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一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术

阅读：554发布：2021-02-28

IPRDB可以提供一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种新型的靶向核酸分子的捕获与富集技术，靶向核酸分子片段通过与特异的捕获探针杂交，而标记有丙烯酰胺基团的探针分子被固定在丙稀酰胺胶中，从而将靶向核酸分子片段捕获下来。该技术可用于微生物群落功能基因捕获与高通量测序分析，人类基因组中疾病相关基因的钓取与高通量测序分析，环境病原微生物特征序列钓取与分析；另外，还可用于多种分子疾病与病原微生物诊断试剂盒的开发。本发明成本较低，并且丙烯酰胺分子胶连效率远远高于磁珠与探针之前的连接效率，因此捕获效率也大大提高。，下面是一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术专利的具体信息内容。

1.一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，包括以下操作步骤：

1）将待捕获核酸分子片段化，切胶回收200bp-500bp的核酸分子片段，连接通用接头，形成靶向核酸分子片段；

2）将步骤1）的靶向核酸分子片段与捕获探针及杂交液混合，完成杂交反应，所述捕获探针修饰有丙烯酰胺化学基团；

3）向步骤2）形成的混合溶液中加入丙烯酰胺贮存液、过硫酸铵和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并将所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺胶成型装置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺胶，并在所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充入导电胶体；

4）将经步骤3）之后的丙烯酰胺胶置于电泳槽的TBE电泳液中，电泳去除其中的非特异片段；

5）将经步骤4）反应之后的丙烯酰胺胶置于变性电泳溶液中，变性电泳将靶向核酸分子片段与捕获探针分离，并且所述靶向核酸分子片段随电流集聚在一段导电胶体中；

6）收集步骤5）中导电胶体中的靶向核酸分子片段，进行高通量测序分析。

2.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述待捕获核酸分子是单双链线形或单双链环形的DNA或RNA。

3.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述捕获探针是单链DNA、RNA、PNA或LNA。

4.根据权利要求1或3所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述捕获探针5’端、3’端或任意碱基上修饰任意个数的丙烯酰胺化学基团。

5.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，步骤3）中所述丙烯酰胺贮存液中丙烯酰胺与N,N＇-亚甲双丙烯酰胺的质量比为19：1或29：1。

6.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述丙烯酰胺胶成型装置为非导电材料制成，包括塑料软管、玻璃沟槽或玻璃管。

7.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述丙烯酰胺溶液质量体积比浓度为2%-6%。

8.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充置的导电胶体为任意导电的、对核酸分子有过滤或吸附作用的材料。

9.根据权利要求8所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述导电胶体为琼脂糖胶。

10.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，步骤5）中的所述变性电泳溶液为碱性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca(OH)2溶液。

说明书全文

一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种核酸分子的捕获与富集技术。

背景技术

[0002] 新一代高通量测序仪的出现大大降低了核酸测序成本，采用高通量测序仪，短短几年内测序了大量的核酸序列，多种生物的全基因组被测序，很多个人基因组也得到测序。人类全基因组测序是高通量测序仪重要的应用。但是，多数研究与诊断目标只需要测序大量样本中的某一特定片段。例如，对于人类基因组来说，外显子是蛋白质编码区域，而外显子只占全基因组的大约1%。大部分情况下，特别是对于疾病相关外显子突变的筛选，只测外显子区域就足够了。另外，越来越多的研究发现，微生物群落的宏基因组功能基因的分析与多种人类重大疾病、环境污染、大气温室效应等密切相关，而宏基因组是一个非常庞大的数据，人类肠道微生物群落宏基因组是人类基因组的100倍，不同人、同一个人不同的生理时期都具有不同的微生物群落组成，但在这些庞大的微生物群落中，起到关键作用的往往只有部分功能基因，对于一个微生物群落，只需要对少量的功能基因进行测序就可以达到分析的目的。
[0003] 大量分子进行靶向平行分析，需要发展核酸捕获技术，目前已有报导和市场化捕获产品主要有两种，第一种是基于高通量杂交分析芯片的捕获与富集。这种方法首先是成本较高。高通量杂交芯片本身是一个非常昂贵的技术，某些芯片杂交分析成本高于目前的高通量测序分析成本，如果以这种昂贵的芯片进行富集与捕获目标分子，然后再进行测序分析，成本较高；采用高通量芯片进行捕获与富集目标分子的第二个弊端是捕获效率较低，芯片与捕获片段杂交的方式是固相杂交，固相分子杂交的杂交效率较低。目前市场上第二种捕获方法是基于液相分子杂交与磁珠分离方法，该方法首先进行一步液相杂交，然后将探针上标记的一个基团与磁珠上的一个特异基团共价连接，将捕获分子与磁珠连接在一起，磁珠通过磁场的作用，将捕获片段与非特异片段分离出来。该方法与第一种方法相比，捕获效率与成本都得以降低。但是，由于该方法需要一步共价连接，连接效率直接影响着捕获与富集产率，另外，由于探针标记价格较高，所以捕获成本仍然较高。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术。
[0005] 本发明采用的一个技术方案是：提供一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，包括以下操作步骤：
1）将待捕获核酸分子片段化，切胶回收200bp-500bp的核酸分子片段，连接通用接头，形成靶向核酸分子片段；
2）将步骤1）的靶向核酸分子片段与捕获探针及杂交液混合，完成杂交反应，所述捕获探针修饰有丙烯酰胺化学基团；
3）向步骤2）形成的混合溶液中加入丙烯酰胺贮存液、过硫酸铵和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并将所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺胶成型装置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺胶，并在所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充入导电胶体；
4）将经步骤3）之后的丙烯酰胺胶置于电泳槽的TBE电泳液中，电泳去除其中的非特异片段；
5）将经步骤4）反应之后的丙烯酰胺胶置于变性电泳溶液中，变性电泳将靶向核酸分子片段与捕获探针分离，并且所述靶向核酸分子片段随电流集聚在一段导电胶体中；
6）收集步骤5）中导电胶体中的靶向核酸分子片段，进行高通量测序分析。
[0006] 在本发明一个较佳实施例中，所述待捕获核酸分子是单双链线形或单双链环形的DNA或RNA。
[0007] 在本发明一个较佳实施例中，所述捕获探针是单链DNA、RNA、PNA或LNA。
[0008] 在本发明一个较佳实施例中，所述捕获探针5’端、3’端或任意碱基上修饰任意个数的丙烯酰胺化学基团。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，步骤3）中所述丙烯酰胺贮存液中丙烯酰胺与N,N＇-亚甲双丙烯酰胺的质量比为19：1或29：1。
[0010] 在本发明一个较佳实施例中，所述丙烯酰胺胶成型装置为非导电材料制成，包括塑料软管、玻璃沟槽或玻璃管。
[0011] 在本发明一个较佳实施例中，所述丙烯酰胺溶液质量体积比浓度为2%-6%。
[0012] 在本发明一个较佳实施例中，所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充置的导电胶体为任意导电的、对核酸分子有过滤或吸附作用的材料。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，所述导电胶体为琼脂糖胶。
[0014] 在本发明一个较佳实施例中，步骤5）中的所述变性电泳溶液为碱性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca(OH)2溶液。
[0015] 本发明的有益效果是：（1）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用大量捕获探针与靶向核酸分子片段结合，并将捕获探针固定在丙烯酰胺胶上，通过跑胶去除其中的非特异片段，靶向核酸分子片段又可以通过变性电泳方法将其收集起来，使得靶向核酸分子片段得以富集，然后进入下一步的测序分析。微生物群落宏基因组庞大，本发明针可对感兴趣的基因或片段进行富集，并进一步的分析。
[0016] （2）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用的杂交体系为溶液内杂交，然后将杂交分子固定，以提高捕获探针与靶向核酸分子片段的杂交效率。以往的研究报导， 核酸分子捕获多采用固液相分子杂交技术，也就是将探针分子固定在固相载体上，然后将被捕获分子与探针杂交，被杂交捕获的分子留下来进一步检验分析，没有被杂交上去的分子被冲洗去除。相对于固液相分子杂交技术，液相分子杂交大大提高了分子之间的碰撞机会，提高分子之间的杂交效率，进一步提高了核酸分子的检测灵敏度，也提高了病原微生物的检测灵敏度。
[0017] （3）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用丙烯酰胺胶固定捕获探针与靶向核酸分子片段的杂交体，胶体对核酸分子的固定量较大，因此捕获效率高。胶体内的探针固定量可达8µM，我们多用的PCR引物浓度为0.4 µM，胶体有这么高的固定容量，多数探针及杂交体都被固定下来，因此具有较高的固定效率。目前，唯一采用溶液杂交的捕获技术，是采用磁珠固定探针与杂交体。磁珠连接亲合素，探针上连接生物素，这种亲和素与生物素的连接效率虽高，但磁珠上的亲合素（固相载体）与探针上的生物素（液相）之间的连接效率最高也只有30%的效率，多数杂交体无法因为连接不到磁珠上，而无法捕获下来。
[0018] （4）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，可采用原位固相单分子扩增的方法来扩大待检测核酸分子的拷贝数，以提高了核酸分子捕获量。当宏基因组中靶向核酸分子片段较少时，本发明可以采用原位扩增的方法增加目标片段数量。核酸分子扩增效率与被扩增分子与引物分子之间的碰撞机会呈正相关，理论上，PCR扩增反应可以将溶液中的单个分子扩增出来，但实际实验操作过程中发现，PCR检测的灵敏度是大于10000个分子。本发明在进行单分子扩增之前，首先通过电泳或沉淀等技术将非目标片段去除，剩余的片段只有引物和目标分子，这样大大增加了目标分子与引物之前的碰撞机会，也大大提高了目标分子的扩增效率。
[0019] （5）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用原位固相单分子扩增方法增加目标核酸分子捕获量，减少了核酸分子扩增的偏性，更宜于高通量测序定量分析目标片段的含量。常规的通用引物PCR扩增，由于模板分子序列及高级结构的不同，如GC含量低的片断较容易被扩增，因此在大量片断扩增过程中，最终的反应液中小片断和GC含量低的片断较多，而大片断与GC含量高的片断较少。扩增效率高的核酸模板分子会越来越多，而扩增效率低人模板分子增长速度会越来越小，最终采用基因芯片杂交技术检测时，低扩增效率的分子几乎检测不到。本发明采用原位单分子扩增，在某一个扩增区域内，只有一个模板分子，这个模板在扩增过程中不受其他模板分子的影响，因此，每个模板分子的扩增效率差别较小，在采用核酸分子芯片杂交检测时，能够真实的反应原液中核酸分子模板数量，也就是微生物数量。
[0020] （6）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用通用引物扩增，以提高扩增效率。多数报导采用多重PCR或多次PCR的方法来检测多种微生物，多重PCR 技术扩增的偏性较大，有些分子较容易扩增，而有些分子基本扩增不出来；即使这样，同时能扩增出来的核酸模板分子的数量也非常有限。多次PCR方法较为烦琐，因此限制了核酸分子检测的种类。本发明采用通用引物扩增，也就是将待扩增模板分子两端接上接头，不同模板分子具有相同的接头，然后以接头序列作为引物序列进行PCR扩增，这样就提高了各种模板分子的扩增效率。
[0021] （7）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术中靶向核酸分子片段富集成本相对较低。本发明采用丙烯酰胺胶聚合的方法将探针固定在丙烯酰胺胶内，探针修饰一个丙烯酰胺分子，相比较其他固定方法及探针的修饰基团，成本相对便宜。不需要昂贵的抗体或者其他蛋白物质，使用的探针可一次合成，多次使用。加上本发明固定效率较高，相比较其他核酸分子的富集方法，成本较低。
[0022] （8）本发明一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，大大降低样本分析成本。多数宏基因组样本基因组信息宠大，而我们感兴趣的目标片段往往只占宏基因组的很少比例（小于万分之一），多数信息对于我们分析宏基因组与疾病或其他性状意议较小。然而目前的测序成本仍然较高，采用本发明可以将目标片段捕获出来进行测序分析，大大降低分析成本。由于宏基因组信息量大，目标片段含量相对较小，所以对于捕获技术要求较高。本发明基于胶固定技术固定效率高等特点，实现了宏基因组目标片段的捕获与富集。本发明不仅降低了DNA的测序成本，同时还降低了样本的人工分析费用。

附图说明

[0023] 图1是本发明的工作原理图；其中a：打碎成200-500bp的非靶向核酸分子片段；
b：打碎成200-500bp的靶向核酸分子片段；
c：连接有接头的非靶向核酸分子片段；
d：连接有接头的靶向核酸分子片段；
e：Linker-PCR扩增后的PCR产物；
f：标记有化学基团的探针；
g：探针和靶向核酸分子片段的杂交体;
h：固定连接有探针和靶向核酸分子片段杂交体以及非靶向核酸分子片段的胶体；
i：去除了非靶向核酸分子片段之后的固定连接有探针和靶向核酸分子片段杂交体的胶体；
j：核酸分子序列分析仪。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0025] 参阅图1，其中步骤1为靶向核酸分子片段和非靶向核酸分子片段连接通用接头，步骤2为Linker-PCR，步骤3为探针与靶向核酸分子片段在杂交液中杂交，步骤4为通过探针上的化学基团将靶向核酸分子片段与探针的杂交体连接固定在固相胶体中，步骤5为采用电泳等技术将非靶向核酸分子片段去除，步骤6为捕获靶向核酸分子片段并进入下一步的高通量测序分析。
[0026] 实施例1 采用聚丙烯酰胺胶捕获技术与高通量测序仪靶向分析肠道微生物宏基因组中多种功能基因分布：（1）探针的设计与制备
肠道微生物功能基因DNA序列片段选择：采用Mega或Clustal W等软件，进行生物信息学比较，完成2万个功能基因核酸序列的选择。
[0027] 探针的设计：采用primer5.0等软件，针对微生物特异片段设计探针。
[0028] 探针的合成与标记：探针采用DNA合成仪进行合成，所有探针合成后，进行5’端标记一个丙烯酰胺基团。
[0029] （2）肠道微生物群落宏基因组提取、基因组片段化及两边接上接头肠道微生物群落宏基因组DNA提取：采集200mg新鲜大便，PBS悬浮大便中的肠道微生物，然后离心收集微生物，进一步采用溶菌酶等试剂提取微生物群落中的宏基因组DNA。
[0030] 基因组DNA的超声波处理：选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-500bp大小的基因片段。
[0031] 基因组DNA片段两端与通用连接子连接（处理方法同专利申请号CN200610098379.X）： 将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow 大片段DNA聚合酶 I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子（linker1：5’- GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’ linker2：5’-CGCCTTGGCCTCCGACT-3’）连接，使基因组片断两端连接上两个通用连接子。连接产物经QIAquick纯化试剂盒 （QIAGEN）纯化后待用。
[0032] （3）Linker-PCR扩增为了尽量避免易扩增片段被大量扩增，PCR的循环数为20-26个。反应体系为100μl，
2+
其中含有1×反应缓冲液，2.5 mM的Mg ，0.4 μM的与连接子互补的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200 μM的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性4分钟，然后 95℃变性1分钟，70℃复性2分30秒，72℃延伸30秒，最后，
72℃再延伸10分钟。PCR产物纯化后备用。
[0033] （4）两端连接有接头的基因组与探针杂交并固定于聚丙烯酰胺凝胶将制备的带有通用引物的PCR产物与杂交液（Telechem）按3: 1混合，95℃变性5分钟，然后快速冷却到室温。把杂交溶液与丙烯酰胺溶液混合，其中，丙烯酰胺单体（29:1, w/w 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺）终浓度为2% （w/v），过硫酸铵 （APS）为1% （w/v），TEMED（N,N,N′,N′-tetramethylethylene diamine）为0.5% 。将上述混合液灌注于透明塑料软管（直径约为2mm-10mm，长为15cm -20cm）一端，等胶体凝固后，将的另一端灌注上2%的琼脂糖溶液，丙烯酰胺胶与琼脂糖胶之间不能有气泡。
[0034] （5）电泳去除非特异片段，变性电泳收集目标片段去除非特异片段：将装有凝胶的塑料软管置平板电泳槽中，软管的两端插在两极凹槽的电泳液（1×TBE）中，电流只从软管中的凝胶通过。电流为100 mA电泳时间10分钟。
[0035] 目标片段收集：将电泳槽两端凹槽中的电泳液更换为0.1M NaOH溶液，将去除了非特异片段的塑料软管置于两边NaOH溶液中，进行电泳，电流为100 mA,电泳10分钟。根据DNA指示剂，切下目标片段琼脂糖胶，提取目标片段，冻存备用。
[0036] （6）通用引物PCR扩增2+
反应体系为50μl，其中含有1×反应缓冲液，2.5 mM的Mg ，0.4 μM的与连接子互补的引物，2U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200 μM的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性4分钟，然后 95℃变性1分钟，70℃复性2分30秒，72℃延伸30秒，最后，72℃再延伸10分钟，PCR循环数为35，PCR产物纯化后备用。
[0037] （7）高通量测序仪测序分析目标片段将上述目标片段分别进行高通量测序仪测序分析，并进行生物信息学分析。
[0038] 实施例2 采用聚丙烯酰胺凝胶捕获与高通量测序仪进行人类基因组中癌症相关基因外显子突变的靶向分析：（1）探针的设计与制备
癌症相关基因外显子核酸序列选择：采用Mega或Clustal W等软件，进行生物信息学比较，完成1000个功能基因核酸序列的选择。
[0039] 探针的设计：采用primer5.0 等软件，针对微生物特异片段设计探针。
[0040] 探针的合成与标记：探针采用DNA合成仪进行合成，所有探针合成后，进行5’端标记一个丙烯酰胺基团。
[0041] （2）肠道微生物群落宏基因组提取、基因组片段化及两边接上接头人类基因组DNA提取：采集2ml静脉血，采用红细胞裂解和蛋白酶K消化，酚-氯仿方法抽提人类基因组DNA。
[0042] 基因组DNA的超声波处理：选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-500bp大小的基因片段。
[0043] 基因组DNA片段两端与通用连接子连接（处理方法同专利申请号CN200610098379.X）： 将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA 聚合酶、Klenow 大片段DNA聚合酶 I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子（linker1: 5’- GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’ linker2: 5’-CGCCTTGGCCTCCGACT-3’）连接，使基因组片断两端连接上两个通用的连接子。连接产物经QIAquick纯化试剂盒 (QIAGEN)纯化后待用。
[0044] （3）Linker-PCR扩增为了尽量避免易扩增片段被大量扩增，PCR的循环数为20-26个。反应体系为100μl，
2+
其中含有1×反应缓冲液，2.5 mM的Mg ，0.4 μM的与连接子互补的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200 μM的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性4分钟，然后 95℃变性1分钟，70℃复性2分30秒，72℃延伸30秒，最后，
72℃再延伸10分钟。PCR产物纯化后备用。
[0045] （4）两端连接有接头的基因组与探针杂交并固定于聚丙烯酰胺胶将制备的带有通用引物的PCR产物与杂交液（Telechem）按3: 1混合，95℃变性5分钟，然后快速冷却到室温。把杂交溶液与丙烯酰胺溶液混合，其中，丙烯酰胺单体（19:1, w/w 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺）终浓度为6% (w/v)，过硫酸铵 （APS） 为1% （w/v）, TEMED（N,N,N′,N′-tetramethylethylene diamine）为0.5% 。将上述混合液灌注于透明塑料软管（直径约为2mm-10mm，长为15cm -20cm）一端，等胶体凝固后，将的另一端灌注上2%的琼脂糖溶液，丙烯酰胺胶与琼脂糖胶之间不能有气泡。
[0046] （5）电泳去除非特异片段，变性电泳收集目标片段去除非特异片段：将装有凝胶的塑料软管置平板电泳槽中，软管的两端插在两极凹槽的电泳液（1×TBE）中，电流只从软管中的凝胶通过。电流为100 mA电泳时间10分钟。
[0047] 目标片段收集：将电泳槽两端凹槽中的电泳液更换为0.1M NaOH溶液，将去除了非特异片段的塑料软管置于两边NaOH溶液中，进行电泳，电流为100 mA,电泳10分钟。根据DNA指示剂，切下目标片段琼脂糖胶，提取目标片段，冻存备用。
[0048] （6）通用引物PCR扩增2+
反应体系为50μl，其中含有1×反应缓冲液，2.5 mM的Mg ，0.4 μM的与连接子互补的引物，2U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200 μM的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性4分钟，然后 95℃变性1分钟，70℃复性2分30秒，72℃延伸30秒，最后，72℃再延伸10分钟。PCR循环数为35。PCR产物纯化后备用。
[0049] （7）高通量测序仪测序分析目标片段将上述目标片段分别进行高通量测序仪测序分析，并进行生物信息学分析。
[0050] 实施例3 采用聚丙烯酰胺凝胶捕获与高通量测序仪靶向进行食品中微量病原微生物种类分析：（1）探针的设计与制备
菌种特异DNA序列片段选择：采用Mega或Clustal W等软件，进行生物信息学比较，完成100种以上食品病原微生物特异基因的选择。
[0051] 探针的设计：采用primer5.0等软件，针对微生物特异片段设计探针。
[0052] 探针的合成与标记：探针采用DNA合成仪进行合成，同时在5’端标记一个丙烯酰胺基团。
[0053] （2）病原微生物基因组提取、基因组片段化及两边接上接头病原微生物基因组DNA提取：采集冷却肉及经屠宰加工后的鸭肉系列产品，用无菌棉
2
拭子进行六面50cm 取样，然后将棉拭子上的微生物用PBS冲洗下来，14000rpm离心10分钟，分离微生物。采用试剂盒或本研究室优化后的微生物DNA抽提方法，进行微生物全基因组DNA抽提。
[0054] 基因组DNA的超声波处理：选取功率适当的超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-500bp大小的基因片段。
[0055] 基因组DNA片段两端与通用连接子连接（处理方法同专利申请号CN200610098379.X）： 将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA 聚合酶、Klenow 大片段DNA聚合酶 I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子（linker1: 5’- GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’ linker2: 5’-CGCCTTGGCCTCCGACT-3’）连接，使基因组片断两端连接上两个通用的连接子。连接产物经QIAquick纯化试剂盒 (QIAGEN)纯化后待用。
[0056] （3）通用引物PCR扩增为了尽量避免易扩增片段被大量扩增，PCR的循环数为20-26个。反应体系为100μl，
2+
其中含有1×反应缓冲液，2.5 mM的Mg ，0.4 μM的与连接子互补的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200 μM的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性4分钟，然后 95℃变性1分钟，70℃复性2分30秒，72℃延伸30秒，最后，
72℃再延伸10分钟。PCR产物纯化后备用。
[0057] （4）两端连接有接头的基因组与探针杂交并固定于聚丙烯酰胺凝胶将制备的带有通用引物的PCR产物与杂交液（Telechem）按3: 1混合，95℃变性5分钟，然后快速冷却到室温。把杂交溶液与丙烯酰胺溶液混合，其中，丙烯酰胺单体（29:1, w/w 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺）终浓度为2% (w/v)，过硫酸铵 （APS)）为1% （w/v）, TEMED（N,N,N′,N′-tetramethylethylene diamine）为0.5% 。将上述混合液灌注于透明塑料软管（直径约为2mm-10mm，长为15cm -20cm）一端，等胶体凝固后，将的另一端灌注上2%的琼脂糖溶液，丙烯酰胺胶与琼脂糖胶之间不能有气泡。
[0058] （5）电泳去除非特异片段，变性电泳收集目标片段去除非特异片段：将装有凝胶的塑料软管置平板电泳槽中，软管的两端插在两极凹槽的电泳液（1×TBE）中，电流只从软管中的凝胶通过。电流为100 mA电泳时间10分钟。
[0059] 目标片段收集：将电泳槽两端凹槽中的电泳液更换为0.1M NaOH溶液，将去除了非特异片段的塑料软管置于两边NaOH溶液中，进行电泳，电流为100 mA,电泳10分钟。根据DNA指示剂，切下目标片段琼脂糖凝胶，提取目标片段，冻存备用。
[0060] （6）通用引物PCR扩增2+
反应体系为50μl，其中含有1×反应缓冲液，2.5 mM的Mg ，0.4 μM的与连接子互补的引物（其中一条引物5’端修饰一个荧光分子），2U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200 μM的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性4分钟，然后 95℃变性1分钟，70℃复性2分30秒，72℃延伸30秒，最后，72℃再延伸10分钟。PCR循环数为35。PCR产物纯化后备用。
[0061] （7）基因芯片法进行病原微生物鉴定基因芯片的制备：①探针制备：针对待检测分析基因，设计基因芯片探针，探针的5’端修饰一个氨基化学基团。②醛基玻片制备：选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片，冲洗表面。将冲洗过的玻片置于盛有去离子水的烧杯，超声清洗1-2小时。将超声洗涤后的玻片放置在含有10% NaOH溶液的封闭的容器中浸泡30分钟。最后用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；洗涤干净的载玻片置于含有10% Alfa Aesar（3-methacryloxypropyltrimethoxysilane）的丙酮溶液中浸泡1小时，用丙酮和去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，烘干备用。③探针固定于醛基玻片：将氨基修饰的探针点样于玻片，然后进行氨基醛基的缩合反应，共价键将探针连接在玻片上。
[0062] 基因芯片法进行病原微生物鉴定：将上述PCR产物与芯片杂交反应，杂交后的玻片进行扫描仪扫描检测荧光信号，分析病原微生物种类。
[0063] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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