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纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料的方法

阅读：1036发布：2020-10-11

IPRDB可以提供纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了纤维增强水凝胶复合材料。复合材料包括水凝胶和含有多个纤维的纤维组分。多个纤维的每个的长度小于约1,000μm。也提供了制备纤维增强水凝胶复合材料的方法。方法包括将水凝胶前驱体溶液涂布在基底上以形成水凝胶前驱体膜，将多个纤维沉积在水凝胶前驱体膜上，并允许水凝胶前驱体膜形成水凝胶膜，从而形成纤维增强水凝胶复合材料。还提供了含有纤维增强复合材料的支架以及使用纤维增强复合材料的组织修复方法。，下面是纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.纤维增强水凝胶复合材料，包括：

水凝胶；和

包括多个纤维的纤维组分，其中所述多个纤维的每个的长度小于约1,000μm。

2.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述多个纤维的每个的长度为约100μm至约

1,000μm。

3.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述多个纤维由电纺纤维组成。

4.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述复合材料由基于复合材料的总重量小于约10wt％的所述纤维组分组成。

5.根据权利要求4所述的复合材料，其中所述复合材料由基于复合材料的总重量约

1wt％至约6wt％的所述纤维组分组成。

6.根据权利要求1所述的复合材料，包括多个所述水凝胶的层和/或多个所述纤维组分的层。

7.根据权利要求6所述的复合材料，其中所述复合材料由交替的所述水凝胶层和所述纤维组分层组成。

8.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述多个纤维选自由包括蛋白质、碳水化合物、羟基羧酸或其组合的纤维或由蛋白质、碳水化合物、羟基羧酸或其组合组成的纤维组成的组。

9.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述纤维包括以下或由以下组成：白蛋白、胶原、弹性蛋白、藻酸盐、聚交酯、聚酰胺、聚(硅氧烷)、聚(硅酮)、聚(乙烯)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(乙酸乙烯酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚(碳酸酯)、聚(环氧乙烷)、聚苯胺、聚(乙烯苯酚)、多羟基酸、聚(己酸内酯)、多羟基链烷酸酯、聚氨酯、壳聚糖、淀粉、透明质酸、其共混物或其共聚物。

10.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述纤维由血清白蛋白组成。

11.根据权利要求10所述的复合材料，其中所述纤维由牛血清白蛋白组成。

12.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述水凝胶包括一种或多种合成的或天然的亲水聚合物，或者所述水凝胶由一种或多种合成的或天然的亲水聚合物组成。

13.根据权利要求12所述的复合材料，其中所述水凝胶包括一种或多种选自由多糖、蛋白质、聚乙二醇、聚乳酸、聚己酸内酯、聚乙醇酸交酯及其组合组成的组中的材料。

14.根据权利要求13所述的复合材料，其中所述水凝胶包括一种或多种选自由葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、明胶、葡聚糖二醛-交联的明胶、胶原、胺化透明质酸、透明质酸-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)、壳聚糖-透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、藻酸盐、纤维粘连蛋白、聚乙二醇纤维蛋白原及其衍生物组成的组中的化合物。

15.根据权利要求10或14所述的复合材料，其中所述水凝胶包括葡聚糖二醛-交联的明胶或由葡聚糖二醛-交联的明胶组成。

16.根据权利要求1所述的复合材料，其中所述水凝胶的材料和所述纤维的材料是不同的。

17.制备纤维增强水凝胶复合材料的方法，所述纤维增强水凝胶复合材料包括：水凝胶；和

包括多个纤维的纤维组分，其中所述多个纤维的每个的长度小于约1,000μm，所述方法包括：将水凝胶前驱体溶液涂布在基底上以形成水凝胶前驱体膜；

将所述多个纤维沉积在所述水凝胶前驱体膜上；和

使所述水凝胶前驱体膜形成水凝胶膜，从而形成所述纤维增强水凝胶复合材料。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个纤维通过电纺含有由所述纤维构成的材料的纺丝溶液形成。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述纺丝溶液在不存在水的情况下进行制备。

20.支架，包括权利要求1所述的纤维增强水凝胶复合材料。

21.组织修复方法，包括使所述组织与根据权利要求20所述的支架接触。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触包括将所述支架植入需要其的对象中。

说明书全文

纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料

的方法

[0001] 交叉引用相关申请

[0002] 本申请要求于2012年5月15日提交的美国临时申请号61/647,166的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文用于所有目的。

技术领域

[0003] 本发明涉及水凝胶，更具体地，涉及纤维增强水凝胶复合材料以及形成纤维增强水凝胶复合材料的方法。

背景技术

[0004] 水凝胶主要由合成的或天然的亲水聚合物组成。由于其类似于细胞外基质(ECM)的3D结构，水凝胶已被用作组织代用品、空间填充支架(scaffold)和细胞载体。为了获得最大的益处，水凝胶组合物必须符合考虑中的每种生物医学应用的机械的(例如模量)、物理的(例如质量传递)和生物学的(例如细胞基质相互作用)需求。尤其，可注射性水凝胶作为生物材料对于许多生物医疗应用是有吸引力的。

[0005] 水凝胶的强度很大程度上依赖于其交联密度，其本质上可以是物理的(可逆的)或化学的(永久性的)。物理网络可存在于水凝胶如胶原、壳聚糖和胺化透明质酸(HA)-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)中，而化学网络可见于壳聚糖-HA、聚乙二醇-纤维蛋白原和藻酸盐水凝胶中。然而，这样的系统通常是弱的各向同性材料并且不能承载大的负载，如由活组织呈现的那样，并且还在植入后具有差的稳定性和生存。

[0006] 纤维增强可用于加强水凝胶并获得具有各向同性机械行为特征的复合材料结构。已经报道了水凝胶/电纺纤维复合材料对细胞生长和分化的支持性影响。然而，在主体材料内并入纤维及其合适的分散体仍提出了技术挑战，尤其是在其中要求注射能力并且必须避免针的阻塞的可注射性水凝胶的情况中。

[0007] 鉴于上述，仍存在对解决至少一个上述问题的水凝胶组合物以及形成水凝胶组合物的方法的需求。

发明内容

[0008] 在第一方面，本发明涉及纤维增强水凝胶复合材料，包括：水凝胶；以及包括多个纤维的纤维组分，其中多个纤维的每个的长度小于约1,000μm。

[0009] 在第二方面，本发明涉及制备根据第一方面的纤维增强水凝胶复合材料的方法，所述方法包括：将水凝胶前驱体溶液涂布在基底上以形成水凝胶前驱体膜；将多个纤维沉积在水凝胶前驱体膜上；和允许水凝胶前驱体膜形成水凝胶膜，从而形成纤维增强水凝胶复合材料。

[0010] 在第三方面，本发明涉及支架，包括根据第一方面的纤维增强水凝胶复合材料。

[0011] 在第四方面，本发明涉及组织修复方法，所述方法包括使组织与根据第三方面的支架接触。

附图说明

[0012] 当结合非限制性实例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好理解本发明，其中：

[0013] 图1显示了测试的根据实施方式的具有(i)明胶、(ii)葡聚糖、(iii)白蛋白和(iv)细胞的混杂生物材料的示意图。插图显示改性葡聚糖的醛基和明胶的氨基之间的共价键。

[0014] 图2是显示明胶、葡聚糖二醛和交联的明胶-葡聚糖的傅里叶变换红外(FTIR)图谱的图示。

[0015] 图3显示根据各个实施方式的电纺短纤维的(a)光学；(b)和(c)扫描电子显微镜(SEM)图像。参考(b)，箭头指向纤丝结构。(c)描绘了具有尖端和双尾的断裂的纤维。(c)中的插图显示纤维横截面的概况。(c)中的放大倍数为10,000×(Ultra Plus)。(a)、(b)和(c)中的标尺条分别指示100μm、10μm和2μm的长度。

[0016] 图4是显示在(i)对照、(ii)L-复合材料、(iii)M-复合材料和(iv)H-复合材料-1的测试水凝胶上进行的时间扫描实验的结果的图。相角δ＝tan (G"/G')，对时间作图。
测试的水凝胶通过以1:1的比率混合10wt％聚合物前驱体溶液制备。L、M和H分别指示约-1
1.4％、约2.9％和约6％的标称纤维重量含量。频率为1s ，应变为3％。插图显示预凝胶溶液(左图)和凝胶(右图)的光学图像。

[0017] 图5是显示在(i)G'对照、(ii)G"对照、(iii)G'M-复合材料和(iv)G"M-复合材料的测试水凝胶上进行的时间扫描实验的结果的图。储能模量G'(实心符号)和损耗模-1量G"(空心符号)对时间作图。M指示约2.9％的标称纤维重量含量。频率为1s ，应变为
3％。

[0018] 图6是显示在(i)G'对照(符号：实心方形)、(ii)G"对照(符号：空心方形)、(iii)G'M-复合材料(符号：实心三角形)和(iv)G"M-复合材料(符号：空心三角形)的水凝胶的应变扫描实验的结果的图。储能模量G'(实心符号)和损耗模量G"(空心符号)-1对应变幅度作图。M指示约2.9％的标称纤维重量含量。频率为1s 。

[0019] 图7是显示明胶/葡聚糖水凝胶(方形)和混杂的明胶-白蛋白纤维/葡聚糖复合材料(三角形)的预凝胶溶液的剪切速率扫描(流动)实验的图。每个点表示20秒的平均测量值；稳态的等待时间为1分钟。

[0020] 图8描述了细胞在水凝胶/纤维复合材料上的粘附。成纤维细胞(星状物)在(a)葡聚糖二醛(DDA)-明胶水凝胶；或(b)纤维含量为约3.9％的复合材料中生长两天。箭头指示牛血清白蛋白(BSA)纤维。放大倍数为100×。

[0021] 图9描绘细胞在水凝胶/纤维复合材料上的存活率(viability)。存活率测定法在成纤维细胞上进行，成纤维细胞在(a)DDA-明胶水凝胶；或(b)纤维含量为约3.9％的复合材料上生长两天。活细胞和死细胞分别被染成绿色和红色。(a)和(b)中的标尺条指示750μm的长度。

具体实施方式

[0022] 通过将短长度纤维——其中每个纤维的长度小于约1,000μm——嵌入水凝胶中，所得复合材料的性能可以由于水凝胶被纤维结构增强而得到改进。在各个实施方式中，例如，复合材料中的水凝胶组分的弹性模量增加约40％，水凝胶的胶凝时间减少约20％。这可有助于增强纤维的短长度，这有利于纤维在水凝胶内的分散以及所得复合材料的注射能力。另一方面，水凝胶保持其性能作为可调基质用于各种应用。例如，预凝胶溶液以中等剪切速率通过医疗针的注射性能不受复合材料中短长度纤维的存在影响。在进行的实验中的接种的成纤维细胞的存活率已经证实使用根据本发明各个实施方式的纤维增强水凝胶复合材料形成的支架的生物相容性。该纤维增强水凝胶复合材料代表一类这样的生物材料：其在结构上模拟普通组织的细胞外基质(ECM)，并且可通过微创法进行递送。

[0023] 因此，在第一方面，本发明涉及纤维增强水凝胶复合材料。如本文所用的术语“复合材料”是指包括纤维组分和水凝胶组分的构造物。复合材料中的组分可物理地混合在一起以形成复合材料。术语“物理地混合”意指水凝胶组分和纤维组分仅分散在彼此之中，而没有化学反应以形成新的材料。

[0024] 纤维组分包括多个纤维。如本文所用的术语“纤维”是指这样的一类材料，其可以是天然的或合成的，为离散的细长的条块。其可用作复合材料的组分，或缠结成片。通过交联、胶粘、织造、编织、结合、连结、模塑等，其可进一步被用在复合材料的制造中。

[0025] 纤维可通过传统的技术如电纺、界面聚合等进行生产。通过例如改变施加至针的电压或通过改变注射器中熔体或溶液的组合物，电纺提供对所得电纺纤维的长度的控制。因此，在各个实施方式中，多个纤维由电纺纤维组成，其中纤维通过电纺生产。

[0026] 在电纺时，通过施加电荷到液体上以从液体吸引(draw)微米纤维或纳米纤维来形成纤维。方法可包括使用带有分配针的喷丝头、注射泵、电源和接地的收集装置。形成纤维的材料可作为熔体或纺丝溶液存在于注射器中，并通过注射泵被驱动至针尖，在此其形成液滴。当电压被施加至针时，液滴被拉伸成带电液体射流。射流被连续伸长直至其沉积在收集器上作为微米或纳米大小维度的细纤维的垫。

[0027] 在这点上，本发明的发明人已经惊讶地发现，使用不含水的溶液，例如非水性溶液，或基本上不含水的溶液，作为纺丝溶液，得到每个纤维具有小于约1,000μm的长度的短长度纤维。术语“基本上不含”，意指该溶液包含少于1wt％的水，如少于0.5wt％，少于0.3wt％，或少于0.1wt％的水。如上所述，所生产的短长度纤维可容易地被分散到水凝胶中以形成纤维增强水凝胶复合材料。在这样做时，短长度纤维增强了水凝胶的结构以得到改进的水凝胶的物理性能，如增加的弹性模量和减少的胶凝时间，同时保持水凝胶的注射能力。

[0028] 在各个实施方式中，复合材料由基于复合材料的总重量小于约10wt％的纤维组分组成。例如，基于复合材料的总重量，复合材料可由约1wt％至约6wt％的纤维组分组成，如约1wt％至约5wt％、约1wt％至约4wt％、约1wt％至约3wt％、约2wt％至约6wt％、约2wt％至约5wt％、约2wt％至约4wt％、约3wt％至约6wt％、约3wt％至约5wt％、或约1wt％、约2wt％、约3wt％、约4wt％、约5wt％、或约6wt％。

[0029] 多个纤维可选自由包括蛋白质、碳水化合物、羟基羧酸或其组合或由蛋白质、碳水化合物、羟基羧酸或其组合组成的纤维组成的组。在这样的实施方式中，纤维可包括以下或由以下组成：白蛋白、胶原、弹性蛋白、藻酸盐、聚交酯、聚酰胺、聚(硅氧烷)、聚(硅酮)、聚(乙烯)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(乙酸乙烯酯)、聚丙烯酰胺、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚(碳酸酯)、聚(环氧乙烷)、聚苯胺、聚(乙烯苯酚)、多羟基酸、聚(己酸内酯)、多羟基链烷酸酯、聚氨酯、壳聚糖、淀粉、透明质酸、其共混物或其共聚物。

[0030] 在各个实施方式中，纤维由血清白蛋白组成。例如，纤维可由牛血清白蛋白组成。

[0031] 根据第一方面的纤维增强水凝胶复合材料包括纤维组分，纤维组分包括多个纤维，其中所述多个纤维的每个的长度小于约1,000μm。这种(短)长度范围的纤维有利于纤维在水凝胶内的分散，同时保持所得复合材料的注射能力。

[0032] 在各个实施方式中，多个纤维的每个的长度为约100μm至约1,000μm，如约100μm至约800μm，约100μm至约500μm，约100μm至约300μm，约300μm至约1,000μm，约500μm至约1,000μm，约800μm至约1,000μm，约300μm至约800μm，约
300μm至约500μm，或约500μm至约800μm。

[0033] 纵横比，在本文被定义为每个纤维的长度与宽度的比，典型地为约100:1。多个纤维的每个的宽度一般为小于约5μm，如约2μm至约5μm，约1μm至约3μm，约2μm至约3μm，约0.5μm至约3μm，约1μm，约2μm，约3μm，约4μm，或约5μm。在各个实施方式中，多个纤维的每个的宽度为约2μm。

[0034] 除了纤维组分之外，纤维增强水凝胶复合材料还包括水凝胶。如本文所用的术语“水凝胶”指宽类别的聚合物材料，其可为天然的或合成的，对水性介质具有亲和力，并且能够吸收大量的水性介质，但其通常不溶解在水性介质中。

[0035] 如本文所用的术语“水性介质”指水或主要基于水的溶液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或包含溶解在其中的盐的水。术语“水性介质”也可以指细胞培养基。术语“细胞培养基”也可被称为“生长培养基”，指能够进行细胞增殖的任何液体介质。生长培养基在本领域中是已知的，并且可根据待生长的细胞的类型选择。例如，适合用于生长哺乳动物细胞的生长培养基为Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)，其可用热灭活胎牛血清和胚胎干细胞来源的条件培养基进行补充。

[0036] 水凝胶的特征是对于交换细胞增殖所需的营养具有高渗透性。水凝胶的物理性能类似于原生(native)组织，并且水凝胶可用于封装在凝胶时形成的水凝胶基质中的细胞。在各个实施方式中，使用可被注入关注的对象中的可注射性水凝胶。

[0037] 一般地，水凝胶可通过以下形成：使用至少一种，或一种或多种类型的水凝胶前驱体，并在水溶液中设置或凝固所述一种或多种类型的水凝胶前驱体，以形成三维网络，其中三维网络的形成可使得一种或多种类型的水凝胶前驱体胶凝。

[0038] 术语“水凝胶前驱体”指可用于形成水凝胶的任何化学化合物。水凝胶前驱体的实例包括但不限于天然聚合物、亲水单体、亲水聚合物、由单体和聚合物形成的亲水共聚物。

[0039] 在各个实施方式中，水凝胶前驱体包括天然聚合物或由天然聚合物组成。天然聚合物可在水性介质中形成三维网络以形成水凝胶。“天然聚合物”是指在自然界中可见的聚合物材料。天然聚合物的实例包括但不限于多糖、葡糖胺多糖、蛋白质、肽和多肽。

[0040] 多糖为可水解为两个或多个单糖分子的碳水化合物。其可包含重复碳水化合物骨架，即，糖单元。多糖的实例包括但不限于藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、淀粉和结冷胶(gellan gum)。

[0041] 葡糖胺多糖为含有氨基糖作为组分的多糖。葡糖胺多糖的实例包括但不限于透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、硫酸葡聚糖、硫酸肝素、肝素、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺和葡糖糖胺。

[0042] 肽一般指氨基酸二聚体(二肽)、直至约25至50个氨基酸的低聚物(低聚肽)和长度为约2至100个氨基酸的短聚合物。多肽一般指多于100个氨基酸单体的单链氨基酸聚合物。蛋白质一般指可以非共价地或共价地(经二硫桥)彼此连接的一个或多个多肽链的3D结构。蛋白质具有不同的生物学功能并且可以被分成五个主要类别，即，结构蛋白如胶原，催化蛋白如酶，转运蛋白如血红蛋白，调节蛋白如激素，以及保护性蛋白如抗体和凝血酶。蛋白质的其它实例包括但不限于明胶、纤维粘连蛋白、血纤维蛋白、果胶、白蛋白、卵清蛋白和聚氨基酸。

[0043] 在一些实施方式中，水凝胶前驱体包括亲水单体或由亲水单体组成。如本文所用，亲水单体是指当与水性介质如水接触时聚合产生能够形成水凝胶的亲水聚合物的任何单体。在一些实施方式中，亲水单体可包含聚合物主链中的官能团或作为侧链。如本文所用的术语“官能团”是指具有形成键的能力的化学部分。官能团的实例包括但不限于羟基(-OH)、羧基(-COOH)、酰胺基(-CONH-)、巯基(-SH)或磺酸基(-SO3H)。

[0044] 亲水单体的实例包括但不限于含羟基的单体如甲基丙烯酸2-羟基乙酯、丙烯酸2-羟基乙酯、2-羟基乙基甲基丙烯酰胺、2-羟基乙基丙烯酰胺、N-2-羟基乙基乙烯基氨基甲酸酯、2-羟基乙基乙烯基碳酸酯、甲基丙烯酸2-羟基丙酯、甲基丙烯酸羟基己酯和甲基丙烯酸羟基辛酯；含羧基的单体如丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、富马酸、巴豆酸、马来酸及其盐；不饱和聚羧酸的含游离羧基的酯，如单甲基马来酸酯、单乙基马来酸酯、单甲基富马酸酯、单乙基富马酸酯及其盐；含酰胺的单体如(甲基)丙烯酰胺、巴豆酰胺、肉桂酰胺、马来二酰胺和富马酸二酰胺；含巯基的单体如甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、丁硫醇、叔丁基硫醇和戊硫醇；含磺酸的单体如对苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、对-a-甲基苯乙烯磺酸、异戊二烯磺酸(sulfonide)及其盐。

[0045] 在一些实施方式中，水凝胶前驱体包括亲水聚合物或由亲水聚合物组成。亲水聚合物可为由上述亲水单体的任何一种构成的聚合物，并且其可由任何反应形成，例如但不限于，自由基聚合、缩合聚合、阴离子或阳离子聚合或逐步增长聚合。例如，亲水单体如乙二醇可经历阴离子或阳离子聚合，这取决于所用的催化剂的类型，以形成为亲水聚合物的聚(乙二醇)。亲水聚合物也可通过已有聚合物的化学改性获得。例如，可在聚合物链上添加或改变官能团以使所得聚合物被制成亲水性的。

[0046] 在一些实施方式中，水凝胶前驱体包括亲水共聚物或由亲水共聚物组成。亲水共聚物可由亲水聚合物和可以是亲水的、疏水的或两亲的单体形成。在一些实施方式中，亲水共聚物可由亲水单体和可以是亲水的、疏水的或两亲的聚合物形成。例如，疏水单体可与亲水聚合物上存在的官能团反应以形成亲水共聚物。

[0047] 一种或多种类型的水凝胶前驱体可在水性介质中设置或凝固以形成三维网络，其中三维网络的形成可使一种或多种类型的水凝胶前驱体胶凝。例如，水凝胶可通过水性介质中一种或多种类型的水凝胶前驱体的物理结合如自组装或化学键合如交联形成。

[0048] 在一些实施方式中，水凝胶可通过水性介质中一种或多种类型的水凝胶前驱体的自组装形成。术语“自组装”是指通过依赖组分彼此的吸引力而不在组分之间形成化学键来自发组织组分的更高级结构的过程。例如，经由在聚合物链上诱导的疏水力、氢键合、范德华力相互作用、静电力或聚合物链缠结的任何一种，聚合物链可彼此相互作用，使得聚合物链可在水性介质中聚集或凝结，这可形成三维网络，从而捕获水分子以形成水凝胶。

[0049] 在一些实施方式中，水凝胶可通过水性介质中一种或多种类型的水凝胶前驱体的化学键合形成。例如，当水凝胶前驱体为亲水聚合物时，可以使用合适的交联剂使聚合物链交联以形成三维网络，这可捕获水分子以形成水凝胶。

[0050] 如本文所用的术语“交联”是指经由化学键合例如但不限于共价键合、离子键合或亲和力相互作用(例如，配体/受体相互作用、抗体/抗原相互作用等)在聚合物链之间的相互连接。可通过反应例如自由基聚合、缩合聚合、阴离子或阳离子聚合或逐步增长聚合的任一种进行化学交联。

[0051] 术语“交联剂”是指诱导交联的试剂。交联剂可以是能够诱导邻近的聚合物链之间的化学键合的任何试剂。例如，交联剂可以是化学化合物。可用作交联剂的化学化合物的实例包括但不限于葡聚糖二醛、l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、乙烯胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、3-氨基丙基甲基丙烯酰胺、乙二胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、甲基丙烯酸甲酯、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双甲基丙烯酰胺、二烯丙基酒石酸二酰胺(diallyltartardiamide)、(甲基)丙烯酸烯丙酯、低级亚烷基二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚低级亚烷基二醇二(甲基)丙烯酸酯、二(甲基)丙烯酸低级亚烷基酯、二乙烯醚、二乙烯砜、二乙烯苯或三乙烯苯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、四(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、双酚A二(甲基)丙烯酸酯、亚甲基二(甲基)丙烯酰胺、三烯丙基邻苯二甲酸酯、二烯丙基邻苯二甲酸酯、转谷氨酰胺酶、或其混合物。

[0052] 在各个实施方式中，交联剂包括葡聚糖二醛或由葡聚糖二醛组成。例如，当添加葡聚糖二醛至水凝胶前驱体如明胶时，在葡聚糖二醛的醛基和明胶的氨基之间形成如图1的插图中所示的共价键，从而使明胶交联以经化学键合形成葡聚糖二醛-交联的明胶水凝胶。

[0053] 在一些实施方式中，水凝胶前驱体本身可被用作交联剂，并且不需要添加或使用单独的交联剂。

[0054] 在一些实施方式中，交联剂可为电磁波的形式。因此，可使用电磁波如γ或紫外辐射进行交联，其可使聚合物链交联并形成三维基质，从而捕获水分子以形成水凝胶。因此，交联剂的选择取决于存在的聚合物链和官能团的类型，并且因此本领域技术人员能够选择合适类型的交联剂。

[0055] 通过交联剂诱导的交联可用于改变用于本发明的复合材料的水凝胶的降解时间。可使用本领域已知的技术测量水凝胶的最终降解速率。最常见地，通过测量水凝胶随时间的干重量损失来确定水凝胶的降解速率。

[0056] 在各个实施方式中，水凝胶包括一种或多种合成的或天然的亲水聚合物或由一种或多种合成的或天然的亲水聚合物组成。例如，水凝胶可包括以下或由以下组成：一种或多种选自由多糖、蛋白质、聚乙二醇、聚乳酸、聚己酸内酯、聚乙醇酸交酯及其组合组成的组的材料。在一些实施方式中，水凝胶包括以下或由以下组成：一种或多种选自由葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、明胶、葡聚糖二醛-交联的明胶、胶原、胺化透明质酸、透明质酸-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)、壳聚糖-透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、藻酸盐、纤维粘连蛋白、聚乙二醇-纤维蛋白原及其衍生物组成的组的化合物。

[0057] 水凝胶和多个纤维之一或两者可包括可生物降解聚合物或由可生物降解聚合物组成。术语“可生物降解”是指当暴露于自然中常见的环境条件下可被微生物分解或在相对短的时间内(2-15个月内)被自发地分解的物质。例如，明胶可被存在于体内的酶降解。

[0058] 可生物降解聚合物的实例包括但不限于乙交酯、丙交酯的聚合物和低聚物，聚乳酸，包括乳酸和乙醇酸的a-羟基酸的聚酯，如聚(a-羟基)酸，包括聚乙醇酸、聚-DL-乳酸、聚-L-乳酸，以及DL-交酯和乙交酯的三元聚合物；e-己内酯和与聚酯共聚的e-己内酯；聚内酯和聚己酸内酯，包括聚(e-己内酯)、聚(8-戊内酯)和聚(γ-丁内酯)；聚酐类；聚原酸酯；其它羟基酸；聚二烷酮；以及无毒性或作为代谢物存在体内的其它可生物降解的聚合物。聚氨基酸的实例包括但不限于聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、和苯乙烯-马来酸酐共聚物。聚乙二醇的衍生物的实例包括但不限于聚(乙二醇)-二-(乙基磷脂酰(乙二醇))(PEDGA)、聚(乙二醇)-共-酐、聚(乙二醇)-共-交酯、聚(乙二醇)-共-乙交酯和聚(乙二醇)-共-原酸酯。丙烯酰胺聚合物的实例包括但不限于聚异丙基丙烯酰胺和聚丙烯酰胺。丙烯酸酯聚合物的实例包括但不限于二丙烯酸酯如聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、丙烯酸酯低聚物(oligoacrylate)、甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯低聚物(oligomethoacrylate)和PEG-羟乙酰基丙烯酸酯低聚物(oligoglycolylacrylate)。羧基烷基纤维素的实例包括但不限于羧甲基纤维素和部分氧化的纤维素。

[0059] 可随范围从几秒钟到几天或几个月的时间段发生纤维增强水凝胶复合材料的降解。纤维增强水凝胶复合材料降解所需时间段可取决于几个参数，例如，纤维增强水凝胶复合材料的组成，如所用的水凝胶和/或纤维的类型和水凝胶的水含量，交联度，温度，pH，存在的水性介质的量，以及在胶凝期间的压力。在生理学条件下，这意思是在动物体内，降解一般在约2个月内发生。该时段可通过改变交联度而延长，如上所述。

[0060] 在各个实施方式中，水凝胶包括葡聚糖二醛-交联的明胶或由葡聚糖二醛-交联的明胶组成，其中明胶被用作水凝胶前驱体，葡聚糖二醛被用作交联剂。如本文所用的术语“明胶”是指从胶原衍生的蛋白质物质。在本发明的上下文中，“明胶”也指等同物质如合成的明胶类似物。一般而言，明胶可被分类为碱性明胶、酸性明胶或酶催化明胶。可用碱如氯化钠处理胶原获得碱性明胶。可用酸如盐酸处理胶原获得酸性明胶。可用酶如水解酶处理胶原获得酶催化明胶。当明胶可为水凝胶的形式时，如本文所述的影响水凝胶的降解行为的因素也可适用于明胶。

[0061] 在一些实施方式中，水凝胶的材料和纤维的材料是相同的。在这样的实施方式中，选择水凝胶的材料和纤维的材料以便各个材料的物理性能是不同的。例如，水凝胶材料和包括在纤维组分中的纤维材料可具有不同的弹性和韧性。

[0062] 在可选的实施方式中，水凝胶的材料和纤维的材料是不同的。例如，在一个具体的实施方式中，复合材料包括葡聚糖二醛-交联的明胶的水凝胶和牛血清白蛋白的纤维，或由葡聚糖二醛-交联的明胶的水凝胶和牛血清白蛋白的纤维组成。

[0063] 在各个实施方式中，复合材料包括多个水凝胶层和/或多个纤维组分层。换言之，复合材料可包括多个水凝胶层和纤维组分层，或反之亦然。就层的厚度和层的含量而言，多个水凝胶层和/或多个纤维组分层的每个可以是相同的或不同的。例如，复合材料可包括多于一个水凝胶层或多于一个纤维组分层，或多于一个水凝胶和纤维组分的每个的层。在这样的实施方式中，复合材料可由交替的水凝胶层和纤维组分层组成。

[0064] 在可选的实施方式中，包括多个纤维的纤维组分至少基本均匀地或均匀地分散在水凝胶中。如前所述，复合材料可包括多个水凝胶层和/或多个纤维组分层。为了将多个纤维至少基本上均匀地分散在水凝胶中，而不是形成复合材料作为多个水凝胶层和/或多个纤维组分层，复合材料可通过首先形成水凝胶前驱体膜随后沉积多个纤维在水凝胶前驱体膜上而形成。包含多个纤维沉积在其上的水凝胶前驱体膜可经历热处理以熔化水凝胶前驱体膜，以形成含有多个纤维分散在其中的水凝胶前驱体溶液。为了形成水凝胶，可将交联剂添加至水凝胶前驱体溶液，以使水凝胶前驱体交联以形成水凝胶。

[0065] 在其中通过电纺形成多个纤维的实施方式中，纤维增强水凝胶复合材料内部纤维的浓度可通过控制纤维收集的持续时间进行控制，例如从电纺方法，或通过控制水凝胶层的厚度。

[0066] 在第二方面,本发明涉及制备根据第一方面的纤维增强水凝胶复合材料的方法。方法包括将水凝胶前驱体溶液涂布在基底上以形成水凝胶前驱体膜；将多个纤维沉积在水凝胶前驱体膜上；和允许水凝胶前驱体膜形成水凝胶膜，从而形成纤维增强水凝胶复合材料。

[0067] 在各个实施方式中，通过电纺含有由纤维构成的材料的纺丝溶液形成多个纤维。如上所述，本发明的发明人已经惊讶地发现，使用不含水的溶液，例如非水性溶液，或基本上不含水的溶液，作为纺丝溶液，得到每个纤维具有小于约1,000μm的长度的短长度纤维，并且其可被用于形成根据第一方面的复合材料。因此，在各个实施方式中，在不存在水的情况下制备纺丝溶液。

[0068] 第二方面的方法包括将水凝胶前驱体溶液涂布在基底上以形成水凝胶前驱体膜。根据所用的水凝胶前驱体溶液的类型，可使用任何合适的涂布或沉积方法如旋涂、涂抹或浇铸。

[0069] 第二方面的方法包括将多个纤维沉积在水凝胶前驱体膜上，并允许水凝胶前驱体膜形成水凝胶膜，从而形成纤维增强水凝胶复合材料。上述涂布或沉积步骤可以以任何合适的顺序发生，和/或根据需要的水凝胶膜和/或纤维组分的层数重复进行。在各个实施方式中，在多个纤维上沉积第二水凝胶前驱体膜，使得多个纤维夹在两个水凝胶前驱体膜之间。

[0070] 第二方面的方法可进一步包括热处理以熔化具有多个纤维沉积在其上的水凝胶前驱体膜以形成水凝胶前驱体溶液。可在任何将水凝胶前驱体膜熔化成其液体形式的合适的温度下进行热处理。例如，在其中水凝胶前驱体包括明胶或由明胶组成并且多个纤维包括牛血清白蛋白或由牛血清白蛋白组成的各个实施方式中，合适的温度可为约50℃。在这样做时，沉积在水凝胶前驱体膜上的纤维可至少基本均匀地分散在水凝胶前驱体内。为了利于水凝胶前驱体的熔化，具有多个纤维沉积在其上的水凝胶前驱体膜在热处理之前可被切片、切割或切丁成较小尺寸。可使用能够熔化水凝胶前驱体的任何合适的温度。

[0071] 第二方面的方法可进一步包括使具有多个纤维分散在其中的水凝胶前驱体溶液与交联剂接触以形成水凝胶。在各个实施方式中，进行水凝胶前驱体的胶凝以使多个纤维嵌入如此形成的水凝胶内。可在任何合适的温度下进行接触，这可取决于所用的水凝胶前驱体溶液和交联剂的类型。例如，可在室温和压力下进行交联。例如，在明胶被用作水凝胶前驱体和葡聚糖二醛被用作交联剂的实施方式中，可在约37℃的温度下进行交联以形成纤维增强水凝胶复合材料。

[0072] 在第三方面，本发明涉及支架，包括根据第一方面的纤维增强水凝胶复合材料。如本文所用，术语“支架”是指可在体内作为框架使用的人造三维结构，另外的细胞可附着至该框架，并且现有的和另外的细胞可在框架生长以再生可能由于损伤或疾病而被损失掉的组织。在各个实施方式中，支架可通过将复合材料倒入或注射入具有期望解剖学形状的模具并且然后硬化以形成用于植入患者内的支架来形成。在一些实施方式中，复合材料适于被递送至动物或人体内的位点如有缺陷的位点，以便复合材料可被直接注入患者内的位点中以形成体内支架。支架可被用作细胞载体或用于在体内放置用于再生柔软而承载负荷的组织(例如但不限于，心肌，软骨和皮肤)。

[0073] 在第四方面，本发明涉及组织修复方法，包括使组织与根据第三方面的支架接触。

[0074] 术语“组织”是指通过相关细胞连接在一起形成的结构，其中细胞一起工作以完成特异性功能。在各个实施方式中，接触组织包括将支架植入需要其的对象内。如本文所用的术语“对象”是指任何活的动物，优选哺乳动物，更优选人。如本文所述的支架适于植入需要其的对象内。在各个实施方式中，支架可包括包含细胞生长介质的胚胎干细胞来源的条件培养基，其典型地提供必要的营养和环境条件用于细胞生长。通过将支架引入患者内并允许原生细胞如干细胞迁移进入支架，细胞可在适于细胞生长的条件下被引入和温育。通过将带有胚胎干细胞来源的条件培养基的复合材料注入需要细胞生长或重塑的区域如受损组织或缺陷位点的区域，可管理支架。

[0075] 之后，本发明将参考附图更充分地描述本发明，在附图中显示了本发明的示例性实施方式。然而，本发明可以以多种不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文阐述的示例性实施方式。而是，提供这些实施方式以便本公开是彻底的和完全的，并且将充分向本领域技术人员传达本发明的范围。在附图中，为了清楚起见，层和区域的长度和尺寸可被放大。

[0076] 如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关的列举项目的任何和所有组合。本文使用的术语仅为了描述具体实施方式，并且不是意图限制本发明。如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”意图也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。与给定数值相关的“约”，例如对于温度和时间段，其意思是包括指定值的10％以内的数值。

[0077] 本文说明性地描述的本发明可适当地在缺少本文没有具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被宽泛地且没有限制地理解。“包括”意指包括但不限于单词“包括”之后所跟随的事物。因此，使用术语“包括”是指所列举的要素是被要求的或强制性的，但其它要素是任选的并且可以存在或不存在。“由……组成”意思是包括但是限于短语“由……组成”中所列举的事物。因此，短语“由……组成”是指所列举的要素是被要求的或强制性的，并且不可存在其它要素。另外，本文使用的术语和表述已被用作描述的术语并且没有限制，不意图在使用这些术语和表述时排除任何所示和所述特征或其部分的等同物，但应认识到，各种改进可存在于要求保护的本发明的范围内。因此，应当理解，尽管本发明已经具体公开为优选的实施方式和任选的特征，本领域技术人员可采用本文公开的其中体现的本发明的改进和变化，并且这些改进和变化被认为是在本发明的范围内。

[0078] 本文已经宽泛地和一般性0地描述了本发明。落入全部公开内的每个更窄的种类和亚类组也形成本发明的一部分。这包括带有从种类排除任何物质的条件或消极限制的本发明的一般描述，无论被切除的材料是否在本文具体描述。

[0079] 其它实施方式在权利要求书和非限制性实施例的范围内。此外，当就马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明也因此就马库什组的任何单个成员或成员的亚组被描述。

[0080] 实施例部分

[0081] 以下显示的示例性实施方式涉及混杂材料，其含有嵌有电纺牛血清白蛋白纤维的葡聚糖二醛-交联的明胶的水凝胶。在该实施方式中，所用的每个纤维的长度范围从约100μm至约1000μm。并入约1％至约6％重量分数的纤维增加水凝胶弹性模量约40％，并且减少胶凝时间约20％。

[0082] 也提供了混杂支架，包括水凝胶和短电纺纤维。葡聚糖二醛-交联的明胶被用作水凝胶组分，具有长度在约100μm至约1000μm范围内的血清白蛋白来源的电纺纤维被嵌入其中。图1显示了测试的根据实施方式的具有(i)明胶、(ii)葡聚糖、(iii)白蛋白和(iv)细胞的混杂生物材料的示意图。插图显示改性葡聚糖的醛基和明胶的氨基之间的共价键。纤维提供了结构增强，而水凝胶被预期提供可调基质。所得支架可在含有蛋白质纤维如胶原和弹性蛋白的多糖-和蛋白多糖-型分子网络(水凝胶)和微米-/亚微米-网络二者的水平下模拟普通组织ECM。

[0083] 实施例1：材料

[0084] 明胶(类型A，来自猪皮)，葡聚糖(70kDa，来自明串珠菌属菌种(Leuconostoc spp.))，过碘酸钠(ACS试剂，纯度大于99.8％)，四硼酸钠十水合物(Borax)和2,2,2-三氟乙醇(TFE，Reagent Plus(R))购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。牛血清白蛋白(BSA,Fraction V)购自MP Biomedicals(Solon,OH,USA)。2-巯基乙醇(ME,分子生物学级)购自Merck(Darmstadt,Germany)。所有化合物没有经过进一步改性被使用。

[0085] 实施例2：制备复合材料水凝胶

[0086] 实施例2.1：明胶溶液

[0087] 将明胶在50℃下溶解于水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以形成不同浓度的溶液(w/w)。溶液在4℃下储存，并在每个实验前被加热至50℃。

[0088] 实施例2.2：合成葡聚糖二醛(PDA)

[0089] 将葡聚糖溶于蒸馏水中以形成10wt％的溶液，其包含68mmol的葡萄糖。然后将三当量溶于蒸馏水中的过碘酸钠以逐滴方式添加。在暗室中室温下进行氧化反应24h。然后将淡红色溶液倒入乙醇中，以沉淀所得的葡聚糖二醛(DDA)。然后将淡黄色沉淀物在乙醇中并且最终在乙醇-蒸馏水溶液(约9:1(v/v)比率)中冲洗数次，以除去碘酸盐和未反应的盐。所得材料在真空下干燥24h，并使用研钵和研杵磨成细粉末。

[0090] 然后将DDA溶于为水基或PBS基的Borax溶液中，以形成不同DDA(w/w)浓度和Borax摩尔浓度的溶液。溶液在4℃下储存，并在每个实验前被平衡至37℃。

[0091] 实施例2.3：制作电纺纤维

[0092] 将BSA溶于TFE中以形成10wt％BSA溶液。然后添加ME(0.2g ME每1gBSA)以还原蛋白质中的二硫键。在室温下使用包括注射泵(Harvard Apparatus,Holliston,MA,USA)、23-规格针(内径约0.37mm)和定制高压DC电源(30kV最大)的垂直设置进行电纺。在
11kV的电压供给下溶液流速为2ml/小时，尖部到收集器的距离为15cm。

[0093] 实施例2.4：白蛋白纤维在明胶中的分散体

[0094] 将明胶前驱体溶液在室温下在载玻片上展开以形成膜。收集BSA电纺纤维并将其保持在膜上，然后将另外的明胶层浇铸在其上。重复该过程以形成在四个明胶层之间包封的三个纤维层。分层的凝胶在4℃下被储存一个小时，然后被切成小方形，其然后在50℃下熔化以形成溶液。明胶溶液内部的纤维的浓度通过纤维收集的持续时间和明胶层的厚度进行控制。通过明胶/纤维溶液和等体积的明胶之间的重量的差值评估纤维标称浓度。随后当明胶与DDA前驱体溶液混合时该浓度下降。

[0095] 制备三个分散体以承载低含量(L)、中含量(M)和高含量(H)，其中L-和M-分散体分别包含约2.80％和约5.86％的标称纤维浓度。H-分散体基本上被浓缩以评估其含量并且估计含有约12％的标称纤维浓度。

[0096] 实施例2.5：水凝胶制备

[0097] 明胶或明胶/BSA纤维溶液与DDA溶液以1:1或2:1的体积比混合。将所得溶液置于37℃以允许在复合材料水凝胶内交联(在席夫碱反应之后)。

[0098] 实施例3：显微表征

[0099] 将电纺纤维收集在碳带覆盖的金属桩(carbon tape-covered metal stub)上并使用Phenom台式机(5kV加速电压,FEI Company,Hillsboro,OR,USA)和Ultra Plus(Gemini柱,1kV加速电压,Zeiss,Oberkochen,Germany)扫描电子显微镜以及光学显微镜(Olympus BX-51,Tokyo,Japan)进行分析。

[0100] 实施例4：红外光谱测量

[0101] 通过将聚合物溶液倒入特氟龙模具中并允许其在55℃下干燥三天来制备明胶、DDA和明胶-葡聚糖的薄膜。使用装备有氘化三甘氨酸硫酸酯(DTGS)Br检测器的FTIR光谱仪(Nicolet 380,Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)进行傅里叶变换红外(FTIR)测量。从32次扫描的平均值构建每个光谱。

[0102] 实施例5：剪切流变测定法

[0103] 使用带有不锈钢椎板几何体(cone-and-plate geometry)的应变控制的旋转流变仪(ARES,Rheometric Scientific)在25℃进行电纺溶液的流变学剪切测量。进行应变扫描测试以确定扫频测试的线性粘弹性规律，并且进行步进率(瞬态)测试以确定速率扫描(流量曲线)测试的稳态条件。

[0104] 使用包括Peltier温度控制器的带有不锈钢平行板几何体(20mm)的应变控制的旋转流变仪(AR-G2,TA Instruments,New Castle,DE,USA)进行前驱体溶液和水凝胶的流变学剪切测量。所有测试在37℃下进行。使用在流变仪提供的溶剂捕集器防止水的蒸发。测试各个前驱体溶液、明胶-DDA混合比以及最终Borax的浓度。前驱体明胶溶液在50℃下储存，与DDA溶液混合并立即注射(约350μl)到流变仪的底板上。上板设置在950μm的-1
距离处。在溶液以1s 的频率和3％的应变幅度进行混合的2min内进行时间扫描测试，以-1
便评估胶凝点。在时间扫描测试结束时，在1s 下进行应变扫描测试，以确定水凝胶的线性粘弹性规律。使用流变仪操作软件的稳态平均工具在预凝胶溶液上进行流量曲线测试。

[0105] 实施例6：生物相容性测试

[0106] 正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)(Lonza,Basel,Switzerland)在补充有10％胎牛血清(FBS)(Hyclone,Cramlington,UK)、1％青霉素/链霉素抗生素(Biological Industries,Beit-Haemek,Israel)、1 ％非必需氨基酸溶液 (NEAA)(Biological Industries)和0.2％ME(Sigma-Aldrich)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco,Paisley,UK)中培养。使用0.22μm注射器过滤器进行DDA前驱体溶液的灭菌，而对明胶前驱体溶液UV-处理20min。将细胞悬浮在DDA中并且然后与明胶混合以形成0.5ml
6
水凝胶样品。最终接种密度为1×10个细胞/ml。然后将嵌入细胞的水凝胶在37℃温育
1小时以允许在添加介质之前进行化学交联。在一周的培养期间将培养介质替换三次。在培养期间使用Eclipse TS100倒置显微镜(Nikon Instruments,Melville,NY,USA)提取图像。存活率测定法根据标准方案使用钙黄绿素AM(细胞质标记)和乙锭同型二聚体-1(核酸染色)(Sigma-Aldrich)进行。整个构建体内的细胞的图像使用超级变焦宏观共焦显微镜(LeicaTCS LSI,Wetzlar,Germany)提取。

[0107] 实施例7：明胶-葡聚糖水凝胶的化学结构

[0108] 收集明胶、DDA和DDA-交联的明胶(明胶-葡聚糖)的FTIR光谱并显示在图2-1 -1中。明胶光谱特征为在约1535cm 和1640cm 的两个强峰，分别归因于连接氨基酸单体的-1
仲酰胺中的C-N和C＝O伸缩振动。DDA光谱特征为在约1000cm 的强峰，归因于在葡萄糖单体的醚键处的C-O伸缩振动。这三个峰也是甚至在简单的共混之后明胶-葡聚糖光谱中的主要峰，如所预料的。

[0109] 胺(明胶中)之间和醛(改性的葡聚糖中)之间的席夫碱反应得到含有碳-氮双-1 -1键的亚胺基。C＝N伸缩振动典型的特征为在1620cm 至1650cm 的中等峰，该峰可能被-1 -1
沿着明胶链的仲酰胺的振动峰所掩盖。此外，在明胶光谱中1238cm 和1446cm 处的两个中等大小的峰在明胶-葡聚糖的分析中没有探测到。前者归因于伯胺中的C-N伸缩振动，后者归因于伯酰胺中N-H弯曲振动。这些基团可见于氨基酸如赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的侧链中，并且是席夫碱连接的潜在位点。这些峰的消失为明胶-葡聚糖的网络的交联本质提供了证据。

[0110] 实施例8：短电纺纤维的形态学

[0111] 一般而言，稳定的电纺过程产生长的均匀的纤维，而由于电纺射流的不足的拉伸粘度产生的不稳定的过程导致形成滴结构或珠串结构。Regev等研究了BSA溶液的流变性能和得到的初生结构，即，滴、珠串片段或长的均匀纤维之间的关系(O.Regev等,Polymer2010,51,2611)。

[0112] 图3显示根据各个实施方式的电纺短纤维的(a)光学；(b)和(c)扫描电子显微镜(SEM)图像。参考(b)，箭头指向纤丝结构。(c)描绘了具有尖端和双尾的断裂的纤维。(c)中的插图显示纤维横截面的概况。(c)中的放大倍数为10,000×(Ultra Plus)。

[0113] 当前研究中的纺丝溶液，产生100μm至1000μm的长纤维，如图3(a)中所示，不同于产生长纤维的那些，因为其不包括水。其主体(bulk)剪切粘度1.43Pa.s高于产生长纤维的纺丝溶液的主体剪切粘度(0.35Pa.s，参见Regev等)，这指示在本溶液中被蛋白质链占据的体积较大。该观察与已知的TFE对溶液中蛋白质构象的作用一致。即，在高TFE浓度下，分子以开放的螺旋结构稳定，其中有利的二级结构为α-螺旋，三级结构趋于为未折叠的状态。因此，预期本蛋白质溶液在纺丝过程期间更稳定，因为其沿着电纺射流的拉伸粘度高。然而，其电纺产生短的均匀纤维的独特结构。如图3(b)和(c)中所示的初生纤维的高倍放大图像披露了棒状形状，可能起因于在电纺期间发生的纤维塌陷(径向屈曲)、相应而生的捕获的溶剂和高挥发性TFE的快速蒸发。该纤维的特征可为其可延展的尖端或具有厚边缘的更普遍存在的双尾，这有利于高度伸长，如图3(c)中所示。认为这些双尾由于纤维的不均匀的横切而形成(参见图3(c)中的插图)。

[0114] 根据获得的结果，假定电纺溶液中的水分子可用作增塑剂以减少内聚的分子间相互作用，并产生更可延展的溶液，从而允许纺丝线拉伸而没有射流断裂。由此断定，在本发明电纺溶液中缺少水产生更脆的材料，这也可影响经拉伸的干射流中的不稳定情况的发生。

[0115] 实施例9：水凝胶/电纺纤维复合材料的机械特性

[0116] 先前已经在各种生产条件下——包括在胶凝期间的温度范围、pH、葡聚糖的氧化水平、聚合物的分子量和明胶/葡聚糖的重量比——研究了明胶-葡聚糖水凝胶的机械性能。

[0117] 明胶的水溶液在溶胶-凝胶转变温度(约40℃)以下形成物理凝胶。在本发明实验中，将预热的前驱体溶液混合并且然后立即注射到流变仪板上，因此确保在明胶链之间形成最少的物理交联。因此，得到的凝胶通过化学交联被“锁”在明胶和葡聚糖链之间，物理交联的贡献是最少的。这确保在处理和环境变化期间稳定的凝胶性能。

[0118] 预凝胶溶液的原位胶凝允许确定胶凝点，并确保水凝胶良好地附着至板，当进行涉及大应变幅度的测试时这是必要的。

[0119] 在振荡剪切实验中，评估储能模量G'和损耗模量G"。

[0120] G"/G'的反正切，相角δ，描述了材料作为粘稠状液体(溶液)或弹性固体(凝胶)。相角越低，材料弹性性能(G')相对于粘性性能(G")越高。材料接近类似凝胶相(参见图4中的插图)。G'曲线和G"曲线交叉处的时间，δ＝45°，通常被认为是胶凝点。以下数据涉及测试的没有纤维的水凝胶(对照)和具有三种纤维浓度的水凝胶，即，低含量(L)、中含量(M)和高含量(H)复合材料，分别含有约1.4％、约2.9％和约6％的标称纤维重量浓度。

[0121] 图4是显示在(i)对照、(ii)L-复合材料、(iii)M-复合材料和(iv)H-复合材料的测试水凝胶上进行的时间扫描实验的结果的图。相角δ＝tan-1(G"/G')，对时间作图。测试的水凝胶通过以1:1的比率混合10wt％聚合物前驱体溶液来制备。L、M和H分别指示-1
约1.4％、约2.9％和约6％的标称纤维重量含量。频率为1s ，应变为3％。插图显示预凝胶溶液(左图)和凝胶(右图)的光学图像。

[0122] 图5是显示在(i)G'对照、(ii)G"对照、(iii)G'M-复合材料和(iv)G"M-复合材料的测试水凝胶上进行的时间扫描实验的结果的图。储能模量G'(实心符号)和损耗模-1量G"(空心符号)对时间作图。M指示约2.9％的标称纤维重量含量。频率为1s ，应变为
3％。

[0123] 由10wt％的明胶在水中的溶液(具有或不具有BSA纤维)以1:1与10wt％DDA和0.01M Borax在水中的溶液混合制备的水凝胶的时间扫描实验，证实了随着纤维浓度增加，以更快的速率发生胶凝(参见图4)，并且产生的复合材料具有更高的弹性模量(纤维增强)(参见图5)。对照样品在20min内发生胶凝并在90min后达到100Pa的G'，而三种复合材料在16min至17.5min内发生胶凝并达到135Pa至140Pa的G'。这些发现表明，白蛋白纤维的胺基与改性葡聚糖链的醛基形成了席夫碱连接(参见图1)。有趣的是，由10wt％的明胶溶液以2:1与10wt％DDA和0.02M Borax溶液混合制备的水凝胶表现出不同的趋势。这些混杂物的储能模量高于对照样品的储能模量，但胶凝时间类似，甚至混杂物更长(数据未示出)。在胶凝的头几分钟期间，这些混杂物的相角比对照品的小，但然后在凝胶形成时段期间变得更大，并且最终达到类似的值。这些不同显示在所得水凝胶中聚合物和Borax的浓度及其相对比率如何影响在纤维存在时的胶凝过程以及如何影响增强的程度。

[0124] 为了进一步探测白蛋白-葡聚糖相互作用，在已经在DDA Borax溶液中浸渍1小-1时的干燥短BSA纤维垫上进行FTIR测量。在PBS中清洗1小时之后，在约1000cm 处(在葡聚糖骨架中的醚键)可观察到强峰(数据未示出)。在PBS中进一步清洗24h之后，该峰-1
与蛋白质在约1640cm 处的典型峰一起明显减弱。这些发现暗示短纤维垫在溶液中的不稳定性，没有确认在BSA和DDA链之间形成了共价键，但确实表明在聚合物之间的强粘附力，这可能具有非共价性质。

[0125] 进行应变扫描实验以评定水凝胶在大变形下的耐久性。图6是显示在(i)G'对照(符号：实心方形)、(ii)G"对照(符号：空心方形)、(iii)G'M-复合材料(符号：实心三角形)和(iv)G"M-复合材料(符号：空心三角形)的水凝胶的应变扫描实验的结果的图。储能模量G'(实心符号)和损耗模量G"(空心符号)对应变幅度作图。M指示约2.9％的-1
标称纤维重量含量。频率为1s 。

[0126] 所有测试的水凝胶特征为宽的线性区域，其中模量恒定直至100％的应变幅度。在该点之后，它们随着模量增加而发生变化(react)，表明非线性的粘弹性，直至在约1000％的幅度下失效。重要的是，注意在生物学环境中，用水和盐使水凝胶溶胀，结果，预期弹性模量略低于实验测量的数值。

[0127] 在溶胶-凝胶转变发生之前，所有测试的水凝胶/纤维复合材料容易注射通过21、25和30规格的皮下注射器针(数据未示出)。为了评估预凝胶溶液在注射的头几秒期间的流动性能，在稳态流动实验中分析不含Borax的明胶/葡聚糖溶液(在PBS中的12wt％的明胶以2:1与在PBS中的10wt％DDA混合)。

[0128] 图7是显示明胶/葡聚糖水凝胶(方形)和混杂的明胶-白蛋白纤维/葡聚糖复合材料(三角形)的预凝胶溶液的剪切速率扫描(流动)实验的图。每个点表示20秒的平均测量值；稳态的等待时间为1分钟。

[0129] 如从图7中可见，以上溶液没有交联，从而允许在无限制的时间期间进行流变测试。添加短BSA纤维不影响预凝胶溶液的牛顿行为，并且仅诱导其剪切粘度的较小增加。

[0130] 实施例10：可注射性水凝胶/纤维复合材料的体外分析

[0131] 在水凝胶中进行成纤维细胞生长的体外研究，该水凝胶由12wt％的明胶在PBS中的溶液(具有或不具有BSA纤维)以2:1与10％DDA和0.03M Borax在PBS中的溶液混合来制备，遵循先前研究的混合比率。将成纤维细胞在水凝胶上培养两天或四天，粘附并在水凝胶中生长，这明显归因于识别序列例如Arg-Gly-Asp(RGD)——胶原分子的特性。图8描述了细胞在水凝胶/纤维复合材料上的粘附。成纤维细胞(星状物)在(a)DDA-明胶水凝胶；或(b)纤维含量为约3.9％的复合材料中生长两天。箭头指示BSA纤维。放大倍数为100×。

[0132] BSA纤维是无毒性的，如在水凝胶和混杂系统中的类似的细胞存活率所显示的。图9描绘细胞在水凝胶/纤维复合材料上的存活率。存活率测定法在成纤维细胞上进行，成纤维细胞在(a)DDA-明胶水凝胶；或(b)纤维含量为约3.9％的复合材料上生长两天。活细胞和死细胞分别被染成绿色和红色。(a)和(b)中的标尺条指示750μm的长度。图9中的图像是穿过支架不同高度提取的连续图像的3D构造(Z-堆叠)，其中每个横截面图像被确认含有活细胞(数据未示出)。注意到在共焦图像中有少量死细胞(红色)。嵌入细胞的复合材料在体外稳定至少一周。

[0133] 来自特定来源的成纤维细胞中的少数细胞类型具有白蛋白结合蛋白(ABP)如gp30和gp18。这些蛋白质用作清道夫受体，其结合变性的血清白蛋白并刺激其降解。因此，预期仅特定细胞类型将与BSA纤维表面相互作用。然而，该相互作用将仅在含有比在此呈现的更高纤维浓度的复合材料、或者可选地，具有表达更高浓度的ABP的细胞类型如内皮细胞的复合材料中可注意到。

[0134] 先前已经证实，细胞前进通过软的水凝胶或诱导其构建直至其被水凝胶/纤维复合材料内部较硬的组分进行信号传导。Ghosh等(Ghosh等,Biomaterials 2007,28,671)显示成纤维细胞在软的纤维粘连蛋白(FN)水凝胶上迁移得更快，但优先在较硬的HA/FN混杂水凝胶上增殖。在本研究中，浸渍的蛋白质纤维相对软，湿纤维网络模量为约0.35MPa(未公布的数据)。单个纤维的局部刚度预期甚至更低，即，在比测试的水凝胶的模量高两个或三个数量级之间。

[0135] 该工作呈现了所述用增加浓度的电纺纤维制备的复合材料的透彻的流变学分析，对得到的机械和流动性能的分析做出了努力。通过监测嵌入构建体内的成纤维细胞的存活率，也评估了生物相容性。该研究的结论一般地适用于由功能高度柔性的嵌入短纤维的水凝胶制成的混杂支架的未来研究。

[0136] 提供了纤维增强水凝胶复合材料，包括水凝胶和含有多个纤维的纤维组分，其中多个纤维的每个的长度小于约1,000μm。示例性实施方式描述了混杂材料，其由嵌有电纺白蛋白纤维的葡聚糖二醛-交联的明胶组成，电纺白蛋白纤维具有典型的100:1的纵横比。如从获得的结果可见，并入白蛋白纤维至葡聚糖-明胶分子网络中增加了水凝胶的弹性行为并减少了胶凝时间。例如，水凝胶的弹性行为增加约40％，并且胶凝时间减少约20％，但仍允许复合材料的注射。在注射期间，混杂预凝胶溶液的流动参数类似于水凝胶溶液的那些。体外研究表明，纤维增强水凝胶是生物相容的并且支持成纤维细胞生长。

[0137] 提出的用于制备水凝胶/纤维混杂材料的方法可导致形成对于细胞迁移、增殖和分化都是至关重要的生物的、化学的和机械的表面或结构线索(cue)。例如通过设计水凝胶/纤维模量不匹配，通过将生物识别序列整合到纤维表面上以增强细胞粘附力，或通过将成形素包封在纤维内并随后其控制释放，可获得这些线索。

[0138] 这些生物材料的潜在应用包括空间填充支架和细胞载体，用于再生柔软而承载负荷的组织(例如，心肌，软骨和皮肤)，其中存在增强当前可得材料的机械性能的需要。

[0139] 虽然已经参考其示例性实施方式具体显示和描述了本发明，但本领域普通技术人员应当理解，在本文中可进行形式上和细节上的各种改变，而不偏离由权利要求书限定的本发明的精神和范围。

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多孔材料的增强-专利编号CN101184606B	2020-05-13	399
玻纤增强PET材料-专利编号CN106893267A	2020-05-11	98
PPS膜增强材料-专利编号CN103579634A	2020-05-12	918
多孔材料的增强-专利编号CN101184606A	2020-05-12	423
增强复合材料-专利编号CN102731803B	2020-05-13	62
增强材料-专利编号CN101977762A	2020-05-11	1029
玻纤增强PET材料-专利编号CN106800749A	2020-05-11	236
增强复合材料-专利编号CN102731803A	2020-05-12	975
增强复合材料-专利编号CN101331176B	2020-05-13	101
钢板增强材料-专利编号CN203960116U	2020-05-11	1033

纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料的方法

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