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支化聚合物

阅读：280发布：2021-02-28

IPRDB可以提供支化聚合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及支化聚合物，所述支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：(i)至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；以及(ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。，下面是支化聚合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.支化聚合物，包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：(i)所述至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；以及(ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

2.根据权利要求1所述的支化聚合物，其中，所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。

3.根据权利要求1所述的支化聚合物，其中，所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括两个亲水性聚合物嵌段和一个阳离子聚合物嵌段，其中，所述阳离子聚合物嵌段(i)位于两个亲水性聚合物嵌段之间，并且(ii)共价连接至所述两个亲水性聚合物嵌段的每一个。

4.根据权利要求1所述的支化聚合物，其中，所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括一个亲水性聚合物嵌段和两个阳离子聚合物嵌段，其中，所述亲水性聚合物嵌段(i)位于两个阳离子聚合物嵌段之间，并且(ii)共价连接至所述两个阳离子聚合物嵌段的每一个。

5.根据权利要求1所述的支化聚合物，其中，所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性聚合物嵌段本身共价连接至亲水性聚合物嵌段。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的支化聚合物，其中，所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个通过可生物降解的共价连接而各自共价连接至所述支撑部分。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的支化聚合物，其中，(i)与可生物降解的所述嵌段共聚物链中的每一个相关的所述共价连接中的至少一个是包括选自以下的一种或多种官能团的生物可降解的连接部分：酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷、醚、二硫化物、氨基甲酸酯(尿烷)和硼酸酯，并且(ii)所述一种或多种官能团的生物降解引起所述共价连接断裂。

8.根据权利要求1所述的支化聚合物，具有由式(A7)或(A8)表示的结构：

其中，SM代表所述支撑部分，LM代表连接部分，A代表亲水性聚合物嵌段，B代表阳离子聚合物嵌段，每个x独立地是0或1，并且v是大于或等于3的整数，使得(i)A、B，可选地与LM一起，代表所述支化聚合物的嵌段共聚物臂，并且(ii)在所述至少3个嵌段共聚物臂的每一个中，至少一个x＝1，并且与x＝1相关的所述LM是共价连接A与B的可生物降解的连接部分。

9.一种包括支化聚合物和核酸分子的复合物，所述支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：(i)所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且(ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

10.根据权利要求9所述的复合物，其中，所述阳离子聚合物嵌段包括约5至约200个各自包括正电荷的单体残基单元。

11.根据权利要求9或10所述的复合物，其中，所述亲水性聚合物嵌段包括约5至约

200个亲水单体残基单元。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的复合物，具有范围从约10mV至约40mV的ζ电位。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的复合物，其中，所述核酸分子选自gDNA、cDNA、双链或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类复合物、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、介导空间发育的miRNA(sdRNA)、胁迫响应RNA(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双链或单链RNA寡核苷酸。

14.一种将核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供包括支化聚合物和核酸分子的复合物，所述支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：(i)所述至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且(ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的；

并且

(b)将所述复合物递送至所述细胞。

15.一种沉默基因表达的方法，所述方法包括用包含支化聚合物和核酸分子的复合物转染细胞，所述支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：(i)所述至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且(ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

16.根据权利要求14或15所述的方法，在体内进行。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，附接于所述支撑部分的所述至少三个聚合物链是线性聚合物链。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子与蛋白配体结合以促进受体介导的细胞靶向。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中，将所述复合物给予受试者。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中，所述核酸分子选自gDNA、cDNA、双链或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类复合物、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、介导空间发育的miRNA(sdRNA)、胁迫响应RNA(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双链或单链RNA寡核苷酸。

说明书全文

支化聚合物

技术领域

[0001] 本发明总体涉及支化聚合物。更具体地，本发明涉及具有至少三个嵌段共聚物臂的聚合物。聚合物尤其适合用于与核酸分子形成复合物(complex)，因此将本发明描述为强调这种应用会是方便的。然而，应该理解的是，聚合物可以用于各种其他应用中。因此，本发明还涉及核酸分子和聚合物的复合物，涉及这些复合物在将核酸分子递送到细胞的方法
中的用途，并且涉及沉默基因表达的方法。本发明进一步涉及聚合物在保护核酸分子免于
酶降解的方法中的用途，并且涉及用于制备聚合物的试剂。

背景技术

[0002] 支化聚合物(branched polymer)是本领域中已知的一种聚合物类型，包括支撑部分，例如，附接至少三个聚合物链的原子或分子。至少三个聚合物链可以被称为支化聚合物的“臂(arm)”。支化聚合物的具体类型包括星形聚合物、梳形聚合物、刷状聚合物和树枝状大分子。与线性聚合物相比，这种聚合物结构提供了不同的物理和化学特性，并且因此具有可观的理论和实际利益。

[0003] 支化聚合物的特性在很大程度上受它们的结构和组成的影响。通过它们的分子结构的处理，已经发现支化聚合物表现出多种独特的特性，并且已经应用于多样化应用功能
中，例如，作为弹性体、表面活性剂和润滑剂。

[0004] 因此，仍然存在机会用于研发出新型支化聚合物结构，其表现出适合进一步扩展其用途的特性。

发明内容

[0005] 因此，本发明提供了包含支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展(延伸，extending)的至少三个嵌段共聚物链的支化聚合物，其中：

[0006] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0007] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0008] 目前，已经发现，根据本发明的支化聚合物呈现出至少阳离子、亲水和可生物降解特征的独特组合，当遭受生物降解环境时，使得它们能够进行实质性的结构转变。该结构转变包括(i)整个嵌段共聚物链、(ii)部分嵌段共聚物链、或(iii)它们的组合的断裂(在存在于至少三个嵌段共聚物链的每一个中的可生物降解的共价连接处)。

[0009] 在只有部分嵌段共聚物链断裂时，支化聚合物可以释放亲水性聚合物嵌段、阳离子聚合物嵌段、或疏水性聚合物嵌段(当存在时)，或当所有三个这样的聚合物嵌段存在于
链中时，(释放)这些聚合物嵌段中的两个的组合。

[0010] 来自于支化聚合物链或其部分的损失(loss)有利地促进聚合物特性的改变，如其亲水、疏水、和/或阳离子特性。支化聚合物的分子量也当然会减小。

[0011] 在一个实施方式中，将至少三个嵌段共聚物链连接至支撑部分的每一个共价连接都是可生物降解的。

[0012] 通过适当选择可生物降解的共价连接，可以设计支化聚合物以在特定的生物降解环境中经历特定的结构转变。例如，可以设计支化聚合物以形成具有核酸分子的复合物，其中，在复合物进行转染时，支化聚合物的所有或部分链在可生物降解的共价连接处断裂。细胞内支化聚合物的这种结构转变可以提供核酸分子增强的可用性并且也促进支化聚合物
(或它的残基)的代谢和清除。

[0013] 由于链的嵌段本质，根据本发明的支化聚合物可以有利地被定制-设计以适合多种应用。通过选择形成链的至少适当的阳离子和亲水嵌段，例如，可以设计支化聚合物以有效且高效地与核酸分子形成复合物。

[0014] 因此，本发明还提供了包括支化聚合物和核酸分子的复合物，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：

[0015] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0016] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0017] 在这种背景下，将要理解的是，复合物本身来自支化聚合物和核酸分子之间。

[0018] 支化聚合物可以与多种核酸分子形成稳定复合物，得到的复合物提供了核酸分子向多种细胞类型的改善的转染。支化聚合物，当处于复合物形式时，也已经被发现对核酸分子提供良好保护以防止酶降解。

[0019] 由于它们的嵌段特性，可以有利地定制设计支化聚合物的每个臂以提供与给定的核酸分子的有效复合和/或提供给定细胞类型的核酸分子的有效转染。支化聚合物也可以
有利地被定制设计以结合将复合物引入选择的靶细胞类型的靶向配体。

[0020] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。在这种情况下，嵌段共聚物链可以方便地被称为具有A-B
二嵌段结构，其中，A代表亲水性聚合物嵌段，以及B代表阳离子聚合物嵌段。进一步的聚合物嵌段，如疏水性聚合物嵌段，可以共价连接至阳离子聚合物嵌段或亲水性聚合物嵌段。在这种情况下，嵌段共聚物链可以方便地被称为具有A-B-C或C-A-B三嵌段结构，其中，A代
表亲水性聚合物嵌段，B代表阳离子聚合物嵌段，以及C代表另外的聚合物嵌段，如疏水性
聚合物嵌段。

[0021] 在另一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括两个亲水性聚合物嵌段和一个阳离子聚合物嵌段，其中，阳离子聚合物嵌段(i)位于两个亲水性聚合物嵌段
之间，并且(ii)共价连接至两个亲水性聚合物嵌段的每一个。在这种情况下，嵌段共聚物
链可以方便地被称为具有A-B-A三嵌段结构，其中，每一个A可以相同或不同，并且代表亲
水性聚合物嵌段，以及B代表阳离子聚合物嵌段。

[0022] 在一个进一步的实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括一个亲水性聚合物嵌段和两个阳离子聚合物嵌段，其中，亲水性聚合物嵌段(i)位于两个阳离子聚合
物嵌段之间，并且(ii)共价连接至两个阳离子聚合物嵌段的每一个。在这种情况下，嵌段
共聚物链可以方便地被称为具有B-A-B三嵌段结构，其中，每一个B可以相同或不同，并且
代表阳离子聚合物嵌段，以及A代表亲水性聚合物嵌段。

[0023] 在另一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，疏水性聚合物嵌段自身共价连接至亲水性聚合物嵌段。
在这种情况下，嵌段共聚物臂可以方便地被称为具有B-C-A三嵌段结构，其中，B代表阳离
子聚合物嵌段，C代表疏水性聚合物嵌段，并且A代表亲水性聚合物嵌段。

[0024] 本发明还提供了将核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括：

[0025] (a)提供包括支化聚合物和核酸分子的复合物，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：

[0026] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0027] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的；以及

[0028] (b)将复合物递送至细胞。

[0029] 在一个实施方式中，将核酸分子递送至细胞以用于沉默基因表达的目的。

[0030] 因此，本发明还提供了沉默基因表达的方法，所述方法包括用包含支化聚合物和核酸分子的复合物转染细胞，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述
部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：

[0031] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0032] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0033] 在本发明的这个和其他方面的一个实施方式中，核酸分子选自DNA和RNA。

[0034] 在一个进一步的实施方式中，DNA和RNA选自gDNA、cDNA、双链或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(piwi-interacting RNA)(PiRNA)、微RNA/小时序
RNA(small temporal RNA)(miRNA/stRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类复合物(ribonuclease-type complex)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、
介导空间发育(spatial development)的miRNA(sdRNA)、胁迫响应RNA(stress response
RNA)(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双链或单链RNA寡核苷酸。

[0035] 也已经发现根据本发明的支化聚合物保护核酸分子免于酶降解。

[0036] 因此，本发明还提供了保护核酸分子免于酶降解的方法，所述方法包括复合核酸分子和支化聚合物(使核酸分子与支化聚合物复合)，所述支化聚合物包括支撑部分和共
价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：

[0037] (i)至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性
聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0038] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0039] 还提供了复合物用于将核酸分子递送至细胞的用途，复合物包括支化聚合物和核酸分子，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个
嵌段共聚物链，其中：

[0040] (i)至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性
聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0041] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0042] 本发明进一步提供了复合物用于沉默基因表达的用途，复合物包括支化聚合物和核酸分子，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三
个嵌段共聚物链，其中：

[0043] (i)至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性
聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0044] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0045] 本发明进一步提供了支化聚合物在保护核酸分子免于酶降解中的用途，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其
中：

[0046] (i)至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性
聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0047] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0048] 本发明的进一步方面和实施方式以下在本发明的具体实施方式中示出。

附图说明

[0049] 在此，将参照以下非限制性附图描述本发明，其中：

[0050] 图1示出了根据本发明可以形成的多种支化聚合物结构，其中，代表支撑部分，—代表普通(general)共价键，代表可生物降解的共价连接(coupling)或键连
(linking)部分，代表阳离子聚合物嵌段，以及代表亲水性聚合物嵌段；

[0051] 图2示出了暴露于实施例1和2(不存在siRNA)中制备的多臂星形共聚物连续稀释液的CHO-GFP和HEK293T细胞的存活力；

[0052] 图3示出了暴露于实施例1和2(存在siRNA)中制备的多臂星形共聚物的CHO-GFP、HEK293T和Huh7-GFP细胞的存活力；

[0053] 图4示出了针对实施例1中制备的系列聚合物，多臂星形共聚物与siRNA的结合(association)，其是聚合物:siRNA比率(w/w)的函数。还示出了相应的N/P比率；

[0054] 图5示出了对于以L2000di22样品或聚合物/di22复合物平均EGFP荧光的百分比呈现的不同siRNA:RAFT聚合物(实施例5中制备的)组合的CHO-GFP、HEK-GFP和Huh7-GFP
细胞中的基因沉默。

[0055] 图6示出了CHO-GFP细胞中荧光标记的si22/ToTo-3聚合物复合物的摄取。CHO-GFP细胞用50pmol的ToTo-3标记的siRNA转染，阳离子脂质体2000(Lipofectamine
2000)作为阳性对照，或细胞具有4:1摩尔比的聚合物:siRNA，siRNA标记了ToTo-3(其加
入6或24小时)。也添加用ToTo-3标记的裸si22。然后，通过流式细胞术对细胞进行试
验并且分析。相比于用ToTo-3标记的裸si22，值以摄取指数表示，图示代表以重复三次±
标准偏差的三次单独实验；

[0056] 图7示出了在胎牛血清(FBS)中siRNA/聚合物复合物的稳定性；(a)裸siRNA的稳定性，(b)ABA-B4S-16/24，(C)BAB-B4S-11/10(d)处理的复合物在CHO-GFP细胞中沉默的
能力；

[0057] 图8示出了在鸡胚(A)干扰素α(IFNα)和(B)干扰素β(IFNβ)中，对于ABA-B4S-16/24的干扰反应。24小时后，肝组织学切片(C、D和E)；以及

[0058] 图9示出了在24h在鸡胚中ABA-B4S-16/24di22-FAM复合物的摄取(A&B)和在鸡胚中流感病毒的抑制(C)。

[0059] 一些附图包含彩色图像或实体。根据需要，可获得彩色版本的附图。

具体实施方式

[0060] 贯穿该说明书和随后的权利要求书，除非上下文另外要求，否则词语“包括”以及变体如“包含”和“含有”，将被理解为暗示包括指定的整数或步骤，或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤，或整数或步骤的组。

[0061] 在本说明书中，提及任何现有出版物(或获自其的信息)，或提及已知的任何事项，并不(表明)且不应视为默许(acknowledgment)或承认或任何形式的暗示现有出版物
(或获自其的信息)或已知事项构成本说明书所致力于的领域中的公知知识的一部分。

[0062] 如在本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在包括复数方面，除非上下文另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括单个细胞以及两个或更多个细胞；提及“试剂”包括一种试剂以及两种或更多种试剂等。

[0063] 如在本文中使用的，表述“支化聚合物”旨在意指包括附接至少三个聚合物链的支撑部分的聚合物。聚合物可以包括多于一个的这种支撑部分。为了方便起见，至少三个聚合物链可以称为支化聚合物的“臂”。支化聚合物可以具有多于三个的这种臂。例如，支化聚合物可以具有4、5、6、7、8、9、10或更多的附接至支撑部分的聚合物链。

[0064] 支化聚合物的具体类型包括但不限于星形聚合物、梳形聚合物、刷状聚合物和树枝状大分子。

[0065] 附接至支撑部分的至少三个聚合物链或臂可以是支化或线性聚合物链。

[0066] 在一个实施方式中，附接至支撑部分的至少三个聚合物链是线性聚合物链。

[0067] 在一个进一步的实施方式中，根据本发明的支化聚合物是星形聚合物。

[0068] “星形聚合物”是指包含发散出至少三个共价连接的线性聚合物链或臂的单个分支部分的高分子(大分子)。在那种情况下，分支部分代表支撑部分，并且支撑部分可以处
于如本文中描述的合适的原子或分子的形式。

[0069] “支撑部分”是指共价附接支化聚合物的臂的部分，如原子或分子。因此，支撑部分起支撑共价附接的臂的功能。

[0070] 为了辅助描述表述“支化聚合物”和“支撑部分”所要表达的含义，可以参考以下通式(A)：

[0071]

[0072] 其中，SM代表支撑部分，BcPA代表嵌段共聚物臂，并且v是大于或等于3的整数。

[0073] 参照通式(A)，支撑部分(SM)具有共价连接至其的至少三个嵌段共聚物臂(BcPA)，并且因此，SM可以过分简单地被视为可以发生支化的结构特征。根据本发明的支
化聚合物可以具有更多这种可以发生支化的结构特征。

[0074] 在支撑部分是原子时，其将通常是C、Si或N。在其中原子是C或Si的情况下，可以存在共价连接至各自原子的第四嵌段共聚物链。

[0075] 在支撑部分是分子时，关于所述部分的性质没有特别限制，只要其可具有共价连接至其的至少三个嵌段共聚物臂。换句话说，分子必须至少是三价的(即，具有共价附接
发生的至少三个点)。例如，分子可以选自可选取代的以下的至少三价形式：烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂环基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、碳环氧基(碳环基氧基)、杂环氧基(杂环基氧基)、杂芳氧基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基烯基、烷基炔基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、烯氧基烷基、炔氧基烷基、芳氧基烷基、烷基酰氧基、烷氧基酰烷基、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、烯硫基烷基、炔硫基烷基、芳硫基烷基、烷酰基硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳硫基、烷基烯烷基、烷基炔烷基、烷基芳基烷基、烷酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基烯基芳基、芳基炔基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、烯氧基芳基、炔氧基芳基、芳氧基芳基、芳基酰氧基、芳基碳环氧基、芳基杂环氧基、芳基杂芳氧基、烷硫基芳基、烯硫基芳基、炔硫基芳基、芳硫基芳基、芳基酰硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基、芳基杂芳硫基、配位络合物(coordination complex)、和聚合物链，其中，在存在时，任何烷基链中的-CH2-基团或每个-CH2-基团可以被独立地选自以下的二价基团取代(替代，replace)：-O-、-OP(O)2-、-OP(O)2O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N＝N-、-OSi(ORa)2O-、-Si(ORa)2O-、-OB(ORa)O-、-B(ORa)O-、-NRa-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-、-OC(O)NRa-和-C(O)NRa-，其中，Ra或每一个Ra可以独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基和酰基。Ra或每一个Ra也可以独立地选自氢、C1-18烷基、C1-18烯基、C1-18炔基、C6-18芳基、C3-18碳环基、C3-18杂芳基、C3-18杂环基和C7-18芳基烷基。

[0076] 在支化聚合物只包括一个支撑部分并且至少三个嵌段共聚物臂是线性的时，支化聚合物可以方便地被称为星形聚合物。

[0077] 当定义支撑部分时，其可以方便地指所述部分获自其的化合物。例如，支撑部分可以获自具有三个或更多个官能团的化合物，所述官能团提供嵌段共聚物臂通过其而共价连接的反应位点(反应性位点，reactive site)。在那种情况下，支撑部分可以获自具有三个或更多个选自以下的官能团的化合物：例如，卤素、醇、硫醇(thiol)、羧酸、胺、环氧化物和酰氯。

[0078] 具有三个或更多个支撑部分可以获自其的醇官能团的化合物的实例包括，但不限于，甘油、季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇、1,2,3-三羟基己烷、三羟甲基丙烷、肌醇、葡萄糖及其异构体(例如，d-半乳糖、d-甘露糖、d-果糖)、麦芽糖、蔗糖和甘露醇。

[0079] 至少三个嵌段共聚物链各自共价连接至支撑部分。每个嵌段共聚物链可以直接或间接地共价连接至支撑部分。通过“直接地”连接是指在嵌段共聚物链和支撑部分之间只
存在共价键。通过“间接地”连接是指存在位于嵌段共聚物链和支撑部分之间的一个或多
个共价连接的原子或分子。在嵌段共聚物链间接地连接至支撑部分时，可以方便地称嵌段
共聚物链通过连接部分共价连接至支撑部分。

[0080] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个各自通过连接部分(linking moiety)共价连接至支撑部分。

[0081] 关于这种连接部分的性质，没有特别的限制，只要(条件是，provided)其可以起到将至少三个嵌段共聚物链连接至支撑部分的功能。

[0082] 适合的连接部分的实例包括可选取代的以下的二价形式：氧(-O-)、二硫化物(-S-S-)、烷基、烯基、炔基、芳基、酰基(包括-C(O)-)、碳环基、杂环基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、酰氧基、碳环氧基、杂环氧基、杂芳氧基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、酰硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基烯基、烷基炔基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、烯氧基烷基、炔氧基烷基、芳氧基烷基、烷基酰基氧、烷氧基酰烷基、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、烯硫基烷基、炔硫基烷基、芳硫基烷基、烷酰基硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳硫基、烷基烯烷基、烷基炔烷基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基烯基芳基、芳基炔基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、烯氧基芳基、炔氧基芳基、芳氧基芳基、芳基酰氧基、芳基碳环氧基、芳基杂环氧基、芳基杂芳氧基、烷硫基芳基、烯硫基芳基、炔硫基芳基、芳硫基芳基、芳基酰硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基和芳基杂芳硫基，其中，在存在时，任何烷基链中的-CH2-基团或每个-CH2-基团可以被独立地选自以下的二价基团取代：-O-、-OP(O)2-、-OP(O)2O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-a a a a a
、-N＝N-、-OSi(OR)2O-、-Si(OR)2O-、-OB(OR)O-、-B(OR)O-、-NR-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)a a a a
O-、-OC(O)NR-和-C(O)NR-，其中，R 或每一个R 可以独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳a a
基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基和酰基。R 或每一个R 也可以独立地选自氢、C1-18烷基、C1-18烯基、C1-18炔基、C6-18芳基、C3-18碳环基、C3-18杂芳基、C3-18杂环基和C7-18芳基烷基。

[0083] 在此，提及的包括两个或更多个亚基团(例如，[基团A][基团B])的基团不旨在限于亚基团呈现的顺序。因此，定义为[基团A][基团B](例如，烷基芳基)的两个亚基团
旨在也提及定义为[基团B][基团A](例如，芳基烷基)的两个亚基团。

[0084] 本发明的重要特征在于：与每一个嵌段共聚物链相关的共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0085] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链的每一个通过可生物降解的连接部分各自共价连接至支撑部分。

[0086] 共价连接、共价连接的、或连接部分是“可生物降解的”，这是指在暴露于生物环境(例如，在受试者中或与生物材料如血液、组织等接触)时，其具有对通过化学反应分解(即，经历键断裂)敏感的分子结构，使得相关共价连接(例如，在支撑部分和嵌段共聚物链之间)断裂。可以通过水解、氧化或还原进行这种化学分解。因此，可生物降解的共价连接、共价连接的、或连接部分将通常对进行水解、氧化或还原断裂敏感。生物降解的速率(rate)可根据多种外部或内部因素(例如，光、热、辐射、pH、酶介导或非酶介导等)而变化。

[0087] 在可生物降解的连接部分用于将嵌段共聚物链共价连接至支撑部分时，将理解的是，当可生物降解的连接部分进行生物降解时，如此连接的嵌段共聚物链将自身从支化聚
合物结构断裂。

[0088] 本领域技术人员将理解可以形成连接部分或可以形成部分键接部分使得其对于进行生物降解敏感的官能团的类型。这种官能团可以包括，例如，酯、酸酐、碳酸酯、
过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷(thiourethane)、醚、二硫化物、氨基甲酸酯(carbamate)(尿烷(urethane))和硼酸酯。

[0089] 在一个实施方式中，可生物降解的连接部分包括一个或多个选自以下的官能团：酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷、醚、二硫化物、氨基甲酸酯(尿烷)和硼酸酯。

[0090] 将理解的是，这些官能团将位于连接部分内，使得在进行生物降解时，相关共价连接断裂。因此，这些官能团直接形成提供共价连接的部分原子串。换句话说，这种官能团的至少一种原子存在于共价连接聚合物的相关部分的原子的直连串(direct string)中(例如，支撑部分至嵌段共聚物链)。

[0091] 因此，连接部分通过选自以下的一种或多种官能团是可生物降解的：酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷、醚、二硫化物、氨基甲酸酯(尿烷)和硼酸酯。

[0092] 在酸、碱、酶和/或能够催化或至少协助键断裂过程的另一种内源生物化合物的存在下，可以促进可生物降解的连接部分的生物降解。例如，酯可以水解断裂以产生羧酸基团和醇基，酰胺可以水解断裂以产生羧酸基团和胺基，以及二硫化物可以还原断裂以产生
硫醇基。

[0093] 生物降解可以发生在生物流体，如血液、血浆、血清、尿、唾液、乳汁(milk)、精液、阴道液、滑液、淋巴液、羊水、汗液和眼泪中；以及工厂生产的水溶液，包括，例如，渗出液(exudate)和吐水液(guttation)、木质部(xylem)、韧皮部(phloem)、树脂和花蜜(nectar)。

[0094] 生物降解也可以发生在细胞或在如核内体(内涵体，endosome)和细胞质的细胞组分中。

[0095] 可以选择可生物降解的连接部分，使得它们可以在暴露于特定的生物环境时，进行生物降解。例如，在正常和病理状态下，氧化还原电势梯度存在于细胞外和细胞内环境之间。存在于可生物降解的连接部分的二硫键在还原细胞内环境中可以容易地被还原，而在
氧化细胞外空间中仍然保持完好。通常通过小氧化还原分子，如谷胱甘肽(GSH)和硫氧还
蛋白，单独的或借助于酶机制(enzymatic machinery)，进行二硫键的细胞内还原。

[0096] 给定的可生物降解的连接部分可以包括两个或更多个官能团，所述官能团使得其对进行生物降解敏感。然而，取决于这些官能团的性质和生物降解环境，可以仅一种官能团实际促进期望的键断裂。例如，可生物降解的连接部分可以包括酯和二硫化物官能团。在
还原环境中，可以仅二硫化物官能团将进行生物降解。在水解环境中，可以仅酯官能团将进行生物降解。在还原和水解环境中，可以二硫化物和酯官能团二者都将进行生物降解。

[0097] 共价连接至支撑部分的至少三个嵌段共聚物链包括：(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，
其中，疏水性聚合物嵌段自身连接至亲水性聚合物嵌段。

[0098] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。在那种情况下，嵌段共聚物链可以方便地被称为具有A-B
二嵌段结构，其中，A代表亲水性聚合物嵌段，以及B代表阳离子聚合物嵌段。另外的聚合
物嵌段，如疏水性聚合物嵌段，可以共价连接至阳离子聚合物嵌段或亲水性聚合物嵌段。在那种情况下，嵌段共聚物链可以方便地被称为具有A-B-C或C-A-B三嵌段结构，其中，A代
表亲水性聚合物嵌段，B代表阳离子聚合物嵌段，以及C代表另外的聚合物嵌段，如疏水性
聚合物嵌段。

[0099] 在至少三个嵌段共聚物链中的每一个都包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段时，每一个臂的阳离子聚合物嵌段可以共价连接至支撑部分，或每一个臂
的亲水性聚合物嵌段可以共价连接至支撑部分。在另外的聚合物嵌段，如疏水性聚合物嵌
段，共价连接至阳离子聚合物嵌段或亲水性聚合物嵌段时，每个臂的阳离子聚合物嵌段、亲水性聚合物嵌段、或疏水性聚合物嵌段可以共价连接至支撑部分。

[0100] 亲水性聚合物嵌段、阳离子聚合物嵌段，或如果存在，另外的聚合物嵌段如疏水性聚合物嵌段，可以以期望的次序彼此直接或间接地共价连接。

[0101] 以上述类似的方式(描述每个嵌段共聚物链和支撑部分之间的共价连接的性质)，在嵌段共聚物链中的至少二嵌段的背景下，通过“直接地”连接是指在各自的聚合物嵌段之间仅存在共价键。同样，在嵌段共聚物链中的至少二嵌段的背景下，通过“间接地”连接是指存在位于各自嵌段之间的一个或多个共价结合的原子或分子。在嵌段共聚物链中的两
个或更多嵌段是间接地连接时，其可以方便地称为各个嵌段通过连接部分彼此共价连接。

[0102] 例如，至少三个嵌段共聚物链中的每一个可以包括通过连接部分共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。同样，另外的聚合物嵌段，如疏水性聚合物嵌段，可以通过连接部分共价连接至阳离子聚合物嵌段或亲水性聚合物嵌段。

[0103] 在嵌段共聚物链内的给定聚合物嵌段通过连接部分共价连接至另一个聚合物嵌段时，本领域技术人员将理解，尽管在每个聚合物嵌段之间存在这种连接部分，整体结构将仍然被描述为嵌段共聚物链。例如，至少三个嵌段共聚物链中的每一个可以包括通过连接
部分共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。在那种情况中，嵌段共聚物链可
以被描述为具有结构A-LM-B，进而其可以方便地称为具有A-B二嵌段结构，其中，A代表亲
水性聚合物嵌段，LM代表连接部分，以及B代表阳离子聚合物嵌段。

[0104] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括通过连接部分共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。

[0105] 在进一步的实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括另外的聚合物嵌段，如疏水性聚合物嵌段，其通过连接部分共价连接至阳离子聚合物嵌段或亲水性聚合物
嵌段。

[0106] 在本文中描述的连接部分适合于共价连接每个嵌段共聚物链内的聚合物嵌段。

[0107] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括通过可生物降解的连接部分共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段。

[0108] 在进一步的实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括另外的聚合物嵌段，如疏水性聚合物嵌段，其通过可生物降解的连接部分共价连接至阳离子聚合物嵌段或
亲水性聚合物嵌段。

[0109] 根据这种实施方式，支化聚合物可以方便地通过以下式(A1)-(A6)表示：

[0110]

[0111] 其中，SM代表支撑部分，LM代表连接部分，A代表亲水性聚合物嵌段，B代表阳离子聚合物嵌段，C代表另外的聚合物嵌段(如疏水性聚合物嵌段)，每个x独立地是0或1，
以及v是大于或等于3的整数，使得(i)A、B，可选地，与LM和C一起，代表支化聚合物的嵌
段共聚物臂，并且(ii)在至少3个嵌段共聚物臂的每一个中，至少一个x＝1，并且与x＝
1相关的LM是可生物降解的连接部分。

[0112] 在以上结构A1-A6中，将理解的是，在给定的嵌段共聚物臂中x＝0时，连接部分(LM)不存在并且支化聚合物的相关部分彼此直接共价连接。

[0113] 在以上结构A1-A6中，将理解的是，在给定的嵌段共聚物臂中x＝1时，连接部分(LM)存在并且支化聚合物的相关部分通过连接部分(LM)彼此间接地共价连接。支化聚合
物的至少3个嵌段共聚物臂中的每一个必须存在至少一个是可生物降解的连接部分(即，
可生物降解的连接部分)。

[0114] 在另一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括两个亲水性聚合物嵌段和一个阳离子聚合物嵌段，其中，阳离子聚合物嵌段(i)位于两个亲水性聚合物嵌段
之间，并且(ii)共价连接至两个亲水性聚合物嵌段的每一个。在那种情况下，嵌段共聚物
链可以方便地被称为具有A-B-A三嵌段结构，其中，链中的每一个A可以相同或不同，并且
代表亲水性聚合物嵌段，以及B代表阳离子聚合物嵌段。

[0115] 可替换地，至少三个嵌段共聚物链中的每一个可包括一个亲水性聚合物嵌段和两个阳离子聚合物嵌段，其中，亲水性聚合物嵌段(i)位于两个阳离子聚合物嵌段之间，并且(ii)共价连接至两个阳离子聚合物嵌段的每一个。在那种情况下，嵌段共聚物链可以方便
地被称为具有B-A-B三嵌段结构，其中，链中的每一个B可以相同或不同，并且代表阳离子
聚合物嵌段，以及A代表亲水性聚合物嵌段。

[0116] 在一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物臂中的每一个包括两个亲水性聚合物嵌段和一个阳离子聚合物嵌段，其中，阳离子聚合物嵌段(i)位于两个亲水性聚合物嵌段之
间，并且(ii)通过连接部分共价连接至两个亲水性聚合物嵌段的每一个。

[0117] 可替换地，至少三个嵌段共聚物臂中的每一个包括一个亲水性聚合物嵌段和两个阳离子聚合物嵌段，其中，亲水性聚合物嵌段(i)位于两个阳离子聚合物嵌段之间，并且
(ii)通过连接部分共价连接至两个阳离子聚合物嵌段的每一个。

[0118] 在进一步的实施方式中，至少三个嵌段共聚物臂中的每一个包括两个亲水性聚合物嵌段和一个阳离子聚合物嵌段，其中，阳离子聚合物嵌段(i)位于两个亲水性聚合物嵌
段之间，并且(ii)通过可生物降解的连接部分共价连接至两个亲水性聚合物嵌段的每一
个。

[0119] 在另一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物臂中的每一个包括一个亲水性聚合物嵌段和两个阳离子聚合物嵌段，其中，亲水性聚合物嵌段(i)位于两个阳离子聚合物嵌段
之间，并且(ii)通过可生物降解的连接部分共价连接至两个阳离子聚合物嵌段的每一个。

[0120] 根据这种实施方式，支化聚合物可以方便地通过以下式(A7)和(A8)表示：

[0121]

[0122] 其中，SM代表支撑部分，LM代表连接部分，A代表亲水性聚合物嵌段，B代表阳离子聚合物嵌段，每个x独立地是0或1，以及v是大于或等于3的整数，使得(i)A、B，可选地
与LM一起，代表支化聚合物的嵌段共聚物臂，并且(ii)在至少3个嵌段共聚物臂的每一个
中，至少一个x＝1，并且与x＝1相关的LM是可生物降解的连接部分。

[0123] 在以上结构A7和A8中，将理解的是，在给定的嵌段共聚物臂中x＝0时，连接部分(LM)不存在并且支化聚合物的相关部分彼此直接共价连接。

[0124] 在以上结构A7和A8中，将理解的是，在给定的嵌段共聚物臂中x＝1时，连接部分(LM)存在并且支化聚合物的相关部分通过连接部分(LM)彼此间接共价连接。支化聚合
物的至少3个嵌段共聚物臂中的每一个必须存在至少一个是可生物降解的连接部分(即，
可生物降解的连接部分)。

[0125] 在嵌段共聚物臂包括两个亲水性聚合物嵌段或两个阳离子聚合物嵌段时，臂中的每一个亲水性聚合物嵌段可以相同或不同，并且臂中的每一个阳离子聚合物嵌段可以相同
或不同。

[0126] 在另一个实施方式中，至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，疏水性聚合物嵌段自身连接至亲水性聚合物嵌段。在那
种情况下，嵌段共聚物链可以方便地被称为具有B-C-A三嵌段结构，其中，B代表阳离子聚
合物嵌段，C代表疏水性聚合物嵌段，以及A代表亲水性聚合物嵌段。

[0127] 在至少三个嵌段共聚物臂中的每一个包括共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，疏水性聚合物嵌段自身连接至亲水性聚合物嵌段时，每一条链的阳离子聚
合物嵌段可以共价连接至支撑部分，或每一条链的亲水性聚合物嵌段可以共价连接至支撑
部分。

[0128] 与至少嵌段共聚物链中的每一个相关的连接部分中的至少一个是可生物降解的连接部分。

[0129] 根据这种实施方式，支化聚合物可以方便地通过以下式(A9)和(A10)表示：

[0130]

[0131] 其中，SM代表支撑部分，LM代表连接部分，A代表亲水性聚合物嵌段，B代表阳离子聚合物嵌段，C代表另外的聚合物嵌段如疏水性聚合物嵌段，每个x独立地是0或1，以及v是大于或等于3的整数，使得(i)A、B，可选地与LM一起，代表支化聚合物的嵌段共聚物臂，并且(ii)在至少3个嵌段共聚物臂的每一个中，至少一个x＝1，并且与x＝1相关的LM
是可生物降解的连接部分。

[0132] 本领域技术人员将理解的是，根据本文中所概述的教导，可以存在能够形成支化聚合物的其他置换以及A、B、C和LM的组合。例如，嵌段共聚物链可以处于更多嵌段共聚物的形式，如四-、五-、或六-等嵌段共聚物。

[0133] 在嵌段共聚物链的每一个包括两个或更多个连接部分时，每一个连接部分可以相同或不同。

[0134] 包含“阳离子聚合物嵌段”的嵌段共聚物链是指在共聚物链结构中其包含呈递或能够呈递净正电荷的可辨别的嵌段(discernable block)。

[0135] 包含“亲水性聚合物嵌段”的嵌段共聚物链是指在共聚物链结构中其包含呈现净亲水特性的可辨别的嵌段。

[0136] 包含“另外的聚合物嵌段”的嵌段共聚物链是指在共聚物链结构中其包含不是阳离子聚合物嵌段或亲水性聚合物嵌段的可辨别的嵌段。

[0137] 另外的聚合物嵌段可以是疏水性聚合物嵌段。包含“疏水性聚合物嵌段”的嵌段共聚物链是指在共聚物链结构中其包含呈现净疏水特性的可辨别的嵌段。

[0138] 以下呈现了关于表述“阳离子聚合物嵌段”、“亲水性聚合物嵌段”和“疏水性聚合物嵌段”所预表达含义的进一步细节。

[0139] 根据本发明，形成支化聚合物臂的嵌段共聚物可以是线性嵌段共聚物。

[0140] 支化聚合物的嵌段共聚物臂中的每个聚合物嵌段可以是均聚物嵌段或者是共聚物嵌段。在聚合物嵌段是共聚物时，共聚物可以是梯度、无规或统计共聚物。

[0141] 给定的阳离子聚合物嵌段和亲水性聚合物嵌段，以及，如果存在，另外的聚合物嵌段如疏水性聚合物嵌段，将通常各自包括大量单体单元的聚合残基。以下呈现了关于可以用于形成这些嵌段的单体的进一步的细节。

[0142] 阳离子聚合物嵌段可以包括从约5至约200，或约40至约200，或约80至约200个单体残基单元。在嵌段共聚物臂包括两个阳离子聚合物嵌段时，臂中的每个阳离子聚合物
嵌段可以独立地包括从约5至约100，或约20至约100，或约40至约100个单体残基单元。
单独地或共同地，阳离子聚合物嵌段将呈现净正电荷。通常，至少约10％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少70％，或至少90％，或所有的组成阳离子聚合物嵌段的单体残基单元包括正电荷。

[0143] 在一个实施方式中，阳离子聚合物嵌段包括从约5至约200，或约40至约200，或约80至约200个各自包含正电荷的单体残基单元。

[0144] 在嵌段共聚物链包括两个阳离子嵌段时，每个阳离子嵌段可以独立地包括从约5至约100，或约20至约100，或约40至约100个各自包含正电荷的单体残基单元。

[0145] 在根据本发明的支化聚合物用于与核酸分子形成复合物时，将理解的是，单独地或共同地，阳离子嵌段将包括足够的正电荷密度以促进与核酸分子的复合
(complexation)。以下讨论了关于这种复合物形成实施方式的进一步的细节。

[0146] 亲水性聚合物嵌段可以包括从约5至约200，或从约30至约200，或从约40至约180，或从约50至约180，或从约60到约180个单体残基单元。在嵌段共聚物臂包括两个
亲水嵌段时，各个亲水嵌段可以独立地包括从约5至约100，或约15至约100，或约20至约
90，或约25至约90，或从约30至约90个亲水单体残基单元。单独地或共同地，亲水性聚
合物嵌段将呈现净亲水特性。通常，至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约
90％，或约100％的形成亲水性聚合物嵌段的单体残基单元将是亲水单体残基单元。

[0147] 在一个实施方式中，亲水性聚合物嵌段包括从约5至约200，或从约30至约200，或从约40至约180，或从约50至约180，或从约60至约180个亲水单体残基单元。

[0148] 在嵌段共聚物链包括两个亲水性聚合物嵌段时，每个亲水性聚合物嵌段可以独立地包括从约5至约100，或约15至约100，或约20至约90，或从约25至约90，或从约30至
约90个亲水单体残基单元。

[0149] 在嵌段共聚物链包括另外的聚合物嵌段时，另外的聚合物嵌段可以包括从约5至约200，或从约30至约200，或从约40至约180，或从约50至约180，或从约60至约180个
单体残基单元。

[0150] 在另外的聚合物嵌段是疏水性聚合物嵌段时，疏水性聚合物嵌段可以包括从约5至约200，或从约30至约200，或从约40至约180，或从约50至约180，或从约60至约180个
单体残基单元。疏水性聚合物嵌段将呈现净疏水特性。通常，至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约90％，或约100％的形成疏水性聚合物嵌段的单体残基单元将是
疏水单体残基单元。

[0151] 在一个实施方式中，疏水性聚合物嵌段包括从约5至约200，或从约30至约200，或从约40至约180，或从约50至约180，或从约60至约180个疏水单体残基单元。

[0152] 在本领域中，通常使用术语如亲水和疏水以表达一种组分相对于另一种之间的相互作用(例如，吸引或排斥相互作用，或溶解度特性)，并且不用于定量地定义特定组分相
对于另一种的性质。

[0153] 例如，亲水组分更可能被水介质(水性介质)如水润湿或溶剂化，而疏水组分则较小可能地被水介质如水润湿或溶剂化。

[0154] 在本发明的上下文中，亲水性聚合物嵌段旨在意指在水介质中表现出溶解性或可混合性的聚合物嵌段，包括生物流体，如血液、血浆、血清、尿、唾液、乳汁(milk)、精液、阴道液(vaginal fluid)、滑液、淋巴液、羊水、汗液和眼泪；以及工厂生产的水溶液，包括，例如，渗出液和吐水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。

[0155] 相反地，疏水性聚合物嵌段旨在意指在水介质中表现出很小或没有溶解性或可混合性的聚合物嵌段，包括生物流体，如血液、血浆、血清、尿、唾液、乳汁、精液、阴道液、滑液、淋巴液、羊水、汗液和眼泪；以及工厂生产的水溶液，包括，例如，渗出液和吐水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。

[0156] 通常选择亲水性聚合物嵌段，使得支化聚合物在水介质中是可溶的或是可混合的。

[0157] 阳离子聚合物嵌段也可以表现出亲水特性，使得其在水介质中是可溶的或是可混合的。

[0158] 在一个实施方式中，支化聚合物不包括带有负电荷的聚合单体残基单元。换句话说，在一个实施方式中，支化聚合物不是两性(ampholytic)支化聚合物。

[0159] 在此，提及分别与阳离子聚合物嵌段或核酸分子相关的“正”或“负”电荷，旨在意指阳离子聚合物嵌段或核酸分子具有一个或多个官能团或部分呈递或旨在呈递以及能够呈递正电荷或负电荷。

[0160] 因此，这种官能团或部分可以固有地带有电荷，或者其可以能够被转换成带电荷的状态，例如通过增加或去除亲电体(electrophile)。换句话说，在正电荷的情况
下，官能团或部分可以具有固有电荷，如季胺官能团或部分，或官能团或部分自身可以是
中性的，然而是通过例如pH依赖性的叔铵阳离子形成、或者叔铵基团的四价化(季化，
quaternerisation)可充电的(可带电荷的，chargeable)，以形成阳离子。在负电荷的情
况下，官能团或部分可以，例如，包括提供负电荷的有机酸盐，或官能团或部分可以包括可以是中性的有机酸，但通过例如pH依赖性的酸质子的去除可充电以形成阴离子。

[0161] 在一个实施方式中，阳离子聚合物嵌段可以使用包括处于中性状态并且随后可以转化为正电荷状态的官能团或部分的单体来制备。例如，单体可以包括叔胺官能团，其在被聚合时形成随后被四价化至正电荷状态的阳离子聚合物嵌段。

[0162] 本领域技术人员将理解的是，在带电荷的状态下，与阳离子聚合物嵌段相关的阳离子本身，或者与例如核酸分子相关的阴离子本身，将具有与其相关的适合的反荷离子。

[0163] 通常，组成每个嵌段共聚物链的单体残基单元的数量范围将从约5至约500，或从约10至约300，或从约20至约150。

[0164] 支化聚合物包括至少三个嵌段共聚物链。在一个实施方式中，支化聚合物包括从3至12个嵌段共聚物链，或从3至9个嵌段共聚物链，或从3至6个嵌段共聚物链。

[0165] 为了避免任何怀疑，根据本发明给定的支化聚合物的每一个嵌段共聚物链具有基本上相同的分子组成。

[0166] 根据本发明的支化聚合物的实例可以参照以下通式A11-A13说明：

[0167]

[0168] 其中，SM是支撑部分，LM是可生物降解的连接部分，DMAEMA是甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙酯的聚合残基，OEGMA是低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯的聚
合残基，并且BMA是甲基丙烯酸正丁酯的聚合残基。

[0169] 在一个实施方式中，支化聚合物进一步包括靶向配体和/或显像剂(显影剂)。在那种情况下，靶向配体或显像剂将通常共价连接至支化聚合物。靶向配体或显像剂可以共
价连接至支撑部分、支化聚合物的嵌段共聚物链，或它们的组合。

[0170] 在一个实施方式中，支化聚合物可以因此方便地由以下式(A14)-(A16)表示：

[0171]

[0172] 其中，SM代表支撑部分，BcPA代表嵌段共聚物链，X代表靶向配体或显像剂，在式(A16)的情况下，每个X可以相同或不同，以及v是大于或等于3的整数。

[0173] 可以连接至支化聚合物的适合的靶向配体的实例包括糖和获自那些糖的寡糖、肽、蛋白质、适体和胆固醇。适合的糖的实例包括半乳糖、甘露糖、和葡糖胺。适合的肽的实例包括铃蟾肽(bobesin)、黄体生成素(黄体化激素)释放肽、细胞穿透肽(CPP’s)、GALA
肽、流感源性促融合肽(influenza-derived fusogeneic peptides)、RGD肽、聚(精氨酸)、聚(甜菜碱)、穿膜肽、tat肽和转运肽(transportan)。其他配体，如可以靶向癌细胞的
叶酸，也可以连接至支化聚合物。适合的蛋白质的实例包括转移鱼精蛋白(transferring
protamine)，和抗体如抗EGFR抗体和抗-K-ras抗体。
TM

[0174] 可以连接至支化聚合物的适合显像剂的实例包括Polyfluor (甲基丙烯酰氧基乙基氨基硫羰基罗丹明B)、Alexa Flour 568，以及BOPIDY染料。

[0175] 为了进一步说明根据本发明的支化聚合物的性质，参照图1，其中，代表支撑部分，—代表普通共价键，代表可生物降解的共价连接(结合，couple)或连接(键连，
linking)部分，代表阳离子聚合物嵌段，并且代表亲水性聚合物嵌段。因此，结构
(A)示出了支化聚合物，其中，每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段的6个线性嵌段共聚物链，通过可生物降解的共价连接而连接至支撑部分。在这种情况
下，阳离子聚合物嵌段直接连接至可生物降解的共价连接。因此，结构(B)示出了支化聚合物，其中，每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段的6个线性嵌段
共聚物链，通过可生物降解的共价连接而连接至支撑部分。在这种情况下，亲水性聚合物嵌段直接连接至可生物降解的共价连接。因此，结构(C)示出了支化聚合物，其中，每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段的6个线性嵌段共聚物链连接至支
撑部分。在这种情况下，每条链具有(i)直接连接至支撑部分的阳离子聚合物嵌段，以及
(ii)通过可生物降解的共价连接而直接连接的两个阳离子聚合物嵌段。因此，结构(D)示
出了支化聚合物，其中，每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段的6个支化嵌段共聚物链，通过可生物降解的共价连接而连接至支撑部分。在这种情况下，阳离子聚合物嵌段直接连接至可生物降解的共价连接。因此，结构(E)示出了支化聚合物，其
中，每一个包括共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段的6个支化嵌段共聚物
链，通过可生物降解的共价连接而连接至支撑部分。在这种情况下，阳离子聚合物嵌段直接连接至可生物降解的共价连接。

[0176] 可以通过任何适合的方法制备支化聚合物。

[0177] 在一个实施方式中，制备支化聚合物的方法包括烯键式(ethylenically)不饱和单体的聚合反应。优选地，使用活性聚合反应技术进行烯键式不饱和单体的聚合反应。

[0178] 在本领域中，通常将活性聚合反应认为是其中基本上不存在不可逆的链终止的链聚合反应的形式。活性聚合反应的重要特征在于：当提供支持聚合反应的单体和反应条件
时，聚合物链将继续增长。通过活性聚合反应制备的聚合物链能够有利地表现出限定很好
的分子结构、预定的分子量和窄分子量分布或低多分散性。

[0179] 活性聚合反应的实例包括离子聚合反应和受控自由基聚合反应(CRP)。CRP的实例包括但不限于，引发-转移-终止剂聚合反应(iniferter polymerisation)、稳定的自由
基介导聚合反应(SFRP)、原子转移自由基聚合反应(ATRP)，和可逆加成断裂链转移(RAFT)
聚合反应。

[0180] 本领域技术人员熟知用于进行活性聚合反应的设备、条件和试剂。

[0181] 在通过活性聚合反应技术聚合烯键式不饱和单体时，通常将必须使用所谓的活性聚合反应试剂。“活性聚合反应试剂”是指可以参与并且控制或者介导一种或多种烯键式不饱和单体的活性聚合反应以形成活性聚合物链的化合物(即，根据活性聚合反应技术已经
形成的聚合物链)。

[0182] 活性聚合反应试剂包括但不限于，促进选自离子聚合反应和CRP的活性聚合反应技术的那些。

[0183] 在本发明的一个实施方式中，使用离子聚合反应制备支化聚合物。

[0184] 在本发明的一个实施方式中，使用CRP制备支化聚合物。

[0185] 在本发明的一个进一步的实施方式中，使用引发-转移-终止剂聚合反应制备支化聚合物。

[0186] 在本发明的另一个实施方式中，使用SFRP制备支化聚合物。

[0187] 在本发明的一个进一步实施方式中，使用ATRP制备支化聚合物。

[0188] 在本发明的一个更进一步的实施方式中，使用RAFT聚合反应制备支化聚合物。

[0189] 通过RAFT聚合反应形成的聚合物可以方便地被为RAFT聚合物。由于聚合反应机理，这种聚合物将包括促进单体的聚合反应的RAFT试剂的残基。

[0190] 根据本发明适合使用的RAFT试剂包括硫羰硫基基团(其是由-C(S)S-表示的二价部分)。在许多出版物，如WO 98/01478,Moad G.；Rizzardo,E；
Thang S,H.Polymer 2008,49,1079-1131 和 Aust.J.Chem.,2005,58,379-410；Aust.
J.Chem.,2006,59,669-692；和Aust.J.Chem.,2009,62,1402-1472(通过引用，将其全部内
容合并于此)中描述了RAFT聚合反应和RAFT试剂。制备支化聚合物中使用的合适的RAFT
试剂包括黄原酸酯、二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯和三硫代碳酸酯化合物。

[0191] 根据本发明适合使用的RAFT试剂还包括由通式(I)或(II)表示的那些：

[0192]

[0193] 其中，Z和R是基团，并且R*和Z*分别是独立地选择使得试剂可以在一种或多种烯键式不饱和单体的聚合反应中起RAFT试剂的作用的x价和y价基团；x是≥1的整数；
以及y是≥2的整数。

[0194] 在一个实施方式中，x是≥3的整数；以及y是≥3的整数。在那种情况下，R*和Z*可以代表支撑部分(SM)。

[0195] 为了在一种或多种烯键式不饱和单体的聚合反应中起RAFT试剂的作用，本领域技术人员将理解的是，R和R*通常将是可选取代的有机基团，所述可选取代的有机基团在
应用的聚合条件下起自由基离去基团的作用，并且作为自由基离去基团，还保持再引发聚
合反应的能力。本领域技术人员还将理解的是，Z和Z*将通常是可选取代的有机基团，所
述可选取代的有机基团用于针对自由基加成，在RAFT试剂中产生C＝S部分的适当高反
应性，而没有将RAFT加合物(加成物)自由基的断裂速度减慢至过度地妨碍聚合反应的程
度。

[0196] 在式(I)中，R*是x价基团，x是≥1的整数。因此，R*可以是一价、二价、三价或更高价。例如，R*可以是C20烷基链，式(I)中描绘的RAFT试剂的剩余部分以悬垂于链的
多取代基基团存在。通常，x将是范围从l至约20，例如，从约2至约10，或从1到约5的
整数。在一个实施方式中，x＝2。

[0197] 类似地，在式(II)中，Z*是y价基团，y是≥2的整数。因此，Z*可以是二价、三价或更高价。通常，y将是范围从2至约20，例如，从约2至约10，或从2至约5的整数。

[0198] 根据本发明使用的RAFT试剂中R的实例包括可选取代的(以下基团)，并且在根据本发明使用的RAFT试剂中R*的情况下，包括x价形式的可选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、碳环基、杂环基、杂芳基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、酰硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基烯基、烷基炔基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、烯氧基烷基、炔氧基烷基、芳氧基烷基、烷酰基氧基、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、烯硫基烷基、炔硫基烷基、芳硫基烷基、烷基酰硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳硫基、烷基烯基烷基、烷基炔基烷基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基烯基芳基、芳基炔基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、烯氧基芳基、炔氧基芳基、芳氧基芳基、烷硫基芳基、烯硫基芳基、炔硫基芳基、芳硫基芳基、芳基酰硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基、芳基杂芳硫基和聚合物链。

[0199] 为了避免任何怀疑，在此，提及的“可选取代的”烷基、烯基等旨在意指各基团如烷基和烯基是可选取代的。

[0200] 根据本发明使用的RAFT试剂中R的实例还包括可选取代的(以下基团)，并且根据本发明使用的RAFT试剂中的R*的情况也包括x价形式的可选取代的烷基；饱和、不饱和
的或芳香族碳环或杂环；烷硫基；二烷基氨基；有机金属种类(species)；和聚合物链。

[0201] 在本领域中，包括聚合物链的活性聚合反应试剂通常称作“大(大分子，macro)”活性聚合反应试剂。在给定的活性聚合反应试剂控制下，通过聚合一种或多种烯键式不饱和单体，可以方便地制备这种“大”活性聚合反应试剂。

[0202] 在一个实施方式中，在RAFT试剂控制下，通过聚合烯键式不饱和单体，形成这种聚合物链。

[0203] 根据本发明使用的RAFT试剂中Z的实例包括可选取代的，并且根据本发明使用的RAFT试剂中Z*的情况包括y价形式的可选取代的F、、Cl、Br、I、烷基、芳基、酰基、氨基、碳环基、杂环基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、酰氨基、碳环氧基、杂环氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、酰硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、烷基芳基、烷基酰基、烷基碳环基、烷基杂环基、烷基杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、烷基酰基氧、烷基碳环氧基、烷基杂环氧基、烷基杂芳氧基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基酰硫基、烷基碳环硫基、烷基杂环硫基、烷基杂芳硫基、烷基芳基烷基、烷基酰基烷基、芳基烷基芳基、芳基酰基芳基、芳基酰基、芳基碳环基、芳基杂环基、芳基杂芳基、芳氧基芳基、芳基酰氧基、芳基碳环氧基、芳基杂环氧基、芳基杂芳氧基、烷硫基芳基、芳硫基芳基、芳基酰硫基、芳基碳环硫基、芳基杂环硫基、芳基杂芳硫基、二烷氧基-、二杂环氧基-、或二芳氧基-磷酰基、二烷基-、二杂环基-、或二芳基-磷酰基、氰基(即，-CN)、和-S-R，其中，R如关于式(II)所定义的。

[0204] 在一个实施方式中，根据本发明使用的RAFT试剂是三硫碳酸酯RAFT试剂并且Z或Z*是可选取代的烷硫基基团。

[0205] 根据本发明适合使用的大(大分子，macro)RAFT试剂可以商业地获得，例如参见在SigmaAldrich目录中描述的那些(www.sigmaaldrich.com)。

[0206] 根据本发明可以使用的其他RAFT试剂包括WO 2010/083569和Benaglia etal,Macromolecules.(42),9384-9386,2009中描述的那些(通过引用，将其全部内容合并
于此)。

[0207] 在一个实施方式中，使用RAFT聚合反应形成支化聚合物的至少三个嵌段共聚物臂。

[0208] 在本文中，在Z、Z*、R和R*可以选自其的限定基团的列表中，每个烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基和聚合物链部分可以是可选取代的。

[0209] 在本文中，Z、Z*、R和R*可以选自其的限定基团的列表中，在给定的Z、Z*、R或R*包括两个或更多亚基团(例如，[基团A][基团B])时，亚基团的顺序并不旨在局限于它们所呈现的顺序(例如，烷基芳基也可以被认为是提及了芳基烷基)。

[0210] Z、Z*、R或R*可以是支化的和/或可选取代的。在Z、Z*、R或R*包括可选取代的烷基部分时，可选的取代基包括其中烷基链中的-CH2-基团被选自以下的基团所取
a a
代，-O-、-S-、-NR-、-C(O)-(即，羰基)、-C(O)O-(即，酯)、和-C(O)NR-(即，酰胺)，其中，a
R 可以选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基和酰基。

[0211] 在此，提及x价、y价、多价或二价“形式的...”旨在意指指定基团分别是x价、y价、多价或二价基团。例如，在x或y是2时，指定基团旨在是二价基团。本领域技术人员将理解，如何在提供更高价的形式中应用该理论。

[0212] 支化聚合物的制备通常将涉及烯键式不饱和单体的聚合反应。在本领域中很好地记载了确定烯键式不饱和单体可共聚性的因素。例如，参见：Greenlee,R.Z.,in Polymer rd
Handbook 3 edition(Brandup,J,and Immergut.E.H.Eds)Wiley:New York,1989,p
II/53(通过引用，将其全部内容合并于此)。

[0213] 可以用于制备支化聚合物的烯键式不饱和单体的合适的实例，包括式(III)中的那些：

[0214]1 1 1 1 1

[0215] 其中，U和W独立地选自-CO2H、-CO2R、-COR、-CSR、CSOR、-COSR、-CONH2、-CONHR1 1
、-CONR2、氢、卤素和可选取代的C1-C4烷基或U和W一起形成自身可以被可选取代的内酯、
1 1
酸酐或酰亚胺环(imide ring)，其中，可选的取代基独立地选自羟基、-CO2H、-CO2R、-COR、-
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CSR、-CSOR、-COSR、-CN、CONH2、-CONHR、-CONR2、-OR、-SR、-O2CR、-SCOR、和-OCSR ；
1 1 l 1 1 l 1 1

[0216] V选自氢、R、-CO2H、-CO2R、-COR、-CSR、-CSOR、-COSR、-CONH2、-CONHR、-CONR2、-1 1 l 1 1
OR、-SR、-O2CR、-SCOR、和-OCSR ；
1 1

[0217] 其中，R 或每个R 独立地选自可选取代的烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的芳基、可选取代的杂芳基、可选取代的碳环基、可选取代的杂环基、可选取代的芳基烷基、可选取代的杂芳基烷基、可选取代的烷基芳基、可选取代的烷基杂芳基、和可选取代的聚合物链。

[0218] 式(III)的单体的具体实例包括以下中的一个或多个中描述的那些：WO2010/083569,WO 98/01478,Moad G.；Rizzardo,E；Thang S,H:Polymer2008,49,1079-1131和 Aust.J.Chem.,2005,58,379-410；Aust.J.Chem.,2006,59,669-692；Aust.J.Chem.,2
rd
009,62,1402-1472,Greenlee,R.Z.,inPolymer Handbook 3 edition(Brandup,J,and
Immergut.E.H.Eds)Wiley:New York,1989,p II/53 以及 Benaglia et
al,Macromolecules.(42),9384-9386,2009(通过引用，将其全部内容合并于此)。

[0219] 当讨论可以用于制备支化聚合物的单体的类型时，可以方便地将单体称为具有亲水、疏水或阳离子特性。在该上下文中，亲水、疏水或阳离子“特性”是指在聚合反应时，这些单体分别(直接或间接地)产生形成嵌段共聚物臂的亲水、疏水和阳离子聚合物嵌段。例
如，通常通过聚合包括亲水单体的单体组分制备形成部分嵌段共聚物臂的亲水性聚合物嵌
段。

[0220] 仅仅作为指导，亲水烯键式不饱和单体的实例包括但不限于，丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、低聚(亚烷基二醇)甲基醚(甲基)丙烯酸酯
(OAG(M)A)、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、丙烯酸羟乙酯、N-甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、N,N-二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺、N-羟丙基甲
基丙烯酰胺、4-丙烯酰基吗啉、2-丙烯酰胺-2-甲基-l-丙磺酸、磷酰胆碱甲基丙烯酸酯和
N-乙烯基吡咯烷酮。

[0221] 在如之前描述的，使用的单体产生阳离子聚合物嵌段时，如此形成的聚合物嵌段可以不固有地处于带电荷的阳离子状态。换句话说，聚合物嵌段可以需要与一个或多个其
他化合物反应以被转换成带电荷的阳离子状态。例如，所选择的形成阳离子聚合物嵌段的
单体，可以包括叔胺官能团。在聚合单体以形成阳离子聚合物嵌段时，叔胺官能团随后可以被四价化至正电荷状态。

[0222] 仅仅作为指导，阳离子烯键式不饱和单体的实例包括但不限于，甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、丙烯酸N,N二甲基氨基乙酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]
甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]丙
烯酰胺、N-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-N-吗啉代乙酯、甲基丙
烯酸2-N-吗啉代乙酯、丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨
基)乙酯、甲基丙烯酸2-(N,N-二乙基氨基)乙酯、2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、甲基
丙烯氨丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、烯丙基二甲基氯化铵、2-(二乙基氨基)乙基苯乙烯、2-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶。

[0223] 仅仅作为指导，疏水烯键式不饱和单体的实例包括但不限于，苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸戊酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙
烯酸月桂酯、甲基丙烯酸十八烷酯、甲基丙烯酸乙基己酯、甲基丙烯酸巴豆酯(crotyl
methacrylate)、甲基丙烯酸肉桂酯、甲基丙烯酸油基酯(oleyl methacrylate)、甲
基丙烯酸蓖麻油酯(ricinoleyl methacrylate)、甲基丙烯酸胆甾酯(cholesteryl
methacrylate)、丙烯酸胆甾酯(cholesteryl acrylate)、丁酸乙烯酯、叔丁酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯和月桂酸乙烯酯。

[0224] 在亲水烯键式不饱和单体OAG(M)A的情况下，亚烷基部分将通常是C2-C6，例如C2或C3亚烷基部分。本领域技术人员将理解的是，与“(亚烷基二醇)”相关的“低聚”术语是指存在多个亚烷基二醇单元。通常，OAG(M)A的低聚组分将包括约2至约200，例如从约2
至约100，或从约2至约50，或从约2至约20个亚烷基二醇重复单元。

[0225] 嵌段共聚物臂的亲水性聚合物嵌段可以因此被描述为包括亲水烯键式不饱和单体的聚合残基。

[0226] 嵌段共聚物臂的阳离子聚合物嵌段可以因此被描述为包括阳离子烯键式不饱和单体的聚合残基。

[0227] 嵌段共聚物臂的疏水性聚合物嵌段可以因此被描述为包括疏水烯键式不饱和单体的聚合残基。

[0228] 在自由基聚合反应技术用于聚合一种或多种烯键式不饱和单体以形成至少部分嵌段共聚物臂时，聚合反应通常将需要来自于自由基源的引发。

[0229] 引发自由基的来源可以由产生自由基的任何合适的方法提供，如热诱导的合适化合物的均裂(热引发剂，如过氧化物、过氧酯或偶氮化合物)、来自单体的自发形成(例
如，苯乙烯)，氧化还原反应引发系统、光化学引发系统或高能辐射，如电子束、X-射线或γ-射线。例如，这种引发剂的实例可以在以下中发现，例如，WO 2010/083569和Moad and Solomon"The Chemistry of Free Radical Polymerisation",Pergamon,London,1995,pp5
3-95(通过引用，在将其全部内容合并于此)。

[0230] 可以使用本领域已知的技术构建支化聚合物。例如，使用合适的聚合反应首先形成聚合物的嵌段共聚物臂，之后，连接至合适的支撑部分。该技术被称为“连接至上
(coupling onto)”方法。

[0231] 可替换地，通过从合适的支撑部分直接聚合单体，可以形成聚合物的嵌段共聚物臂。该技术被称为“核心第一(core ﬁrst)”方法。

[0232] 也可以使用连接至上方法和核心第一方法的组合。例如，可以直接从合适的支撑部分聚合单体，以形成阳离子聚合物嵌段(核心第一)。然后，预形成的亲水性聚合物嵌段
可以连接至阳离子聚合物嵌段，以形成嵌段共聚物臂(连接至上)。

[0233] 在应用核心第一方法时，在一个实施方式中，使用通式(IV)的活性聚合反应试剂可以制备支化聚合物：

[0234]

[0235] 其中，SM代表支撑部分，LM代表连接部分(如果存在)，LPG代表活性聚合反应基团，x是0或1，并且v是大于或等于3的整数。

[0236] 在一个实施方式中，LPG选自促进活性离子聚合反应或受控自由基聚合反应的基团。在LPG促进受控自由基聚合反应时，其可以方便地被表示为CRPG。

[0237] 在一个实施方式中，CRPG选自促进引发-转移-终止剂聚合反应、SFRP聚合反应、ATRP、或RAFT聚合反应的基团。

[0238] 在CRPG促进RAFT聚合反应时，式(IV)可以方便地由式(V)表示：

[0239]

[0240] 其中，SM代表支撑部分，LM代表连接部分(如果存在)，Ra代表如在本文中关于式(I)所定义的二价形式的R*，Z是如在本文中关于式(I)所定义的，x是0或1，并且v是
a
大于或等于3的整数。将理解的是，通式(V)中的LM和R 可以一起用于将活性RAFT部分
(即，S-C(S)-Z)连接至支撑部分SM。因此，通式(V)中的LM的作用是识别可能存在或可
能不存在的分子结构的特征，并且如果存在，可能是或可能不是可生物降解的。通式(V)中a
的R 也可以是可生物降解的，但是该功能不是必不可少的。相反，LM(当存在时)出现在通
式(V)中，具体为了选择其是可生物降解的。

[0241] 在一个实施方式中，通式(V)的特征各自独立地由以下定义：SM，选自烷基、芳基、杂环基、杂芳基和配位络合物；LM，通过选自以下的一种或多种官能团是可生物降解的：酯、酸酐、碳酸酯、过氧化物、过氧酯、磷酸酯、硫酯、脲、硫尿烷、醚、二硫化物、氨基甲酸酯a
(尿烷)和硼酸酯；R，选自二价形式的可选取代的烷基、芳基、杂环基、杂芳基(其中，优选的可选取代基包括在本文中定义的那些，并且尤其是烷基和氰基)；以及Z，选自可选取代
的烷基、芳基、烷硫基、和芳硫基(其中，优选的可选取代基包括在本文中定义的那些，并且尤其是烷基和氰基)。

[0242] 将理解的是，LM是“通过一个或多个官能团可生物降解的”是指这些官能团直接形成提供共价连接的部分原子串。换句话说，这些官能团中的至少一个原子存在于共价连接聚合物的相关部分的直接的原子串中(例如，支撑部分至嵌段共聚物链)。

[0243] 在另一个实施方式中，通式(V)具有结构(Va)或(Vb)：

[0244]

[0245] 本发明还提供了包含支化聚合物和核酸分子的复合物。如在本文中使用的，术语“复合物”是指支化聚合物和核酸分子通过离子键合的结合。通过与支化聚合物的阳离子聚合物嵌段和核酸分子相关的相反电荷的离子之间的静电吸引得到离子键合。将理解的是，
阳离子聚合物嵌段将提供正电荷，并且相应地，核酸分子将提供负电荷，以促进所需的静电吸引和复合物的形成。

[0246] 核酸分子上的净负电荷将通常获自带负电荷的核酸本身(例如，获自磷酸酯基团)。对核酸分子所做的任何修饰都应当保持一定程度的净负电荷，使得其允许通过与支化聚合物的离子键合而形成复合物。

[0247] 在不希望受理论限制的情况下，支化聚合物和核酸分子被认为通过核酸分子的负电荷骨架和支化聚合物的阳离子嵌段之间的离子相互作用形成纳米颗粒。取决于给定的支
化聚合物中的阳离子电荷的数目，一个或多个核酸分子可以与聚合物结合形成复合物，并
且复合的核酸分子的数目随着聚合物中臂/分支的数目的增加而增加。因此，支化聚合物
可以具有的优势在于，与它们的线性对应物相比，每个支化聚合物分子可以复合更多核酸
分子。此外，支化聚合物，由于在每个聚合物分子中存在多个阳离子嵌段，使得能够与在两个或更多支化聚合物分子之间起桥联分子作用的核酸分子形成大复合物结构。

[0248] 使用用于制备阳离子聚合物/核酸分子复合物的已知技术，可以制备包括支化聚合物和核酸分子的复合物。例如，可以将悬浮于水中的需要量的聚合物引至包含还原的血
清介质如的容器中。之后，可以将需要量的核酸分子引至该溶液中，并且将
所得混合物涡旋适当量的时间以形成复合物。

[0249] 核酸分子可以商业地获得，或可以使用本领域中熟知的技术制备或分离。

[0250] 关于核酸分子与可以用于形成复合物的支化聚合物的比例，不存在特别的限制。本领域技术人员将理解的是，支化聚合物和核酸分子的电荷密度(如通过ζ电位(zeta
potential)表示的)，与支化聚合物和核酸分子的比率一起，将影响所得复合物的整体电
荷/中性状态。

[0251] 在一个实施方式中，复合物具有正ζ电位。在进一步的实施方式中，复合物具有范围从大于0mV至约50mV，例如，从约10mV至约40mV，或从约15mV至约30mV，或从约20mV
至约25mV的正ζ电位。

[0252] 根据本发明的复合物的ζ电位是如通过Malvern Zetasizer测量的。从电场中颗粒的迁移率(电泳迁移率)和样品中粒度分布的测量，计算ζ电位。

[0253] 在本文中使用的术语“核酸分子”是指包括以下的核酸分子：DNA(gDNA、cDNA)、寡核苷酸(双链或单链)、RNA(正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微RNA(miRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类复合物和本文中描述的其他这种分子。为了避免怀疑，术语“核酸分子”包括非天然存在的修饰形式，以及天然存在的形式。

[0254] 在一些实施方式中，核酸分子包括从约8至约80个核碱基(即，从约8至约80个连续连接的核酸)。本领域普通技术人员将理解的是，本发明包括了长度为以下的核酸分
子：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53，54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或80个核碱基。

[0255] 术语“核酸分子”也包括化合物的其他家族，如寡核苷酸类似物，嵌合、混合(杂合，hybrid)和模拟形式。

[0256] 嵌合低聚化合物也可以形成为两个或更多个核酸分子的复合结构，包括但不限于，寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷和寡核苷酸模拟物。通常使用的嵌合化合物包括但不限于杂合物(hybrid)、半混物(半体，hemimer)、间隙物(gapmer)、扩展间隙物(extended gapmer)、颠倒间隙物(inverted gapmer)和嵌段物(blockmer)，其中，各种点修饰和/或
区域选自天然或修饰的DNA和RNA类型单元和/或模拟类型亚单元，如，例如锁核酸(LNA)、
肽核酸(PNA)、吗啉基以及其他。例如，美国专利号5,013,830、5,149,797、5,220,007、
5,256,775、5,366,878、403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、
5,652,356、以及5,700,922中描述了这种混合物结构的制备，通过引用，将每一个的全部
内容合并于此。

[0257] RNA和DNA适体也被考虑在内。适体是通过相互作用(不是经典的Watson-Crick碱基配对)，对非核酸或核酸分子具有特异性结合亲和性的核酸分子。例如，美国专利
号5,475,096、5,270,163、5,589,33.2、5,589,332和5,741,679中描述了适体。已经研
发并且已经表征了识别它们的非核酸靶标的增加数目的DNA和RNA适体(参见，例如，
Gold et al.,Annu.Rev.Biochem.,64:763-797.1995；Bacher et al.,Drug Discovery
Today,3(6):265-273,1998)。

[0258] 可以对核酸分子进行进一步的修饰，并且可以包括附接至末端之一、选定的核碱基位置、糖位置或内核苷连接之一的共轭基团(conjugate group)。

[0259] 本发明也提供了将核酸分子递送至细胞的方法，所述方法包括：

[0260] (a)提供包括支化聚合物和核酸分子的复合物，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其中：

[0261] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0262] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的；以及

[0263] (b)将复合物递送至细胞。

[0264] 该方法可以体内、离体(离体回输，ex vivo)或体外进行。

[0265] 本发明进一步提供了基因治疗的方法，包括如在本文中描述的，给需要其的受试者给药根据本发明的治疗有效量的核酸分子复合物。

[0266] 例如，当在遗传病如囊性纤维化、血友病和血红蛋白病(globinopathies)，如镰形细胞贫血和β-地中海贫血的背景下研究时，作为基因治疗的DNA修复和介导重组的相关性是明显的。例如，如果靶基因包含引起遗传疾病的突变，那么将核酸分子递送至受试者的细胞中可以有用于促进突变修复，以将异常靶基因的DNA序列恢复到正常。可替换地，引入至受试者的细胞中的核酸分子可以导致否则在疾病状态中抑制或沉默的基因的表达。这种
核酸分子可以自身编码沉默或抑制基因，或者它们可以激活否则抑制或沉默的靶基因的转
录和/或翻译。

[0267] 本领域技术人员将理解的是，使用本发明的方法待治疗的疾病或状况可以是能够通过基因治疗而治疗的任何疾病或状况，并且待使用的基因物质(即，核酸分子)的选择将
清楚地取决于特定的疾病或状况。可以被治疗的疾病或状况包括但不限于，癌症(例如，骨髓紊乱)、地中海贫血、囊性纤维化、耳聋、视觉障碍(例如，莱贝尔先天性黑矇)、糖尿病、亨廷顿病、X染色体连锁性严重联合免疫缺陷病和心脏病。可替换地，基因疗法可以被用于引入非内源性基因，例如，生物发光基因，或者引入敲除内源性基因的基因(例如，RNA干扰)。

[0268] 本领域技术人员还将理解的是，核酸分子的性质常常取决于待治疗或预防的疾病或状况。例如，通过将本发明的核酸分子复合物递送至受试者(以靶向或非靶向方法)，可
以治疗或预防至少部分归因于纤维变性细胞外基质物质(例如，II型胶原)的累积的疾病
或状况，其中，核酸分子(例如，siRNA)能够沉默编码细胞外基质物质的基因。在一些实施方式中，疾病或状况是传染病、炎症性疾病、或癌症。

[0269] 在体内进行根据本发明的核酸分子复合物至细胞的递送时，通过在该情况下适当的任何给药途径，可以将核酸分子复合物引入至细胞。例如，在旨在系统递送时，复合物可以静脉内给药、皮下给药、肌肉给药、口服给药等。可替换地，通过本领域技术人员已知的方法，复合物可以靶向特定细胞或细胞类型。出于多种原因如，例如，对于靶癌细胞，如果核酸分子对于非癌症细胞具有不可接受的毒性，或如果其将另外需要过高剂量，靶向可以是可
期望的。通过本领域技术人员已知的任何方法，可以实现靶向递送，包括但不限于，受体介导的靶向或通过将核酸复合物直接给予包含靶细胞的组织。

[0270] 例如，通过将核酸分子结合至蛋白质配体，例如，通过聚赖氨酸，可以实现受体介导的靶向。通常根据在靶细胞/组织类型的表面上相应配体受体的存在来选择配体。这些配体核酸分子结合物可以与根据本发明的支化聚合物复合并且根据需要而系统地给药
(例如，静脉内地)，其中，它们将被导向受体结合发生的靶细胞/组织。

[0271] 在一个实施方式中，离体进行根据本发明的核酸分子至细胞的递送方法。例如，从受试者分离细胞，并且用本发明的核酸分子复合物离体引入以产生包含外源核酸分子的细胞。可以从待治疗的受试者或从同基因的(同源的，syngeneic)宿主中分离细胞。之后，
为了治疗或预防的目的，将细胞重新导回受试者中(或到同基因的受体中)。在一些实施方
式中，细胞可以是造血祖细胞(hematopoietic progenitor)或干细胞。

[0272] 在一个实施方式中，为了沉默(或抑制)基因表达的目的，将核酸分子递送至细胞。在一些实施方式中，通过降低翻译效率或降低信息稳定性或这些效应的组合来沉默基
因表达。在一些实施方式中，未加工的RNA的剪接是导致无功能或较低活性蛋白质的生产
的预定目标。

[0273] 在一些实施方式中，通过将DNA分子递送至细胞来沉默基因表达，包括但不限于，gDNA、cDNA以及DNA寡核苷酸(双链或单链)。

[0274] 在一些实施方式中，通过RNA干扰(RNAi)沉默基因表达。在没有将本发明限制于特定理论或作用模式的情况下，“RNA干扰”通常描述基于降解或另外地防止mRNA翻译，例如，以序列特异性方式的沉默基因表达的机理。本领域技术人员将理解的是，外源性干扰
RNA分子可以导致mRNA降解或者mRNA翻译抑制。在一些实施方式中，通过改变读码框以引
入一个或多个导致无义介导衰变的提前终止密码子(premature stop codon)来实现RNA
干扰。

[0275] RNAi包括涉及通过靶mRNA降解在基因表达中导致序列特异性降低的双链(正义和反义)RNA的基因沉默的过程。通常通过短双链siRNA或者单链微RNA(miRNA)介
导RNAi。在一些实施方式中，当来自这些分子中的任何一个的RNA链形成靶向互补
RNA并且抑制翻译的被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的复合物时，RNAi被启动。可
以将该方法用于研究目的和治疗应用(参见，例如，lzquierdo et al.,Cancer Gene
Therapy,12(3):217-27,2005)。

[0276] 也已经描述了具有RNA类性质的其他寡核苷酸，并且可以开发更多不同类型的RNAi。例如，反义寡核苷酸已经被用于改变外显子使用并且被用于调整前体RNA剪接(参
见，例如，Madocsai et al.,Molecular Therapy,12:1013-1022,2005和Aartsma-Rus et
al.,BMC Med Genet.,8:43,2007)。反义和iRNA化合物可以是双链或单链寡核苷酸，其是
特异地杂交至感兴趣的靶基因的DNA或RNA的RNA或RNA类(RNA样，RNA-like)或DNA或
DNA类(DNA样，DNA-like)分子。

[0277] 适合用于本发明的上下文中的RNA分子的实例包括但不限于：

[0278] (i)长双链RNA(dsRNA)-这些通常由于通过它们自身的载体各自单独转录的正义RNA链和反义RNA链的杂交而产生。这种双链分子通常不以发夹环为特征。这些分子需要
由酶如Dicer断裂，以产生短干扰RNA(siRNA)双链体(duplexes)。该断裂事件优选在其中
dsRNA被转录的细胞中发生。

[0279] (ii)发夹双链RNA(发夹dsRNA)-这些分子表现出茎-环结构并且通常是具有通过核苷酸间隔区如内含子分开的反向重复序列的构建体转录的结果。这些分子通常是更长
的RNA分子，需要发夹环断裂并且形成的线性双链分子通过酶Dicer断裂以产生siRNA。该
类型分子具有通过单个载体可表达的优势。

[0280] (iii)短干扰RNA(siRNA)-这些可以被合成产生，或通过其自身启动子和4-5个胸苷转录终止位点为各自特征的包括串联的正义和反义链的载体的基于启动子的表达而重
组表达。这能够使得产生随后退火的两个单独的转录本。在一些实施方式中，这些转录本
可以是长度为20-25个核苷酸的量级。因此，在RNA干扰途径中，这些分子不需要进一步断
裂以使得能够实现它们的功能。

[0281] (iv)短发夹RNA(shRNA)-这些分子也称为“小发夹RNA”并且长度通常类似于siRNA分子，但是排除它们包括反向重复序列的RNA分子，反向重复通过核苷酸间隔子
(spacer)分离。在发夹(环)区域断裂之后，生成功能性siRNA分子。

[0282] (v)微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)-通常将miRNA和stRNA理解为代表天然存在的、内源表达的分子。因此，尽管旨在模拟miRNA活性的分子的设计和给药，将采用合成生成或重组表达siRNA分子的形式，然而通过表现基本上相同的RNA序列和整体结构，本发
明仍然扩展至旨在模拟miRNA、pri-miRNA(初级-miRNA、前前体miRNA)或pre-miRNA(前
体-miRNA)分子的寡核苷酸的设计和表达。这种重组产生的分子，可以被称为miRNA或者
siRNA。

[0283] (vi)介导空间发育(sdRNA)、胁迫响应(srRNA)或细胞周期(ccRNA)的miRNA。

[0284] (vii)设计以杂交内源性表达miRNA或stRNA或外源性引入的siRNA并防止内源性表达miRNA或stRNA或外源性引入的siRNA的功能的RNA寡核苷酸。在一些实施方式
中，将理解的是，这些分子不是设计以激活RNA干扰机制，而是阻止通过存在于细胞内环境的miRNA和/或siRNA向上调节该路径。就它们对杂交至其的miRNA的影响而言，这反映
了更经典的反义抑制。

[0285] 提及“RNA寡核苷酸”应当被理解为提及具有双链或单链并且能够诱导指向沉默靶基因表达的RNA干扰机理的RNA核酸分子。在这方面，所述寡核苷酸可以能够直接调整RNA干扰机理，或其可以要求进一步处理，如具有以下特征：(i)发夹双链RNA，需要切除发夹区域，(ii)需要通过dicer断裂的较长的双链RNA分子，或(iii)类似需要断裂的前体分子
如pre-miRNA。受试者寡核苷酸可以是双链的(如在影响RNA干扰的背景下是典型的)或
单链的(如可以是如果仅仅寻求生产适合用于结合内源表达基因的RNA寡核苷酸的情况)。

[0286] 在其他实施方式中，核酸分子抑制翻译引发、在剪接供体位点或剪接受体位点下的剪接。在其他实施方式中，剪接修饰改变读码框并且引发无义介导的转录本降解。

[0287] 将理解的是，本领域技术人员可以确定根据本发明使用并且针对任何给定的情况的最适合的核酸分子。例如，尽管优选的是RNA分子对于其靶核酸序列表现出100％的互
补性，RNA分子可以表现出一定程度的错配，使得能够以序列特异性方式进行充分杂交以诱导RNA干扰反应。因此，优选的是，RNA分子包括与靶核酸序列的至少70％序列互补性，更
优选地，至少90％互补性，并且甚至更优选地，95％、96％、97％、98％、99％或100％序列互补性。

[0288] 在关于根据本发明适合使用的核酸分子的设计的另一个实施例中，在本领域技术人员的技术内的是确定分子的特定结构和长度，例如，其是否采取dsRNA、发夹dsRNA、
siRNA、shRNA、miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA的形式或如在本文中描述的任何其他的适合形式。例如，通常理解的是，就实现基因沉默而言，例如，与利用两种结构分别编码正义和反义RNA链生成的双链DNA相比，茎-环RNA结构如发夹dsRNA和shRNA通常更为有效。此外，
插入间隔区的性质和长度能够影响给定的茎-环RNA分子的功能。在又一个实施例中，如果
在特定细胞环境的背景下存在可能发生干扰素反应的风险(这在使用长dsRNA时比其中使
用短dsRNA分子时是更为显著的风险)，需要通过酶如Dicer断裂的长dsRNA或短dsRNA(如
siRNA或shRNA)的选择可以是相关的。在仍又另一个实施例中，是否需要使用单链或双链
核酸分子也将取决于寻找的功能结果。例如，就用反义分子靶向内源性表达的miRNA来说，通常恰当的是，设计适合于特异性杂交至所述(目的，subject)miRNA的单链RNA寡核苷酸。
就寻求诱导RNA干扰而言，可能需要双链siRNA分子。在一些实施方式中，这可以被设计为
进行进一步断裂的长dsRNA分子或siRNA。

[0289] 术语“基因”以其最广义使用并且包括相对于基因外显子的cDNA。在此，提及的“基因”也包括：由转录和/或翻译调节序列和/或编码区域和/或非翻译序列(即，内含子，5′-和3′-未翻译序列)构成的经典基因组基因；或与编码区域(即，外显子)、pre-mRNA
和基因的5′-和3′-非翻译序列相对应的mRNA或cDNA分子。

[0290] 提及的“表达”是指对基因表达的广泛提及并且包括从基因或核酸分子，从前转录(pre-transcription)，通过转录和翻译至翻译后(post-translation)生成蛋白或RNA过程中的任何阶段。

[0291] 如在本文中使用的，“细胞”包括真核细胞(例如，动物细胞、植物细胞和真菌或原生生物的细胞)，和原核细胞(例如，细菌)。在一个实施方式中，细胞是人类细胞。

[0292] 如在本文中使用的，术语“受试者”是指动物或人受试者。“动物”是指灵长类动物、家畜(包括奶牛、马、羊、猪和山羊)、宠物(包括狗、猫、兔子和豚鼠)、捕获的野生动物(包括动物园环境中通常发现的那些)、和水生动物(包括淡水和咸水动物，如鱼和甲壳类动物)。实验室动物如兔子、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠也被考虑，因为它们可以提供方便的测试系统。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。

[0293] 复合物或组合物“给药”至受试者是指呈递试剂或组合物，使得其能够被或被转移至受试者。对给药模式没有特殊的限制，但这将通常通过口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌肉、静脉、鞘内、以及脊柱内的)、吸入(包括雾化)、直肠和阴道(vaginal)模式。

[0294] 在不受理论约束或限制的情况下，已经发现本发明的复合物保护核酸分子免于通过酶如RNA酶和/或DNA酶降解。

[0295] 因此，本发明也提供了保护核酸分子免于酶降解的方法，所述方法包括将核酸分子与支化聚合物复合，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩
展的至少三个嵌段共聚物链，其中：

[0296] (i)至少三个嵌段共聚物链的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水性
聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0297] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的每一个是可生物降解的。

[0298] 还提供了复合物用于将核酸分子递送至细胞的用途，复合物包括支化聚合物和核酸分子，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个
嵌段共聚物链，其中：

[0299] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0300] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0301] 本发明进一步提供了复合物用于沉默基因表达的用途，复合物包括支化聚合物和核酸分子，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三
个嵌段共聚物链，其中：

[0302] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏水
性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0303] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的至少一个是可生物降解的。

[0304] 在一个实施方式中，核酸分子选自DNA和RNA。在进一步的实施方式中，DNA和RNA选自gDNA、cDNA、双链或单链DNA寡核苷酸、正义RNA、反义RNA、mRNA、tRNA、rRNA、小/短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微RNA/小时序RNA(miRNA/stRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核(SnRNA)核酶、适体、DNA酶、核糖核酸酶类复合物、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、介导空间发育的miRNA(sdRNA)、胁迫响应
RNA(srRNA)、细胞周期RNA(ccRNA)和双链或单链RNA寡核苷酸。

[0305] 在不受理论约束或限制的情况下，已经发现本发明的复合物保护核酸分子免于通过酶如RNA酶和/或DNA酶降解。

[0306] 本发明进一步提供了支化聚合物在保护核酸分子免于酶降解中的用途，支化聚合物包括支撑部分和共价连接至所述部分并且从所述部分扩展的至少三个嵌段共聚物链，其
中：

[0307] (i)至少三个嵌段共聚物链中的每一个包括(a)共价连接至亲水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，或者(b)共价连接至疏水性聚合物嵌段的阳离子聚合物嵌段，所述疏
水性聚合物嵌段共价连接至亲水性聚合物嵌段；并且

[0308] (ii)与每一个所述嵌段共聚物链相关的所述共价连接中的每一个是可生物降解的。

[0309] 本发明也指向组合物如药用组合物，包括本发明的核酸分子复合物。在一些实施方式中，组合物将包括本发明的核酸分子复合物和一个或多个药学上可接受的载体、稀释
剂和/或赋形剂。

[0310] 在本发明的组合物中，核酸分子复合物通常配制用于以有效量给药。如在本文中使用的，核酸复合物的术语“有效量”和“治疗有效量”通常指在至少统计上显著数量的受试者中，在疗程(course)中提供期望的治疗或预防效果的复合物的足够的量。

[0311] 在一些实施方式中，人类受试者的有效量位于约0.1ng/kg体重/剂量至lg/kg体重/剂量的范围内。在一些实施方式中，范围是约1μg至1g、约1mg至1g、1mg至500mg、
1mg至250mg、1mg至50mg、或者1μg至1mg/kg体重/剂量。剂量方案被调整以适应紧急
情况并且可以被调整以产生最佳治疗或预防剂量。

[0312] “药学上可接受的”载体、赋形剂或稀释剂是指由非生物学或者其他不希望的物质组成的药用载体；即，该物质可以与本发明的复合物一起给予受试者，而不引起任何的或实质性的不良反应。

[0313] 本发明的方面包括针对传染疾病、炎症性疾病或者癌症用于治疗受试者的方法，所述方法包括将根据本发明的复合物给予受试者，或者将根据本发明的药用组合物给予受
试者。

[0314] 根据本发明的支化聚合物的重要特征是：存在在生物环境中对降解敏感的可生物降解的共价连接。根据存在的可生物降解的共价连接的类型，存在于生物环境中的氧化、还原、水解或酶降解路径能够促进连接的断裂，导致支化聚合物分子量的减少和由复合的核
酸经历的分子环境的改变。例如，在细胞的内体区室中，具有二硫化物(S-S)连接的支化聚合物对于还原断裂敏感。这种降解被认为导致聚合物/核酸分子复合物的解离，导致核酸
分子更有效的释放并且使其更容易可用于参与，例如，基因沉默。此外，在递送核酸分子之后，支化聚合物分子量的降低能够增强来自细胞间环境中的聚合物残基的排出。

[0315] 如在本文中使用的，单独或以复合词使用的术语“烷基”表示直链、支链或环状烷基，优选地，C1-20烷基，例如C1-10或C1-6。直链和支链烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基-丙基、和己基。环状烷基的实例包括单环或多环烷基基团，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等。在将烷基基团通常称作“丙基”、“丁基”等时，将理解的是，在适当时，这可以指任何直链、支链和环状异构体。烷基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。

[0316] 如在本文中使用的，术语“烯基”表示从包含至少一个碳碳双键的直链、支链或环状烃残基形成的基团，包括如之前定义的烯键式单-、双-或多不饱和烷基或环烷基基团，优选地，C2-20烯基(例如，C2-10或C2-6)。烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、l-甲基乙烯基和丁烯基。烯基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。

[0317] 如在本文中使用的，术语“炔基”表示从包含至少一个碳碳三键的直链、支链或环状烃残基形成的基团，包括如之前定义的烯键式单-、双-或多不饱和烷基或环烷基基团。除非指定碳原子的数量，术语优选指C2-20炔基(例如，C2-10或C2-6)。实例包括乙炔基、l-丙炔基、2-丙炔基、和丁炔基异构体，和戊炔基异构体。炔基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。

[0318] 术语“卤素”(“卤”)表示氟、氯、溴或碘(氟代、氯代、溴代或碘代)。

[0319] 术语“芳基”(或“碳芳基”)表示任何单核、多核、共轭和稠和的芳香族烃环系统残基(例如，C6-24或C6-18)。芳基的实例包括苯基、联苯基(联二苯基，biphenyl)、三联苯、四联苯(quaterphenyl)和萘基。芳基基团可以由或可以不由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚芳基”旨在表示二价形式的芳基。

[0320] 术语“碳环基”包括任何非芳香族单环、多环、稠和或共轭烃残基，优选C3-20(例如，C3-10或C3-8)。环可以是饱和的，例如，环烷基，或可以具有一个或多个双键(环烯基)和/或一个或多个三键(环炔基)。碳环基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚碳环基”旨在表示二价形式的碳环基。

[0321] 如在本文中使用的，术语“杂原子”或“杂”以其最广泛的意义指其可以是环状有机基团的成员的除碳原子之外的任何原子。特别地，杂原子的实例包括氮、氧、硫、磷，硼、硅、硒和碲，更特别地是氮、氧和硫。

[0322] 当单独或以复合词使用时，术语“杂环基”包括任何单环、多环、稠和或共轭烃残基，优选C3-20(例如，C3-10或C3-8)，其中，一个或多个碳原子被杂原子所代替以提供非芳香族残基。合适的杂原子包括O、N、S、P和Se，特别是O、N和S。在两个或更多碳原子被代替时，这可以通过两个或更多相同杂原子或不同杂原子(代替)。杂环基团可以是饱和或部分不饱和的，即，具有一个或多个双键。杂环基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术语“亚杂环基”旨在表示二价形式的杂环基。

[0323] 术语“杂芳基”包括任何单环、多环、稠和或共轭烃残基，其中，一个或多个碳原子被杂原子取代以提供芳香族残基。优选的杂芳基具有3-20个环原子，例如3-10个。尤其优选的杂芳基是5-6和9-10元的双环系统。合适的杂原子包括O、N、S、P和Se，特别是O、
N和S。在两个或更多碳原子被代替时，这可以通过两个或更多相同杂原子或不同杂原子
(代替)。杂芳基基团可以由如在本文中定义的一种或多种可选的取代基可选地取代。术
语“亚杂芳基”旨在表示二价形式的杂芳基。

[0324] 术语“酰基”单独或以复合词表示包含部分C＝O(并且不是羧酸、酯或酰胺)的e e
基团。优选的酰基包括C(O)-R，其中，R 是氢或烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、或杂环基残基。

[0325] 术语“亚砜”，单独或以复合词指基团-S(O)Rf，其中，Rf选自氢、烷基、烯基、炔基、f芳基、杂芳基、杂环基、碳环基和芳烷基。优选的R 的实例包括C1-20烷基，苯基和苄基。

[0326] 术语“磺酰基”，单独或以复合词指基团S(O)2-Rf，其中，Rf选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基和芳烷基。

[0327] 术语“磺酰胺”，单独或以复合词指基团S(O)NRfRf，其中，每个Rf独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基和芳烷基。

[0328] 本文中使用的术语“氨基(amino)”，以如其在本领域中理解的最广泛的意义使用a b a b并且包括式NRR 的基团，其中，R 和R 可以是独立选自以下的任一种：氢、烷基、烯基、炔a b
基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基，和酰基。R 和R 与附接至其的氮也可以形成单环、或多环系统，例如3-10元环，尤其5-6和9-10元系统。

[0329] 本文中使用的术语“氨基的(amido)”以如其在本领域中理解的最广泛的意义使用a b a b并且包括具有式C(O)NRR 的基团，其中，R 和R 如以上所定义的。

[0330] 本文中使用的术语“羧基酯”以其在本领域中理解的最广泛的意义使用并且包括g g
具有式CO2R 的基团，其中，R 可以选自包括烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂芳基、杂环基、芳基烷基、和酰基的基团。

[0331] 如在本文中使用的，术语“芳氧基”是指通过氧桥附接的“芳基”基团。芳氧基取代基的实例包括苯氧基、联苯氧基(biphenyloxy)、萘氧基等。

[0332] 如在本文中使用的，术语“酰氧基”是指其中“酰基”基团又通过氧原子附接的“酰基”基团。

[0333] 如在本文中使用的，术语“烷氧基羰基”是指通过羰基基团附接的“烷氧基”基团。“烷氧基羰基”基团的实例包括甲酸丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸己酯、甲酸辛酯、甲酸癸酯、甲酸环戊酯等。

[0334] 如在本文中使用的，术语“芳基烷基”是指用芳香族环取代的直链或支链烷烃形成的基团。芳基烷基的实例包括苯甲基(苄基)、苯乙基和苯丙基。

[0335] 如在本文中使用的，术语“烷基芳基”是指用直链或支链烷烃取代的芳基基团形成的基团。烷基芳基的实例包括甲苯基和异丙基苯基。

[0336] 在该说明书中，“可选取代的”用于指基团可以被或可以不被一个、两个、三个或更多有机和无机基团取代或稠和(以便形成缩合的多环基团)的基团，所述有机和无机基团包括选自以下的那些：烷基、烯基、炔基、碳环基、芳基、杂环基、杂芳基、酰基、芳烷基、烷芳基、烷杂环基、烷杂芳基、烷碳环基、卤素、卤烷基、卤烯基、卤炔基、卤芳基、卤碳环基、卤杂环基、卤杂芳基、卤酰基、卤芳烷基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基碳环基、羟基芳基、羟基杂环基、羟基杂芳基、羟基酰基、羟基芳烷基、烷氧基烷基、烷氧基烯基、烷氧基炔基、烷氧基碳环基、烷氧基芳基、烷氧基杂环基、烷氧基杂芳基、烷氧基酰基、烷氧基芳烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、碳环氧基、芳基烷氧基、杂芳氧基、杂环氧基、酰氧基、卤烷氧基、卤烯氧基、卤炔氧基、卤芳氧基、卤碳环氧基、卤芳基烷氧基、卤杂芳氧基、卤杂环氧基、卤酰氧基、硝基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、硝基杂芳基、硝基碳环基、硝基酰基、硝基芳烷基、氨基(NH2)、烷氨基、二烷氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳氨基、二芳氨基、芳烷基氨基、二芳烷基氨基、酰氨基、二酰氨基、杂环氨基、杂芳基氨基、羧基、羧基酯、氨基(胺基，amido)、烷磺酰氧基、芳基次磺酰氧基(芳基亚磺酰氧基，arylsulphenyloxy)、烷基次磺酰基、芳基次磺酰基、硫基、烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、芳烷基硫基、碳环硫基、杂环硫基、杂芳硫基、酰硫基、亚砜、磺酰基、磺酰胺(sulfonamide)、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基碳环基、氨基芳基、氨基杂环基、氨基杂芳基、氨酰基、氨基芳烷基、硫代烷基、硫代烯基、硫代炔基、硫代碳环基、硫代芳基、硫代杂环基、硫代杂芳基、硫代酰基、硫代芳烷基、羧基烷基、羧基烯基、羧基炔基、羧基碳环基、羧基芳基、羧基杂环基、羧基杂芳基、羧基酰基、羧基芳烷基、羧基酯烷基、羧基酯烯基、羧基酯炔基、羧基酯碳环基、羧基酯芳基、羧基酯杂环基、羧基酯杂芳基、羧基酯酰基、羧基酯芳烷基、胺基烷基(amidoalkyl)、胺基烯基、胺基炔基、胺基碳环基、胺基芳基、胺基杂环基、胺基杂芳基、胺酰基、胺基芳烷基、甲酰烷基、甲酰烯基、甲酰炔基、甲酰碳环基、甲酰芳基、甲酰杂环基、甲酰杂芳基、甲酰酰基(formylacyl)、甲酰芳烷基、酰烷基、酰基烯基、酰基炔基、酰基碳环基、酰芳基、酰基杂环基、酰基杂芳基、酰基酰基、酰基芳烷基、亚砜烷基、亚砜烯基、亚砜炔基、亚砜碳环基、亚砜芳基、亚砜杂环基、亚砜杂芳基、亚砜酰基、亚砜芳烷基、磺酰烷基、磺酰烯基、磺酰炔基、磺酰碳环基、磺酰芳基、磺酰杂环基、磺酰杂芳基、磺酰酰基、磺酰芳烷基、磺酰胺烷基、磺酰胺烯基、磺酰胺炔基、磺酰胺碳环基、磺酰胺芳基、磺酰胺杂环基、磺酰胺杂芳基、磺酰胺酰基、磺酰胺芳烷基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基碳环基、硝基芳基、硝基杂环基、硝基杂芳基、硝基酰基、硝基芳烷基、氰基、硫酸酯、磷酸酯、三芳基甲基、三芳基氨基、噁二唑和咔唑基团。可选取代也可以用于指其中链或环中的-CH2-基团由选自以
a a
下的基团取代：-O-、-S-、-NR-、-C(O)-(即，羰基)、-C(O)O-(即，酯)、和-C(O)NR-(即，酰a
胺)，其中，R 如在本文中所定义的。

[0337] 现在，将参照以下非限制性实施例描述本发明。

[0338] 实施例

[0339] 材料

[0340] 从Aldrich购买甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)和低聚(乙二醇)-1
甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA475，Mn～475g mol )单体，并且在使用之前，在存在用于氢醌或氢醌单甲醚的抑制剂-去除剂(Aldrich)下通过搅拌30分钟，进行纯化。α,α′-偶
氮双(异丁腈)(AIBN)(TCI)在使用之前从甲醇重结晶两次。1,1′-偶氮双(环己烷腈)
(VAZO-88)引发剂(杜邦)以收到时(的状态)使用。在使用之前，通过喷雾氮气至少15
分钟对N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(AR级，Merck)脱气。二氯甲烷(DCM)、正庚烷、二异丙醚、碘代甲烷和甲醇是商业试剂并且不需要进一步纯化即可使用。季戊四醇四(3-巯基丙酸
酯)(Aldrich)、2-巯基乙醇(Aldrich)、2-巯基吡啶(Aldrich)以收到时(的状态)使用。
过氧化氢(30％)(BDH Chemicals)以收到时(的状态)使用。

[0341] 多臂RAFT试剂

[0342] 四臂星形RAFT试剂(5)根据以下描述的步骤准备。

[0343] 四臂星形RAFT试剂(5)：

[0344] (4S,4′S)-10,10-双((R)-14-氰基-l4-甲基-3,11-二氧-16-硫酮-2,10-二氧杂-6,7,15,17-四硫二十九烷基)-7,13-二氧-8,12-二氧杂-3,4,16,17-四硫十九烷
基-1,19-二基双(4-氰基-4-(((十二烷基硫基)碳硫酰基)硫基)戊酸酯)(5)

[0345]

[0346] 该四臂星形RAFT试剂(5)的合成方案如下。

[0347]

[0348] 步骤1：合成(S)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基4-氰基-4-(((十二烷基硫基)碳硫酰基)硫基)戊酸酯(3)

[0349] 在二氯甲烷溶剂中存在DIC偶联剂和催化量的DMAP下，通过RAFT酸、(S)-4-氰基-4-(十二烷硫基碳硫酰硫基)戊酸(1)和2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙醇(2)的反应
合成该标题化合物(3)。

[0350] 根据Polymer 2005,46,8458-8468中描述的文献过程制备RAFT酸(1)。化合物(1)也可以购买自sigma-Aldrich或Strem Chemicals。

[0351] 根据S.Thayumanavan et al.Macromolecules,2006,39,5595-5597中描述的方法制备2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙醇(2)。

[0352] 使二氯甲烷(50mL)和DMAP(N,N-二甲基氨基吡啶，催化量)中的(S)-4-氰基-4-(十二烷硫基碳硫酰硫基)戊酸(1)(4.60g，11.39mmol)、2-(吡啶-2-基二硫
烷基)乙醇(2)(2.13g，11.39mmol)、DIC(二异丙基碳二亚酰胺，1.58g，12.53mmol)在
室温搅拌三小时。在去除溶剂后，使用乙酸乙酯:正己烷1:3(v/v)作为洗脱剂，在
硅胶柱上通过柱色谱法纯化粗制反应混合物以产生黄色油状的标题产物(3)(5.5g，
84 ％收率 )。1HNMR(CDCl3)(ppm):0.85(t,3H,CH3)；1.27(br s,18H)；1.68(m,2H)；
1.85(s,3H,CH3)；2.35-2.60(m,4H,CH2CH2)；3.05(t,2H,CH2SS)；3.35(t,2H,CH2S)；
4.35(t,2H,CH2O)；7.10(m,1H,ArH)；7.65(m,2H,2xArH)；8.45(m,1H,ArH)。13C NMR(CDCl3)(ppm):14.1,22.7,24.9,27.6,28.9,29.0,29.3,29.4,29.5,29.6(2C),31.9,33.7,37.1(2
C),46.3,62.7,118.9,119.9,120.9,137.0,149.8,159.5,171.1,216.0。

[0353] 步骤2：合成(5)

[0354] 来自以上步骤1的(S)-2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基4-氰基-4-(((十二烷基硫基)碳硫酰基)硫基)戊酸酯(3)(0.47g，8.22×10-4mol)与季戊四醇四(3-巯基丙
-4
酸酯)(购买自Aldrich Chemicals)(0.10g，2.04×10 mol)在具有两滴冰醋酸的二氯甲
烷溶剂(25ml)中反应。允许反应在室温下搅拌过夜。在去除溶剂后，先使用乙酸乙酯：
正己烷1:3(v/v)作为洗脱剂在硅胶柱上通过柱色谱法纯化粗制反应混合物以去除一些
未反应的(3)，然后使用乙酸乙酯:正己烷2:3(v/v)溶剂以分离期望的黄色油状标题产
1
物(5)(0.36g，75.5％收率)。H-NMR(CDCl3)(ppm):0.86(t,12H,4×CH3)；1.27-1.40(br
s,72H,4×(CH2)9)；1.70(m,8H,4×CH2)；1.86(s,12H,4×CH3)；2.35(dd,4H,4×CHCCN)；
2.55(dd,4H,4×CHCCN) ；2.65(m,8H,4×CH2) ；2.76(m,8H,4×CH2) ；
2.90(m,16H,4×CH2SSCH2)；3.30(t,8H,4×CH2SC( ＝ S))；4.15(s,8H,4×OCH2C)；
4.35(t,8H,4×CH2O)。

[0355] 六臂星形RAFT试剂(6)：

[0356]

[0357] 根据通过Chen et al.公开于J.Mater.Chem.,2003,13.2696-2700的文献方法制备RAFT试剂(6)。

[0358] 多臂星形RAFT聚合物的实施例

[0359] 实施例1：四臂星形嵌段共聚物ABA-B4S-16/24(TL48A)

[0360] ABA-B4S-16/24:PEG-DMAEMA-PEG(TL48A)

[0361] 方法：

[0362] PEG-DMAEMA-PEG四臂嵌段共聚物

[0363] 合成和表征聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)(PDMAEMA)远螯大(macro)RAFT试剂：
-3

[0364] 在典型的聚合反应实验中，将786mg的DMAEMA单体(5.00×10 mol)、0.66mg的-6 -5
VAZO-88引发剂(2.70×10 mol)、92.32mg的四臂RAFT试剂(5)(3.96×10 mol)和620mg
-3
的DMF(8.49×10 mol)称重到Schlenk瓶中。溶液混合物用4个冷冻-抽空-解冻循环脱
气并且在90℃下聚合5小时。
1

[0365] 如通过 H-NMR(在CDCl3中)测定单体至聚合物的转化率为78％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；
将5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比较。
1
根据 H-NMR计算的聚合物的分子量是17.4kDa，对应于98的聚合度。如通过凝胶渗透色谱
法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标准测定的聚合物的数均分子量(Mn)是12.8kDa(分散度为
1.3)。

[0366] 获得的聚合物溶解于少量的DCM中并且沉淀在庚烷中；随后，使用相同的步骤，沉淀回收的聚合物两次以上并且在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0367] 步骤2：合成并表征聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)-嵌段-聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)-嵌段-聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(P(OEG
MA475-b-DMAEMA-b-OEGMA475):(ABA-B4S-16/24)(样品编码：TL48A)

[0368] 在典型的聚合反应实验中，将来自步骤1的281mg的PDMAEMA远螯大RAFT试剂-5 -3
(1.62×10 mol)、712mg的OEGMA475(单体)单体(1.50×10 mol)、0.792mg的VAZO-88引
-6 -2
发剂(3.24×10 mol)、和6940mg的DMF(9.50×10 mol)称重至Schlenk瓶中。溶液混合
物用4个冷冻-抽空-解冻循环脱气并且在90℃下聚合12小时。

[0369] 通过1H-NMR(在CDCl3中)确定单体至聚合物的转化率为68％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；
将5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比较。
1
根据 H-NMR的分子量是47.7kDa。如通过凝胶渗透色谱法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标准
测定的聚合物的数均分子量(Mn)是50.2kDa(分散度为1.2)。

[0370] 获得的聚合物溶解于少量的DCM中并且沉淀在二异丙基醚中；随后，使用相同的步骤，沉淀回收的聚合物两次以上并且在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0371] 四价化ABA嵌段

[0372] 在圆底烧瓶中，ABA嵌段共聚物以10％(w/v)溶解于甲醇。然后，相对于嵌段共聚物中的PDMAEMA部分，加入两摩尔当量的碘代甲烷，反应混合物在室温下搅拌4小时。通过
旋转蒸发仪去除所有挥发物，并且随后在40℃的真空烘箱中进一步干燥。

[0373] 透析(dialysis)

[0374] 通过透析 ( 分子量截留为 3500，Spectra Por.Spectrum MedicalIndustries,Inc.,Itouston,Tx)，针对去离子水，进行聚合材料的进一步纯化，持续三天。
在透析之后，通过冻干去除聚合物溶液中的水。

[0375] 实施例2：四臂星形嵌段共聚物BAB-B4S-22/10(TL68B)

[0376] BAB-B4S-22/10：DMAEMA-PEG-DMAEMA(TL68B)

[0377] 方法：

[0378] 合成并表征聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)的远螯大RAFT试剂：

[0379] 在典型的聚合反应实验中，将880mg的OEGMA475单体(1.85×10-3mol)、2.94mg的-5 -5
VAZO-88引发剂(1.21×10 mol)、137.00mg的四臂RAFT试剂(5)(5.88×10 mol)和9818mg
-1
DMF(1.34×10 mol)称重至Schlenk瓶中。将溶液混合物用4个冷冻-抽空-解冻循环脱
气并且在90℃下聚合5小时。

[0380] 通过1H-NMR(在CDCl3中)确定单体至聚合物的转化率为46％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；
将5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比较。
1
根据 H-NMR计算的分子量是20.3kDa，对应于～40的聚合度(平均10个OEGMA475单元
/臂)。如通过凝胶渗透色谱法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标准测定的聚合物的数均分子量
(Mn)是10.9kDa(分散度为1.15)。

[0381] 获得的聚合物溶解于少量的DCM中，然后沉淀在二异丙基醚中；使用相同的步骤，沉淀回收的聚合物两次，并且然后在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0382] 步骤2：合成和表征聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)-嵌段-聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯-嵌段-聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)[P(DMAEMA-b
-OEGMA475-b-DMAEMA)]:(BAB-B4S-22/10)或(样品编码：TL68B)

[0383] 在典型的聚合反应实验中，将来自步骤1的241mg的POEGMA475远螯大RAFT-5 -3
试剂(1.62×10 mol)、346mg的DMAEMA单体(2.20×10 mol)、1.16mg VAZO-88引发剂
-6 -2
(4.75×10 mol)、和7202mg的DMF(9.87×10 mol)称重到Schlenk瓶中。将溶液混合物用
4个冷冻-抽空-解冻循环脱气并且在90℃下聚合4.5小时。

[0384] 通过1H-NMR(在CDCl3中)确定单体至聚合物的转化率为56.8％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；
将5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比较。
根据NMR计算的分子量是36.9kDa。如通过凝胶渗透色谱法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标准
测定的聚合物的数均分子量(Mn)是7.0kDa(分散度为1.23)。

[0385] 获得的聚合物溶解于少量的DCM中，然后沉淀在二异丙基醚中；然后，将获得的沉淀物沉淀两次以上，然后在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0386] 四价化(quarternization)ABA嵌段

[0387] 在圆底烧瓶中，BAB嵌段共聚物(BAB-B4S-22/10或TL68B)以10％(w/v)溶解于甲醇。然后，相对于嵌段共聚物中的PDMAEMA部分，加入两摩尔当量的碘代甲烷，反应混合物在室温下搅拌4小时。通过旋转蒸发仪去除所有挥发物，并且随后在40℃的真空烘箱中
进一步干燥。

[0388] 透析

[0389] 通过透析 ( 分子量截留为 3500，Spectra Por.Spectrum MedicalIndustries,Inc.,Itouston,Tx)，针对去离子水对聚合物质进行进一步纯化，持续三天。在透析之后，通过冻干去除聚合物溶液中的水。

[0390] 表1：使用RAFT聚合反应制备的星形嵌段共聚物的分子量、分散度和组成。

[0391]聚合物编码 Mn(kDa) 分散度 Mn(NMR)(kDa) 组成A:B*/臂嵌段
TL48A 50.3 1.20 47.7 24:16 ABA
TL48B 8.5 1.2 9.0 11:10 BAB
TL68B 7.0 1.23 36.9 22:10 BAB
TL65B1 13.8 1.4 52.3 38:10 BAB

[0392] *A:DMAEMA；B:OEGMA475

[0393] 实施例3

[0394] rAB-6S(统计学 DMAEMA和 OEGMA475六臂星形共聚物)( 样品编码：LN2009/1735/79Q)

[0395]

[0396] 方法：

[0397] 存在六臂星形RAFT试剂(6)下的RAFT共聚反应

[0398] 在 5mL 容量瓶中，将 DMAEMA(1.01g，2.13×10-3mol)、OEGMA475(0.5g，-3 -5
3.18×10 mol)、AIBN(4.5mg，2.74×10 mol) 以及六臂 RAFT 试剂 (6)(7.41mg，
-6
2.95×10 mol)溶解于DMF溶剂中至5mL的标记。将该混合物转移到反应容器中并通过三
个冷冻-抽空-解冻循环脱气，之后，在真空下密封，并且在60℃下加热16小时。通过在
MiniQ水中透析48小时纯化聚合物。如通过凝胶渗透色谱法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标
准并且在N,N-二甲基乙酰胺作为溶剂下，测定的聚合物的数均分子量(Mn)是53.1kDa(分
散度为1.86)。

[0399] 四价化统计六臂星形共聚物

[0400] 在圆底烧瓶中，六臂星形嵌段共聚物以10％(w/v)溶解于甲醇。相对于嵌段共聚物中的PDMAEMA部分，随后加入过量碘代甲烷，反应混合物在室温下搅拌16个小时。通过
旋转蒸发仪去除所有溶剂，然后在40℃的真空烘箱中进一步干燥。

[0401] 实施例4

[0402] 针对不同细胞系，评价实施例1和2中制备的RAFT嵌段共聚物的毒性

[0403] 材料

[0404] 细胞：在5％CO2和37℃下，组成型表达绿色荧光蛋白的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GFP)(K.Wark；CSIRO CMHT Australia馈赠)在由10％胎牛血清、10mM的Hepes(羟
乙基哌嗪乙磺酸)、0.01％的青霉素和0.01％的链霉素补充的MEMα改良(改良培养基，
modiﬁcation)中生长，并且每周传代(次培养、继代培养，subculture)两次。

[0405] 在5％CO2和37℃下，组成型表达GFP的人类胚胎肾细胞(HEK293-GFP)在由10％的胎牛血清、10mM的Hepes(羟乙基哌嗪乙磺酸)、2mM的谷氨酰胺、0.01％的青霉素和
0.01％的链霉素补充的RPMI1640中生长，并且每周传代两次。

[0406] 在5％CO2和37℃下，组成型表达GFP的人肝癌细胞(Huh7-GFP)在由10％的胎牛血清、10mM的Hepes(羟乙基哌嗪乙磺酸)、2mM的谷氨酰胺、0.01％的青霉素和0.01％的链
霉素补充的DMEM中生长，并且每周传代两次。

[0407] 毒性试验：在96孔组织培养板中CHO-GFP以3×104接种HEK293-GFP和Huh7-GFP4
细胞以1×10 细胞每孔接种，并且在200μl的标准介质中在5％CO2和37℃下生长过夜。

[0408] 将不具有siRNA的多臂星形RAFT嵌段共聚物连续稀释在水中，并且添加至用于各样品的96孔培养板的3个孔中，之后，温育72h。如以下实施例5中描述的制备对于与siRNA
有关的样品毒性。在200μlOPTIMEM中，将样品添加到细胞中并且温育5h。OPTIMEM被替
换为200μl正常介质(普通介质)并且进一步温育67h。根据制造商的说明，使用Alamar
蓝色试剂(Invitrogen USA)测量毒性。快速去除介质并用包含10％的Alamar蓝色试剂的
100μl标准介质替换，之后，细胞在5％CO2和37℃下温育4h。在EL808吸光度微量培养板
阅读器(读板器)(BIOTEK，USA)上，在540nm和620nm处读取试验值。通过从540nm测量
值减去620nm测量值确定细胞存活率。结果以未处理细胞的百分数呈现。图2示出了当用
CHO-GFP和HEK293T细胞检验时，不具有siRNA的多臂星形共聚物的细胞存活率结果。图3
示出了与siRNA有关的聚合物样品下，3个细胞系中的毒性。

[0409] 在不具有siRNA结合的两个细胞系中并且在具有siRNA结合的三个细胞系中研究聚合物的毒性。CHO-GFP细胞是快速生长的强壮细胞系，同时HEK293T-GFP细胞对于转染
更敏感，而Huh7-GFP细胞具有在其他细胞系之间的特性。认为可接受的毒性水平是在所
有的细胞系中超过70％的存活。分析了聚合物浓度范围。当通过在两个细胞系中连续稀
释分析时，与ABA-B4S-16/24(TL48A)相比，BAB-B4S-22/10(TL48B)看起来毒性稍微更大。
BAB-B4S-22/10(TL48B)在MR为4下对应于30μg/ml聚合物。该浓度对于具有或不具有
siRNA均没有毒性。ABA-B4S-16/24(TL48A)在MR为4下对应于51μg/ml聚合物。该浓度
是在任何细胞系中对单独的聚合物没有毒性，然而，当在HEK-GFP细胞中与siRNA结合时有
毒性。这可能是由于siRNA和不同复合物的内部结合，由于与膜的相互作用，其可能影响不同细胞。在Huh7-GFP细胞中，当与siRNA结合时，任何聚合物都是没有毒性的。

[0410] 实施例5

[0411] 合成siRNA和DNA寡核苷酸：从QIAGEN(USA)获得抗GFP siRNA。抗GFP siRNA序列是正义5′gcaagcugacccugaaguucau 3′和反义5′gaacuucagggucagcuugccg 3′，并
且被称为si22。siRNA双链体的Mn是15191Da。

[0412] 从Geneworks(Sth Australia)购买对应于抗GFP siRNA序列的DNA寡核苷酸，并且被确定为di22。通过结合等摩尔量的寡核苷酸，加热至95℃持续10分钟以及逐渐冷却
至室温，退火寡核苷酸。由于其将不具有沉默效果，这些将用作阴性对照。

[0413] 形成聚合物/siRNA复合物：计算聚合物(参见表1，针对聚合物Mn)与50nM siRNA或si22的摩尔比。通过添加OPTIMEM介质(Invitrogen，美国)至微量离心管(eppendorf
tube)中形成复合物。将在水中再悬浮至10mg/ml的所需量的聚合物添加至管中并且涡旋
混合物。然后，将50nM的si22或di22添加至管中并且涡旋样品。允许复合作用在RT下
持续l小时。

[0414] 琼脂糖凝胶电泳：在100V下，在TBE中的2％琼脂糖凝胶上对样品(聚合物与50nMsiRNA的不同摩尔比下)进行电泳，持续40分钟。用照相机在UV透射仪上，通过凝胶红色
(Jomar Bioscience)可视化siRNA，通过GeneSnap program(Syngene,USA)记录图像。

[0415] 前期工作已经表明50nM的si22足以在琼脂糖凝胶上可视化，并且通过脂质体2000转染，在CHO-GFP细胞内沉默80％的EGFP信号(数据未示出)。因此，si22的这个
量被用于确定聚合物结合siRNA的能力并且用于确定CHO-GFP细胞中沉默EGFP表达的能
力。针对每个聚合物，配制范围从1:1至7:1的聚合物与si22的摩尔比。这是为了确保在
毒性极限下使用聚合物水平。将这些样品进行电泳并且观察到了与siRNA相关的能力的最
小差异(图4)。通过siRNA从期望的22nt迁移至不能够以任何显著的程度进入凝胶的迁
移，确定siRNA相关性。尽管ABA-B4S-16/24也能够以1的摩尔比结合siRNA，两种多臂星
形聚合物都能够以2:1的低摩尔比结合siRNA。测定聚合物siRNA复合物的尺寸以及具有
和不具有siRNA的ζ电位(参见，实施例6)。

[0416] 实施例6

[0417] 动态光散射(DLS)和ζ电位测量：通过使用具有在i)632.8nm下操作的22mWHe-Ne激光的Malvern-Zetasizer Nano Series DLS检测器、具有高量子效率的雪崩光电
二极管检测器(avalanche photodiode detector)、以及ALV/LSE-5003多数字相关器电
子系统(multiple digital correlator electronics system)的动态光散射实验，获
得siRNA/嵌段共聚物复合物的流体动力学直径(水力学直径，hydrodynamic diameter)
(DH)。维持4.0的N/P比率制备样品，并且包含最小的0.5mg/mL总质量/体积(即，嵌段
共聚物质量+siRNA质量/mL)。为了去除灰尘，在经由DLS表征之前，在14000rpm下离心样
品10分钟。在25℃下，所有DH测量进行三次(一式三份)，并且将复合物尺寸与未复合的
嵌段共聚物和纯siRNA的尺寸相比较。

[0418] 在标准的一次性ζ电位流动池中，使用自动化设置在HEPES缓冲液中测量ζ电位。

[0419] 表2.从实施例l中制备的RAFT聚合物和siRNA形成的复合物的粒度和ζ电位。

[0420]

[0421] 注释：*DLS测量示出了双峰粒度分布且报道的值是针对构成几乎99％的粒子的较小尺寸范围。

[0422] 实施例7

[0423] 沉默试验

[0424] 在96孔组织培养板中，一式三份地以3×104细胞接种CHO-GFP，以1×104细胞接种Huh7-GFP和HEK-GFP细胞，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。根据制造商的
说明，使用脂质体2000(Invitrogen,USA)将阳性和阴性对照siRNA转染至细胞中。快
速地，50皮摩尔相关siRNA(相当于250nM)与1μl脂质体2000混合，两者均在50μl
OPTI-MEM(lnvitrogen，USA)中稀释并且在室温下温育20min。在100μl OPTI-MEM中，
siNA:脂质体混合物添加至细胞中，并且温育4h。更换细胞介质并且温育另外的67h。

[0425] 对于根据实施例5制备的聚合物/siRNA复合物，除去细胞介质并更换为200μlOPTI-MEM。10μl体积的siNA:聚合物复合体物添加至每个样品细胞的3个孔中并且温育
5h。更换细胞介质并且将细胞温育另外的67h。

[0426] 用PBS洗涤细胞两次，并且在设置为激发488nm和发射516nm的BiotekH1synergy读板器(Biotek，USA)上读数，并且以聚合物/di22复合物平均EGFP荧光的百
分比分析EGFP沉默。结果总结在图5和表3中。

[0427] 表3.N/P比率、％siRNA结合和沉默效率以及对于嵌段共聚物/siRNA复合物不同比率的聚合物浓度。

[0428]

[0429] a)N/P比率；b)siRNA结合％；c)CHO-GFP细胞中的沉默效率％；d)聚合物浓度μg/mL。

[0430] GFP细胞普遍地表达增强的绿色荧光蛋白，当通过蓝色488nm激光激发时，其在约518nm处发射绿色信号。通过荧光显微术和流式细胞术很容易检测到这些。因此，通过流式细胞术图上的细胞群的转移和通过平均GFP荧光的减少容易地测定EGFP沉默，在测试的三
种细胞系中，BAB-B4S-22/10(TL48B)不能够以任何摩尔比沉默GFP。在摩尔比增长没有提
高的情况下，ABA-B4S-16/24(TL48A)能够以3:1的摩尔比沉默GFP至51％。

[0431] 细胞摄取

[0432] 根据制造商的说明(Invitrogen,USA)用ToTo-3染料标记si22。快速地，在室温下，将3染料分子/siRNA约束(bound)在水中1小时。在96孔组织培养板中，一式三份地
以1×105细胞接种CHO-GFP细胞，并且在5％CO2和37℃下生长过夜。使用如以上描述的
脂质体2000，对于阳性对照，将标记的si22转染至细胞中。如以上描述的，生产聚合物和
标记的siRNA复合物，并且添加至细胞中。用PBS洗涤细胞，胰酶化(trypsinise)，用FACS
洗液(具有1％FBS的PBS)并且洗涤两次。将细胞进行流式细胞术，并且分析647nm发射
处的ToTo-3荧光。

[0433] 由于结果表明(图 6)标记的siRNA的最小摄取，摄取很好地与BAB-B4S-11/10(TL48B)的沉默结果相符，从而观察到了聚合物。ABA-B4S-16/24(TL48A)显
示了表明与脂质体2000递送类似的siRNA递送的标记的siRNA的良好摄取。尽管这样，对
于ABA-B4S-16/24(TL48A)的沉默，不如脂质体2000有效，表明siRNA功能的损失可能是由
于溶酶体的降解，或不能够有效地从聚合物释放。

[0434] 实施例8

[0435] 血清稳定性：在体外，使用通常用于组织培养中以提供基本生长激素的胎牛血清，履行保护siRNA免于通过血清蛋白酶降解的聚合物的能力。裸siRNA在几小时内在该血清中降解，结果表明：在50％血清中在37℃下，保护包含在摩尔比为4:1下的两种不同聚合
物复合物中的siRNA，持续长达72小时(图7)。将剩余的样品添加至CHO-GFP细胞以确定
siRNA是否完整并且仍然有活性。在FBS处理(图7d)之后，利用ABA-B4S-16/24(TIA8A)
复合物观察到沉默，活性降低微小。如期望的，用BAB-B4S-11/10(TL48B)没有观察到沉默。
这是由聚合物提供的显著保护。用血清没有观察到复合物沉淀，血清也被作为与血清蛋白
相关并且从溶液中沉淀出来的正电荷分子进行关注(数据未示出)。

[0436] 实施例9

[0437] 使用在实施例2中描述的实验步骤制备RAFT聚合物AB-B4S-16/24。如在实施例4、7和8中描述的，分别评价该聚合物的毒性、沉默试验和血清稳定性。该实施例说明了如以下描述的鸡胚测试中该聚合物的干扰反应。

[0438] 体内IFN反应

[0439] 从澳大利亚查尔斯河实验室获得商业的第10天鸡胚。将聚合物复合物注射在10天-含胚鸡卵(蛋)的尿囊腔中。在37℃温育卵6或24h。将2nmol下的PBS和si22单
独注射在卵中作为对照。尿囊膜和肝稍后收集在RNA中，并且存储在4℃下。使用Trizol
方法收集RNA。

[0440] 反转录和实时定量PCR

[0441] 根据制造商的说明用脱氧核糖核酸酶(Promega，美国)处理1微克提取的RNA，根据制造商的说明，使用power Sybr green RNA to CT试剂盒(Applied Biosystems,USA)进
行定量实时PCR(QRT-PCR)试验以测量细胞因子表达水平。将针对鸡或人的GAPDH的所有定
量数据标准化。在StepOnePlus实时PCR系统、96孔板RT-PCR仪器(Applied Biosystems)
上，在以下条件下进行QRT-PCR：1个循环50℃进行30分钟之后95℃进行10分钟，40个循
环95℃进行15秒之后60℃进行1分钟。使用比较阈值循环(Ct)方法以获得基因表达倍
数改变。从Geneworks(Sth Australia)获得引物。

[0442] 组织病理学和尿囊膜摄取

[0443] 从与研究24h下的IFN反应的膜相同的胚胎中获得胚胎鸡肝。在10％缓冲的甲醛溶液中，将肝固定24h并且提交至澳大利亚动物健康实验室的病理实验室，用于常规H&E染
色。

[0444] 在注射聚合物di22-FAM复合物24h之后，从胚胎中移除尿囊膜，并且用4％的低聚甲醛固定2h。随后用DAPI染色膜。

[0445] 体内条件显著不同于组织培养中的那些，因此，针对毒性、摄取和递送靶向流感聚合酶的PB1亚单元的抗流感siRNA(PB1-2257)以沉默鸡胚模型中的流感复制的能力，测试AB-B4S-16/24。用聚合物加或减siRNA注射第10天的鸡胚6或24h，随后通过定量PCR以
及在24h下由组织病理学的聚合物存在引起的肝损害，针对免疫刺激(干扰素IFNα和β)
测试胚胎。在尿囊膜(图8A和8B)或脾中，在6或24h的时间点下，都没有观察到IFNα或
β信使(mRNA)的显著增加。在澳大利亚动物健康实验室的病理实验室的H&E染色也显示，
在24h下没有观察到免疫细胞的汇聚(influx)和肝脏的损害。这表明胚胎在短时期内，能
很好地耐受聚合物(图8C、8D和8E)。

[0446] 实施例10

[0447] 使用在实施例2中描述的实验步骤制备RAFT聚合物AB-B4S-16/24。如分别在实施例4、7和8中描述的，评价毒性、沉默试验和该聚合物的血清稳定性。该实施例说明通过在鸡胚测试中的该聚合物沉默体内甲型流感PR8。

[0448] 体内甲型流感(Influenza A)-PR8沉默

[0449] 将聚合物复合物注射在10天含含胚鸡卵的尿囊腔。在37℃温育卵24h。注射PBS作为对照。在100μl PBS中，将H1N1流感PR8病毒稀释至500pfu/卵，并且立即注射至10
天含胚鸡卵的尿囊腔中。在37℃温育卵48h，并且收集尿囊液以测定病毒滴度。简要地，用
10倍稀释系列，通过针对细胞病变效应的终点稀释，在MDCK细胞上试验尿囊液的病毒感染
性。滴定度以log10TCID50/ml表示。

[0450] 还用以FAM标记的di22复合的聚合物注射胚胎，以在流感注射时测定聚合物是否能够进入尿囊膜的细胞、流感复制的主要位点。在第10天含胚鸡卵的尿囊液中注射
ABA-B4S-16/24±相关siRNA，并且温育24h。在每一个胚胎的尿囊液中注射500pfu的PR8
并且在37℃温育另外的48h。收集尿囊液，并且进行TCID50。结果代表每组5个鸡胚±SEM。
相比PBS，统计学**p<0.01。一种方法用参数、Tukey事后分析(post analysis)重复测量
ANOVA。出现的强烈摄取表明在尿囊膜内围绕血管的细胞中的高浓度摄取(concentrated
uptake)，并且，相比于用FAM标记的DNA寡核苷酸单独注射的胚胎，随后观察到24h下贯穿
整个膜，从这些细胞中弥散出去(图9A和9B)。用单独的聚合物注射或复合至无关的抗GFP
siRNA的胚胎，相比于用PBS注射的胚胎，没有示出流感复制的降低。然而，用AB-B4S-16/24注射的胚胎导致在病毒产生上显著地平均两倍的降低(图9C)。

[0451] 实施例11

[0452] 在本说明书中描述的RAFT试剂合成实施例中描述的来源中获得实施例11中使用的材料。也可以根据之前在说明书中描述的，合成四臂RAFT试剂(5)。

[0453] 合成并表征聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)-嵌段-聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯-嵌段-聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)
[P(DMAEMA-b-OEGMA475-b-DMAEMA)]，不具有[BAB-B4S-30/16：(TL46)]和具有聚荧光素
(PolyFluor)[BAB-B4S-31/15(TL47-PF)]

[0454] 步骤1a：合成并表征聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)的远螯大RAFT试剂：

[0455] 方法：

[0456] 在典型的聚合反应实验中，将1319mg的OEGMA475单体(2.78×10-3mol)、3.20mg-5 -5
VAZO-88引发剂(1.31×10 mol)、169.60mg 4臂RAFT试剂(5)(7.27×10 mol)和11930mg
-1
DMF(1.63×10 mol)称重至Schlenk烧瓶中。将溶液混合物在4个冻结-抽空-解冻循环
中脱气，并且在90℃下聚合21h。

[0457] 通过1H-NMR(在CDCl3中)确定单体至聚合物的转化率为82％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；将
5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比。根据
1
H-NMR计算的分子量是31kDa，这对应于～66的聚合度(平均16个OEGMA475单元/臂)。
如通过凝胶渗透色谱法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标准测定的，聚合物的数均分子量(Mn)是
23kDa(分散度为1.25)。将获得的聚合物溶解于少量的DCM中，然后沉淀在二异丙基醚中；
使用相同的步骤，将回收的聚合物沉淀两次，然后，在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0458] 步骤1b：合成并表征具有聚荧光素TM570的聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)的远螯大RAFT试剂：

[0459] 在典型的聚合反应实验中，1359mg OEGMA475单体(2.86×10-3mol)、3.20mg-5 -5
VAZO-88引发剂(1.31×10 mol)、168.7mg 4臂RAFT试剂(5)(7.23×10 mol)、19.8mg聚
TM -5 -1
荧光素 570(2.9×10 mol)和11930mg DMF(1.63×10 mol)称重至Schlenk烧瓶中。将溶
液混合物在4个冻结-抽空-解冻循环下脱气，并且在90℃下聚合21小时。

[0460] 通过1H-NMR(在CDCl3中)确定单体至聚合物的转化率为78％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；将
5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比。根据
1
H-NMR计算的分子量是30kDa，这对应于～62的聚合度(平均16个OEGMA475单元/臂)。
如通过凝胶渗透色谱法(GPC)，针对线性聚苯乙烯标准测定的聚合物的数均分子量(Mn)是
22kDa(分散度为1.25)。将获得的聚合物溶解于少量的DCM中，然后沉淀在二异丙基醚中；
使用相同的步骤，将回收的聚合物沉淀两次，然后，在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0461] 步骤2：合成并表征聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)-嵌段-聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯-嵌段-聚(甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯)
[P(DMAEMA-b-OEGMA475-b-DMAEMA)]：BAB-B4S-30/16：(TL46)和BAB-B4S-31/15：(TL47-PF)[0462] 以下步骤用于制备TL46和TL47-PF

[0463] 在典型的聚合反应实验中，将来自步骤1a或(具有荧光素TM570)1b的1503mg-5 -3
POEGMA475远螯大RAFT试剂(4.797×10 mol)、1448mgDMAEMA单体 (9.21×10 mol)、
-6 -2
0.586mg VAZO-88引发剂(2.4×10 mol)、和7229mg DMF(9.87×10 mol)称重到Schlenk
瓶中。将溶液混合物在4个冻结-抽空-解冻循环中脱气，并且在90℃下聚合16小时。

[0464] 通过1H-NMR(在CDCl3中)确定单体到聚合物的转化率为63％。通过以5mg/1mL1
的量将内标1,3,5-三噁烷添加至聚合反应溶液计算转化率。比较聚合前后的 H-NMR谱；将
5.1ppm下的三噁烷的-OCH2环的积分与5.5-6ppm下单体的CH2＝C质子的积分相比。如
根据表1，基于NMR计算分子量，并且通过凝胶渗透色谱法(GPC)针对线性聚苯乙烯标准测
定。将获得的聚合物溶解于少量的DCM中，然后沉淀在二异丙基醚中；将获得的沉淀物随后沉淀两次以上，然后，在40℃的真空烘箱中干燥至恒重。

[0465] 四价化嵌段共聚物

[0466] 在圆底烧瓶中，BAB嵌段共聚物(BAB-B4S-30/16或TL46)以10％(w/v)溶解于甲醇中。随后，添加相对于嵌段共聚物中的PDMAEMA部分的两摩尔当量的碘代甲烷，反应混合物在室温下搅拌过夜。通过旋转蒸发仪去除所有挥发物，然后在40℃的真空烘箱中进一步
干燥。

[0467] 透析

[0468] 通过透析 ( 分子量截留为 3500，Spectra Por. Spectrum MedicalIndustries,Inc., Itouston, Tx)，针对去离子水，对聚合物质进行进一步纯化，持续3天。
在透析之后，通过冻干去除聚合物溶液中的水。

[0469] 表4：使用RAFT聚合反应制备的星形嵌段共聚物的分子量、分散度和组成

[0470]聚合物编码 Mn(kDa) 分散度 Mn(NMR)(kDa) 组成A:B*/臂嵌段
LN2012/1TL46 22 1.35 50.3 30:16 BAB
LN2012/1TL47 21.7 1.31 48.9 31:15 BAB1％PF

[0471] *A: DMAEMA；B: OEGMA475

[0472] 贯穿整个说明书和随后的权利要求书，除非上下文另外要求，否则单词“包括”和变体如“包含”以及“含有”，将理解为暗示包括规定的整数或步骤，或整数或步骤的组，但是不排除任何其他的整数或步骤，或整数或步骤的组。

[0473] 在该说明书中，提及任何现有出版物(或获自其的信息)，或已知的任何事物，不且不应当被视为接纳或承认，任何形式地暗示现有出版物(或获自其的信息)或已知事物
构成本说明书所致力的领域中的公知常识的一部分。

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聚合物肥料-专利编号CN109627076A	2020-05-12	455
混合聚合物-专利编号CN104144958A	2020-05-12	201
混合聚合物-专利编号CN104144958B	2020-05-13	960
增强聚合物-专利编号CN101230145B	2020-05-13	1040
聚合物-专利编号CN101432318A	2020-05-11	955
聚合物-专利编号CN101432318B	2020-05-11	1063
氟聚合物管-专利编号CN109968750A	2020-05-11	349
增强聚合物-专利编号CN100357340C	2020-05-13	121
氟聚合物管-专利编号CN110028613A	2020-05-11	886
氟聚合物管-专利编号CN104245300A	2020-05-12	560

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