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Kv1.3钾通道拮抗剂

阅读：842发布：2021-03-01

IPRDB可以提供Kv1.3钾通道拮抗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及能够选择性结合并抑制钾通道Kv1.3活性的化合物。本发明还涉及包括该化合物的药物组合物，以及所述化合物和所述药物组合物用于治疗或预防自身免疫性疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥的用途。，下面是Kv1.3钾通道拮抗剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种化合物，包括SEQ ID No：25的氨基酸序列或由SEQ ID No：25的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中与钾通道Kv1.1相比，所述化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

4.一种核酸序列，编码根据权利要求1、2或3中任一项所述的氨基酸序列。

5.一种药物组合物，包括根据权利要求1、2或3中任一项所述的化合物。

6.根据权利要求1、2或3中任一项所述的化合物或根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述化合物或所述药物组合物适合于口服、鼻腔、舌下、经皮、静脉内或肌内给药。

7.根据权利要求1、2或3中任一项所述的化合物或根据权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗或预防自身免疫性疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥。

8.根据权利要求1、2或3中任一项所述的化合物或根据权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗或预防自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病选自包括多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、1型糖尿病、血管炎、桥本氏病、干燥综合征、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、艾迪生病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、腹腔疾病、克罗恩病、妊娠类天疱疮、痛风、白赛病、肺出血肾炎综合征、Grave病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、川畸病、红斑狼疮、重症肌无力、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎，Ord's甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、多发性关节炎(狗)、原发性胆汁性肝硬化、赖特综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血和韦格纳肉芽肿病的组。

9.根据权利要求1、2或3中任一项所述的化合物或根据权利要求5或6所述的药物组合物，用于治疗或预防类风湿性关节炎。

说明书全文

Kv1.3钾通道拮抗剂

技术领域

[0001] 本发明涉及能够选择性结合并抑制钾通道Kv1.3活性的化合物。本发明还涉及包括该化合物的药物组合物，和所述化合物及所述药物组合物在治疗或预防自身免疫性疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥中的用途。

背景技术

[0002] 自身免疫性疾病是当宿主的免疫应答无法区分外来抗原与自身分子(自身抗原)时引起异常免疫应答而出现的一组超过80种的不同疾病。自身免疫性疾病的原因仍然不明，但是认为它们是由遗传和环境因素综合引起的。

[0003] 免疫炎症性疾病如多发性硬化、银屑病和类风湿性关节炎具有共同的致病原理。它们的发病机制是以自身反应性记忆T细胞在刺激后调节慢性炎症过程为特征。特别地，通常发生在自身免疫性疾病中的重复的抗原攻击，引起长寿命的中枢记忆细胞(TCM)(如初始细胞)返回到淋巴结抵抗它们的同源抗原，分化成了短寿命的效应器记忆细胞(TEM)，其不需要返回到淋巴结用于抗原诱导的活化。活化的TEM细胞变成TEM效应器，其迅速迁移到炎症部位，在那里产生大量的促炎细胞因子。CD8+TEM细胞进一步产生大量穿孔素，因此是高度破坏性的。

[0004] 目前对于自身免疫性疾病的治疗包括全身使用抗炎药和高效免疫抑制剂和免疫调节剂。然而，这些药物引起了许多不良副作用，包括例如抑制整个免疫系统，并具有感染和形成肿瘤的风险。此外，在临床上，所述药物在一些患者中不能诱导显著的缓解。

[0005] 电压门控Kv1.3K+通道是人类基因组中的76个钾通道之一，并且已发现存在于人类的T淋巴细胞中。人类的所有T细胞表达共同提供对于T细胞活化和增殖所需的钙内流的平衡钾外流的Kv1.3通道以及钙激活KCa3.1通道。由给定细胞表达的通道数目取决于其活化和分化的状态。抗原或丝裂原刺激的CD4+和CD4+TEM细胞表现出表达增加大约4至5倍的Kv1.3表达，而人类初始或TCM细胞上调了钙激活的KCa3.1通道以调节活化状态中的膜电位和Ca2+信号。

[0006] 考虑到TEM细胞中的这种差异性过表达，Kv1.3通道构成了用于治疗其发病机制涉及自身反应性TEM细胞的自身免疫性疾病，例如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病和1型糖尿病，还可用于其它慢性炎性疾病如牙周炎的具有前景的TEM细胞特异性治疗新靶点。

[0007] 此外，有迹象表明，Kv1.3通道在体重调节中也起到了作用。因此，Kv1.3通道也构成了对于治疗肥胖症的具有前景的靶点。

[0008] 因此，对于Kv1.3通道特异性治疗化合物有持续需求，该化合物显示出与Kv1.3通道间强烈和特异性相互作用，并且能够阻断或降低其活性。

[0009] 发明目的和内容

[0010] 本发明的一个目的是提供能够特异性结合并抑制或降低钾通道Kv1.3活性的化合物。

[0011] 本发明的另一个目的是提供用于这类抑制性化合物和包括该抑制性化合物的药物组合物，其用于治疗自身免疫性疾病如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病和/或1型糖尿病、肥胖症和/或牙周炎。

[0012] 通过，在随后描述和权利要求中将变得明显的这些和其它目的由独立权利要求的主题来实现。由从属权利要求来限定一些优选实施方案。

[0013] 在第一方面，本发明涉及包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的化合物：

[0014] X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C(SEQ ID No.：23)，

[0015] 其中X1＝T,Q,S,Y,N；X2＝I,F,V,A,L,W；X3＝I,T,Y,S,V,A,L；X4＝K,S,T,Y,R；X5＝R,T,K,S,Y；X6＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X7＝P,S,T；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X11＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X12＝P,H,V,I,L,A；X13＝R,K,Q,N；X14＝K,D,A,R,E,V,L,I；X15＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X16＝Y,N,S,T,Q；X17＝A,G,V,I,L；X18＝K,R；X19＝Y,N,Q,T,S和X20＝G,R,K。

[0016] 在第一方面的变体中，本发明涉及包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的化合物：

[0017] X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C(SEQ ID No.：23)，

[0018] 其中X1＝T,Q,S,Y,N；X2＝I,F,V,A,L,W；X3＝I,T,Y,S,V,A,L；X4＝K,S,T,Y,R；X5＝R,T,K,S,Y；X6＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X7＝P,S,T；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X11＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X12＝P,H,V,I,L,A；X13＝R,K,Q,N；X14＝K,D,A,R,E,V,L,I；X15＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X16＝Y,N,S,T,Q；X17＝A,G,V,I,L；X18＝K,R；X19＝Y,N,Q,T,S和X20＝G,R,K；并且

[0019] 其中，该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0020] 在第二方面，本发明涉及包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的化合物：

[0021] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No：1)；

[0022] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K。

[0023] 在第二方面的变体中，本发明涉及包括根据SEQ ID No：1的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：1的氨基酸序列组成的化合物：

[0024] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K；并且

[0025] 其中，该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0026] 在第三方面，本发明涉及包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的化合物：

[0027] G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：27)；

[0028] 其中X1＝P,I,F,V,A,L,W；X2＝K,S,T,Y,R；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K。

[0029] 在第三方面的变体中，本发明涉及包括根据SEQ ID No：27的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：27的氨基酸序列组成的化合物：

[0030] 其中X1＝P,I,F,V,A,L,W；X2＝K,S,T,Y,R；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K；并且[0031] 其中，该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0032] 在另一方面，本发明涉及编码根据本发明的氨基酸序列的核酸序列。

[0033] 在另一方面，本发明还提供了包括根据本发明的核酸序列的载体。

[0034] 在另一方面，本发明还提供了包括根据本发明的核酸序列或载体的宿主细胞。

[0035] 在另一方面，本发明涉及包括根据本发明的化合物的药物组合物。

[0036] 在另一方面，还涉及本发明根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物，其用于治疗或预防自身免疫性疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥。

[0037] 在另一方面，本发明还涉及根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防自身免疫疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥的药物中的用途。

[0038] 在另一方面，本发明涉及通过将根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物给药至需要其的哺乳动物以治疗或预防哺乳动物体内自身免疫疾病、肥胖症、牙痛炎和/或组织移植排斥的方法。

[0039] 在另一方面，本发明还提供了制备根据本发明的化合物、核酸序列、载体或药物组合物的方法。

附图说明

[0040] 图1通过膜片钳测量Kv1.3、Kv1.5和Kv1.1的通道抑制。

[0041] 图2序列表cgtx 538-548。

[0042] 图3化合物1-8(C1-8)的效果。

[0043] 化合物1：cgtx 538

[0044] 化合物2：cgtx 539

[0045] 化合物3：cgtx 540

[0046] 化合物4：cgtx 541

[0047] 化合物5：cgtx 542

[0048] 化合物6：cgtx 543

[0049] 化合物7：cgtx-544

[0050] 化合物8：cgtx 547

[0051] 左侧，在施用外来溶液(黑色)、施用化合物(蓝色)和奎尼丁(灰色)后的hERG电流痕示例性踪迹。右图显示了峰值电流幅值随时间的变化。虚线表示施用化合物。通过10或20次扫描来评价每种化合物浓度的效应。所有化合物似乎对hERG没有影响或只有很小的影响。相反，奎尼丁完全阻断了电流。注意到，从施用化合物的开始到记录扫描结束，发生了衰减(run-down)。

[0052] 图4在Sf21细胞(A)中表达的和在TEM细胞(B)中内源表达的Kv1.3通道的代表性电压依赖性活化。(C)电压依赖的Kv1.3活化的脉冲方案。

[0053] 图5在Sf21(中线和上线)和TEM细胞(下线)中表达的Kv1.3通道的特征型归一化的电压-电流相关性；n＝41、n＝12和n＝29。使用Sf21杆状病毒群表达系统，可以表达大量的Kv1.3钾通道。

[0054] 图6 TEM细胞和Sf21细胞的对比。cgtx-544阻断在Sf21(A)和TEM(B)细胞中由表达的Kv1.3通道。显示了在Kv1.3拮抗肽浓度增加的情况下，代表性原始电流踪迹和时间剂量响应。

[0055] 图7大鼠膝关节炎的局部诱导的示意图.

[0056] 图8诱导局部关节炎后的膝关节肿胀。

[0057] 图9基于外周血中WBC计数的实验动物的免疫状态；AI：关节炎诱导，初始动物＝NaCl“免疫动物”，免疫动物＝用包括mBSA的弗氏佐剂处理的动物。

[0058] 图10 cgtx-544处理的和未处理的对照动物(每组：n＝14；菱形实线：未处理的对照动物；方形虚线：cgtx-544处理的动物)之间膝关节肿胀的差异。

[0059] 图11时间进程中甲氨蝶呤(MTX)标准治疗对关节炎大鼠的绝对膝关节肿胀增加的改变。在第-21天和第-14天的两次免疫后，在第0天通过关节内注射甲基化BSA诱导抗原诱导的关节炎(AIA)。高剂量MTX治疗组从第-21天开始直到第0天，以皮下注射的方式按1mg/kg体重接受每周一次的MTX施用。低剂量MTX治疗组从第-3天开始至第6天，以静脉注射的方式按照100μg/kg体重接受每日一次的MTX施用；而溶剂对照组从第0天开始直到第6天，以静脉注射的方式接受每日一次的0.9％NaCl施用。肿胀膝的绝对增加是每组各自的非诱导膝值与关节炎诱导膝值之间的差异。数值为平均值±SD。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝14)。

[0060] 图12时间进程中甲氨蝶呤(MTX)标准治疗与cgtx-544肽治疗相比，对关节炎大鼠的绝对膝关节肿胀增加的改变。在第-21天和第-14天的两次免疫后，在第0天通过关节内注射甲基化BSA诱导抗原诱导的关节炎(AIA)。低剂量MTX治疗组从第-3天开始直到第6天，以静脉注射的方式按照100μg/kg体重接受每日一次的MTX施用。相比之下，cgtx-544治疗组从第-3天开始直到第6天，以静脉注射的方式按照1mg/kg体重接受每日一次的cgtx-544施用；而溶剂对照组从第0天开始，以静脉注射的方式也接受每日一次的0.9％NaCl施用。肿胀膝的绝对增加是每组各自的非诱导膝值与关节炎诱导膝值之间的差异。数值为平均值±SD。
三角形长虚线-点线：每日一次MTX静脉注射组(L组，n＝7)；方形虚线：cgtx-544治疗组(I组，n＝14)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝14)。

[0061] 图13时间进程中甲氨蝶呤(MTX)标准治疗对关节炎大鼠的相对肿胀膝增加的改变。在第-21天和第-14天的两次免疫后，在第0天通过关节内注射甲基化BSA诱导抗原诱导的关节炎(AIA)。高剂量MTX治疗组从第-21天开始直到第0天，以皮下注射的方式按照1mg/kg体重接受每周一次的MTX施用。低剂量MTX治疗组从第-3天开始直到第6天，以静脉注射的方式按照100μg/kg体重接受每日一次的的MTX施用；且从第0天开始直到第6天，溶剂对照组以静脉注射的方式也接受每日一次的0.9％NaCl施用。肿胀膝的相对增加是每组各自的归一化后的非诱导膝值和归一化后的关节炎诱导膝值之间的差异。归一化值(第-21天＝1)是平均值±SD。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝14)。

[0062] 图14时间进程中甲氨蝶呤(MTX)标准治疗与cgtx-544治疗相比，对关节炎大鼠的相对膝关节肿胀增加的改变在第-21天和第-14天的两次免疫后，在第0天通过关节内注射甲基化BSA诱导抗原诱导的关节炎(AIA)。低剂量MTX治疗组从第-3天开始直到第6天，以静脉注射的方式按照100μg/kg体重接受每日一次的MTX施用。相比之下，cgtx-544治疗组从第-3天开始直到第6天，以静脉注射的方式按照1mg/kg体重接受每日一次的cgtx-544施用；而溶剂对照组从第0天开始，以静脉注射的方式也接受每日一次的0.9％NaCl施用。肿胀膝的相对增加是每组各自的归一化后的非诱导膝值和归一化后后关节炎诱导膝值之间的差异。归一化值(第-21天＝1)是平均值±SD。三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；方形虚线：cgtx-544肽治疗组(组I，n＝14)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝14)。

[0063] 图15甲氨蝶呤(MTX)标准治疗与cgtx-544治疗相比，对关节炎大鼠的免疫状态影响。白细胞(WBC)计数绝对值；值为平均值±SD(n＝7)。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；方形虚线：每日一次静脉注射的cgtx-544肽治疗组(I组，n＝7)；菱形实线：每日一次静脉注射溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝7)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。用Sysmex XT-2000iV测定EDTA全血。

[0064] 图16甲氨蝶呤(MTX)标准治疗与cgtx-544治疗相比，对关节炎大鼠中的嗜中性粒细胞的影响。A.绝对值为平均值±SD(n＝7)。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；方形虚线：每日一次静脉注射cgtx-544治疗组(I组，n＝7)；菱形实线：每日一次静脉注射溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝7)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。B.相对嗜中性粒细胞(％)是指相对于WBC的总量。值为平均值±SD(n＝7)。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；方形虚线：每日一次静脉注射cgtx-544治疗组(I组，n＝7)；菱形实线：每日一次静脉注射溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝7)。黑色箭头(应为第-21天和-14天)：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。用Sysmex XT-2000iV测定EDTA全血。

[0065] 图17时间进程中甲氨蝶呤(MTX)标准治疗与cgtx-544治疗相比，对关节炎大鼠中淋巴细胞的影响。A.绝对值为平均值±SD(n＝7)。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；方形虚线：每日一次静脉注射cgtx-544-肽治疗组(I组，n＝7)；菱形实线：每日一次静脉注射溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝7)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。B.甲氨蝶呤(MTX)标准治疗与cgtx-544治疗相比，对节炎大鼠中的淋巴细胞的百分比(相对淋巴细胞(％)是指相对于WBC的总量)的影响。值为平均值±SD(n＝7)。实心圆虚线：每周一次皮下注射MTX组(组J，n＝7)；三角形长虚线-点线：每日一次静脉注射MTX组(组L，n＝7)；方形虚线：每日一次静脉注射cgtx-544治疗组(I组，n＝7)；菱形实线：每日一次静脉注射溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝7)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。用Sysmex XT-2000iV测定EDTA全血。

[0066] 图18预防治疗和剂量依赖性-时间进程中膝关节直径的相对增加(高/中/低剂量)。数值为平均值±SD。三角形长虚线-点线：5mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(N组，n＝5)；黑色方形虚线：按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(I组，n＝14)；实心圆虚线：按照
0.1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(M组，n＝5)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H#15-19，n＝5)。白色方形实线：未诱导的膝直径没有增加(I、N、M和H组；左侧未诱导的膝关节)。

[0067] 图19 cgtx-544疗效结果的统计分析：关节炎诱导之后第1天(A)和第3天(B)采用和不采用cgtx-544肽治疗(高/中/低剂量)的相对膝肿胀的改变。所有箱线图显示了中位数范围、四分位数范围、样品最小和最大值。为了分析显著性，将溶剂对照组与治疗组进行比较。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0068] 图20祛病治疗(在d＝0或d＝1时开始治疗)时间进程中采用和不采用cgtx-544肽治疗对关节炎大鼠中膝关节直径(个体内，减除个体间/非个体)的改变(治疗开始于d0和d1)。数值为平均值±SD。三角形长虚线-点线–在d1开始治疗：按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(Q组，n＝7)；实心圆虚线-在d0开始治疗：按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(组P，n＝6)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H)。白色方形实线：未诱导的膝直径无增加(Q、P、和H组；左侧未诱导膝)。

[0069] 图21关节炎诱导之后第1天(A)、第2天(B)和第3天(C)cgtx-544疗效结果的统计分析：采用和不采用cgtx-544肽治疗对相对膝肿胀的改变-祛病治疗(开始于d0和d1)。所有箱线图显示了中位数范围、四分位数范围、样品最小和最大值。为了分析显著性，将溶剂对照组与治疗组比较。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0070] 图22祛病治疗(从d＝0或d＝1时开始治疗)时间进程中采用和不采用cgtx-544肽治疗对关节炎大鼠中的WBC计数的影响(治疗开始于d0和d1)。白细胞(WBC)计数绝对值；值为平均值±SD。三角形长虚线-点线-从d1开始治疗：按照1mg/kg体重的cgtx-544(混合)肽治疗组(组Q，n＝7)；实心圆虚线-从d0开始治疗：按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(组P，n＝6)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝5)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。

[0071] 图23祛病治疗(从d＝0或d＝1时开始治疗)时间进程中采用和不采用cgtx-544肽治疗对关节炎大鼠中的嗜中性粒细胞占WBC的百分比的影响(治疗开始于d0和d1)。嗜中性粒细胞(以％表示)相对于WBC的总量。数值为平均值±SD。三角形长虚线-点线-从d1开始治疗：按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(Q组，n＝7)；实心圆虚线-从d0开始治疗：按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(组P，n＝6)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝5)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。

[0072] 图24祛病治疗(从d＝0或d＝1时开始治疗)时间进程中采用和不采用cgtx-544肽治疗对关节炎大鼠中的淋巴细胞相对于WBC的百分比的影响(治疗开始于d0和d1)。淋巴细胞(以％表示)相对于WBC的总量。数值为平均值±SD。三角形长虚线-点线：(从d1开始治疗)按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(组Q，n＝7)；实心圆虚线-(从d0开始治疗)按照1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(组P，n＝6)；菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝5)。黑色箭头：用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(750μg)和mBSA的免疫时间。

[0073] 图25祛病治疗(每周一次或每周两次)-时间进程中对膝关节直径的相对增加的影响。数值为平均值±SD。三角形长虚线-点线-d1单次治疗：1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(R6-10组，n＝5)；实心圆虚线-在d1和d4单次治疗：1mg/kg体重的cgtx-544肽治疗组(组R1-5，n＝5)；以上两组的曲线直到第4天都是重合的。菱形实线：溶剂(NaCl)对照组(组H，n＝
5)。

[0074] 图26祛病治疗(每周一次或每周两次)-cgtx-544功效的统计分析：关节炎诱导之后第2天(A)和第5天(B)采用和不采用cgtx-544肽治疗对相对膝肿胀的改变。所有箱线图显示了中位数范围、四分位数范围、样品最小和最大值。为了分析显着性，将溶剂对照组与治疗组比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

[0075] 图27 mBSA特异性抗体的分析。在实验组H和I中，所有动物在免疫和AIA诱导期期间都产生了针对抗原mBSA的抗体。在对照组F中(初始动物)检测不到特异性mBSA抗体。

[0076] 图28 MTX疗效结果的统计分析：关节炎诱导之后第1天(A)和第3天(B)采用和不采用MTX治疗(高/低剂量)对相对膝肿胀的改变。所有箱线图显示了中位数范围、四分位数范围、样品最小和最大值。为了分析显着性，将溶剂对照组与治疗组比较。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.不显著。

[0077] 图29肽合成方案。

[0078] 图30折叠后cgtx-544肽的UPLC图

[0079] 图31 cgtx-544(单个)的IC50。A.将结果拟合到Hill曲线时，cgtx-544(单个)显示出6.9nM的IC50值。B.随着cgtx-544(单个)浓度的增加，电流逐步降低。C.在不同的cgtx-544(单个)浓度下测量的电流痕量。

[0080] 图32 cgtx-544(单个)的选择性。A.将结果拟合到Hill曲线时，cgtx-544(单个)显示出Kv1.1的IC50值为约6μM。B.随着cgtx-544(单个)浓度的增加，Kv1.1电流逐步降低。C.不同的cgtx-544(单个)浓度下测量过程中Kv1.1的电流踪迹。D.10μM的cgtx-544(单个)溶液没有诱导Kv1.5电流的显着降低，而该电流对奎尼丁敏感。E.100nM的cgtx-544(单个)溶液没有改变经过稳定感染的CHO细胞中的Kv1.2电流。浓度>1μM仅导致电流的略微降低。在2.5μM处确定IC50。

[0081] 图33 37℃下的人血清中cgtx-544(单个)的衰减。将已知量的cgtx-544(单个)加入来自3个供血者的人血清中，并在37℃下孵育57天的时间。在此期间，在测量肽对Kv1.3通道的阻断活性。肽保持稳定16小时，且在45天后仍然可以检测到。在第57天，阻断效应不再可见。衰减描述为通过下式确定的cgtx-544(单个)的浓度的降低C(t)＝IC50(t0)/IC50(t).C0。通过简单的衰减曲线拟合衰变：C(t)＝C0.2(-t/t1/2)，其中C0是溶液中肽的初始浓度，t0是在37℃点孵育0分钟，t1/2是半衰期。

[0082] 图34静脉注射后，所治疗的大鼠的血清中，cgtx-544(单个)的降低。基于标准曲线计算出未结合的循环cgtx-544(单个)的浓度。以误差柱描述平均值的标准误差(n＝6)。

[0083] 图35 A.延长孵育cgtx-544导致了皮摩尔的IC50值。通过非特异性钾通道阻断剂奎尼丁将Kv1.3电流归一化为初始峰电流和完全阻断(数据未显示)。当在控制条件(上曲线，n＝11)电流稳定至少10分钟的情况下，单次施用(箭头)cgtx-544(下曲线，n＝13)导致了随时间增加的阻断。B.延长孵育时间下cgtx-544的剂量响应曲线。在黑色虚线中，显示了短孵育时间下的cgtx-544剂量响应曲线。当延长cgtx-544与Kv1.3通道孵育时间(即15分钟)，得到了黑色实线。与长孵育时间的60％的阻断(黑点)相比，观察到的短孵育时间下20％的阻断(白点)导致了剂量-响应曲线的左移，并随之导致IC50(水平虚线)降低。C.长孵育时间和短孵育时间下cgtx-544对Kv1.3和Kv1.1的IC50值。

具体实施方式

[0084] 在下面详细描述本发明之前，应当理解的是本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们都可以变化。还应当理解的是，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求所限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。本文中使用一个和三个字母的氨基酸缩写，其对应于IUPAC命名法(参见例如European Journal of Biochemistry，138：9-37，1984)。

[0085] 引入以下定义：

[0086] 除非上下文另有明确说明，如本说明书和所要求保护的权利要求中所使用的，单数形式的“一”和“一个”也包括它们各自的复数。

[0087] 应当理解的是，术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变化形式不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施方案，则这意味着也包括优选地仅由这些实施方案组成的组。

[0088] 在本发明的上下文中，术语“大约”和“近似”表示本领域技术人员会理解的确保所讨论的特征技术效果的精度区间。该术语通常包括所示数值的±10％、优选±5％的偏差。

[0089] 本文所用的术语“肽”是指氨基酸类的分子链，并且不是指产物的特定长度；因此，在肽的定义内包括了多肽类、寡肽类和蛋白质类。根据定义，肽类可以是天然存在的肽类和合成肽类，其可以包括天然或非天然存在的氨基酸类。定义中还包括肽的功能性衍生物，即被例如通过修饰天然或非天然存在的氨基酸的侧链、游离氨基和/或羧基端基，优选该修饰不改变相应氨基酸的身份的化学修饰的肽，例如，肽的氨基酸的侧链或游离氨基或羧基端基可以通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化、羧化等修饰。在优选的实施方案中，根据本发明的肽可以通过PEG化、HES化或PAS化进行修饰。

[0090] 本发明人惊讶地发现，本文公开的化合物能够选择性结合Kv1.3钾通道而非其它钾通道，如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率的Ca2+活化的K+通道(BK通道)。鉴于在TEM细胞中Kv1.3的普遍性，因此根据本发明的化合物构成了用于TEM细胞介导疾病(如自身免疫性疾病)的有力的治疗剂。此外，所公开的化合物具有降低的副作用的优点，因为它们基本上不调节分布在其它类型的细胞或组织上的其它钾通道的活性。

[0091] 因此，本发明一般涉及能够选择性结合Kv1.3钾通道而非其它钾通道如Kv1.1的化合物。设想将此类化合物用于治疗或预防自身免疫性疾病。此类化合物可以选自由肽、抗体或小分子组成的组。在特别优选的实施方案中，所述化合物是如本发明的第一、第二和第三方面和其变体中所述的肽。

[0092] 能够选择性结合钾通道Kv1.3的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体还可以选自抗体变体或片段，例如单链抗体、双抗体、微抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab')2片段，条件是所述抗体变体或片段能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0093] 本文所用的术语“小分子”是指具有低分子量的小分子有机化合物。

[0094] 小分子可以是自然界中不存在的合成化合物或从天然来源中分离或一直存在于天然来源的天然存在的化合物，如细胞、植物、真菌、动物等等。在本发明的上下文中，小分子优选具有低于5000道尔顿、更优选低于4000道尔顿、更优选低于3000道尔顿、更优选低于2000道尔顿或甚至更优选低于1000道尔顿的分子量。在特别优选的实施方案中，本发明上下文中的小分子具有低于800道尔顿的分子量。

[0095] 在另一个优选的实施方案中，本发明上下文中的小分子具有50至3000道尔顿、优选100至2000道尔顿、更优选100至1500道尔顿且甚至更优选100至1000道尔顿的分子量。最优选地，在本发明的上下文中的小分子具有100至800道尔顿的分子量。

[0096] 能够选择性结合钾通道Kv1.3的小分子可以例如通过筛选小化合物数据库来识别。

[0097] 因此，本发明在第一、第二和第三方面及其变体中涉及能够选择性结合钾通道Kv1.3的肽化合物。优选地，所述化合物能够选择性地结合钾通道Kv1.3而不是其它钾通道，例如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率的Ca2+活化的K+通道(BK通道)。在特别优选的实施方案中，根据本发明的化合物能够选择性地结合钾通道Kv1.3而不是钾通道Kv1.1。

[0098] 在第一方面，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0099] X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C(SEQ ID No.：23),

[0100] 其中X1＝T,Q,S,Y,N；X2＝I,F,V,A,L,W；X3＝I,T,Y,S,V,A,L；X4＝K,S,T,Y,R；X5＝R,T,K,S,Y；X6＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X7＝P,S,T；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X11＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X12＝P,H,V,I,L,A；X13＝R,K,Q,N；X14＝K,D,A,R,E,V,L,I；X15＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X16＝Y,N,S,T,Q；X17＝A,G,V,I,L；X18＝K,R；X19＝Y,N,Q,T,S和X20＝G,R,K。

[0101] 在第一方面的变体中，本发明还涉及包括以下根据SEQ ID No：23的氨基酸序列或由以下根据SEQ ID No：23的氨基酸序列组成的化合物，

[0102] 其中X1＝T,Q,S,Y,N；X2＝I,F,V,A,L,W；X3＝I,T,Y,S,V,A,L；X4＝K,S,T,Y,R；X5＝R,T,K,S,Y；X6＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X7＝P,S,T；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X11＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X12＝P,H,V,I,L,A；X13＝R,K,Q,N；X14＝K,D,A,R,E,V,L,I；X15＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X16＝Y,N,S,T,Q；X17＝A,G,V,I,L；X18＝K,R；X19＝Y,N,Q,T,S和X20＝G,R,K；且

[0103] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0104] 在第一方面的优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0105] X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C(SEQ ID No.：24)；

[0106] 其中X1＝T,Q；X2＝I,F；X3＝I,T；X4＝K,S；X5＝R,T,K；X6＝T,G,S,N,I；X7＝P,S；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W；X11＝D,R,P,K,E,S；X12＝P,H,V；X13＝R,K,Q；X14＝K,D,A,R；X15＝E,Q,A,L；X16＝Y,N；X17＝A,G；X18＝K,R；X19＝Y,N和X20＝G,R。

[0107] 在第一方面的变体的优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：24的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：24的氨基酸序列组成的化合物，

[0108] 其中X1＝T,Q；X2＝I,F；X3＝I,T；X4＝K,S；X5＝R,T,K；X6＝T,G,S,N,I；X7＝P,S；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W；X11＝D,R,P,K,E,S；X12＝P,H,V；X13＝R,K,Q；X14＝K,D,A,R；X15＝E,Q,A,L；X16＝Y,N；X17＝A,G；X18＝K,R；X19＝Y,N和X20＝G,R；且[0109] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0110] 在第一方面和其变体的更优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括SEQ ID No.25(cgtx-544)或SEQ ID No.26(cgtx 547)的氨基酸序列或由SEQ ID No.25(cgtx-544)或SEQ ID No.26(cgtx 547)的氨基酸序列组成。在本文上下文的第一方面和其变体的另一个更优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括与SEQ ID No.25(cgtx-544)具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、约
97％、至少约98％或至少约99％的百分同一性的氨基酸序列或由与SEQ ID No.25(cgtx-
544)具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、约97％、至少约98％或至少约99％的百分同一性的氨基酸序列组成。两个序列之间的百分同一性的确定优选使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:
5873-5877的数学算法完成。该算法并入了例如在NCBI可得的Altschul等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)。百分同一性的测定优选用BLASTn和BLASTp程序的标准参数进行。BLAST多核苷酸检索优选采用BLASTn程序进行。对于一般参数，“最大目标序列(Max Target Sequence)”框可以被设置为100，可以勾选“短查询(short queries)”框，可以将“期望阈值(Expect threthhold)”框设置为10，并且可以将“字大小(Word Size)”框设置为28。对于评分参数，“匹配/错配得分(Match/mismatch Scores)”可以被设置为1、-2并且“间隙成本(Gap Costs)”框可以被设置为线性的。对于过滤和掩蔽参数，可以不勾选“低复杂度区域(Low complexity regions)”框，可以不勾选“物种特定重复(Species-specific repeats)”框，可以勾选“仅用于查找表的掩码(Mask for lookup table only)”框，可以不勾选“掩蔽小写字母(Mask lower case letters)”框。BLAST蛋白质检索优选用BLASTp程序进行。对于一般参数，“最大目标序列(Max Target Sequence)”框可以被设置为100，可以勾选“短查询(short queries)”框，可以将“期望阈值(Expect threthhold)”框设置为10，且可以将“字大小(Word Size)”框设置为“3”。对于评分参数，“矩阵(Matrix)”框可以被设置为“BLOSUM62”，“间隙成本(Gap Costs)”框可以被设置为“存在：11延伸：1(Existence:
11Extension:1)”，“组成调整(Compositional adjustments)”框可以被设置为“条件成分得分矩阵调整(Conditional compositional score matrix adjustment)”。对于过滤和掩蔽参数，可以不勾选“低复杂度区域(Low complexity regions)”框，可以不勾选“仅用于查找表的掩码(Mask for lookup table only)”框，且可以不勾选“掩蔽小写字母(Mask lower case letters)”框。

[0111] 在第一方面和其变体的更优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括SEQ ID No.25(cgtx-544)的氨基酸序列或由SEQ ID No.25的氨基酸序列(cgtx-544)组成。

[0112] 下文所述的实施方案优选是指本发明第一方面和其变体的化合物。然而，需要理解的是，这些实施方案，例如如下所述的肽类的长度，对Kv1.3相对于Kv1.1的选择性等，也适用于本发明的第二和第三方面和它们的变体的化合物以及其如下文所述的优选实施方案。

[0113] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物是肽。

[0114] 如果根据本发明的化合物是肽，则根据本发明的化合物优选具有低于1000个氨基酸、低于500个氨基酸、低于200个氨基酸、优选低于150个氨基酸、低于100个氨基酸、低于90个氨基酸、低于80个氨基酸、低于70个氨基酸、低于60个氨基酸、低于50个氨基酸或低于40个氨基酸的长度。

[0115] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的化合物具有至少20至1000个氨基酸之间、优选至少25至500个氨基酸之间、更优选至少30至200个氨基酸之间，更优选至少34和150个氨基酸之间、更优选至少34至100个氨基酸之间、更优选至少34至90个氨基酸之间、甚至更优选至少34至80个氨基酸之间、至少34至70个氨基酸之间、34至60个氨基酸之间、34至
50个氨基酸之间或34至40个氨基酸之间的长度。

[0116] 在更优选的实施方案中，根据本发明的化合物基本上由所示的氨基酸序列组成。

[0117] 包括在根据本发明的化合物中的氨基酸可以是L-或D-氨基酸。优选地，包括在根据本发明的化合物的氨基酸是L-氨基酸。在一些实施方案中，特别是在需要对蛋白水解高抗性的情况下，可以优选D-氨基酸。

[0118] 由于不同钾通道差异性分布在不同类型细胞上，如果将抑制不同钾通道活性的化合物应用于活生物体，同时会产生显著的副作用。因此，本发明提供了相比其它钾通道、特别是相比钾通道Kv1.1，能够选择性结合钾通道Kv1.3的化合物。

[0119] 本文所用的术语“选择性结合”是指根据本发明的化合物优选结合Kv1.3通道，而不是其它离子通道，特别不是其它钾通道如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率Ca2+活化的K+通道(BK通道)。

[0120] 优选地，根据本发明的化合物能够选择性地结合钾通道Kv1.3而不是钾通道Kv1.1。在这种情况下，根据本发明的化合物以明显高于与Kv1.1通道的亲和力结合Kv1.3通道。

[0121] 在本发明的上下文中，毒素HsTx1被认为不是能够选择性结合钾通道Kv1.3的化合物，因为它还结合并有效抑制Kv1.1通道。

[0122] 在优选的实施方案中，根据本发明选择性结合Kv1.3的化合物，以比所述化合物结合Kv1.1通道的Kd值低至少1/2、1/5、1/10、1/100、1/1000、1/2000、优选地至少1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000或1/10000倍的Kd值结合钾通道Kv1.3。在另一个优选的实施方案中，根据本发明选择性结合Kv1.3的化合物以比所述化合物结合其它钾通道，例如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率Ca2+活化的K+通道(BK通道)的Kd值低至少1/4000、1/5000或1/10000的Kd值结合钾通道Kv1.3。

[0123] 在特别优选的实施方案中，根据本发明选择性结合Kv1.3的化合物以比所述化合物结合Kv1.1通道的Kd值低至少1/4000、1/5000或1/10000的Kd值结合钾通道Kv1.3。

[0124] 在优选的实施方案中，本发明的化合物结合钾通道Kv1.3的Kd值通常为约0.1nM至约250nM之间、约0.5nM至约250nM之间、约1nM至约225nM之间、约1nM至约200nM之间，甚至更优选约1nM至约100nM之间，最优选约1nM至约50nM之间。

[0125] 根据本发明的化合物结合其它钾通道，例如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率Ca2+活化的K+通道(BK通道)的Kd值优选高于0.1mM、高于0.2mM、高于0.3mM、高于0.4mM或高于0.5mM。在特别优选的实施方案中，根据本发明的化合物以高于
0.1mM、高于0.2mM、高于0.3mM、高于0.4mM或高于0.5mM的Kd值结合Kv1.1通道。

[0126] 因此，根据本发明的化合物优选以约0.5至约200nM之间，如约1或2nM至约200nM的Kd值结合钾通道Kv1.3，而以高于0.1mM、高于0.2mM、高于0.3mM、高于0.4mM或高于0.5mM的Kd值结合Kv1.1通道。更优选地，根据本发明的化合物以约0.5至约100nM之间，如约1或2nM至约100nM的Kd值结合钾通道Kv1.3，而以约高于0.1mM、高于0.2mM、高于0.3mM、高于0.4mM或高于0.5mM的Kd值结合Kv1.1通道。甚至更优选地，根据本发明的化合物以约0.5至约50nM之间，如约1或2nM至约50nM的Kd值结合钾通道Kv1.3，而以约高于0.5mM的Kd值结合Kv1.1通道。

[0127] 根据本发明的化合物优选能够选择性结合并阻断或降低钾通道Kv1.3的活性。与对照组相比，根据本发明的化合物可以将钾通道Kv1.3的活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％，更优选至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些优选的实施方案中，根据本发明的化合物可以阻断100％的钾通道Kv1.3的活性。

[0128] 根据本发明的化合物选择性结合并阻断或降低Kv1.3通道活性的能力可以通过本领域已知的测定方法来测试。例如，在一种方法中，可以将表达Kv1.3或另一种钾通道如Kv1.1、Kv1.2、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率Ca2+活化的K+通道(BK通道)的哺乳动物细胞系与本发明的化合物接触，且通道电流可以通过如描述于Grissmer等人(Mol Pharmacol 45；1227-34(1994))或下文示例部分中所述的膜片钳法来测量。每种化合物可以例如在不同浓度下进行测试。根据本发明的化合物的Kd值可以例如通过用所测量的峰值电流的降低对Hill方程进行拟合来确定。

[0129] 应当理解的是，如例如示例2中所述的用于测定Kd的方法不考虑所测量的通道的数目，这是为什么本公开中Kd对应于IC50值，使得术语Kd和IC50在本文中同义使用的目的。应当理解的是，当完全折叠和纯化的肽类与包括不完全折叠的肽类共同使用时，可以观察到较低的Kd值(参见示例2)。

[0130] 在一些实施方案中，根据本发明的化合物可以已经连接到能够识别和靶向TEM细胞的抗体或其它分子的N-末端氨基基团或其C-末端羧基基团。

[0131] 本发明的化合物可以使用本领域已知的技术制备。例如，肽可以采用固相Fmoc化学，例如根据由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.85；7129(1963))最初描述并由Meienhofer等人(J.Peptide Prot.Res.13；35(1979))和Fields等人Peptide Res.4；95(1991))之后修改的原理来合成。该合成可以例如在自动肽合成仪上进行。合成后，可以使用自动肽测序仪验证序列。

[0132] 在本发明的上下文中提到的钾通道，如钾通道Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv1.6、IKCa1、hERG或大电导率Ca2+活化的K+通道(BK通道)在本领域是公知的。因此，普通技术人员可以容易地从任何合适的公共数据库如NCBI数据库(例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中检索到这些通道的多核苷酸和氨基酸序列和其直系同源物和剪接异构体。

[0133] 在第二方面，本发明涉及包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的化合物：

[0134] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No：1)；

[0135] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K。

[0136] 在优选的实施方案中，所述化合物不是HsTx1(SEQ ID NO：32)。

[0137] 在第二方面的变体中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：1的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：1的氨基酸序列组成的化合物，

[0138] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K；且

[0139] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0140] 在优选的实施方案中，所述化合物不是HsTx1。

[0141] 在第二方面优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0142] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No：2)；

[0143] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G；X16＝K,R；X17＝Y,N和X18＝G,R；且

[0144] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0145] 在优选的实施方案中，所述化合物不是HsTx1。

[0146] 在第二方面的变体的优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：2的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：2的氨基酸序列组成的化合物，

[0147] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G；X16＝K,R；X17＝Y,N和X18＝G,R；且

[0148] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0149] 在优选的实施方案中，所述化合物不是HsTx1。

[0150] 在第二方面的优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0151] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C(SEQ ID No.：3)；

[0152] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝K,R；
X15＝Y,N,Q,T,S和X16＝G,R,K。

[0153] 在第二方面的变体的优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：3的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：3的氨基酸序列组成的化合物，

[0154] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝K,R；
X15＝Y,N,Q,T,S和X16＝G,R,K；且

[0155] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0156] 在第二方面的优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0157] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C(SEQ ID No.：4)；

[0158] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝K,R；X15＝Y,N和X16＝G,R。

[0159] 在第二方面的变体的优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：4的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：4的氨基酸序列组成的化合物，

[0160] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝K,R；X15＝Y,N和X16＝G,R；且

[0161] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0162] 在第二方面的另一个优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0163] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C(SEQ ID No.：5)；

[0164] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L和X16＝K,R。

[0165] 在第二方面的变体的另一个优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：5的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：5的氨基酸序列组成的化合物，

[0166] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L和X16＝K,R；且

[0167] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0168] 在第二方面的更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0169] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C(SEQ ID No.：6)；

[0170] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G和X16＝K,R。

[0171] 在第二方面的变体的更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：6的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：6的氨基酸序列组成的化合物，

[0172] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G和X16＝K,R；且

[0173] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0174] 在第二方面的另一个优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0175] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C(SEQ ID No.：7)；

[0176] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I和X14＝K,R。

[0177] 在第二方面的变体的另一个优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：7的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：7的氨基酸序列组成的化合物，

[0178] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I和X14＝K,R；
且

[0179] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0180] 在第二方面的更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0181] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C(SEQ ID No.：8)；

[0182] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L和X14＝K,R。

[0183] 在第二方面的变体的更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：8的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：8的氨基酸序列组成的化合物，

[0184] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L和X14＝K,R；且

[0185] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0186] 在第二方面的甚至更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：9(cgtx 538)的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：9(cgtx 538)的氨基酸序列组成的化合物。

[0187] 在第二方面的另一个更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0188] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：10)；

[0189] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N和X10＝K,D,A,R,E,V,L,I。

[0190] 在第二方面的变体的另一个优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：10的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：10的氨基酸序列组成的化合物，

[0191] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N和X10＝K,D,A,R,E,V,L,I；且

[0192] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0193] 在第二方面的另一个更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0194] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：11)；

[0195] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝A,Y,I,L,W；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N和X10＝K,D,A,R,E,V,L,I。

[0196] 在第二方面的变体的更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：11的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：11的氨基酸序列组成的化合物，

[0197] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝A,Y,I,L,W；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N和X10＝K,D,A,R,E,V,L,I；且

[0198] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0199] 在第二方面的甚至更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括根据SEQ ID No：12(cgtx 539)的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：12(cgtx 539)的氨基酸序列组成。

[0200] 在第二方面另一个优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0201] X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No：13)；

[0202] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X4＝P,S,T；X5＝R,K,P；X6＝R,K,Q,N；X7＝K,D,A,R,E,V,L,I和X8＝E,Q,A,L,D,N,V,I。

[0203] 在第二方面的变体的另一个优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：13的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：13的氨基酸序列组成的化合物，

[0204] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X4＝P,S,T；X5＝R,K,P；X6＝R,K,Q,N；X7＝K,D,A,R,E,V,L,I和X8＝E,Q,A,L,D,N,V,I；且

[0205] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0206] 在第二方面的更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0207] X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：14)；

[0208] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝T,G,S,N,I；X4＝P,S,T；X5＝R,K,P；X6＝R,K,Q；X7＝K,D,A,R和X8＝E,Q,A,L；且

[0209] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0210] 在第二方面的变体的更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：14的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：14的氨基酸序列组成的化合物，

[0211] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝T,G,S,N,I；X4＝P,S,T；X5＝R,K,P；X6＝R,K,Q；X7＝K,D,A,R和X8＝E,Q,A,L；且

[0212] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0213] 在第二方面的甚至更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括根据SEQ ID No：15(cgtx 540)的氨基酸序列。

[0214] 在第二方面的另一优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0215] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C(SEQ ID No.：16)；

[0216] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,Q,T,S和X15＝G,R,K。

[0217] 在第二方面的变体的另一个优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：16的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：16的氨基酸序列组成的化合物，

[0218] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,Q,T,S和X15＝G,R,K；且

[0219] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0220] 在第二方面的更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0221] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C(SEQ ID No.：17)；

[0222] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N和X15＝G,R。

[0223] 在第二方面的变体的更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：17的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：17的氨基酸序列组成的化合物，

[0224] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N和X15＝G,R；且

[0225] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0226] 在第二方面的甚至更特别优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括根据SEQ ID No：18(cgtx 541)或SEQ ID No：19(cgtx 542)的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：18(cgtx 541)或SEQ ID No：19(cgtx 542)的氨基酸序列组成。

[0227] 在第二方面另一个优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0228] I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：20)；

[0229] 其中X1＝R,T,K,S,Y；X2＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X3＝P,S,T；X4＝R,K,P；X5＝D,Q,N,E；X6＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X7＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N；X10＝K,D,A,R,E,V,L,I和X11＝E,Q,A,L,D,N,V,I。

[0230] 在第二方面的变体的另一个优选实施方案中，本发明还涉及包括以下SEQ ID No：20的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：20的氨基酸序列组成的化合物，

[0231] 其中X1＝R,T,K,S,Y；X2＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X3＝P,S,T；X4＝R,K,P；X5＝D,Q,N,E；X6＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X7＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N；X10＝K,D,A,R,E,V,L,I和X11＝E,Q,A,L,D,N,V,I；且

[0232] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0233] 在第二方面的更优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0234] I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：21)；

[0235] 其中X1＝R,T,K；X2＝T,G,S,N,I；X3＝P,S；X4＝R,K,P；X5＝D,Q,N,E；X6＝A,Y,I,L,W；X7＝D,R,P,K,E,S；X8＝P,H,V；X9＝R,K,Q；X10＝K,D,A,R和X11＝E,Q,A,L。

[0236] 在第二方面的变体的更优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：21的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：21的氨基酸序列组成的化合物，

[0237] 其中X1＝R,T,K；X2＝T,G,S,N,I；X3＝P,S；X4＝R,K,P；X5＝D,Q,N,E；X6＝A,Y,I,L,W；X7＝D,R,P,K,E,S；X8＝P,H,V；X9＝R,K,Q；X10＝K,D,A,R和X11＝E,Q,A,L；且[0238] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0239] 在第二方面的甚至更优选实施方案中，根据本发明的化合物包括根据SEQ ID No：22(cgtx 545)的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：22(cgtx 545)的氨基酸序列组成。

[0240] 在第三方面，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0241] G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：27)；

[0242] 其中X1＝P,I,F,V,A,L,W；X2＝K,S,T,Y,R；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R，X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K。

[0243] 在第三方面的变体中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：27的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：27的氨基酸序列组成的化合物，

[0244] 其中X1＝P,I,F,V,A,L,W；X2＝K,S,T,Y,R；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K；且

[0245] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0246] 在第三方面的优选实施方案中，根据本发明的化合物包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

[0247] G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：28)；

[0248] 其中X1＝P,I,F；X2＝K,S；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G；X16＝K,R；X17＝Y,N和X18＝G,R。

[0249] 在第三方面的变体的优选实施方案中，本发明还涉及包括根据SEQ ID No：28的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：28的氨基酸序列组成的化合物，

[0250] 其中X1＝P,I,F；X2＝K,S；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G；X16＝K,R；X17＝Y,N和X18＝G,R；且

[0251] 其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0252] 在第三方面的特别优选的实施方案中，根据本发明的化合物包括根据SEQ ID No：29(cgtx 543)、SEQ ID No.30(cgtx 546)或SEQ ID No.31(cgtx 548)的氨基酸序列或由根据SEQ ID No：29(cgtx 543)、SEQ ID No.30(cgtx 546)或SEQ ID No.31(cgtx 548)的氨基酸序列组成。

[0253] 因此，特别优选的是根据本发明的化合物包括根据SEQ ID NO.9、12、15、18、19、22、25、26、29、30或31的氨基酸序列或由根据SEQ ID NO.9、12、15、18、19、22、25、26、29、30或31的氨基酸序列组成，且包括根据SEQ ID NO.25的氨基酸序列的化合物或由根据SEQ ID NO.25的氨基酸序列组成的化合物是最优选的。

[0254] 在一些实施方案中，包括根据SEQ ID NO.9、12、15、18、19、22、25、26、29、30或31的氨基酸序列的上述化合物或由根据SEQ ID NO.9、12、15、18、19、22、25、26、29、30或31的氨基酸序列组成的上述化合物可以包括0至5个，即0、1、2、3、4、5个氨基酸的取代、缺失或插入，条件是该化合物仍然能够选择性结合和/或阻断或降低Kv1.3钾通道的活性。具有这种氨基酸突变的化合物称为变体，并且其也形成本发明的一部分。

[0255] 取代可以是保守性取代或非保守性取代，优选地取代是保守性取代。保守性取代包括用具有与被取代的氨基酸相似的化学性质的另一氨基酸来取代氨基酸。在一些实施方案中，取代还可以是天然存在的氨基酸与非天然氨基酸的替换。

[0256] 术语“氨基酸缺失”和“氨基酸插入”在本文中根据它们在本领域中常规和公知含义使用。

[0257] 本发明在另一方面还提供了编码根据本发明氨基酸序列的核酸。

[0258] 在本发明的上下文中，术语“核酸”或“核酸序列”是指能够编码给定氨基酸序列的单链或双链形式的天然存在或合成的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。该术语还包括给定脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的衍生物，其可以不同于原始脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，原始脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中原始序列的一个以上核苷酸被其它核苷酸取代和/或被通过本领域技术人员已知的方法(化学)修饰，条件是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物仍然能够编码其各自的氨基酸序列。

[0259] 对于本领域技术人员显而易见的是，由于遗传密码的简并性，根据本发明的给定氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列编码。

[0260] 本发明在另一方面还提供了包括根据本发明的核酸序列的载体。

[0261] 载体可以是任何分子媒介，如质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或任何其它媒介，其含有一个以上根据本发明的核苷酸序列，并且优选设计为用于在不同宿主细胞之间转移。在优选的实施方案中，载体是原核或真核表达载体。

[0262] 如本文所用的术语“表达载体”是指含有操作性连接的编码序列的表达所需的期望的编码序列和合适DNA序列并且能够在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中诱导蛋白质表达的载体。表达载体可以包括功能性元件如可操作地连接到待转录的核酸序列的启动子、使转录正确终止的终止序列和可选择标记。本领域技术人员可意识到，启动子的性质将取决于载体是否将被用于原核或真核宿主细胞中。为了在延长的时间段内获得稳定的表达，表达载体可以进一步包括复制起点(ORI)。合适的表达载体是本领域技术人员已知的。根据表达是否在原核或真核宿主细胞中或在体外表达系统中实现，载体可以是原核和/或真核表达载体如质粒、粘粒、微染色体、细菌噬菌体、逆转录病毒载体等。如何根据具体需要选择合适的载体是技术人员熟悉的。

[0263] 本发明在另一方面是指包括根据本发明的核酸序列或载体的宿主细胞。

[0264] 根据应用领域，宿主细胞可以是原核或真核宿主细胞。典型的原核宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。典型的真核宿主细胞包括酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞如Sf9/Sf21细胞、植物细胞和哺乳动物细胞如COS、CHO和HeLa细胞。

[0265] 本发明在另一方面还涉及包括根据本发明的化合物的药物组合物。

[0266] 在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物可以包括超过一种根据本发明的化合物。例如，根据本发明的药物组合物可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种根据本发明的化合物。在一些优选的实施方案中，本发明的药物组合物可以包括一种以上根据本发明的化合物，其中所述化合物选自包括SEQ ID NO.9、12、15、18、19、22、25、26、29、30或31的氨基酸序列的化合物组或选自由SEQ ID NO.9、12、15、18、19、22、25、26、29、30或31的氨基酸序列组成的化合物组。

[0267] 贯穿本公开始终被认为特别优选的用于治疗使用的肽是SEQ ID No.：25(cgtx-544)、SEQ ID No.：29(cgtx 543)和SEQ ID No.：9(cgtx 538)的肽。应注意的是，下文描述的大多数实验是采用SEQ ID No.：25(cgtx-544)的肽来进行的。然而，也已经测试了SEQ ID No.：29(cgtx 543)和SEQ ID No.:9(cgtx 538)的肽相对于hERG的选择性，并且基于它们的序列相似性，似乎可以合理地得出对于这些肽也可以观察到如ctgx 544观察到的相似效果。

[0268] 这些肽以及本文所述的其它肽可以通过本领域已知的方法制备，例如固相合成。应注意的是，这些肽包括半胱氨酸残基，因此可能需要主动折叠成天然状态以实现最佳的活性。通过纯化已经完全折叠的肽可以进一步增强活性。

[0269] 可以通过使被合成的肽进行氧化而形成半胱氨酸残基之间的二硫桥来实现折叠。这可以通过如示例8所述，将肽在例如PH约为8的磷酸酯缓冲液中，在大气氧存在下孵育来实现。折叠后可以进行质谱分析，因为经过折叠的肽将显示出的轻微的质量降低，对应于在二硫桥形成过程中氢原子损失。在ctgx 544的情况下，质量差将是4212对4220.2Da。

[0270] 经过完全折叠的肽的纯化可以通过本领域已知的方法如HPLC纯化来实现。在示例8中描述了合适的方法。

[0271] 根据本发明的药物组合物可以口服给药，例如以可吸入粉末丸剂、片剂、漆片剂、糖衣片剂、颗粒剂、硬质和软质的明胶胶囊、水性、醇性或油性溶液剂、糖浆剂、乳剂或悬浮液给药，或直肠给药，例如以栓剂的形式给药。

[0272] 给药也可以在鼻内或舌下进行。

[0273] 给药可以进一步以注射或输注溶液的形式在肠胃外，例如皮下、肌肉内或静脉内进行。其它合适的给药形式是例如经皮或局部给药，例如以软膏、酊剂、喷雾剂或经皮治疗系统的形式，或以鼻喷雾剂或气雾剂混合物的形式吸入给药。

[0274] 贯穿本公开始终被认为是特别优选的给药形式是静脉内、肌内或皮下给药。

[0275] 对于丸剂、片剂、糖衣片和硬明胶胶囊的生产，可以使用例如乳糖、淀粉例如玉米淀粉或淀粉衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等。用于软质明胶胶囊和栓剂的载体是例如脂肪、石蜡、半固体和液体多元醇类、天然或硬化油类等。用于制备溶液(例如注射溶液或乳液或糖浆)的合适载体是例如水、生理氯化钠溶液、如乙醇、甘油、多元醇的醇类、蔗糖、转化糖、葡萄糖、甘露醇、植物油等。

[0276] 药物组合物还可包含添加剂，例如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质，溶剂、增溶剂、实现储存效果的试剂、用于改变渗透压的盐类、包衣剂或抗氧化剂。

[0277] 用于本文所述的各种不同形式的药物组合物的合适赋形剂的实例可以在A Wade和PJ Weller编辑的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第2版，(1994)中找到。

[0278] 在一些实施方案中，药物组合物可以是持续释放制剂。

[0279] 在一些实施方案中，除了至少一种根据本发明的化合物之外，根据本发明的药物组合物还可以包括适于治疗自身免疫疾病的其它免疫抑制剂。此类免疫抑制剂的实例包括例如皮质醇、氢化皮质醇、地塞米松、环磷酰胺、亚硝基脲、甲氨蝶呤、巯嘌呤、丝裂霉素C、博来霉素、光辉霉素、环孢菌素、雷帕霉素、硫唑嘌呤、泼尼松和脱氧精胍菌素和干扰素。

[0280] 在其它优选实施方案中，可将包括上述其它免疫抑制剂的组合物各自与包括一种以上根据本发明化合物的药物组合物联合来给药至需要其的哺乳动物。

[0281] 在另一方面，本发明涉及根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物用于治疗或预防涉及效应器记忆细胞(TEM细胞)的疾病。

[0282] 本发明优选涉及根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物用于治疗选自由自身免疫性疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥组成的组的疾病。

[0283] 为了本公开的目的，术语“治疗”是指疾病的治愈性缓解，而术语“预防”是指预防性预防。应当理解的是，这两个术语并不意味着各个疾病的完全缓解或预防，而是在没有以治疗性或预防性目的而给药药物活性剂的情况相比有所改善。

[0284] 在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物用于治疗或预防自身免疫性疾病的用途。

[0285] 在本发明的上下文中，术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性类疾病”是指由针对自编码实体(即自身抗原)的不适当免疫应答引起的疾病状态。包含在本定义之内的这类疾病是由使得机体去攻击自身的组织的免疫系统缺陷引起的许多疾病中的任何一种疾病。在优选的实施方案中，自身免疫疾病是T细胞介导的自身免疫疾病。

[0286] 可以通过本发明的化合物和药物组合物治疗或预防的自身免疫性疾病的示例包括例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病、血管炎、桥本氏病、哮喘、特应性皮炎、自身免疫性眼病、干燥综合征、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、艾迪生病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、腹腔疾病、克罗恩病、妊娠性类天疱疮、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、川崎病、红斑狼疮、重症肌无力症、斜视性眼阵挛-肌阵孪综合征、视神经炎、Ord's甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、多发性关节炎(狗)、原发性胆汁性肝硬化、赖特综合征、高安动脉炎、颞动脉炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病、ANCA相关性系统性血管炎、Churg-Strauss综合征、显微镜下多血管炎、结肠炎、炎症性肠病、葡萄膜炎和银屑病性关节炎。

[0287] 这些自身免疫类疾病中的某些与TEM细胞有关，例如ANCA相关性系统性血管炎(Abdulahad,Nephrology,2009，第14卷，第26页)、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿病、显微镜下多血管炎(Berden,Arthritis&Rheumatism,2009,第60卷,第1578页)、强直性脊柱炎，白赛病、结肠炎、克罗恩病、炎症性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎、干燥综合征、I型糖尿病(Ulivieri,Expert Rev.Vaccines,2013，第12卷，第297页)、系统性红斑狼疮(Devarajan,Immunol.Res,2013,第57卷,第12页)、葡萄膜炎(Amadi-Obi,Nephrology,2009,第14卷，第26页)和银屑病性关节炎(De Vlam,Acta Derm.Venereol,2014,第94卷,第
627页)。

[0288] 这也适用于肥胖症(Xu,Human Molecular Genetics,2003,第12卷,第551页)。

[0289] 鉴于ctgx544已经显示出选择性地作用于TEM细胞并对类风湿性关节炎具有效果，假设可将cgtx544和本文公开的其它肽类用于治疗或预防此类疾病似乎是合理的。

[0290] 在优选的实施方案中，通过本发明的化合物和药物组合物治疗或预防的自身免疫疾病选自由多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病和血管炎组成的组。

[0291] 由于针对新器官或组织(例如心脏、肝脏、肾脏、胰腺或皮肤)的T细胞介导的免疫应答，器官或组织移植到新的宿主中时常常可能导致被移植器官或组织的排斥。因此，本发明还涉及根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物用于治疗或预防器官或组织移植排斥。器官移植排斥也已经显示出涉及了TEM细胞(参见例如Macedo,Transplantation,2012，第93卷，第813页)。鉴于cgtx544和本文公开的其它肽类的高选择性，假设cgtx544和本文公开的其它肽类可用于治疗或预防此类疾病似乎是合理的。

[0292] 在另一方面，本发明涉及通过将根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物给药至需要其的哺乳动物，来治疗或预防哺乳动物体内自身免疫疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥的方法。

[0293] 优选地，自身免疫疾病选自由多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病和血管炎组成的组。

[0294] 本文所用的术语“哺乳动物”包括例如人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊等。优选的哺乳动物是人类。

[0295] 根据本发明的药物组合物的单位剂量可以含有任何合适有效量的以待采用的预期的每日剂量范围的根据本发明的化合物。

[0296] 需要给药根据本发明的化合物或根据本发明的药物组合物的哺乳动物是例如患有或有风险形成T细胞介导的疾病、优选T细胞介导的自身免疫疾病的哺乳动物。在优选的实施方案中，所述自身免疫疾病选自由多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、I型糖尿病和血管炎组成的组。

[0297] 本发明的其它方面还涉及制备根据本发明的化合物、根据本发明的核酸序列、根据本发明的载体或根据本发明的药物组合物的方法。

[0298] 本发明还涉及：

[0299] (1)包括以下氨基酸序列的化合物：

[0300] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：1)；

[0301] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K。

[0302] 在优选的实施方案中，所述化合物不是HsTx 1(SEQ ID No.：32)。

[0303] (2)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0304] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：2)；

[0305] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G；X16＝K,R；X17＝Y,N和X18＝G,R。

[0306] 在优选的实施方案中，所述化合物不是HsTx 1。

[0307] (3)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0308] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C(SEQ ID No.：3)；

[0309] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝K,R，X15＝Y,N,Q,T,S和X16＝G,R,K。

[0310] (4)包括以下氨基酸序列的根据(3)的化合物：

[0311] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-X15-X16-C(SEQ ID No.：4)；

[0312] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝K,R；X15＝Y,N和X16＝G,R。

[0313] (5)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0314] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C(SEQ ID No.：5)；

[0315] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L和X16＝K,R。

[0316] (6)包括以下氨基酸序列的根据(5)的化合物：

[0317] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-Y-G-C(SEQ ID No.：6)；

[0318] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G和X16＝K,R。

[0319] (7)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0320] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C(SEQ ID No.：7)；

[0321] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I和X14＝K,R。

[0322] (8)包括以下氨基酸序列的根据(7)的化合物：

[0323] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-N-A-K-C-M-N-R-K-C-X14-C-Y-G-C(SEQ ID No.：8)；

[0324] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L和X14＝K,R。

[0325] (9)包括氨基酸序列SEQ ID No.9的根据(8)的化合物。

[0326] (10)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0327] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：10)；

[0328] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N和X10＝K,D,A,R,E,V,L,I。

[0329] (11)包括以下氨基酸序列的根据(10)的化合物：

[0330] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-Q-C-X7-R-X8-C-X9-X10-Q-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：11)；

[0331] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝A,Y,I,L,W；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N和X10＝K,D,A,R,E,V,L,I。

[0332] (12)包括氨基酸序列SEQ ID No.12的根据(11)的化合物。

[0333] (13)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0334] X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：13)；

[0335] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X4＝P,S,T；X5＝R,K,P；X6＝R,K,Q,N；X7＝K,D,A,R,E,V,L,I和X8＝E,Q,A,L,D,N,V,I。

[0336] (14)包括以下氨基酸序列的根据(13)的化合物：

[0337] X1-X2-C-R-X3-X4-X5-Q-C-Y-P-H-C-X6-X7-X8-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：14)；

[0338] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝T,G,S,N,I；X4＝P,S,T；X5＝R,K,P；X6＝R,K,Q；X7＝K,D,A,R和X8＝E,Q,A,L。

[0339] (15)包括氨基酸序列SEQ ID No.15的根据(14)的化合物。

[0340] (16)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0341] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C(SEQ ID No.：16)；

[0342] 其中X1＝A,V,I,L；X2＝S,R,K,T,Y；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,Q,T,S和X15＝G,R,K。

[0343] (17)包括以下氨基酸序列的根据(16)的化合物：

[0344] X1-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-R-C-X14-X15-C(SEQ ID No.：17)；

[0345] 其中X1＝A,V,I；X2＝S,R,K；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N和X15＝G,R。

[0346] (18)包括SEQ ID No.18或SEQ ID No.19的氨基酸序列的根据(17)的化合物。

[0347] (19)包括以下氨基酸序列的根据(1)的化合物：

[0348] I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：20)；

[0349] 其中X1＝R,T,K,S,Y；X2＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X3＝P,S,T；X4＝R,K,P；X5＝D,Q,N,E；X6＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X7＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X8＝P,H,V,I,L,A；X9＝R,K,Q,N；X10＝K,D,A,R,E,V,L,I和X11＝E,Q,A,L,D,N,V,I。

[0350] (20)包括以下氨基酸序列的根据(19)的化合物：

[0351] I-S-C-X1-X2-X3-X4-X5-C-X6-X7-X8-C-X9-X10-X11-T-G-C-P-Y-G-K-C-M-N-R-K-C-K-C-N-R-C(SEQ ID No.：21)；

[0352] 其中X1＝R,T,K；X2＝T,G,S,N,I；X3＝P,S；X4＝R,K,P；X5＝D,Q,N,E；X6＝A,Y,I,L,W；X7＝D,R,P,K,E,S；X8＝P,H,V；X9＝R,K,Q；X10＝K,D,A,R和X11＝E,Q,A,L。

[0353] (21)包括SEQ ID No.22的氨基酸序列的根据(20)的化合物。

[0354] (22)包括以下氨基酸序列的化合物：

[0355] X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C(SEQ ID No.：23)，

[0356] 其中X1＝T,Q,S,Y,N；X2＝I,F,V,A,L,W；X3＝I,T,Y,S,V,A,L；X4＝K,S,T,Y,R；X5＝R,T,K,S,Y；X6＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X7＝P,S,T；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X11＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X12＝P,H,V,I,L,A；X13＝R,K,Q,N；X14＝K,D,A,R,E,V,L,I；X15＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X16＝Y,N,S,T,Q；X17＝A,G,V,I,L；X18＝K,R；X19＝Y,N,Q,T,S和X20＝G,R,K。

[0357] (23)包括以下氨基酸序列的根据(22)的化合物：

[0358] X1-X2-X3-N-V-X4-C-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-C-X13-X14-X15-T-G-C-P-X16-X17-K-C-M-N-R-K-C-X18-C-X19-X20-C(SEQ ID No.：24)；

[0359] 其中X1＝T,Q；X2＝I,F；X3＝I,T；X4＝K,S；X5＝R,T,K；X6＝T,G,S,N,I；X7＝P,S；X8＝R,K,P；X9＝D,Q,N,E；X10＝A,Y,I,L,W；X11＝D,R,P,K,E,S；X12＝P,H,V；X13＝R,K,Q；X14＝K,D,A,R；X15＝E,Q,A,L；X16＝Y,N；X17＝A,G；X18＝K,R；X19＝Y,N和X20＝G,R。

[0360] (24)包括SEQ ID No.25或SEQ ID No.26的氨基酸序列的根据(23)的化合物。

[0361] (25)包括以下氨基酸序列的化合物：

[0362] G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：27)；

[0363] 其中X1＝P,I,F,V,A,L,W；X2＝K,S,T,Y,R；X3＝R,T,K,S,Y；X4＝T,G,S,N,I,K,Q,A,V,L,Y；X5＝P,S,T；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W,S,T,V,L,F；X9＝D,R,P,K,E,S,T,Y；X10＝P,H,V,I,L,A；X11＝R,K,Q,N；X12＝K,D,A,R,E,V,L,I；X13＝E,Q,A,L,D,N,V,I；X14＝Y,N,S,T,Q；X15＝A,G,V,I,L；X16＝K,R；X17＝Y,N,Q,T,S和X18＝G,R,K。

[0364] (26)包括以下氨基酸序列的根据(25)的化合物：

[0365] G-V-X1-I-N-V-X2-C-X3-X4-X5-X6-X7-C-X8-X9-X10-C-X11-X12-X13-T-G-C-P-X14-X15-K-C-M-N-R-K-C-X16-C-X17-X18-C(SEQ ID No.：28)；

[0366] 其中X1＝P,I,F；X2＝K,S；X3＝R,T,K；X4＝T,G,S,N,I；X5＝P,S；X6＝R,K,P；X7＝D,Q,N,E；X8＝A,Y,I,L,W；X9＝D,R,P,K,E,S；X10＝P,H,V；X11＝R,K,Q；X12＝K,D,A,R；X13＝E,Q,A,L；X14＝Y,N；X15＝A,G；X16＝K,R；X17＝Y,N和X18＝G,R。

[0367] (27)包括SEQ ID No.：29、SEQ ID No.：30或SEQ ID No.：31的氨基酸序列的根据(26)的化合物。

[0368] (28)根据(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(17)、(19)、(20)、(22)、(23)、(25)或(26)中任一化合物，其中该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0369] (29)根据(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(13)、(14)、(17)、(19)、(20)、(22)、(23)、(25)或(26)中任一化合物，其中相比于钾通道Kv1.1，该化合物能够选择性结合钾通道Kv1.3。

[0370] (30)编码(1)至(27)中任一项所述的氨基酸序列的核酸序列。

[0371] (31)包括根据(30)的核酸序列的载体。

[0372] (32)包括根据(30)的核酸序列或根据(31)的载体的宿主细胞。

[0373] (33)包括根据(1)至(29)中任一项的化合物的药物组合物。

[0374] (34)根据(1)至(29)中任一项所述的化合物或根据(33)的药物组合物，用于治疗自身免疫性疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥。

[0375] (35)根据(1)至(29)中任一项的化合物或根据(33)的药物组合物在制备用于治疗或预防自身免疫疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥的药物中的用途。

[0376] (36)通过将根据(1)至(29)中任一项的化合物或根据(33)的药物组合物给药至需要其的哺乳动物来治疗或预防哺乳动物体内的自身免疫疾病、肥胖症、牙周炎和/或组织移植排斥的方法。

[0377] (37)采用根据(30)的核酸序列、根据(31)的载体或根据(32)的宿主细胞制备根据(1)至(29)任一项的化合物的方法。

[0378] 示例

[0379] 示例1-电生理学测量

[0380] 通过采用表达人Kv1.3(hKv1.3)通道的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf 21)细胞来测量钾电流。在膜去极化时通道活性被活化至比-40mV更正向的电压。活化动力学是快速且强电压依赖性的，而失活却慢得多，并没有显示出显著的电压依赖性。在Sf21细胞中，hKv1.3在+40mV下具有250pA-5nA之间的平均电流幅度。

[0381] 感染1-3天后，次用平面膜片钳技术，利用Port-A-Patch(Nanion Technologies GmbH)记录钾电流。通过电压阶跃将离子电流激活至+40mV的去极化电位并持续200ms。

[0382] 将Sf21细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)、2mM谷氨酰胺、1×酵母自溶液(Yeastolate)(来自50×储备溶液)和0.1％ F68(BASF)的Grace's昆虫细胞培养基
中培养至细胞密度为2–3×106个细胞/ml。

[0383] 电生理学缓冲液如下：

[0384] 外缓冲液：160mM NaCl

[0385] 4.5mM KCl

[0386] 1mM MgCl2

[0387] 2mM CaCl2

[0388] 5mM D-葡萄糖一水合物

[0389] 10mM HEPES/NaoH pH 7.4

[0390] 内缓冲液：75mM KCl

[0391] 10mM NaCl

[0392] 70mM K-氟化物

[0393] 2mM MgCl2

[0394] 10mM EGTA

[0395] 10mM HEPES/KOH pH 7.2

[0396] 为了证明本文所述的肽类(SEQ ID NO：1至31，特别是cgtx-544(SEQ ID No：25))的选择性，测定结合cgtx-544与Kv1.3、Kv1.1和Kv1.5的IC50。以HsTx1(SEQ ID No：32)作为对照。

[0397] 将肽类以1μg/μl溶解于20mM pH为8.2的NaPO4缓冲液中(1mg每1ml折叠缓冲液)，并在室温下，在相同的缓冲液3×1L中，用截止500Da的Float-a-Lyzer(Spectrapor)透析。

[0398] 测试例如100pM、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM和1μM的不同浓度下的HsTx1结合性，该结合性取决于测试的通道。Kv1.1、Kv1.3和Kv1.5的代表性测量被分别如图1a)、图1b)和图1c)所示。

[0399] HsTx1与Kv1.3结合的IC50为25±2.1nM。HsTx1与Kv1.1结合的IC50为11.3μM。Kv1.5中没有检测到结合。因此，与Kv1.1相比，HsTx1对Kv1.3具有约450倍的更高的选择性。

[0400] 测试不同浓度下例如1nM、10nM、50nM、100nM、1μM和5μM的cgtx-544结合性，该结合性取决于测试的通道。Kv1.1、Kv1.3和Kv1.5的代表性测量如图1d)、图1e)和图1f)所示。

[0401] cgtx-544与Kv1.3的结合的IC50为6.9nM。高达10μM的浓度下都检测不到与Kv1.5的结合。Kv1.1在10μM下被阻断约22％。因此，与HsTx1相比，cgtx-544对Kv1.3比Kv1.1具有更高的选择性。

[0402] 示例2：比较与Kv1.3和hERG的结合性

[0403] 在下面的示例中，通过电生理学测量比较所选的肽类与Kv1.3和hERG的结合性。

[0404] 细胞系统

[0405] 为了测定与Kv1.3的结合性，采用内源表达Kv1.3的Jurkat细胞。为了与hERG结合，采用稳定表达hERG的HEK细胞。

[0406] 细胞培养

[0407] 采用标准细胞培养技术进行细胞培养。简言之，使细胞在基于DMEM的培养基中，在10cm培养皿或T75培养瓶中生长。当达到60-80％的融合度时，每2-3天将细胞分开。将Jurkat细胞重新悬浮，然后在离心机中旋转以在Patchliner(Nanion)上记录。在旋转之前，用胰蛋白酶处理HEK细胞，将其从培养皿表面分离。旋转后，将细胞重新悬浮于外记录缓冲液中直至密度为约1-2百万个细胞/ml。

[0408] 内记录溶液：50mM KCl

[0409] 10mM NaCl

[0410] 60mM KF

[0411] 20mM EGTA

[0412] 10mM HEPES/KOH，pH 7.2,(Osm:约290mOsm)

[0413] 将新鲜的5mM Mg-ATP和0.3mM Na-GTP加入内溶液中，并将pH调节至7.2。

[0414] 外记录缓冲液：140mM NaCl

[0415] 4mM KCl

[0416] 1mM MgCl2

[0417] 2mM CaCl2

[0418] 5mM D-葡萄糖一水合物

[0419] 10mM HEPES/NaOH pH 7.4，(Osm:约298mOsm)

[0420] 化合物

[0421] 测试下列化合物

[0422]

[0423] 电生理学测量

[0424] 用Patchliner进行电生理学记录，同时记录多达8个通道。Patchliner是利用硼硅酸盐玻璃芯片(NPC-16)作平面膜片钳并通过PatchControlHT软件操作的自动膜片钳系统。使用具有对于Jurkat细胞为3-5MΩ的电阻的和对于HEK细胞为2-3MΩ的电阻的NPC-16芯片进行记录。在记录过程中，将细胞保存在“细胞旅馆(cell hotel)”中，并在其中定期用移液器上下移动以保持其活力。细胞存活约2-3小时。

[0425] PatchControlHT软件

[0426] 在计算机上同时运行两个程序来操作Patchliner-Nanion的PatchControlHT和HEKA的PatchMaster。

[0427] PatchMaster控制HEKA EPC10放大器并执行记录。脉冲方案和在线分析可以在此程序内生成。PatchControlHT用于定义从捕获和封接该细胞至进入(going)全细胞并获得所需记录的完整实验程序。PatchControlHT和PatchMaster之间的双向通信使得PatchControlHT根据细胞状态(高阻封接，全细胞模式)来调整其动作。

[0428] 该程序完全指导包括用于进行溶液交换的移液管的Patchliner的机器人功能。同时，PatchControlHT还控制放大器，并从PatchMaster读出所有重要的patch参数。PatchControlHT是图形用户界面，其中定义了实验中的所有参数和成功标准。如果记录没有很好地达到成功标准，则可使用使PatchControlHT停止特别好的记录的选项。

[0429] 实验路线

[0430] 为了建立适当的记录条件，通过Patchliner的标准程序功能完成芯片填充、细胞捕获、封接和破碎成全细胞模式。在该程序结束时，对于期望的记录适当地设置放大器(例如保持电位、慢容量补偿和增益)，然后开始记录。

[0431] 在每个实验中，细胞用外溶液洗涤三次以确保稳定的记录。进一步在表达hERG细胞上测试化合物1-8。每种化合物的暴露时间为4分钟，每个实验总共运行24分钟。

[0432] 电压方案

[0433] 对于hERG：使用电压阶跃方案使hERG电流从保持电位的-80mV变为-40mV并保持500ms，随后阶跃至+40mV保持500ms，进行500ms的-40mV测试脉冲，得到尾电流，然后返回到保持电位。每10秒重复该阶跃。

[0434] 连续运行该方案，并连续读取在线结果。这样做可以监测由于洗涤和/或施加化合物引起的变化，并达到评价的稳态。

[0435] 数据分析

[0436] 使用2×EPC10Quadro放大器、PatchMaster软件包(HEKA Electronics，Lambrecht/Pfalz，Germany)、Excel和Igor(WaveMetrics，USA)进行数据记录和分析。

[0437] 对于hERG的药理学，使用PatchMaster中的在线分析功能计算第二次-40mV步骤(尾电流)的峰值振幅。从该峰中减去泄漏(从第一步计算至-40mV)以计算出真实峰，并可将这些绘制为时间的函数。

[0438] 将数值导出到Excel中以计算Igor中的浓度响应曲线。利用Igor(WaveMetrics，USA)绘制和导出附图。在Igor中构建浓度响应曲线。拟合Hill方程，估算每种化合物的IC50，并且计算出相对于最大阻断的IC50。如果可能，数值表示为平均值±S.E.M。

[0439] 结果

[0440] 在hERG电流上测试化合物1-8

[0441] 在Kv1.3电流上化合物1-8的电生理学测量表明这些肽类是活性的。因此，在表达hERG的HEK细胞上测试化合物1-8。为了研究这些化合物的作用，进行两点筛选程序。通常，测试3至5个细胞以确保准确性。每个实验开始时，进行三次洗涤以确保电流稳定。hERG电流略微增加，但在第二次洗涤后变得稳定。化合物1、2、4、5、7和8似乎对hERG电流仅具有较低的影响。通常，化合物1-8的作用也可以通过hERG电流的衰减效应来解释。结果示于图3中。所有化合物的平均电流阻断值±SEM的概述示于表1中。

[0442] 表1

[0443]

[0444] 表1：化合物1-8的效果的总结。每种化合物的测试浓度不同。从每种化合物施加结束时的从稳态电流计算归一化后的阻断值。所有化合物似乎对较低浓度的hERG电流没有或只有很小的影响。在更高的浓度，化合物似乎影响了hERG，然而，这些影响可能是由于hERG电流的衰减造成的。

[0445] 进一步分析

[0446] 在使各个肽经历如示例8所述的折叠方案，而不对经过完全折叠的肽进行纯化后，进行了上述分析。

[0447] 此外，如上所述将cgtx-544折叠和纯化。然后对该cgtx-544(单个)进行重复分析。此外，随后通过更长的时间的孵育(即约20分钟(与肽长结合(on-rate)相关性更好的时间))测试cgtx-544(单个)对Kv1.3的作用。在这些条件下，与6.9nM未纯化的cgtx-544(参见示例1)相比，经过折叠和纯化后的cgtx-544(单个)显示出约900pM的IC50。结果示于图35中。

[0448] 示例3-在人和大鼠血浆中cgtx-544(SEQ ID No：25)的稳定性

[0449] 1、测定人和大鼠血清样品中的离体稳定性

[0450] 目的是在室温(RT)和37℃下，在不同孵育时间后测试哺乳动物血浆中cgtx-544肽的稳定性。稳定性定义为在RT和37℃下，在不同孵育时间后cgtx-544的IC50值。用来自健康大鼠或人的新鲜血液样品制备血浆。将肝素添加到新鲜血液样品中以防止结块。通过在RT下以2000xg离心2分钟制备血浆。

[0451] 在实验开始之前定义cgtx-544的IC50-电生理学测定产生46.1nM±3.9nM的IC50值(对于n＝5个细胞)。由于在这些实验中采用的cgtx-544肽不完全折叠，因此测定出的IC50比正常更高。制备的人和大鼠血浆的阴性对照显示出没有血浆成分与Sf21昆虫细胞中表达的Kv1.3通道进行非特异性结合。

[0452] 为了研究血浆中的稳定性和活性，将肽加至新制备的人和大鼠血浆中，最终浓度为20μM。将样品分成两等份并在37℃和室温(RT，20℃)下孵育。制备样品的连续的稀释液用于电生理学分析。

[0453] 时间点0h：将肽添加入血浆后，直接分析样品并显示出对Kv1.3通道的强亲和力。人血浆中的cgtx-544的IC50值被提高至20.9nM和大鼠血浆中IC50值被提高至15.0nM(数据未显示)。

[0454] 时间点24h：在随后的24小时中，没有检测在37℃和RT下储存的肽探针的活性的显著变化。

[0455] 时间点48h:48小时后，在37℃孵育的肽的活性降低，并且在人血浆或大鼠血浆中孵育的cgtx-544的IC50值是t＝0h时的两倍(分别为37.3nM和57.8nM)。在RT保存的cgtx-544的活性保持不变。

[0456] 时间点14天：在37℃孵育14天后，未检测到活性。在室温孵育的cgtx-544探针显示活性不变。

[0457] 示例4-cgtx-544(SEQ ID No.：25)对分离出的人TEM细胞的疗效

[0458] 1、在分离出的人TEM中Kv1.3电流的分析

[0459] 联合利用昆虫细胞系草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf21)与杆状病毒感染系统，以用于异源表达重组离子通道。Sf21细胞提供高度特异性的蛋白表达和正确的翻译后修饰，导致形成与提出的体内离子通道的电生理参数具有可比性的功能性通道。因此，有必要比较在Sf21细胞中表达的钾选择性离子通道Kv1.3和在TEM细胞中内源表达的Kv1.3通道的电生理学性质。

[0460] 为了比较特征电压依赖性Kv1.3通道活化，采用以20mV阶跃(激活脉冲200ms)从-60mV至+60mV的典型电压方案。在保持电位-100mV下夹持细胞。图4显示了两个单独的Sf21和TEM细胞(分别为图4A和4B)的电流响应和电压依赖性Kv1.3活化的脉冲方案(图4C)。

[0461] 图5显示了相应的归一化的电压-电流关系。在膜从保持电位(-100mV)至-20mV的去极化时，Kv1.3开始打开，并在+60mV时达到其最大打开状态。即使Kv1.3的表达在Sf21细胞中高得多，特性电压依赖性活化保持不变。

[0462] 明显源自Kv1.3活性的最大观察电流和施加的电压能够评估所有Kv1.3通道的总电导率。因此，可以使用已知的单个Kv1.3通道的电导率来计算出通道的数量。最大K+外向电流被定义为在前20％电流踪迹中活化的未阻断电流和最大阻断(完全阻断)电流之间的差。通过改变感染条件，可以根据研究的需要控制Sf21细胞中Kv1.3的表达水平。在我们的标准条件下，可以估算出每个细胞具有的最大电流为2-5nA，电导为33-50nS和存在2500-3800个通道。

[0463] Sf21细胞中的异源表达系统显示用于体外药理学感兴趣的离子通道的电生理学分析的合适方法。基于这些观察，可以假定Kv1.3离子通道在Sf21细胞的质膜中的折叠和插入是可以与TEM细胞中的天然Kv1.3蛋白相当的。

[0464] 可以清楚地证明，异源表达的Kv1.3通道可以作为通过评估电生理参数来研究药物靶向的模型系统。用肽化合物cgtx-544进行特异性Kv1.3阻断。如前所示，肽对Kv1.3通道显示高亲和力，也将其在分离出的人的TEM细胞上进行测试(图6)。注意的是，在这些实验中采用的cgtx-544是不完全折叠的，并且显示出的IC50比正常更高。然而，该化合物在Kv1.3转染的Sf21细胞上显示出与在人的TEM细胞上相同的值(图6)。

[0465] 示例5-用肽cgtx-544(SEQ ID No.：25)治疗抗原诱导的关节炎

[0466] 1、实验模型

[0467] 1、AIA-抗原诱导的关节炎

[0468] 大鼠中抗原诱导的关节炎(AIA)的疾病模型代表了T细胞依赖性的自身免疫性关节炎，其与人类中的类风湿性关节炎的许多特征类似。因此，该系统可以作为评估本文公开的T细胞抑制肽的治疗成功的疾病模型。相对于目前治疗(例如使用一般性细胞抑制剂)，这种治疗方法的一个主要优点是，只有在疾病产生中临时涉及的免疫系统的小亚群被抑制，而免疫防御的其它重要部分，例如先天免疫系统仍然完好无损的事实。此外，该疾病模型能够测试cgtx肽在体内的疗效和耐受性。

[0469] 2、诱导关节炎

[0470] 在4周的时间段内进行整个实验。通过皮下注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的mBSA和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的混合物，在第-21天(实验开始)和第-14天进行预免疫。在第0天，通过在右膝关节内单次注射抗原mBSA而在一个膝关节中诱导了局部诱导炎症。在该实验设置中，第二(左)未治疗的膝关节用作个体内对照。

[0471] 诱导后的第一个小时期间，经过处理的膝关节发展出严重的肿胀反应，通常在诱导后第1天和第2天肿胀达到最大。该表型在额外的2至3天内是稳定的，之后肿胀再次消退。

[0472] 该方案能够在>95％的实验动物中诱导出局部的、可再现的关节炎。在阴性对照实验中，在对照动物的膝部内给予相同体积(针对mBSA诱导溶液)的0.9％NaCl(参见图7和8)。

[0473] 2、材料和方法

[0474] 2.1动物

[0475] Lewis大鼠，雌性，体重(BW)180-200g，年龄约8周，Janvier，法国

[0476] 将动物保持在常规房舍条件下-每个IV型Makrolon笼中5只动物，在12小时日/夜节律中自由采食食物和水，室温为22+/-2℃，空气湿度在55+/-5％。

[0477] 2.2.制备用于免疫的乳剂、动物免疫和诱导局部关节炎

[0478] 2.2.1.免疫乳剂和免疫过程

[0479] 2.2.1.1.材料：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(BD 231141)[0480] 不完全弗氏佐剂(Sigma F5506)

[0481] mBSA(Sigma A1009-1G)

[0482] 0.9％NaCl(Braun)

[0483] 异氟醚(Abbott)

[0484] 2.2.1.2.预免疫乳剂

[0485] 溶液A：mBSA储备溶液(50mg/ml)：

[0486] 无菌条件下添加20ml水溶性注射液至1小瓶mBSA(1g)中。

[0487] 该无菌溶液可以在4℃下储存几个月。

[0488] 溶液B：完全弗氏佐剂(CFA)储备溶液(10mg/ml)：

[0489] 向1小瓶含有100mg细菌的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中加入10ml(1小瓶)不完全弗氏佐剂。该溶液可以在4℃下储存1个月。

[0490] 制备混合物

[0491] 两种组分以相等的体积混合，得到乳液(在超净台中在无菌条件下混合)。如下所述，将组分移液至15ml或50ml Falcon管中：

[0492] 1.溶液A-mBSA储备溶液

[0493] 2.溶液B-结核分枝杆菌(M.tuberculosis)溶液

[0494] 在加入组分后，直接将管涡旋20秒。在制备的最后步骤中，将溶液用超声处理器(0.5个循环，振幅为60％)乳化，直到形成稠的乳液。

[0495] 2.2.1.3.预免疫

[0496] 在最后的关节炎诱导前将动物预免疫两次。预免疫在第-21天和第-14天进行。在这些时间点，皮下注射免疫溶液。用5％异氟醚诱导麻醉后，用2％的异氟醚维持麻醉。通过使用25G套管施用总共500μl的乳化溶液。在尾基部的两侧(右和左)以及左右肩胛骨上方的两侧皮下分别注射125μl的预免疫乳剂。

[0497] 2.2.1.4.局部关节炎的诱导

[0498] 在第0天，通过在右膝关节中关节内给予抗原(500μg mBSA/50μl 0.9％NaCl溶液)诱导关节炎。左膝作为个体内对照保持不变。麻醉动物，并对注射部位进行消毒。这种施用采用短而细的套管(30G，1/2)以尽量减少组织损伤完成。在给予抗原并撤出导管后，使关节缓慢弯曲并伸展数次。

[0499] 2.2.2.膝关节肿胀测量

[0500] 用测径器测定膝关节的矢状径。将实验动物麻醉短暂的时间并将背部定位。将腿调节到90度角，并测量三次膝部的矢状径。

[0501] 2.2.3.取血

[0502] 为了取血，将动物简单麻醉，尾部消毒，并用套管刺穿尾静脉，用肝素涂覆的移液管抽出50μl血液，并与5μl稳定剂(CPD)和1μl肝素(1.5U/μl以1:4稀释在0.9％NaCl中)混合。

[0503] 2.2.3.血液学

[0504] 用库尔特计数器以自动模式计数白细胞(WBC)。

[0505] 2.2.4.体重测量

[0506] 在上午8:00和9:00之间，每天测量一次实验动物的体重。

[0507] 2.2.5.临床检查和膝关节肿胀的测量

[0508] 在诱导局部关节炎后，每天检查实验动物。测量膝关节的肿胀，并对总体健康状态进行评分。

[0509] 2.3.实验动物的治疗

[0510] 动物的治疗从第-3天开始，施用肽cgtx-544(SEQ ID No.25)以1mg/kg体重(BW)的体积为0.6ml的0.9％NaCl的剂量，或可选地对于对照对物施以相同体积的0.9％NaCl(赋形剂)。在麻醉动物的尾静脉以静脉注射的方式分别给予肽或赋形剂。治疗后约1小时，观察治疗的动物。

[0511] 3.结果

[0512] 在预免疫阶段，密集地监测实验动物，并在第-21、-14、-7、0和7天抽取血液样品用于监测动物的免疫状态。在相应的分析时间点，在外周血中，炎症的发展和白细胞(WBC，白细胞)计数之间存在非常好的相关性。

[0513] 与未处理的动物相比，最近免疫的动物(第-21天和第-14天)的外周血中的WBC数显著增加(参见图9)。WBC的数量在天-14和天-7之间达到最大值，然后下降。WBC的增加与免疫诱导炎症的严重性相关。

[0514] 在诱导局部关节炎后，短时间内立即显示出WBC的增加(参见图9)。然而，这种短时间的增加较小，因为炎症反应是局部的。用0.9％NaCl免疫的对照动物在WBC计数中没有显示出任何的差异。

[0515] 预免疫的动物仅在通过mBSA注射诱导局部关节炎后几个小时就发生右膝关节的严重溶胀反应(参见图8)。相反，用作个体内对照膝的未处理的左膝没有显示任何肿胀反应的迹象。

[0516] 用cgtx-544肽治疗的动物与未治疗(赋形剂)的动物对照的比较揭示出，与未治疗的对照动物相比，cgtx-544治疗导致膝关节肿胀的明显减少(参见图10)。可以得出结论，与未治疗的对照动物相比，用cgtx-544治疗的动物显示出膝关节肿胀的明显减轻和更快的肿胀消退。

[0517] 示例5a-在RA的AIA大鼠模型中cgtx-544肽的预防疗效

[0518] 1.材料和方法

[0519] 在第-21天和第-14天用在完全弗氏佐剂和750μg热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium(M.)tuberculosis)的抗原mBSA的乳剂进行两次免疫后，第0天以膝关节内注射的方式通过在右膝部注射甲基化BSA来诱导AIA，如示例5所示。对于cgtx-544肽疗效的研究，大鼠从第-3天开始持续10天(第-3天至第6天)每日一次接受0.1、1或5mg/kg的cgtx-
544肽(低、中和高剂量水平)或溶剂(0.9％NaCl)的静脉注射。

[0520] 通过使用测径器测量三次膝关节直径，监测关节炎严重性。将数值归一化至第-21天。通过从右膝(诱导的)直径减去左膝(未诱导的)直径，计算膝肿胀值的差异。

[0521] 定期取血样用于监测血液参数。在诱导前、诱导日和诱导后10天(第-21、-14、-7、0和10天)对所有动物每周评价血液学参数。未治疗的动物的血液学数据(第-21天)与文献中报道的相当(Waynforth和Flecknell，1992)。分析了白细胞(WBC)、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的绝对计数，最后两个也以总WBC的百分比表示。用Sysmex XT-2000i测量溶剂组和cgtx-544肽治疗组的七个个体的EDTA全血。

[0522] 2.结果

[0523] 对治疗动物的膝肿胀，所有测试的剂量水平(0.1、1和5mg/kg BW)的cgtx-544显示出明显的降低、剂量依赖性和统计学的显著效果(图18)。

[0524] 对于结果的统计分析，使用威尔士两样本t检验。在下文中，显示了第1天和第3天测试的所有剂量水平(0.1、1和5mg/kg BW)的cgtx-544的统计分析。与载体对照组相比，在膝肿胀中所有测试的剂量水平显示出统计上明显的降低(图19)。

[0525] 总之，在AIA模型中，cgtx-544肽治疗对炎性关节炎症状具有强烈的作用，特别是对于膝肿胀，最大减少70％。在治疗7天后，治疗组中的膝直径进一步降低到几乎与非诱导的个体内对照膝相当的直径。此外，cgtx-544肽治疗个体的WBC、嗜中性粒细胞和淋巴细胞(数据未显示)显示出与溶剂处理的个体相当的绝对和相对细胞计数。

[0526] 示例5B-在RA的AIA大鼠模型中cgtx-544肽的治疗功效

[0527] 1.材料和方法

[0528] 在第-21天和第-14天用在完全弗氏佐剂和750μg热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium(M.)tuberculosis)的抗原mBSA的乳剂进行两次免疫后，第0天以膝关节内注射的方式通过在右膝部注射甲基化BSA来诱导AIA，如示例5所示。对于cgtx-544肽疗效的研究，大鼠从关节炎诱导后立即从第0天开始或从第1天开始每日一次接受1mg/kg cgtx-
544肽的静脉内注射。对照动物每日一次接受溶剂(0.9％NaCl)注射。

[0529] 通过使用测径器测量三次膝关节直径，监测关节炎严重性。将数值归一化至第-21天。通过从右膝(诱导的)直径减去左膝(未诱导的)直径，计算膝肿胀值的差异。

[0530] 2.结果

[0531] 以cgtx-544(混合)(1mg/kg BW)开始的两个测试时间点的治疗都显示出对治疗动物的膝肿胀有明显的减轻和统计学上显著的效果(图20)。

[0532] 对于结果的统计分析，使用威尔士两样本t检验。在下文中，显示了第1、2和3天的cgtx-544(第0天和第1天)治疗方案的统计分析。与溶剂对照组相比，两个治疗方案都在膝肿胀中显示出统计上显著的降低(图21)。

[0533] 图22中示出了时间进程中的白细胞(WBC)计数。图23中示出了时间进程中的嗜中性粒细胞。图24中示出了时间进程中的淋巴细胞。

[0534] cgtx-544(混合)治疗显示出膝关节肿胀的显着减轻。治疗动物中的剩余肿胀被认为是由于抗体/抗原反应而造成的。因此，测试了免疫以及初始动物的mBSA特异性抗体的存在。在关节炎诱导7天后，在组H和I的所有免疫动物中都可以检测到抗mBSA的抗体(图27)。初始动物(实验组F)对mBSA并没有显示任何反应性。cgtx-544治疗似乎并不抑制B淋巴细胞和抗体形成。此外，在cgtx-544肽治疗10天后的免疫动物没有显示出对cgtx-544(混合)的反应性(用trx-标签的融合蛋白L544-2a，数据未显示)。

[0535] 总之，AIA模型中，cgtx-544肽治疗对炎性关节炎症状、特别是对于膝肿胀具有强烈的作用，如果在关节炎诱导后立即从第0天开始治疗，则最大减少40％，或者如果治疗从第1天开始，则为最大减少58％。在治疗7天后，治疗组中的膝直径进一步降低至几乎与非诱导的个体内对照膝相当的直径。此外，cgtx-544肽处理的个体的WBC、嗜中性粒细胞和淋巴细胞显示出与溶剂处理的个体相当的绝对和相对细胞计数。

[0536] 示例5C-在RA的AIA大鼠模型中cgtx-544(混合)的持续疗效

[0537] 先前的实验(参见示例5A和5B)已经证明，在每天施药的情况下，在AIA大鼠模型中，cgtx-544在不同治疗方案(治疗性和预防性)下都具有极好的疗效。我们试图说明在AIA模型中cgtx-544的活性维持的时长，以便得到cgtx-544的治疗间隔时长的暗示。因此，建立了每周一次的施药的治疗性治疗方案。

[0538] 1.材料和方法

[0539] 在第-21天和第-14天用在完全弗氏佐剂和750μg热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium(M.)tuberculosis)的抗原mBSA的乳剂进行两次免疫后，第0天以膝关节内注射的方式通过在膝部注射甲基化BSA来诱导AIA，如示例5所示。对于cgtx-544肽疗效和持续疗效研究，大鼠(10个个体)在关节炎诱导后第1天(d1)接受1mg/kg cgtx-544肽的单次静脉内注射。在第4天(d4)，将cgtx-544治疗组分成两个亚组，每组5个个体。第一亚组接受cgtx-544的第二次注射，以评估第二次注射是否会导致肿胀进一步减轻。第二亚组没有接受额外的给药。对照动物在第1天接受单次注射溶剂(0.9％NaCl)。

[0540] 通过使用测径器测量三次膝关节直径，监测关节炎严重性。将数值归一化至第-21天。通过从右膝(诱导的)直径减去左膝(未诱导的)直径，计算膝肿胀值的差异。

[0541] 2.结果

[0542] 使用cgtx-544(1mg/kg BW)的单次注射(1×d1)后显示出，在施药后24小时后，治疗的动物的膝部肿胀明显减轻且在统计学上明显减轻(图25)。在第4天第二次单次注射后(1×d1和1×d4)，肿胀可以再次降低至明显的数值。膝部肿胀保持在相同水平，并且在第一次和第二次注射后都没有增加。

[0543] 对于结果的统计分析，使用威尔士两样本t检验。在下文中，显示了对于第2天(分组前)和第5天(分组)的cgtx-544(1×d1或1×d1和1×d4)两种治疗方案的统计分析。与溶剂对照相比，两种治疗方案在每次注射后24小时都显示出膝部肿胀的统计学意义上明显减轻(图26)。

[0544] 总之，在AIA模型中，cgtx-544肽治疗对炎症性关节炎症状，特别是在单次注射24小时后发生肿胀减轻的膝肿胀具有强烈和持续的作用。即使在单次注射后三天，cgtx-544肽显示出了持续的活性和临床效果，其中膝肿胀水平保持恒定。因此，无需每日一次给予肽以达到AIA大鼠模型中的持续治疗效果。因此可以实现静脉注射给药的治疗间隔为3-4天(或对于潜在的皮下注射给药途径，间隔更长)。

[0545] 示例6-在AIA大鼠模型中甲氨蝶呤(MTX)治疗与cgtx-544肽(SEQ ID NO：25)治疗的比较

[0546] 1.在AIA大鼠模型中甲氨蝶呤(MTX)治疗与cgtx-544肽(SEQ ID NO：25)治疗的比较

[0547] 根据疾病的形式和严重程度，采用甲氨蝶呤(MTX)的治疗在剂量和方案上有所不同。与标准治疗相似，我们检查了在AIA大鼠模型中高剂量MTX治疗(每周1次皮下注射1mg/kg体重(J组，n＝7))和低剂量MTX治疗(每天1次静脉注射100μg/kg体重(组L，n＝7))。高剂量MTX治疗在实验的第一天开始(第-21天)，并额外三次(第-14、-7、0天)给药。低剂量MTX治疗在关节炎诱导前三天(第-3天)开始，并且在关节炎诱导后持续额外7天。将结果与cgtx-544治疗组I(1mg/kg体重cgtx-544，与组L相同的方案)和溶剂对照组H(从诱导开始日，即第
0天开始每天1次静脉注射0.9％NaCl)对比。通过使用测径器测量三次膝关节直径，监测关节炎严重性。定期采集EDTA全血样品以监测免疫状态。

[0548] 1.1与cgtx-544治疗相比，使用MTX治疗以较低程度减少膝部肿胀的程度

[0549] 首先，将高剂量(J)和低剂量(L)MTX治疗组的膝参数与溶剂对照组(H)进行比较，以显示出可能的疗效差异，其取决于剂量和方案。第二，比较同一方案的三组(每日一次静脉注射施用)：低剂量(L)MTX治疗组、cgtx-544治疗组(I)和溶剂对照组(H)。通过从右膝(诱导的)直径减去左膝(未诱导的)直径，计算肿胀绝对增长的差异。计算出MTX高剂量和低剂量治疗组在实验开始时的差异接近于零(分别为0.01±0.06mm和0.0±0.03mm)，因为两个膝部在尺寸方面都是可比的。关节炎诱导后的第一天，差异分别升高至3.17±1.26mm和3.45±0.87mm(图11)。

[0550] 与cgtx-544治疗组相比，与具有绝对差3.79±1.10mm的溶剂对照组相比，肿胀的减轻不是非常快(图12)。

[0551] 为了在0和1之间的范围内归一化数值，在实验开始时(第-21天)将肿胀的相对增加设置为0，并如前所述计算肿胀相对增加的差异。MTX高剂量和低剂量治疗组的相对差分别为0.39±0.16和0.43±0.11(图13)。

[0552] 相比之下，溶剂对照组和cgtx-544治疗组分别为0.46±0.14和0.18±0.05(图14)。总之，相对于溶剂对照组，我们观察到MTX高剂量治疗中的大鼠膝部肿胀平均减轻
15％，而MTX低剂量治疗中的大鼠膝部肿胀减轻7％，而cgtx-544治疗的大鼠在关节炎诱导
24h后减轻60％。

[0553] 1.2MTX对增殖细胞的细胞抑制作用

[0554] 为了筛选所有个体的健康状态，再次使用完整的血象。MTX高剂量和低剂量治疗组的7个个体的EDTA全血在诱导前每周、诱导当天、诱导后第4天和第7天用Sysmex XT-2000i.V进行测量(第-21、-7、0、4和7天；MTX低剂量治疗组额外地在第-3天、当静脉注射施用开始时)。未治疗动物的血液学数据(第-21天)与文献中提供的数据相当。

[0555] 1.2.1白细胞

[0556] 在实验开始(第-21天)时，MTX高剂量和低剂量治疗组的白细胞计数分别为9.41±1.42×103/μl和11.66±2.81×103/μl。由于免疫系统的炎症反应，第一次和第二次免疫后，WBC计数分别升高至20.79±5.96×103/μl和24.01±3.81×103/μl(第-7天)。溶剂对照组和cgtx-544治疗组的数值相当。7天内，白细胞计数略有下降。关节炎诱导四天后，MTX高剂量治疗组的WBC计数再次增加，可能是由于与诱导相关的急性炎症过程。这不能说明在cgtx-
544治疗组和溶剂对照组中是否也发生了这种效应，因为对于这两组，在这一天没有分析EDTA全血。此外，对于MTX低剂量治疗组，可能不能将WBC计数作为适当的比较，因为MTX的细胞毒性效应可能在关节炎诱导四天后影响血液的组成。在关节炎诱导后额外7天，MTX高剂量和低剂量治疗组的WBC计数进一步降低至14.68±2.15×103/μl和6.63±1.37×103/μl(第7天)(图15)，从而显示出MTX低剂量治疗的细胞抑制作用。与实验开始时相比，WBC计数减少了近50％。相比之下，MTX高剂量治疗组的WBC计数与cgtx-544治疗组和溶剂对照组的WBC计数相当。

[0557] 1.2.2嗜中性粒细胞

[0558] 在实验开始(第-21天)，MTX高剂量和低剂量治疗组的绝对嗜中性粒细胞计数分别3 3
为1.55±0.52×10/μl和1.93±0.6×10/μl(图16A)(分别等于相对总WBC计数的嗜中性粒细胞为16.39±4.85％和相对总WBC计数的嗜中性粒细胞为16.64±4.07％)(图16B)。对于WBC计数，在第一次和第二次免疫后，嗜中性粒细胞计数也分别升高至7.54±3.19×103/μl和10.77±2.7×103/μl(第-7天，分别等于WBC的35.46±7.08％和WBC的44.33±5.4％)。在
7天内，嗜中性粒细胞计数减少，MTX高剂量治疗组的诱导计数7天后与实验开始时相当(1.94±1.1×103/μl，等于WBC的12.63±6.1％)。在cgtx-544治疗组和溶剂对照组中也观察到该效果。MTX低剂量治疗组显示出比0.33±0.36×103/μl的嗜中性粒细胞更明显的下降(第7天，等于WBC的4.41±4.63％)。

[0559] 1.2.3淋巴细胞

[0560] 在实验开始(第-21天)，MTX高剂量和低剂量治疗组的绝对淋巴细胞计数分别为7.39±1.05×103/μl和9.21±2.4×103/μl(图17A)(分别等于WBC的78.77±4.76％和WBC的
78.97±3.94％(图17B))。在MTX高剂量和低剂量治疗组中，与WBC和嗜中性粒细胞计数不同，淋巴细胞计数在第一次和第二次免疫后没有显着升高，计数为11.68±2.8×103/μl和
11.83±1.35×103/μl(第-7天)。这分别等于WBC的57.01±6.45％和WBC的49.83±5.45％(第-7天)，随着总WBC计数剧烈增加，其百分比降低。在7天内，WBC的淋巴细胞百分比再次增加，且诱导7天后，在MTX高剂量治疗组中，其与实验开始时的百分比相当(WBC的78.16±
7.20％，第7天)，而不同于MTX低剂量治疗组，其甚至会变得更高(WBC的93.13±4.66％，第7天)。与实验开始时相比，MTX高剂量治疗组的绝对计数增加，MTX低剂量治疗组的绝对计数
3 3
减少：分别为11.38±1.15×10 /μl和6.14±1.11×10 /μl(第7天)。尽管与实验开始时相比，关节炎诱导后7天，MTX低剂量治疗组的绝对淋巴细胞计数减少，但仍占所有白细胞约
93％。这使得提出假设：白细胞的其它亚群比淋巴细胞群更受细胞毒性作用的影响。

[0561] 用MTX治疗导致抑制了二氢叶酸还原酶，并导致对增殖细胞的细胞抑制作用。与不显示广义免疫抑制的cgtx-544治疗下的个体不同，与溶剂对照组相比，MTX治疗的个体对血象显示出不同的影响。关节炎诱导7天后，低剂量治疗的个体的WBC计数、嗜中性粒细胞计数和淋巴细胞计数减少。此外，这导致所有白细胞百分比的组成不同。此外，我们观察到在用两种MTX方案(7％和15％)关节炎诱导24小时后，与在cgtx-544治疗大鼠中的60％相比，膝肿胀的减轻更轻微。

[0562] 对于MTX疗效结果的统计分析，使用威尔士两样本t检验。在下文中，显示了第1天和第3天所有测试的MTX剂量水平的统计分析(静脉注射0.1mg/kg BW和皮下注射1mg/kg BW)(图28)。

[0563] 总之，用MTX处理导致抑制了二氢叶酸还原酶，并导致了对增殖细胞的细胞抑制作用。与cgtx-544肽治疗的个体不同，与溶剂对照组相比，MTX治疗的个体显示出对血象的不同效果。关节炎诱导7天后，低剂量治疗的个体的WBC计数、嗜中性粒细胞计数和淋巴细胞计数减少。此外，这导致所有白细胞百分比的组成不同。此外，我们观察到，在两种MTX方案(7％和15％)关节炎诱导24小时后，与在cgtx-544治疗大鼠中最大70％相比，膝肿胀的减轻更轻微。

[0564] 示例7-cgtx-55的进一步表征

[0565] cgtx-544肽由38个没有修饰的天然氨基酸组成，分子量约为4220Da。它与蝎型肽的α-KTx6亚家族具有特定功能域的相似性。cgtx-544受到4个二硫桥的限制，并且其3D结构包括α-螺旋/β-折叠构象。

[0566] 制备cgtx-544

[0567] 图29提供了cgtx-544肽的制备步骤的示意图。利用F-moc策略，在不溶性聚苯乙烯树脂上合成肽。将固相附着肽的游离N-末端胺偶联至单个N-保护的氨基酸单元。然后将该单元脱保护(F-moc基团在碱性pH下通过哌啶裂解)，出现新的N-末端胺，可以将其它氨基酸连接到该新的N-末端胺。将叔丁氧基羰基(Boc)基团作为永久的侧链保护基团，并且通过采用TFA(三氟乙酸)处理完成肽的合成后将其裂解。

[0568] 肽合成完成后，将肽脱保护并从聚苯乙烯树脂上裂解下来。此时，粗肽产物显示出约50％的纯度，然后进行分析级UPLC和LC-MS。在随后的步骤中，通过制备型HPLC纯化粗肽，得到纯度≥90％的线性肽产物。

[0569] cgtx-544肽的折叠

[0570] 该肽溶液通过氧化(形成二硫键)而被折叠。折叠方法基于在大气氧存在下在pH 8.3的磷酸酯缓冲液中键的形成。根据该方案，折叠的cgtx-544的HPLC分析显示，肽是以折叠和部分折叠变体的混合物存在的。该中间折叠产物被称为cgtx-544(混合)。基于用不同的分离出的UPLC峰的材料产生的电生理学数据，结论是，折叠混合物中的一个峰(保留时间
12.77min)对应了天然活性肽，而所有其它峰都与电生理学活性无关(图30)。因此，在折叠反应后，通过制备型HPLC，从折叠和部分折叠的肽的cgtx-544混合物来纯化活性肽(保留时间12.77min)。在该纯化步骤后，活性肽(被称为cgtx-544(单个))通常具有预计大于95％的纯度。在室温和4℃下，经过纯化的cgtx-544(单个)肽在0.9％NaCl溶液中高度可溶并稳定长达数周。

[0571] 由于方法的发展，仅以小规模形式制备经过纯化的肽cgtx-544(单个)。因此，材料是有限的，并将其用于鉴定cgtx-544(单个)在Kv1.3、Kv1.1、Kv1.2和Kv1.5中的IC50值的实验(参见示例8)。除非用术语cgtx-544(单个)来表示，在本文所述的所有其它实验(示例1至6)都使用cgtx-544(cgtx-544(混合))的未纯化的折叠混合物。混合物中的活性材料的含量被计算为15％。

[0572] 总之，cgtx-544肽显示出对于生物化学分析很重要的以下生物化学性质：

[0573] ·cgtx-544是高度碱性的肽，包含6个赖氨酸和2个精氨酸氨基酸，能够以低浓度(<100ng/ml)粘在玻璃小瓶的表面。

[0574] ·其含有8个通过4个二硫桥连接的半胱氨酸氨基酸。

[0575] ·等电点：9.29。

[0576] ·当二硫键结合时，MW：4212Da，还原形式中MW：4220.2Da。

[0577] ·由于4个二硫键的存在，cgtx-544的结构是紧凑的。

[0578] 示例8-基于电生理学分析的cgtx-544(单个)的离子通道选择性的进一步表征[0579] 1.材料和方法

[0580] 如示例1、2和4中所述，通过杆状病毒(Kv1.1、Kv1.3-和Kv1.5构建体)感染的Sf21细胞或稳定转染的CHO细胞(Kv1.2)来表达离子通道。电生理学分析在自动膜片钳装置“Patchliner”(Nanion Technologies，Munich，Germany)上进行。Patchliner基于平面膜片钳方法采用硼硅酸酯玻璃芯片(NPC-16)，而不是玻璃移液管。Patchliner能够同时记录四个细胞。所有通道记录在全细胞模式下进行。使用PatchMaster软件(HEKA Electronics，Lambrecht/Pfalz，Germany)进行数据记录。用IGOR软件(Wavemetrics，USA)实现实验结果的可视化。平均数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。

[0581] 测试化合物被用作浓缩的储备溶液(大多为1.5μg/μl)。将储备溶液在缓冲液中稀释至所需的最终浓度。

[0582] 2.结果

[0583] 2.1目标通道Kv1.3的IC50分析

[0584] 在化学合成后(参见示例7)，通过用大气氧氧化来折叠肽，并通过制备型HPLC纯化正确折叠的(生物活性)肽级分。对于单数峰，该纯化的cgtx-544肽被命名为cgtx-544(单个)。

[0585] cgtx-544(单个)的电生理学分析产生了6.9nM的优异IC50值(图31)。

[0586] 2.2在Kv1.1、Kv1.2和Kv1.5上的cgtx-544(单个)电生理学分析

[0587] 在Kv1.1、Kv1.2和Kv1.5上的cgtx-544(单个)电生理学分析证明，cgtx-544是高选择性的。在Kv1.1、Kv1.2和Kv1.5上的cgtx-544(单个)电生理学表征的结果总结在图32中。

[0588] 示例9-cgtx-544(单个)的蛋白酶抗性

[0589] 进一步进行示例3中所述的实验，在体外条件下，在血清样品中测试cgtx-544肽的稳定性。因此，通过向人血清中加入已知量的cgtx-544(单个)并随后在37℃下孵育来测定人血清中cgtx-544(单个)的稳定性。在57天的时间段内，在Kv1.3通道上测量ctx-544的阻断活性(单个)。cgtx-544(单个)在人血清中极其稳定。其活性保持恒定至少16小时，并缓慢衰减，到57天后不再能检测到肽阻断效应。这表明，cgtx-544对血液蛋白酶的作用非常耐受(图33)。

[0590] 在不存在血清的情况下IC50保持在7nM范围内进行的测量，观察到阻断效应并没有降低。无肽的血清对照样品中没有显示出Kv1.3的非特异性阻断。因此，可以得出结论，所观察到的阻断效应仅仅是由于cgtx-544(单个)的影响。代表在57天内在孵育溶液中测量的cgtx-544(单个)的浓度，在37℃下在人血清中cgtx-544(单个)的50％活性保持期为5天。

[0591] 总之，cgtx-544在37℃的人血清中的持久性非常高。cgtx-544不与血清成分结合(如果只有非常低的亲和力)，并且对人血清中存在的蛋白酶的降解极其耐受。

[0592] 示例10–cgtx-544(单个)的体内半衰期

[0593] 本研究的目的是，实施生物测定以评估大鼠中cgtx-544(单个)的体内半衰期。先前的实验(示例3)表明，当掺入血清并在37℃下孵育时，cgtx-544不会快速降解。

[0594] 1.材料和方法

[0595] 大鼠接受静脉注射cgtx-544(单个)(750μg/kg BW)。在时间点0、1、10和60分钟抽取血液。随后，从血液样品制备血清。通过测量在CHO细胞中表达的Kv1.3通道的阻断效应，通过电生理学分析在这些样品中cgtx-544含量。没有肽的血清对照样品(0分钟)没有显示出Kv1.3的非特异性阻断，1分钟样品的cgtx-544(单个)活性被视为100％。在第三个时间点(60分钟)收集的样品显示出10％的初始阻断活性。为了研究大鼠中未结合的cgtx-544(单个)的量，通过校准曲线计算出在上述时间点存在于循环血液中的cgtx-544(单个)的量。通过将已知量的cgtx-544(单个)加入血清并随后在Kv1.3通道上进行电生理学测量来获得该校准曲线。这些加标样品的Kv1.3电流阻断与没有血清的cgtx-544(单个)获得的结果相似(数据未显示)。

[0596] 2.结果

[0597] 治疗的大鼠血液中cgtx-544(单个)的衰变遵循典型的衰减曲线，在循环血液中cgtx-544(单个)的大约浓度为62nM的情况下，得到大约t1/2＝26分钟的半衰期(图34)。该浓度足以实现Kv1.3通道的完全阻断。该半衰期在其它肽通道阻断剂的范围内-ShK毒素的变体显示其半衰期在20至50分钟之间。

[0598] 总之，静脉注射施用后，在大鼠中cgtx-544的体内半衰期在竞争性肽ShK的范围内。体内半衰期为约26分钟。由于cgtx-544的小尺寸和紧凑的结构，假定肽最可能通过肾脏过滤从血液中清除。可以合理地假设cgtx-544在人类中的半衰期比大鼠中的长，因为大鼠比人类的代谢速率快得多。体内半衰期与药物效应的持续时间不是对应的，因为肽紧密结合离子通道并长时间阻断离子通道。

[0599] 示例11-临床数据

[0600] 迄今为止还没有进行过临床研究。

[0601] 首次人体试验

[0602] 1期研究可以是在健康受试者中的随机、双盲、安慰剂对照、单中心试验。

[0603] 本研究的第一部分可以是在较低剂量组的4名受试者(3+1)和较高剂量组的8名受试者(2+6)的队列中的单剂量、剂量递增研究。起始剂量将根据FDA的“估计成年健康志愿者疗法的初始临床试验中的最大安全起始剂量”工业指南中所规定的毒性研究中的NOAEL进行估计。

[0604] 1a期的第二部分可以设计为多剂量研究。将8名受试者(6+2)的一个队列暴露于低于MTD的一个剂量水平，连续7次每日给药一次。

[0605] 该标准1a期研究的主要目的可以是评价cgtx-544在健康受试者中的安全性、耐受性和药代动力学。

[0606] 概念验证研究

[0607] 该2a期研究可以是在中度至重度斑块状银屑病患者中的随机、双盲、安慰剂对照、多中心、概念验证和剂量确定研究。

[0608] 计划的概念研究2a期将包括80名成人患者(20+60)和3种剂量水平。每种剂量水平将在20名患者中测试12周的时间。

[0609] 主要终点：在第12周达到PASI 75(从PASI基准而改善至少70％的患者)的受试者的比例。

[0610] 次要终点：通过评估不良事件、生命体征、实验室参数、健康检查和脑电图来评价长达12周的cgtx-544的安全性。

[0611] 在第一次治疗后12周的不同时间点的cgtx-544的药代动力学。在第12周达到IGA评分“清除”或“几乎清除”的受试者的比例。

[0612] 在第12周达到PASI 50(从PASI基准而改善至少50％的患者)的受试者的比例。

[0613] 在第12周达到PASI 90(从PASI基准而改善至少90％的患者)的受试者的比例。

[0614] 可以对血管炎进行类似的研究。终点必须相应地进行评估。

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从钾长石中制取硫酸铵钾的工艺方法-专利编号CN103539162B	2020-05-12	66
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一种利用含钾岩石生产硫酸钾的方法-专利编号CN105060316B	2020-05-13	449
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