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用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置

阅读：918发布：2020-05-12

IPRDB可以提供用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于测量微生物(5)的培养基(4)粘度的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：a)将至少一种带电、磁性或可磁化或者覆盖至少一层磁性层或可磁化层(3)的颗粒浸没在该培养介质(4)中，b)将该培养介质置于电场、磁场或电磁场中，以便使该颗粒(3)运动，以及c)检测该颗粒(3)在该培养基中运动的自由度。更具体地，本发明涉及检测生物膜在微生物培养基中形成与生长的方法和装置。，下面是用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于自动检测微生物膜在液体培养介质(4)中生长的方法，所述方法包括以下步骤：a)将至少一种带电、磁性或可磁化的或者覆盖至少一层磁性层或可磁化层的颗粒(3)置于该培养介质(4)中，b)将所述培养介质(4)置于允许所述微生物膜生长的电场、磁场或电磁场，以使所述颗粒(3)运动，c)光学检测所述微生物膜在所述培养介质(4)中形成，当所述至少一种颗粒(3)的运动由于所述微生物膜的形成而变慢直到停止时，检测到所述生物膜的形成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤c)包括将所述至少一种颗粒置于电磁场。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述步骤b)包括将所述培养介质(4)置于逐渐增强的电磁场。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述电场、磁场或电磁场由产生运动的场的装置来产生。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养介质(4)以恒流流过开放的反应器(1)。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该培养介质(4)在给定的时间间隔以不连续流流过开放的反应器(1)。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)中用光源照亮所述颗粒并检测被照亮的所述颗粒(3)的运动。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述颗粒(3)产生信号。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述颗粒(3)是荧光型、磷光型、放射性或化学发光型的。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(a)中，在所述培养介质中引入几种颗粒，以及在步骤(c)中，将电磁场施加于所述颗粒，使其运动来检测在所述界面上所述生物膜的形成，当所述颗粒在所述界面上由于电磁场不能聚集到一起时检测到生物膜的形成。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述检测是可视化检测。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养介质是均质或非均质的。

13.用于实现权利要求1-12的方法的装置，包括：

至少一个培养介质反应器(1)，用于容纳所述培养介质(4)以便检测生物膜(6)的形成与生长，包括至少一个浸没在所述培养介质中的界面；

浸没在所述培养介质(4)中的至少一种带电或者磁性或可磁化或者覆盖至少一层磁性层或可磁化层的颗粒，当存在于所述反应器中并静止于所述界面时，所述颗粒浸没在所述培养介质中；

用于产生可施加给所述至少一种颗粒(3)使其运动的电场、磁场或电磁场的装置，用于光学检测所述颗粒在所述培养介质中运动的设备。

14.根据权利要求13所述的装置，其中，所述反应器(1)具有一个封闭的端部以便形成平的底部(2)。

15.根据权利要求13所述的装置，其中，所述反应器(1)的底部(1)具有一个或者多个孔穴(8，9)或槽，用于容纳所述颗粒。

16.根据权利要求13所述的装置，其中，所述反应器(1)具有一个封闭的端部以便形成半球形底部(2)。

17.根据权利要求13所述的装置，其中，所述反应器(1)具有两个开放的端部。

18.根据权利要求17所述的装置，其中，所述反应器(1)构造成使得所述培养介质(4)以恒流流动或者在给定时间间隔的不连续流流动。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的装置，其中，所述颗粒(3)产生由所述用于检测运动的设备可检测到的信号。

20.根据权利要求19所述的装置，其中，所述颗粒(3)是荧光型、磷光型或放射性或化学发光型的。

21.根据权利要求20所述的装置，其中，所述颗粒(3)构造成使得静止时在所述反应器(1)中处于稳定的状态。

22.根据权利要求21所述的装置，其中，所述颗粒(3)的大小与微生物(5)的大小基本一致。

23.根据权利要求13所述的装置，其中，所述光学检测设备包括在所述至少一种颗粒(3)的方向上发射的光源，以及可以检测所述至少一种颗粒(3)在培养介质(4)中运动的检测装置。

24.根据权利要求13所述的装置，其中，所述装置包括可在所述界面上分散并静止的几种颗粒，以及可产生电场、磁场或电磁场的装置，该电场、磁场或电磁场可使所述颗粒聚集从而使所述表面的某一区域没有颗粒。

说明书全文

用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置

技术领域

[0001] 本发明涉及检测培养基粘度(粘滞性)的领域。

[0002] 更具体地，本发明涉及生物膜(biofilm)在均质或非均质培养基中生长的研究领域。当该生物膜生长时，其阻碍可在磁场、电场或电磁场中移动的颗粒的运动，例如带电颗粒(由于正和/或负离子的存在而造成)或者磁性或可磁化颗粒或者覆盖磁性层或可磁化层的颗粒。

背景技术

[0003] 在这方面，在本文中，术语“粘度”的含义应该理解为与可磁化颗粒在生物膜中的自由度相关。在阅读了本文后，我们理解，本发明的目的并非如我们原本理解的该术语“粘度”的一般含义来测量培养基的粘度，而是通过测量一种(或多种)可磁化颗粒的自由度来证明微生物的生长(développement)，该颗粒的运动受或不受生物膜阻碍，该生物膜本身对生长中的微生物的存在与否是非常重要的。

[0004] 同样，术语“培养基”的含义应该理解为至少一种微生物能够存在并生长的任何介质，因此可以为天然的或者合成的介质。由此，例如水包括在该定义中。接下来，在本文中，通过参考该定义，术语“培养基”或者“介质”或“培养介质”可以无差别地使用。

[0005] 由此，根据本发明，术语“培养基”，“介质”或“培养介质”可以理解为一种微生物及其存在的介质，或者可能仅指介质。

[0006] 微生物是微观的活体，例如细菌，酵母，真菌，藻类，原生生物。微生物可以是单细胞的或者多细胞的。多细胞微生物(后生动物)的幼体阶段也可以作为生物膜的来源。

[0007] 迄今为止，大多数微生物(病原体或者非病原体)已经以在介质中游离的或者分离的(悬浮培养的或者选择培养基上的)“浮游生物(planctonique)”的形式进行了研究。然而，在实验室外的自然环境中，发现细菌菌群固定在载体上(“固着”状态)并且在称为“生物膜”的有序共同体中生长。这种细菌共同体通常包含在胞外多糖基质(matrice d’exopolysaccharide)中，该基质限制了其与周围介质的交换(A.Filloux，I.Vallet.Biofilm：“Mise en place etorganization d’une communautébactérienne”.Médecine/Sciences 2003；19：77-83)。

[0008] 生物膜生长时，细菌首先附着到载体上然后在该载体上定植(colonisation)。繁殖的细菌快速形成由细胞体层构成的膜，该细胞体层分泌一层起保护作用免受周围介质侵袭的胞外多糖外鞘(gangue d’exopolysaccharides)(Costerton et al.Bacterial Biofilm.Sciences 1999；284-6)。生物膜形成的动力学可以分成5个步骤：

[0009] -表面的调节：存在于液相中的有机或矿物分子被吸附在表面上，从而形成“调节膜(film conditionnant)”。

[0010] -黏附或可逆附着：存在的微生物通过重力作用、布朗运动或者通过趋化性(如果具有鞭毛)而靠近表面。在该连接(或固定)的第一步骤，仅仅涉及纯粹的物理现象以及发生微弱的物理化学相互作用，微生物仍能很容易地脱离出来。

[0011] -附着：这个更慢的步骤涉及与更强能量的相互作用以及微生物代谢和微生物的细胞附属物(鞭毛、纤毛，…)。附着是一个活跃且特异的现象。特别是由于胞外多糖的合成，第一批移生菌(colonisateurs)将不可逆地连接到表面上。这个过程相对缓慢，并依赖于环境因素和所存在的微生物。

[0012] 生物膜的成熟(生长和表面挂膜)：附着到表面之后，细菌繁殖并且重新集聚以形成被聚合物围绕的微菌落。该聚合物基质(或糖萼)将起如同胶合剂的作用，并加强细菌彼此间的联系以及与表面的联系以最终形成生物膜，并达到平衡状态。该生物膜通常以构成限制点的三维结构生长。该微环境将是浮游生物生长方式相关的多种生理修饰和分子修饰的场所。如果条件允许，以这种方式形成的生物膜将占据提供给它的所有表面。尽管某些种类的微生物不合成EPS或者只有很少的聚合物同样能够在表面上附着并形成生物膜，生物膜的成熟一般均与EPS的生成相关。

[0013] 脱落：生物膜是永久动态平衡的结构并作为载体、微生物和环境的函数而变化。前述变化可以表示为细胞或者聚集体的脱落。

[0014] 作为其他表面污染的结果，细胞这样释放到液体基质中是可实现的，通常是医疗环境中多种复发性疾病(耐药性的起源)的起因。

[0015] 生物膜的本质有很大差异，一些富含胞外多糖(EPS)，其他的主要由细菌体构成。

[0016] 在人类健康中，生物膜引起了越来越难以抑制的感染：在整个ORL球体中(听觉通道，鼻膜，眼结膜，...)，在牙齿上(牙垢的出现，牙蛀蚀，…)，在支气管上，肺上(遭受囊性纤维变性的病人，...)，在尿道系统中(...)。

[0017] 另外，生物膜通过在导管或者植入物(心瓣膜，人工髋部，尿道探针)上形成，成为大多数医院内病理(pathologies nosocomiales)的根源(每年死亡人数超过10,000)(J.W.Costerton，P.Stewart andE.P.Greenberg，Bacterial Biofilms“A common cause of persistentinfections”，Science，vol.284，pp.1318-1322)。

[0018] 生物膜还存在于冷却塔中，从而引起军团病菌传染。

[0019] 它们同样影响农产品工业，因为它们牵涉食品中毒(当冷链打断时形成，在切割工具、研磨工具上和操作表面上生长)。

[0020] 同样，生物膜可在管子上形成，尤其导致腐蚀现象。

[0021] 生物膜也在浸没物体例如船体的表面形成，引起“结垢(fouling)”问题(由于船体上聚集各种微生物使船体表面变脏)。

[0022] 应该指出，并非只有细菌产生生物膜：真菌、藻类和原生动物也可以组织成生物膜。

[0023] 因此，生物膜在很多地方是无处不在的，表现出健康危害性并引起相对显著的损害。

[0024] 然而，由于生物膜研究的复杂性，虽然实现了多种研究生物膜生长的方法，但是对生物膜的生长和行为仍知之甚少。

[0025] 生物膜的研究方法仍主要基于在干燥箱(或恒温箱)中振摇时，浸没于小瓶(或烧瓶)内培养基中的玻璃片或者塑料片的挂膜，以便接下来用结晶紫染色或者在显微镜下进行观察。

[0026] 存在其他更加复杂的检测方法，例如通过石英晶体的微量天平(Q-CMD，分散监测的石英晶体微量天平)来检测，通过MTA(质量传递分析)、UFDR(超声波频率域反射计)、原位PCR(在功能基因Amo A上)、FISH(荧光原位杂交)、CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)、PAS(光声光谱法)...来检测。

[0027] 还有其他一些方法采用覆盖有植物凝血素或者抗体的磁性颗粒/磁珠，以分离引起生物膜形成的细菌，以便接下来能够通过免疫分析或者分子生物学的经典方法(杂交或者PCR)表征微生物。

[0028] 然而，已经证明这些方法难于实施并且相对繁琐。另外，它们无法给出关于细菌行为的充分的探索性教导，因此无法给出关于生物膜形成与生长的充分的探索性教导。事实上，这些方法无法实现生物膜生长的追踪，无论它是简单地由细胞体(李斯特氏杆菌类型)或者EPS(胞外多糖)构成还是由定植的微生物(假单胞菌型)分泌的类似基质构成。

[0029] 本发明涉及可以检测均质或非均质、浑浊的和/或不透明的培养基粘度发展(或变化)的方法和装置以及该方法和/或该装置在具体应用中的使用。

[0030] 术语“非均质的培养基”在本申请中应该理解为其最广的意思。具体而言，非均质的培养基可以包括在其中微生物悬浮生长的清澈培养基。

[0031] 从现有技术，法国专利申请FR2555316已为人们所熟知。该专利申请涉及用于确定流体介质粘度的方法和装置，该方法包括：将传导珠浸没在流体介质中，施加给小珠一个基本上以其为中心的旋转磁场，使得与旋转的小珠接触的流体的流动保持薄片状，以及确定与由于流体介质的粘度而施加到小珠上的力偶相关的大小。因此，投入粘滞介质的小珠承受与粘度成比例的制动减速力矩，并呈现速度恒定的旋转，该旋转持续的时间也与待分析介质的粘度成比例。借助于沿着其旋转轴的激光束照亮小珠而获得的衍射盘 de diffraction)来使小珠的旋转可视化。

[0032] 但是，这样的方法仅仅适合在均质粘滞介质中实施。然而，细菌培养基是乳白、浑浊而不透明的。因此，该方法不能够确定生物膜在培养基中形成与否。

[0033] 在日本专利申请JP61161436的摘要中也提供了基于磁吸引原理用于测量非牛顿流体粘度的一种方法。该方法包括：通过测定磁棒在磁场作用下的位移和位移速度来测量粘度。

[0034] 在日本(专利申请)摘要中提供的方法可以确定与粘滞流体相关的特征例如粘度。但是，其中提及的方法无论用任何方式都不能够再现微生物的行为例如细菌在粘滞流体中的生长。

发明内容

[0035] 因此，本发明的目的在于提供一种能够模拟生物膜在非均质、浑浊和不透明的介质(对应于微生物在其中生长以形成这样的生物膜的培养基)中生长的方法和装置。

[0036] 本发明的另一目的在于可以模拟微生物在表面定植的过程。

[0037] 本发明的又一目的在于允许证明在非均质介质中粘度的不同，从而允许根据生物膜在每一区域的生长，模拟不同区域的培养基。

[0038] 本发明的目的还在于提供一种实施简单、不很繁琐并且能够自动化检测生物膜生长的方法和装置。

[0039] 为此，本发明属于上述类型，并且在其最广泛的意义上是值得注意的。

[0040] 由此，本发明的目的在于一种能够测量微生物5的培养基粘度的方法，依次包括以下步骤：

[0041] a)将至少一种带电、磁性的或可磁化颗粒或者覆盖至少一层磁性层或可磁化层的颗粒浸没在前述的培养介质中，

[0042] b)将前述的培养介质置于电场、磁场或电磁场中，优选磁场，以便使颗粒运动，[0043] c)光学检测前述颗粒在前述培养介质中运动的自由度，优选通过光学测量，前述方法不使用扫描显微镜。

[0044] 步骤b)包括将前述培养介质置于电场或磁场或电磁场中，可选地通过脉冲施加，或者置于逐渐增加的电磁场或变化更加复杂的电磁场或不同场的组合中。

[0045] 根据本发明的特殊结构，通过沿直线或者正弦曲线的轨迹接近磁体或者根据具有或者不具有可变振荡幅度和可变频率的振荡运动，获得电磁场的逐渐增强。电磁场更复杂的变化通过前述培养介质附近磁棒的旋转或不同运动的组合来获得。

[0046] 电场、磁场或电磁场有利地由产生运动的场的装置来产生。

[0047] 有利地，该培养介质以恒流(flux constant)或者在给定时间间隔以不连续流流过开放的反应器。而后者的构造优选在其可以具有与生物膜生长的自然条件相适合的范围内。

[0048] 根据本发明，其中涉及的颗粒可以是带电颗粒，或者磁性颗粒，或者覆盖至少一层磁性层的颗粒，或者可磁化颗粒或覆盖一层可磁化层的颗粒。

[0049] 有利地，前述磁性颗粒可以具有与产生生物膜的微生物的大小基本上一致的大小。

[0050] 同样有利地，可以使用不同大小和/或(同样有利地)不同颜色的颗粒。在生物膜生长过程中，较小颗粒在较大颗粒之前固定。因此可以更精确地将生物膜的生长或其降解特征化。

[0051] 同样，根据本发明的有利构造，前述颗粒产生前述光学检测运动的设备可检测到的信号。前述信号可以以自动的方式(有利地通过放射)检测，或者通过以连续或不连续流传输的能量的再发射(有利地通过激光束的光能传输和荧光再发射)来检测。

[0052] 有利地，前述颗粒是荧光型、磷光型、放射性或者化学发光型。

[0053] 根据本发明的优选方式，步骤c)包括用光源照亮该颗粒以及检测前述颗粒在前述培养介质中的运动。

[0054] 为此，有利地，前述颗粒可以是荧光的。

[0055] 根据优选的构造，前述颗粒3构造成使得其在该反应器1中静止(无场)时处于稳定状态。有利地，该颗粒可以是例如冰球形状、平面不对称的几何形状，(...)的颗粒。

[0056] 另外，根据本发明的具体实施方式，前述方法还包括在对应于给前述培养介质接种的时间t＝0时根据前述方法测定前述培养介质的粘度以及在时间t时根据前述方法进行至少一次对前述培养介质粘度的测定，以及比较t0和t时的前述测定值。

[0057] 根据本发明的方法可以测量均质或非均质、优选非均质微生物培养介质的粘度。

[0058] 根据另一方面，本发明的目的在于提供可以实施如前述本发明方法的装置。

[0059] 由此，本发明的目的在于提供可以测量均质或非均质微生物培养介质粘度的装置，包括：

[0060] -至少一个培养介质反应器，用于容纳前述培养介质，以便检测生物膜的形成与生长，

[0061] -浸没在培养介质中的至少一种带电、磁性或可磁化或者覆盖至少一层磁性层或可磁化层的颗粒，

[0062] -用于产生电场、磁场或电磁场，优选为磁场的装置，前述场施加给前述颗粒，以便使其运动，

[0063] -用于光学检测前述颗粒运动的设备，扫描显微镜除外。

[0064] 术语“培养介质反应器”指至少一端封闭的容器如管子型、小孔(puit)，(...)(封闭反应器)，或者可以使前述培养介质流经的、两端开放的反应器(开放反应器)。

[0065] 根据本发明的第一构造，前述反应器具有一个封闭的端部以形成平底。

[0066] 为了在颗粒静止时，即不加任何场时，在管子底部具有稳定状态，前述反应器的底部可以具有一个或者多个孔穴或槽，用于容纳前述颗粒。

[0067] 根据本发明的第二构造，前述反应器具有一个封闭的端部以便形成半球形的底部。

[0068] 根据本发明的另一构造，反应器可以具有两个开放的端部。在该构造中，前述反应器可以构造成使得前述培养介质以稳定流或者在给定时间间隔的不连续流流动。

[0069] 有利地，其中涉及的该颗粒是带电颗粒(由于阴离子和/或阳离子的存在)，或者磁性颗粒，或者覆盖至少一层磁性层的颗粒，或者可磁化颗粒，或者覆盖至少一层可磁化层的颗粒。

[0070] 有利地，前述磁性颗粒的小大与产生生物膜的微生物的大小基本一致。

[0071] 有利地，可以使用不同大小和(同样有利地)不同颜色的颗粒。在生物膜生长过程中较小的颗粒在较大的颗粒之前固定不动。由此颗粒更准确地表征前述生物膜的生长或者其降解。

[0072] 同样，根据本发明的有利构造，前述颗粒产生由前述用于光学检测运动的设备可检测到的信号。有利地，前述颗粒是荧光型或磷光型或放射性或化学发光型的。

[0073] 关于前述用于光学检测运动的设备，其包括在前述颗粒的方向上发射的光源，以及可以检测前述颗粒在培养介质中的运动的光学检测装置。术语“光学检测装置”指任何可使用的检测装置。根据优选实施方式，其为宏观(macroscopiques)光学装置。根据本发明的具体方式，所述颗粒的运动可以直接用肉眼看到。

[0074] 在这个检测范围，被照亮的颗粒可以包括荧光颗粒或者黑色或至少不透光的颗粒。

[0075] 有利地，可以使用不同颜色、不同大小、不同密度、不同形状/几何状态、不同物理-化学构成、不同表面状态的颗粒，用于增加使生物膜生长表征的标准。

[0076] 有利地，待测试的化学基团(groupements)可以连接到颗粒表面，并且对前述化学基团(可移动颗粒)的抗附着性进行测试。

[0077] 有利地，允许表征某些种类微生物的分子能够连接到颗粒表面，并对前述种类的微生物(固定的颗粒)的附着性进行测试。

[0078] 前述颗粒可以直接构造成使其静止时在前述反应器的平底部保持在稳定的状态。有利地，所述颗粒可以是例如冰球状的、平面几何不对称、(...)的颗粒。

[0079] 有利地，前述装置还包括用于在给定时间间隔测量前述培养介质的装置以及可以将获得的测量值进行比较的装置。

[0080] 如此，可以测试由于定植的微生物或者在不同时间将微生物包围起来的胞外多糖或微生物分泌的基质的存在对该颗粒位移的阻碍。

附图说明

[0081] 通过以下结合附图对本发明实施例的纯粹解释性的说明，将更好地理解本发明，在附图中：

[0082] 图1示出对在具有半球形底部的管中生物膜的形成与生长进行检测的原理；

[0083] 图2表现对在具有半球形底部的管(或非平底管)中生物膜的形成与生长进行检测的原理(顶视图)。

[0084] 图3示出对平底管中生物膜的形成与生长进行检测的原理；

[0085] 图4示出对端部开放的管中生物膜的形成与生长进行检测的原理；

[0086] 图5表现对平底2管1型反应器1中的生物膜的形成与生长进行检测的原理的另一图例。

[0087] 图6表现图5中示出的本发明的一个变化例。

[0088] 图7表现如同图5所述的本发明的一个具体应用。

[0089] 图8表现在监视管道污染方面，尤其在监视阀污染方面本发明的一个具体应用。

具体实施方式

[0090] 用于检测生物膜在含有微生物的培养介质中形成与生长的一般原理如下。

[0091] 一种或多种带电、磁性、可磁化或者覆盖一层磁性层或可磁化层的颗粒或小珠置于培养介质中。颗粒的组成可以变化，只要其与电场、磁场或电磁场中的反应性相容。为了简化以下的描述，这些颗粒将仅被描述为小珠。

[0092] 可以发现，前述小珠逐渐结合到微生物分泌的基质中直到完全固定不动。

[0093] 在生物膜形成的生物过程中，微生物被固定和包围在该基质中。由此它们被隐藏、保护以免受外界介质侵袭，所观察到的对抗生素的抗性(医院内病理)来源于此。前述小珠可以模拟该固定过程。

[0094] 为了模拟该固定过程，将场发生器靠近前述小珠。由此，在生物膜未形成的介质中，小珠在前述发生器靠近时起反应并移动，通常朝场发生器移动，可选地根据前述发生器的运动来移动。另一方面，如果颗粒被包围在生物膜的基质中，它们的运动将根据生物膜形成的程度被抑制甚至阻止。

[0095] 因此，本发明的方法在于对小珠行为的利用，该小珠能够在电场、磁场、电磁场的作用下运动。如果这些小珠的行为被构成生物膜的基质的存在而阻碍，这样就有可能检测它们的活动程度(活动的、半活动的、固定的)并使之可视化，由此可以使生物膜的生长可视化。

[0096] 前述的方法还可以区分能够在场作用下运动的小珠以及因存在微生物分泌的基质而运动受阻的小珠。

[0097] 通过由直接照亮或者间接照亮的光学测量对小珠在生物膜中的运动进行检测，在后一情况中，所使用的小珠有利地是荧光的。

[0098] 根据所选小珠的形式(几何形状、大小、密度)，细菌体将被或多或少准确地模拟，并且用新的标准可表征生物膜的发展(1’évolution)。

[0099] 作为场发生器的表现频率的函数和作为场力的函数，构成生物膜的基质的动态生长可以进行追踪。同样，生物膜一旦构成，其降解可以在特殊处理作用下进行追踪。

[0100] 由此有可能通过生化试验分析前述基质的构成。

[0101] 同样，用类推的方法，通过构成生物膜的基质追踪小珠的固定过程，也可以追踪细菌包埋在其分泌的基质中的过程。

[0102] 为了测试生物膜在管底的生长，使用密度足够大的颗粒进行检测以便在管底形成沉淀。相反，使用密度不很大的颗粒以便漂浮在培养基的表面来进行检测，从而可以研究生物膜在表面(气/液界面)的生长。

[0103] 此外，通过利用颗粒密度，可以在固/液、液/液、液/气界面上进行一系列检测。

[0104] 检测可以使用不同大小的颗粒，这些颗粒还可以用例如不同颜色加以区分。

[0105] 现将该方法的一些具体实施例描述如下。在这些实施例中，所描述的微生物是细菌。应该理解，对于其生物膜的生长待研究的任何微生物，以下说明均可适用。然而，如果希望模拟微生物在形成的生物膜中的行为，有利地使小珠的大小适合于所研究微生物的大小。

[0106] 图1至8示出检测在不同几何形状的管中生物膜生长的原理，该管容纳含有待研究细菌的培养介质。

[0107] 图1和2具体示出检测在具有半球形底部2的管1型反应器1中生物膜形成与生长的原理。图1是剖视图，图2是顶视图。

[0108] 举例而言，实验可以在具有96个200μl容量管(或孔)的板上进行。在本实施例中，小珠3置于每管1的底部。应该理解，该方法不是必须限于单一小珠。然后将培养基4加入到每一管1中，接着在标准化培养条件(温度、给氧、pH)下对该培养基接种能够形成生物膜6的细菌菌株5。

[0109] 置于在管1之下、更具体地置于小珠3之下的磁体7以规则的时间间隔移动，以便沿着前述管1的壁规则地上升。

[0110] 当小珠3在其运动中未遇到障碍或者在细菌5分泌的构成生物膜6的基质中未被充分阻碍时，小珠跟随前述磁体7的运动(图1b和1c或图2b和2c)。当磁体远离，小珠不再受到其磁场作用而能够回到其最初的位置。相反，当生物膜的形成使得小珠3的运动受阻碍甚至被阻止，该小珠3在管1的底部保持不动(图1d或2d)。由此这个状态可以表示在管1中构成生物膜6的细胞外基质的发展(或生长)，使得该基质以其包围细菌5的相同的方式包围小珠1。

[0111] 在本实施例中，操作磁体以便沿着前述管1的壁移动小珠3。然而，有利地可以在小珠3的方向上操作磁体或者相反地，朝磁体操作管，以便根据除前述管1的壁之外的另一轨迹移动小珠3。

[0112] 有利地，光学设备能够自动将前述小珠的自由度可视化(未示出)。前述设备包括沿前述小珠3的方向发射的光源以及能够检测小珠3在培养介质4中的运动的检测装置。

[0113] 当管3是透明时，光源置于前述管1之下以便直接向磁珠3发出光束。然后将检测装置置于前述管3的上面。于是，跟随对应于小珠3的黑点的运动对小珠3的运动进行检测。

[0114] 当管1为不透明材料，例如由金属制成，光源置于前述管的上面，以便透过培养介质4朝磁珠3发射光束。与前面相同，前述检测装置置于前述管的上面。在这个构造中，前述小珠3有利地由荧光材料制成。由此，当前述小珠3经光源照亮，跟随对应于小珠3的荧光点的运动，通过前述检测装置检测它们的运动。

[0115] 图3示出本发明一个具体实施例的变化例：检测在具有平底2的管1型反应器1中生物膜6的生长。

[0116] 有利地，管1的底部2设置有两个相邻的孔穴8，9。最初，将小珠3置于孔穴8的其中一个内。然后将磁体7设置成与另一个孔穴9接触。当小珠3在其运动中未被生物膜6阻碍时，它从孔穴8滑到相邻的孔穴9(图3b)。接着将磁体7移到第一个孔穴8的下面(图3c)。当其运动尚未被阻止或者至少尚未被充分阻碍时，在磁体7的吸引作用下，小珠
3滑向前述第一个孔穴8。在固定的时间间隔重复试验直到观察到如图3d示出的小珠完全或者部分固定：当磁体7移动到第二个孔穴9下面时，粘滞在生物膜中的小珠3由于其运动在生物膜6中被阻碍，对磁体7的吸引作用不再起反应，不再能够穿入第二个孔穴9内。

[0117] 在一个变化例中，管底不具有用于容纳磁珠的孔穴。为此，前述磁珠构造成使其自身能够在所述管1的底部保持稳定状态。

[0118] 图4示出本发明的另一具体实施方式，使用具有开放端部10，11的管1型反应器。于是将管1构造成使得允许培养基5连续流动。

[0119] 正如在平底管的实施例中，前述管1的壁13的内表面12有利地具有孔穴8，9，以便容纳前述小珠3。根据前述相同的原理，磁体7表现为使小珠3运动使其从一个孔穴运动到另一个孔穴。

[0120] 在所述管1的壁13的内表面12没有形成任何孔穴的情况下，其原理类似于半球形底部管的原理，磁体7被呈现并移动，使所述小珠3在管1壁13的内表面12上升高。

[0121] 根据本发明的具体构造，包在生物膜6中的小珠随后可以通过浸没到培养介质中的磁体回收。这样，提取生物膜的一部分用于物理表征(基质的粘度等)、化学和生化表征(基质的构成成分等)和生物表征(在潜伏、活动、死体等状态下构成基质的微生物)的试验。

[0122] 图5是检测生物膜在具有平底2的管1型反应器1中生物膜形成与生长原理的另一图解。该图解是从管的顶部(看)的平面视图。

[0123] 将小珠3置于在每一管1的底部。然后将培养基4加入到每一管中(图5a)，接着在标准化的培养条件下(温度、给氧、pH...)用能形成生物膜6的细菌菌株5对该培养基接种。

[0124] 在固定的时间间隔，磁体7置于在管1下面(图5b和5e)。当小珠在其运动中未遇到障碍或者未被细菌5分泌并构成生物膜6的基质充分阻碍时，它们在磁体7的方向受吸引(图5b)。围绕磁体7受吸引的小珠3游离出“无小珠”区或者“空旷区”，该区容易检测、尤其是易于可视化检测。当生物膜6的形成使得小珠3的运动被阻碍甚至被阻止时，这些小珠3在管1的底部保持不动(图5d和5e)。于是这个状态表示在管1中构成生物膜6的细胞外基质的发展，使得该基质以与包围细菌5的相同的方式包围磁珠。

[0125] 图6示出图5中示出的本发明的变化例。

[0126] 对含有液体培养基4的培养皿1接种细菌5，不同大小的磁珠3和3′置于每一培养皿1中(图7)。培养条件标准化(温度、给氧、pH...)以便允许细菌的生长以及由此的生物膜6的生长。

[0127] 在固定的时间间隔将磁珠置于培养皿1之下。当小珠3在其运动中未遇到障碍或者在细菌5分泌的构成生物膜6的基质中未被充分阻碍，磁珠3在磁体7的方向上被吸引。在磁场线9影响区的外界和小珠聚集体15之间形成空旷区14。当生物膜的形成使得小珠
3的运动被阻碍甚至被阻止，这些小珠在培养皿1中保持不动。然而，由于小珠大小不同，小珠的移动是其大小和生物膜密度的函数。随着生物膜的生长，较小小珠的移动首先被生物膜抑制，随着生物膜的补充性生长，较大的小珠也停止移动。

[0128] 图7示出如在图5或图6中所述的本发明的具体应用，小珠放置在覆盖含抗微生物制剂(例如去污剂)的制品表面上。该表面可以由任何材料制成，特别是由金属制成。当磁体靠近该表面时，小珠被磁体的磁力线吸引，于是构成一个比该表面的其余部分更密集的小珠密集区。当希望测定应用于金属表面的防污制品的有效性时，这一应用是有利的。

[0129] 在本具体实施例中，例如通过在待测试的表面之下旋转磁棒而使磁场强度发生改变可能更有意义。

[0130] 图8示出本发明在监测管道污染特别是在监测阀污染中的具体应用。

[0131] 为了模拟生物膜在置于液流的载体(管道1)上的生长，有可能使用具有束缚在管17凸出部分的环16的装置。可磁化的颗粒4装入环2的一处。该环在磁场作用下可以转动(图8b或8c)。

[0132] 如果生物膜在该装置中生长，环的运动将受阻碍。

[0133] 前述装置对阀，即管道中生物膜最易形成的位置进行模拟。

[0134] 本发明通过实施例的方式描述如上。应该理解，在不背离本发明的保护范围的情况下，本领域技术人员能够实现本发明的不同变化例。

标题	发布/更新时间	阅读量
生物膜制备方法-专利编号CN106587356A	2020-05-13	680
生物膜阻抗材料-专利编号CN102869424A	2020-05-13	333
用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置-专利编号CN1934435B	2020-05-12	918
生物膜控制-专利编号CN101478878A	2020-05-11	864
用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置-专利编号CN1934435A	2020-05-12	900
一种生物膜-专利编号CN107662974A	2020-05-11	1014
星型尖型生物膜-专利编号CN107648681A	2020-05-13	732
生物膜治疗-专利编号CN103357014A	2020-05-11	119
预防生物膜形成、减少现有生物膜和减少细菌群的方法和组合物-专利编号CN101001635A	2020-05-11	852
生物膜治疗-专利编号CN101842097A	2020-05-12	962

用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置

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