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一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法及应用

阅读：774发布：2021-02-22

IPRDB可以提供一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种磁性氧化石墨烯‑鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的制备方法，属于材料合成和生物医药技术领域。具体方法为：以石墨烯的衍生物负载四氧化三铁制备的磁性氧化石墨烯为基体，采用层层自组装技术，将鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠依次包裹在其表面而形成复合物。本发明的层层组组装纳米复合材料具有超顺磁性，且在水中的分散性和稳定性较好。其利用天然的鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基纤维素钠作为聚电解质，以纳米尺寸的磁性氧化石墨烯为核心，所有的材料都具有良好的生物相容性；该材料具有一定的磁性，将抗肿瘤药物负载于载体的核心，载药稳定且载药量大，并且对药物能起到靶向缓释的作用，使药物更好地发挥其治疗效果。，下面是一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物，其特征在于，所述复合物是利用层层自组装技术形成的纳米载体，以磁性纳米氧化石墨烯为核心，鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基纤维素钠为囊材，将鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠通过非共价作用依次吸附在表面而形成。

2.一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将氧化石墨烯溶于乙二醇和二乙二醇混合溶剂，获得悬浮液，水浴超声，得到氧化石墨烯水分散液，分别加入六水三氯化铁、丙烯酸钠和醋酸钠，搅拌，置于反应釜中进行孵化，反应结束后取出样品，洗涤获得沉淀，所得沉淀即为磁性氧化石墨烯，加入去离子水溶解，得到磁性氧化石墨烯水分散液；

（2）将鱼精蛋白硫酸盐溶于纯水中，搅拌得鱼精蛋白硫酸盐溶液，加入步骤（1）所述的磁性氧化石墨烯水分散液，超声、抽滤、洗涤，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白水分散液；

（3）将羧甲基纤维素钠溶于纯水中，搅拌，加入步骤（2）所述的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白水分散液，经搅拌、抽滤、洗涤后，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠水分散液。

3.根据权利要求2所述的一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的超声功率250W-400W，超声时间0.5 h-2 h，冰水浴。

4.根据权利要求2所述的一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的乙二醇和二乙二醇的体积比为1:19；所述的氧化石墨烯的浓度为1 mg/mL-4 mg/mL。

5.根据权利要求2所述的一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的氧化石墨烯与六水三氯化铁的质量比为1:10 20；所述~的氧化石墨烯与丙烯酸钠的质量比为1:1 10；所述的氧化石墨烯与醋酸钠的质量比为1:30~

50。

6. 根据权利要求2所述的一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的鱼精蛋白硫酸盐溶液中鱼精蛋白硫酸盐的浓度为1 mg/mL。

7.根据权利要求2所述的一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的磁性氧化石墨烯与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:1 10。

8.根据权利要求2所述的一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基纤维素钠质量比为1:1。

9.根据权利要求1-8中任一权利要求所述的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物应用于调节药物释放率和抗肿瘤药物载体的制备。

说明书全文

一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的制

备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于材料合成和生物医药技术领域，具体涉及一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 当前，癌症已成为威胁人类生命与健康的首要敌人，而传统的治疗手段因副作用严重使治疗结果不佳。随着科学技术的发展，利用药物载体对癌症进行靶向治疗来提高疗效，降低毒副作用，为癌症的治疗开辟了新的思路。目前发现的抗癌药物载体的种类多种多样，包括有机材料（如蛋白质、脂类）、无机材料以及高分子材料等。由于有机材料和高分子材料作为药物载体有易降解、药物易渗漏及成本高等缺陷，为了克服这些缺陷，本发明采用了一种无机材料氧化石墨烯作为抗癌药物的载体，具有结构稳定、载药稳定且载药量大、易制备、成本低等优点。

[0003] 大量研究表明，纳米粒子能将治疗药物有效地传递到靶组织或靶细胞，增加药物的体内循环时间，避免药物的降解失活。而近些年来纳米材料靶向治疗在癌症领域有些许的突破性进展，2004年发现石墨烯，由于其结构稳定，在水中分散性好，比表面积大，生物相容性好，在生物医药方面有着重要的应用前景，包括基因与药物递送以及细胞内追踪。氧化石墨烯可通过吸附法大量携载各类药物及基因，对抗肿瘤药物阿霉素的负载率很高。

[0004] 在这些复合材料中，石墨烯和磁性氧化石墨烯纳米复合材料具有靶向药物递送的特别亮点。一方面，具有平面结构的超大表面积和与不饱和和芳香族药物/氧化石墨烯的生物分子的π-π共轭有利于多种有效载荷和药物靶向；另一方面，四氧化三铁纳米颗粒使其具有磁性靶向能力，然后可以通过将药物载体有效地传递到肿瘤组织中来改善药物递送效率。

[0005] 然而，未经修饰的氧化石墨烯对溶质，酸碱度，离子强度等溶液环境比较敏感，在生理环境下易发生团聚，严重限制了其在生物医学领域的应用。所以，改善其在生理环境下的稳定性就显得尤其重要，而使GO在生理环境下变稳定的一个有效方法是表面修饰。层层自组装技术为其表面修饰提供了一种既简便又价廉的途径，它是将带相反电荷的聚电解质通过静电吸引交替沉积在GO片层上，得到功能性多层膜的一种方法。氧化石墨烯的功能化修饰可分为共价功能化和非共价功能化，共价修饰的缺点是修饰分子与氧化石墨烯之间的作用力很强，制备过程中要使用有机溶剂，若不能完全去除，可能对人体有害。

[0006] 因此，本发明利用非共价作用对氧化石墨烯进行表面修饰，制备简单且不使用有机溶剂。非共价键功能化是利用ππ相互作用、离子键、氢键以及静电作用等非共价键作用，对氧化石墨烯进行功能化来改善氧化石墨烯的分散性和稳定性。本发明以利用石墨烯的衍生物负载四氧化三铁制备的磁性氧化石墨烯为基体，采用层层自组装技术，将鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠通过静电吸附作用依次包裹在其表面，制备得到的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料具有良好的分散性和稳定性。

发明内容

[0007] 本发明目的是为了解决氧化石墨烯材料对环境敏感，在生理环境下易发生聚集的缺点，提供一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的制备方法，该方法制备的载体材料亲水性强，水中分散性好，也很稳定性，载药量大，可减少药物对机体的毒副作用，具有广泛的应用前景。

[0008] 本发明首先提供一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料，所述复合物是利用层层自组装技术形成的纳米载体，以磁性纳米氧化石墨烯为核心，鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基纤维素钠为囊材，将鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠通过非共价作用依次吸附在表面而形成。

[0009] 本发明还提供一种磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的制备方法，按照以下步骤进行：（1）将氧化石墨烯溶于乙二醇和二乙二醇混合溶剂，获得悬浮液，水浴超声，得到氧化石墨烯水分散液，分别加入六水三氯化铁、丙烯酸钠和醋酸钠，搅拌，置于反应釜中进行孵化，反应结束后取出样品，洗涤获得沉淀，所得沉淀即为磁性氧化石墨烯，加入去离子水溶解，得到磁性氧化石墨烯水分散液；
（2）将鱼精蛋白硫酸盐溶于纯水中，搅拌得溶液A，加入步骤（1）所述的磁性氧化石墨烯水分散液，超声、抽滤、洗涤，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白水分散液；
（3）将羧甲基纤维素钠溶于纯水中，搅拌，加入步骤（2）所述的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白水分散液，经搅拌、抽滤、洗涤后，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠水分散液。

[0010] 步骤（1）中所述的超声功率250W-400W，超声时间0.5 h-2 h，冰水浴。

[0011] 步骤（1）中所述的乙二醇和二乙二醇的体积比为1:19；所述的氧化石墨烯的浓度为1 mg/mL-4 mg/mL。

[0012] 步骤（1）所述的氧化石墨烯与六水三氯化铁的质量比为1:10 20；所述的氧化石墨~烯与丙烯酸钠的质量比为1:1 10；所述的氧化石墨烯与醋酸钠的质量比为1:30 50。
~ ~

[0013] 步骤（2）所述的溶液A中鱼精蛋白硫酸盐的浓度为1 mg/mL。

[0014] 步骤（2）所述的磁性氧化石墨烯与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:1 10。~

[0015] 所述步骤（3）中所述鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基纤维素钠质量比为1:1。

[0016] 所述的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料用于载药以及靶向释药方面。

[0017] 本发明的有益效果：（1）本发明制得的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料，粒径在
200500 nm的范围内，载药量高达110%，经过层层自组装法对磁性氧化石墨烯进行非共价修饰后，载体材料在水中分散性和稳定性均良好，在生理条件下也无明显的团聚现象，与未修饰的氧化石墨烯相比，本发明制得的复合材料在纯水、PBS溶液及细胞培养液中经过48 h的放置后均没有出现明显的聚沉现象（详见实施例4）。

[0018] （2）本发明所述磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料具有良好的磁性，经过磁铁吸引后，载体材料明显地聚集在有磁铁的一端（如图1a）。在低pH下可以靶向定位释药，降低了药物的毒副作用，具有广阔的应用前景。

[0019] （3）本发明所述磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的制备方法，通过非共价修饰改善了氧化石墨烯在生理条件下易团聚的缺点。

[0020] （4）本发明制备简单，成本低，易于大规模生产，可以广泛应用于催化、传感器与生物医药等领域，特别是应用于载药和药物控制释放领域。

附图说明

[0021] 图1（a）是实施例4所制备的样品的磁性考察结果图，磁铁吸引前（左）和磁铁吸引后（右）；图1（b）是实施例4中磁性氧化石墨烯样品的磁滞回归曲线；图2是实施例4所制备的氧化石墨烯（a）、磁性氧化石墨烯（b）、磁性氧化石墨烯鱼精蛋白（c）以及磁性氧化石墨烯鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠（d）材料的原子力显微镜图谱（右侧的坐标图表示AFM图谱中所画直线上的粒子的厚度的具体数值）；
图3是实施例4所制备材料在纯水中的Zeta电位图；
图4（a）是实施例4所制备的磁性氧化石墨烯在纯水（左）、pH为7.4的PBS缓冲液（中）和含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（右）中分别放置0 h和24 h的稳定性考察图；
图4（b）是实施例4所制备的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白在纯水（左）、pH为7.4的PBS缓冲液（中）和含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（右）中分别放置0 h和24 h的稳定性考察图；
图4（c）是实施例4所制备的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠在纯水（左）、pH为7.4的PBS缓冲液（中）和含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（右）中分别放置0 h和24 h的稳定性考察图；
图5是实施例7中磁性氧化石墨烯阿霉素（a）、磁性氧化石墨烯鱼精蛋白阿霉素（b）、磁性氧化石墨烯鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠阿霉素（c）在PBS溶液中的稳定性分散状态图；
图6是实施例8所制备的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠-盐酸阿霉素材料的体外释药图。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：磁性氧化石墨烯的合成
将适量氧化石墨烯分散于乙二醇和二乙二醇的混合溶剂中，氧化石墨烯浓度为2 mg/mL，在冰水浴环境中探头超声至完全分散，再向溶液中加入六水合氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠，氧化石墨烯和六水合氯化铁的质量比为1:10，氧化石墨烯和丙烯酸钠的质量比为1:1，氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1:30，室温下机械搅拌均匀，将上述溶液装入反应釜中，
200℃条件下反应24h。取出样品，水洗和醇洗之后所得样品即为磁性氧化石墨烯。样品分散到去离子水中，超声得到磁性氧化石墨烯溶液。

[0023] 磁性考察结果表明，合成的磁性氧化石墨烯材料具有较好的磁性。粒径测量结果表明，氧化石墨烯的粒径为234±2 nm，磁性氧化石墨烯的粒径为268±2 nm，这说明合成的磁性氧化石墨烯材料粒径仍未为纳米级且合成前后粒径变化不大，性质稳定，有利于到达靶组织或靶细胞更好地发挥靶向治疗作用。

[0024] 实施例2：将适量氧化石墨烯分散于乙二醇和二乙二醇的混合溶剂中，氧化石墨烯浓度为1 mg/mL，在冰水浴环境中探头超声至完全分散，再向溶液中加入六水合氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠，氧化石墨烯和六水合氯化铁的质量比为1:15，氧化石墨烯和丙烯酸钠的质量比为1:5，氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1:40，室温下机械搅拌均匀，将上述溶液装入反应釜中，
200℃条件下反应24h。取出样品，水洗和醇洗之后所得样品即为磁性氧化石墨烯。样品分散到去离子水中，超声得到磁性氧化石墨烯溶液。

[0025] 磁性考察结果表明，合成的磁性氧化石墨烯材料具有较好的磁性。粒径测量结果表明，氧化石墨烯的粒径为239±2 nm，磁性氧化石墨烯的粒径为270±2 nm。

[0026] 实施例3：将适量氧化石墨烯分散于乙二醇和二乙二醇的混合溶剂中，氧化石墨烯浓度为4 mg/mL，在冰水浴环境中探头超声至完全分散，再向溶液中加入六水合氯化铁、丙烯酸钠和乙酸钠，氧化石墨烯和六水合氯化铁的质量比为1:20，氧化石墨烯和丙烯酸钠的质量比为1:10，氧化石墨烯和乙酸钠的质量比为1:50，室温下机械搅拌均匀，将上述溶液装入反应釜中，
200℃条件下反应24h。取出样品，水洗和醇洗之后所得样品即为磁性氧化石墨烯。样品分散到去离子水中，超声得到磁性氧化石墨烯溶液。

[0027] 磁性考察结果表明，合成的磁性氧化石墨烯材料具有较好的磁性。粒径测量结果表明，氧化石墨烯的粒径为226±2 nm，磁性氧化石墨烯的粒径为256±2 nm。

[0028] 实施例4：磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合物的合成将鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中，配成1 mg/mL溶液；（2）在磁力搅拌状态下，将0.2 mg/mL 磁性氧化石墨烯溶液缓慢加入到该溶液中并搅拌均匀。磁性氧化石墨烯与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:4。然后将该混合物用0.22 μm 微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白（0.2 mg/mL），超声破碎仪分散均匀；（3）将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中；（4）在磁力搅拌状态下，将磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白溶液缓慢加入到羧甲基纤维素钠溶液中并搅拌均匀；鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基纤维素钠质量比为1:1，然后将该混合物用0.22 μm微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠水分散液。

[0029] 样品的磁性考察结果（图1a和1b）表明，实验中合成的各个磁性氧化石墨烯材料均具有较好的磁性，且表现出超顺磁性。如原子力显微镜图像所示（图2），氧化石墨烯的厚度在1nm左右，引入磁性粒子后的氧化石墨烯厚度增加到2nm左右，经鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠修饰以后，其厚度分别增加到5 nm和60 nm，这表明两者都成功地聚合到了氧化石墨烯的表面。粒径测量结果表明，磁性氧化石墨烯的粒径为266±2 nm，经鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠修饰后粒径变为496±2 nm，这与原子力显微镜结果是一致的。磁性氧化石墨烯的Zeta电位（图3）为﹣32.08 mV，其表面包裹上鱼精蛋白后变为＋35.98 mV，羧甲基纤维素钠包裹后又变为带有﹣32.43 mV的负电荷，这说明鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠都成功包裹在磁性氧化石墨烯的表面。稳定性考察结果（图4）表明，磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料在三种分散介质中均可以保持稳定，说明磁性氧化石墨烯被鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基纤维素钠层层自组装包裹可以有效地改善其分散性和稳定性。

[0030] 实施例5：（1）将鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中，配成1 mg/mL溶液；（2）在磁力搅拌状态下，将0.2 mg/mL 磁性氧化石墨烯溶液缓慢加入到该溶液中并搅拌2均匀。磁性氧化石墨烯与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:6。然后将该混合物用0.22 μm 微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白（0.2 mg/mL），超声破碎仪分散均匀；（3）将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中；（4）在磁力搅拌状态下，将磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白溶液缓慢加入到羧甲基纤维素钠溶液中并搅拌均匀。鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基纤维素钠质量比为1:
1。然后将该混合物用0.22 μm微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠水分散液。

[0031] 粒径测量结果表明，磁性氧化石墨烯粒径273±2 nm，经鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基纤维素钠层层自组装修饰以后粒径变为499±2 nm。磁性氧化石墨烯的Zeta电位为－33.84 mV，鱼精蛋白硫酸盐包裹以后，Zeta电位变为＋36.87 mV，羧甲基纤维素钠包裹以后，Zeta电位变为﹣37.98 mV。

[0032] 实施例6：（1）将鱼精蛋白硫酸盐溶解于去离子水中，配成1 mg/mL溶液；（2）在磁力搅拌状态下，将0.2 mg/mL 磁性氧化石墨烯溶液缓慢加入到该溶液中并搅拌均匀。磁性氧化石墨烯与鱼精蛋白硫酸盐质量比为1:8。然后将该混合物用0.22 μm 微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水中，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白（0.2 mg/mL），超声破碎仪分散均匀；（3）将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中；（4）在磁力搅拌状态下，将磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白溶液缓慢加入到羧甲基纤维素钠溶液中并搅拌均匀。鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基纤维素钠质量比为1:1。
然后将该混合物用0.22 μm微孔滤膜抽滤洗涤三次，分散于纯水，得磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠水分散液。

[0033] 粒径测量结果表明，磁性氧化石墨烯粒径258±2 nm，经鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基纤维素钠层层自组装修饰以后粒径变为482±2 nm。氧化石墨烯的Zeta电位为－34.03 mV（图3），鱼精蛋白硫酸盐包裹以后，Zeta电位变为＋32.16 mV，羧甲基纤维素钠包裹以后，Zeta电位变为－33.27 mV。

[0034] 实施例7：负载阿霉素的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的制备取磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠溶液适量，置于离心管中，加入阿霉素溶液（1 mg/mL）200 μl，使用PBS（pH=7.4）稀释至2mL，之后放入37 ℃恒温振荡箱中振荡24 h。然后，将载药后的样品离心，取上清液稀，用紫外分光光度计测定样品在480 nm波长下的吸光度，根据标准曲线计算出阿霉素负载量。结果表明，该复合材料对盐酸阿霉素的负载量为116.2%。负载上药物的材料分散图说明，经鱼精蛋白和羧甲基纤维素钠层层自组装修饰后的载药体系的稳定性得到明显改善（图5）。

[0035] 实施例8：负载阿霉素的磁性氧化石墨烯-鱼精蛋白/羧甲基纤维素钠复合材料的体外药物释放将负载了阿霉素的样品沉淀用PBS（pH=7.4）分散，分别加入两个透析袋中，分别放入装有20 mL pH 5.0和pH 7.4的PBS缓冲液的离心管中，放入37 ℃恒温振荡箱中振荡并开始计时，在不同时间点依次取出所有溶出介质，将透析袋转入对应空白介质内继续溶出，并在离心管中加入新鲜PBS缓冲液介质预热。取出的介质采用荧光分光光度计测定其荧光光谱，然后根据标准曲线计算出阿霉素的释放量。药物的释放结果表明（图6），该材料的药物释放具有明显的pH依赖性，在pH 7.4 的环境中释放较缓慢且不完全，而在弱酸性条件下，迅速释放。

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