤施加。可使用任何可溶形式的氢氧根离子，优选使用水溶性的形式。在一些情况中，碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钾是特别合适的。如同钙离子和磷酸根离子的情况那样，氢氧根离子溶液的浓度和量可改变。会减少、消除或逆转在磷灰石使用过程中发生的树脂劣化的氢氧化物的量、体积、浓度等，可以是允许足够将松散结合的钙、磷酸盐或磷酸钙转换至磷灰石的量。所述氢氧根离子也可清洁残留蛋白质和污染物的树脂，并还可作为消毒或储存溶液。

[0087] 氢氧根离子的浓度可从约0.005或0.01M至约5M；约0.1至约4.0M，在很多情况中为约0.3至约3.0M，包括0.2M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、2.0M或2.5M。含氢氧根离子的处理溶液的合适的体积为约1.0至约20.0树脂体积，在很多情况中为约1.5至约10.0树脂体积，包括2、3、4、4.5、5、6、7、8或9体积。在一些情况中，可以小于1个树脂体积(例如小于约0.9、0.7、0.5体积)的体积使用高氢氧化物浓度。

[0088] 氢氧化物处理后，所述树脂可用合适的缓冲液清洗或平衡。在一些情况中，将所述树脂平衡或清洗，随后用加载缓冲液平衡。例如，所述树脂可用10mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5平衡，以平衡用于蛋白质纯化的柱。在一些情况中，将所述树脂平衡或清洗，随后用储存缓冲液平衡。例如，可将所述树脂用0.1M NaOH、10mM磷酸盐缓冲液平衡，随后储存。实施例

[0089] 仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。

[0090] 实施例1

[0091] 本实施例说明了在纯化步骤中第一次使用前，羟基磷灰石树脂的劣化(即钙浸出)。

[0092] 进行4个实验以测定四种接触溶液的钙浸出程度：(1)0.4M NaPO4，pH 8.8，(2)1M NaCl，(3)PBS，pH 7.4(12mM磷酸盐，0.15M NaCl，pH 7.4)，以及(4)0.4M NaPO4，pH 6.6。用长20厘米，内径3.2厘米，内部体积为159mL的柱进行所述实验。将100g陶瓷I型羟基磷灰石粉末干燥装入每个柱中，随后通过将240mL接触溶液泵入到所述柱进口中并在流出物刚离开所述柱之前停止泵入来进行水合作用。将所述柱出口与传导性和pH流动监视器连接，随后与组分收集器连接。以140厘米/小时的速度洗脱所述柱，同时收集6×0.25柱体积部分的流出物(240mL)。水合物的量(160mL)和收集的接触溶液(即400mL的总溶液体积或2.5柱体积)相当于在过程柱(process column)的水合填充的准备中的陶瓷羟基磷灰石/接触溶液混合物的推荐的溶液的量。下述表I列出了留出部分的pH、各部分的钙浓度、以及在用于过程色谱柱填充的具体浆料混合物中预计的钙浸出。用比色测定法(生物试验系统公司(BioAssay Systems)试剂盒DICA-500或BV公司(Biovision)试剂盒K380-250)测定所述钙浓度。

[0093] 表I

[0094] 钙流出物分析和浆料混合物中钙含量的估计

[0095]

[0096]

[0097] 表I中的数据显示，PBS，pH 7.4和1M NaCl接触溶液浸出大量钙，而含有0.4M磷酸盐的接触溶液在pH为6.6或8.8时都没有浸出大量钙。所述结果确认，磷酸盐接触溶液最小化了钙浸出，同时水合羟基磷灰石粉末。

[0098] 实施例2

[0099] 本实施例显示了在预处理方案后结合间歇或连续的原位再生(ISR)方案的结果。将所述磷灰石树脂暴露于模拟在蛋白质分离中遇到的条件的一系列循环中，但不加载和洗脱蛋白质。

[0100] 在下述实验之前，对在以下八个实验中使用的所有柱进行预处理方案(即将所有柱干燥填充，随后用0.4M磷酸钠缓冲液，pH 8.8平衡，随后用0.5M或1M氢氧化钠平衡)。在下述表II至IX中列举了所述八个实验的说明和条件。每个实验进行一系列连续循环，每个循环包括的步骤在每张表中说明。表II-VI所述的每个实验采用30个循环。表VII所述的实验采用10个循环。表VIII和IX所述的实验分别采用24个循环和5个循环。

[0101] 表II-III和V-VII所述的每个实验都在长30厘米、内径为1.6厘米、内部体积为60.32mL的柱中进行。填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重38克，得到的通过所述柱的移动相流速为180厘米/小时。表IV、VIII和IX所述的实验在长20厘米、内径为1.6厘米、内部体积为40.21mL的柱中进行，移动相流速为350厘米/小时。填充物是40微米的陶瓷I型羟基磷灰石颗粒，重25.33克。移动相在每个柱的顶部进入。

[0102] 表II-IV模拟了没有柱恢复的对照纯化方案。表III对照方案的步骤3中，将多糖加载到所述柱上。表IV中的对照方案模拟了具有窄的磷酸盐梯度的酸性蛋白质洗脱(参见步骤6)。

[0103] 在表IV、VIII和IX中，稀释MES是指MES浓度至少为约10mM、15mM或20mM MES，并少于约25mM或30mM MES。稀释Tris是指Tris浓度至少为约2mM、3mM、4mM、5mM、10mM或15mM Tris，并且少于约20mM或25mM Tris。

[0104] 表II

[0105] 采用30个循环的对照处理方案

[0106]

[0107]

[0108] 表III

[0109] 采用30个循环并模拟糖加载的对照处理方案

[0110]

[0111] 表IV

[0112] 采用30个循环并模拟酸性蛋白洗脱的对照处理方案

[0113]

[0114] 表V和VI是在缓冲的钙步骤(即每个方案的步骤6)中使用低浓度缓冲液和氯化钙的恢复方案。

[0115] 表V

[0116] 柱恢复方案

[0117]

[0118] 表VI

[0119] 柱恢复方案

[0120]

[0121]

[0122] 表VII是在树脂预处理后并在应用表II中所述的对照处理方案后应用的间歇恢复方案。所述间歇恢复方案包括一个恢复方案(即表VII中的步骤R1-R7)以及之后的两个对照方案(即表VII中的步骤C1-C4)。将表VII中所列的步骤重复10次，得到总共10个恢复方案和20个对照方案。

[0123] 表VII

[0124] 间歇柱恢复方案

[0125]

[0126]

[0127] 与表V-VII中的恢复方案相比，表VIII和IX是包括高的缓冲液浓度和缓冲的钙溶液中的氯化钙(参见步骤9)的柱恢复方案(即50mM CaCl2/100mM MES/pH 7.0对比5mM CaCl2/20mM ACES或MES/pH 7.8)。与表IX中的方案相比，表VIII中的方案使用更少的柱体积以及更强的缓冲的钙溶液的更多次循环(即表VIII中1.1柱体积/24次循环的方案对比表IX中3.0柱体积/5次循环的方案)。

[0128] 表VIII

[0129] 柱恢复方案

[0130]

[0131]

[0132] 表IX

[0133] 柱恢复方案

[0134]

[0135]

[0136] 在第一次循环之前和最后一次循环之后测量表II-IX中所述的每个方案的颗粒质量和颗粒强度。使用单轴约束体积压缩测定颗粒强度。表X列举了表II-IX中所述的方案的结果。

[0137] 表X

[0138] 结果

[0139]

[0140] 表X中实验1-3(即表II-IV)中每个对照方案的数据都显示少量质量损失和显著的颗粒强度减小，这说明树脂的降解。相对于对照方案，从使用含有低浓度氯化钙和缓冲液的连续恢复方案(即实验4和5；表V和VI)操作的柱中得到的羟基磷灰石显示出令人惊讶的显著的质量和强度增加，这说明树脂的再生。这些结果证明，即使在恢复方案中采用低浓度的氯化钙和缓冲液时，缓冲的钙溶液仍然提供了显著且令人惊讶的再生程度。

[0141] 相对于对照方案，从使用间歇式恢复方案(即实验6；表VII)操作的柱中得到的羟基磷灰石在质量和强度上具有小的增长，这说明间歇式恢复方案没有降解树脂。因此，令人惊讶的是，羟基磷灰石不需要在每次纯化步骤后恢复，这可导致工艺时间和成本的节约。

[0142] 与对照方案相比，使用恢复方案(即实验7；表VIII)运行24个循环和1.1柱体积的柱中得到的羟基磷灰石显示在质量和颗粒强度上增加，所述恢复方案在缓冲的钙溶液中具有较高氯化钙和缓冲剂浓度。这些结果证明，即使在恢复方案中采用高浓度的氯化钙和缓冲液时，缓冲的钙溶液的使用仍然提供了显著且令人惊讶的再生程度。

[0143] 与对照方案相比，使用恢复方案(即实验8；表IX)运行5个循环和3柱体积的柱中得到的羟基磷灰石显示质量和颗粒强度上的少量增加，所述恢复方案在缓冲的钙溶液中具有较高氯化钙和缓冲剂浓度。这些结果令人惊讶地说明，当所述缓冲的钙溶液包含高浓度氯化钙和缓冲液时，对于缓冲的钙溶液可使用较少的循环次数和更多的柱体积。

[0144] 本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

标题	发布/更新时间	阅读量
磷灰石钛铁矿选矿工艺-专利编号CN110090730A	2020-05-13	108
磷灰石原位恢复-专利编号CN105517718A	2020-05-11	402
磷灰石结晶-专利编号CN104220649A	2020-05-11	158
磷灰石原位恢复-专利编号CN105517718B	2020-05-12	685
磷灰石预处理-专利编号CN105392569B	2020-05-11	360
磷灰石原位恢复-专利编号CN105407917A	2020-05-12	1029
磷灰石预处理-专利编号CN105392569A	2020-05-12	259
磷灰石结晶-专利编号CN104220649B	2020-05-11	337
一种多孔羟基磷灰石-专利编号CN107837419A	2020-05-13	989
磷灰石钛铁矿选钛工艺-专利编号CN109954576A	2020-05-13	469

磷灰石预处理

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