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低泡发酵方法

阅读：582发布：2021-02-23

IPRDB可以提供低泡发酵方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及在包含发酵培养基的发酵池中从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的方法，该方法包括：将该可易于发酵的糖材料进料到包含发酵有机体浆料的发酵池中；将该可浆料易于发酵的糖材料发酵成希望的发酵产物，其中S8A蛋白酶在将该可易于发酵的糖材料进料到发酵池期间或之后添加，或在将该可易于发酵的糖材料发酵成希望的发酵产物期间添加。本发明还涉及在发酵该可易于发酵的糖材料期间，S8A蛋白酶用于减少由发酵有机体在发酵孔中产生发泡的用途。，下面是低泡发酵方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的一种方法，该方法包括：i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的该发酵池中；

ii)将该可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

其中在以下时刻添加高温球菌属物种S8A蛋白酶

a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或

b)在步骤ii)中的发酵期间。

2.如权利要求1所述的方法，其中该可易于发酵的糖材料选自下组，该组由以下组成：甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜高粱、甜菜、及其混合物。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中该发酵有机体是酵母，如发泡酵母，例如来自酵母属的菌株，如来自酿酒酵母的菌株，尤其是来自当发酵时产生泡沫的酿酒酵母的菌株。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该高温球菌属物种S8A蛋白酶是嗜热高温球菌蛋白酶，或是高温球菌属物种PK蛋白酶。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该S8A蛋白酶选自下组，该组由以下组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少

85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少

95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(c)(a)、或(b)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该S8A蛋白酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:9的成熟多肽或由其组成。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸或SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该可易于发酵的糖材料底物不包含多糖，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。

10.当从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时，高温球菌属物种S8A蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。

11.如权利要求10中所述的用途，其中该高温球菌属物种S8A蛋白酶选自下组，该组由以下组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少

85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(c)(a)、或(b)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

12.如权利要求10-11中任一项所述的用途，其中该高温球菌属物种S8A蛋白酶与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少

92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

13.如权利要求10-12中任一项所述的用途，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的107至

424位氨基酸或SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸。

14.如权利要求10所述的用途，其中该S8A蛋白酶是嗜热高温球菌蛋白酶，或是高温球菌属物种PK蛋白酶。

说明书全文

低泡发酵方法

发明领域

[0001] 本发明涉及减少用于从可易于发酵的糖材料生产发酵产物、例如乙醇的发酵工艺中的发泡。

[0002] 对序列表的引用

[0003] 本申请含有一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。

[0004] 发明背景

[0005] 可以从各式各样的可再生的原料生产发酵产物，例如乙醇。这些可以分为三大类：(1)可易于发酵的糖材料，如甘蔗(即甘蔗汁和糖蜜)，甜菜，甜高粱；(2)淀粉质材料，如玉米、马铃薯、稻、小麦、龙舌兰；和(3)纤维素材料，例如秸秆、草、玉米棒、木材和甘蔗渣。可易于发酵的糖材料包含可以容易地被酵母发酵的单糖，例如蔗糖、葡萄糖和果糖。

[0006] 可易于发酵的糖材料，例如甘蔗汁和糖蜜，被用作例如巴西乙醇生产中的底物。酵母，例如尤其是酿酒酵母，被用作发酵有机体。通常使用酵母再循环系统，其中高达90％-95％的酵母被从一个发酵循环再用于下一个发酵循环。这导致发酵池内非常高的细胞密度(例如8％w/v-17％w/v，湿量基准)并且导致非常短的发酵时间。在约32℃，在6-11小时的时段内，达到8-11％(v/v)的乙醇浓度。在每批分批发酵后，通过离心收集酵母细胞，酸洗(例如，用pH 1.5-3.0的硫酸洗1小时到2小时)并送回发酵池。现今，在每一循环后，在酸洗期间按固定剂量添加化学消泡剂(分散剂)，并且将另一种化学消泡剂(止泡剂)直接自动地(当泡沫达到料位探测器时)或手动地添加至发酵池，直至完全控制泡沫。

[0007] US 3,959,175披露了包含液体聚丁烯的水性消泡剂组合物。消泡剂组合物可以进一步包括部分地疏水性二氧化硅和硅酮油。

[0008] US 5,288,789披露了已经被聚烷氧基化的烷基酚和醛的缩合物用来减少发酵液中的泡沫的用途。

[0009] US 6,083,998涉及用于醇发酵的消泡剂组合物，该组合物是水基的并且包括聚二甲基硅氧烷油、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物和硅酮/二氧化硅掺合物。

[0010] 当从可易于发酵的糖材料，例如甘蔗汁和糖蜜生产乙醇时，由发酵有机体产生的泡沫是严重问题。

[0011] 即使可以使用化学消泡剂，但是仍希望并且需要提供用于生产发酵产物，例如乙醇的工艺，在这些工艺中泡沫产生是被减少/控制的。

[0012] WO 2014/205198披露了来自强烈火球菌的蛋白酶，其可以减少由发酵有机体在从可易于发酵的糖材料(例如甘蔗糖蜜中)生产发酵产物(例如尤其是乙醇)的发酵过程中产生的泡沫。

[0013] 本发明提供了与来自强烈火球菌的蛋白酶相比，在泡沫减少方面表现出更好的性能的S8A蛋白酶，所述来自强烈火球菌的蛋白酶是一种细胞内酶并且对于在发酵方法中使用而言是昂贵的。

发明内容

[0014] 当从可易于发酵的糖材料，例如甘蔗汁和糖蜜生产发酵产物，尤其例如是乙醇时，由发酵有机体产生的泡沫是严重问题。因此，本发明的目标是当从可易于发酵的糖材料，例如甘蔗糖蜜生产发酵产物，尤其例如是乙醇时，减少在发酵期间由发酵有机体产生的泡沫。诸位发明人令人惊讶地发现高温球菌属(Thermococcus)物种S8A蛋白酶可以用于有效地解决发泡问题。

[0015] 本发明的第一个方面涉及在包含发酵培养基的发酵池中使用发酵有机体从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

[0016] i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的该发酵池中；

[0017] ii)将该可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

[0018] 其中在以下时刻添加高温球菌属物种S8A蛋白酶

[0019] a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或

[0020] b)在步骤ii)中的发酵期间。

[0021] 在第二个方面，本发明涉及使用高温球菌属物种S8A蛋白酶，用于减少发酵有机体从可易于发酵的糖材料生产希望的发酵产物时产生的泡沫。

[0022] 定义

[0023] S8A蛋白酶：术语“S8A蛋白酶”意指属于A.枯草杆菌蛋白酶亚家族EC 3.4.21.62的S8蛋白酶，是S8A亚家族中的子组，然而，本发明的来自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)或高温球菌属物种PK的S8A蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶，其尚未包含在IUBMB分类系统中。根据本发明的S8A蛋白酶水解底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA。对硝基苯胺(pNA)的释放导致在405nm处的吸光度增加，并且与酶活性成比例。最适pH＝pH 8，并且最适温度＝60℃。

[0024] 在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。在另一个方面中，S8A蛋白具有SEQ ID NO:9的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。

[0025] 在一个实施例中，蛋白酶活性可以通过本文披露的并且如实例6和8中举例说明的Suc-AAPF-pNA动力学分析来确定。

[0026] 片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。一方面，片段含有至少314个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的111至424位氨基酸，特别是SEQ ID NO:2的110至424位氨基酸，更特别是109至424位氨基酸，更特别是108至424位氨基酸，甚至更特别是107至
424位氨基酸)。在另一个实施例中，片段含有至少315个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:9的
111至425位氨基酸，特别是SEQ ID NO:9的110至425位氨基酸，更特别是109至425位氨基酸，更特别是108至425位氨基酸，甚至更特别是107至425位氨基酸)。

[0027] 成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸。SEQ ID NO:2的1至25位氨基酸是信号肽。26至106位氨基酸是前肽。在另一个方面中，成熟多肽来自SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸，特别是来自108至425位氨基酸，且更特别来自109至425位氨基酸。SEQ ID NO:9的1至25位氨基酸是信号肽。26至106位氨基酸，特别是26至107位氨基酸，且更特别是26至108位氨基酸是前肽。本领域已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。如实例部分所示，通过纯化蛋白酶的MS-EDMAN数据确认N-末端。

[0028] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的319至1272位核苷酸，76至318位核苷酸编码前肽，且SEQ ID NO:1的1至75位核苷酸编码信号肽。在另一个方面中，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的319至1275位核苷酸、或322至1275位核苷酸、或325至1275位核苷酸，76至318位核苷酸、或76至321位核苷酸、或76至324位核苷酸编码前肽，且SEQ ID NO:8的1至75位核苷酸编码信号肽。

[0029] 序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

[0030] 出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.)48：443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16：276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比同一性并且如下计算：

[0031] (同一的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

[0032] 出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比同一性并且如下计算：

[0033] (同一的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-在比对中的空位总数)

[0034] 严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

[0035] 术语“低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

[0036] 术语“中严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

[0037] 术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

[0038] 术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

[0039] 术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

[0040] 子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。

[0041] 变体：术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。在描述变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

[0042] 取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

[0043] 缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

[0044] 插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。将多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入氨基酸#1、插入氨基酸#2等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

[0045] 在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

[0046]亲本：变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A

[0047] 多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

[0048] 不同改变。在可以在某一位置引入不同的改变的情况下，所述不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指定以下变体：

[0049] “Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

[0050] 发明详细说明

[0051] 本发明的目标是当从可易于发酵的糖材料，尤其例如是甘蔗糖蜜生产希望的发酵产物，尤其例如是乙醇时，减少在发酵期间由发酵有机体，尤其是发泡酵母，例如是酵母属的酵母，具体地是酿酒酵母产生的发泡。在一个优选的实施例中，本发明涉及巴西型乙醇发酵方法，例如，如Basso等在(2011)“乙醇生产在巴西：工业过程及其对酵母发酵，生物燃料生产的影响-近期发展和展望，Marco Aurelio Dos Santos Bernardes博士(编辑)，ISBN：978-953-307-478-8，InTech.”描述的。总体上巴西乙醇方法包括再循环发酵有机体，尤其是发泡发酵酵母，例如酿酒酵母，并且是作为一个分批方法或进料分批方法进行的。然而，一些工厂进行半连续的或连续的发酵工艺。

[0052] 诸位发明人已经发现在本发明的过程中添加高温球菌属物种S8A蛋白酶的多个令人惊讶的优点。

[0053] 在WO 2014/205198中披露了来自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的丝氨酸蛋白酶，在从可易于发酵的糖材料(例如甘蔗糖蜜中)生产乙醇时，其可以有效地替代用于减少发泡的化学物质。然而，由于细胞内表达，PfuS是一种难以表达的蛋白酶，所以需要替代性蛋白酶。

[0054] 因此，本发明的第一方面涉及使用发酵有机体在包含发酵培养基的发酵池中由可易于发酵的糖材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

[0055] i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的该发酵池中；

[0056] ii)将该可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

[0057] 其中在以下时刻添加高温球菌属物种S8A蛋白酶

[0058] a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或

[0059] b)在步骤ii)中的发酵期间。

[0060] 根据本发明，术语“可易于发酵的糖材料”是指待转化/发酵为希望的发酵产物，尤其例如是乙醇的含糖起始材料，该含糖起始材料是属于包含可以容易地被发酵有机体，尤其例如是源自酿酒酵母的酵母菌株发酵的单糖，例如蔗糖、葡萄糖和果糖的一类。

[0061] 根据本发明，术语“发酵池”是指并且包括在其中进行发酵的任何类型的发酵池、发酵容器、发酵罐、或发酵器皿、或类似物。

[0062] 根据本发明，可以同时或相继地进行步骤i)和ii)。发酵可以在25℃至40℃，例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、优选约32℃的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行2小时至120小时，特别是4小时至96小时。在一个实施例中，发酵可以进行小于24小时、例如小于12小时、例如在6和12小时之间。

[0063] 与含淀粉原料(例如玉米、小麦、黑麦、蜀黍、高粱等)和纤维素原料(例如玉米芯、玉米秸秆、甘蔗渣、麦秸、木头等)相反，不需要发酵前的预处理和/或(预先)水解。在一个优选实施例中，可易于发酵的糖材料选自下组，该组由以下组成：甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜高粱、甜菜、及其混合物。然而，根据本发明，发酵培养基还可以进一步包括甘蔗的其他副产物，具体地是来自甘蔗渣的水解产物。在一个实施例中，发酵培养基可以包括单独的流，其包含例如C5-液等。根据本发明，可易于发酵的糖材料(底物)不包含基本含量的多糖，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素。

[0064] 在一个优选实施例中，用于本发明的方法的发酵有机体可以是发泡发酵有机体，该发泡发酵有机体能够将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，尤其例如是乙醇。现今商业上使用(例如在巴西)的很多商业酵母菌株，尤其包括酿酒酵母的菌株，例如用于从甘蔗糖蜜生产乙醇，在发酵期间产生泡沫。在一个实施例中，该发酵有机体是酵母，例如来自酵母属的菌株，例如酿酒酵母的菌株。因此，在一个优选实施例中，发酵有机体是发泡发酵有机体，例如酵母属的发泡菌株，尤其例如是在发酵期间产生泡沫的酿酒酵母的菌株。
根据本发明，发酵培养基中的酵母的密度是高的，例如是从8％w/v-17％w/v(发酵培养基的湿量基准)。在一个实施例中，在非无菌条件下发生发酵，例如，还可以将具有发泡表型的野生酵母菌株引入发酵池，并且并入酵母群体。

[0065] 在本发明的一个优选实施例中，在步骤ii)中的发酵之后，将发酵有机体再循环。根据本发明，将从50％-100％、例如70％-95％、例如约90％的发酵有机体再循环。在步骤ii)中的发酵之后，收集发酵有机体，例如酵母，酸洗，并且再循环至发酵池。然后用硫酸来酸洗发酵有机体，例如，在pH1.5-3.0，如2.0-2.5下，酸洗例如1-2小时。可以作为一个分批发酵或进料分批发酵进行本发明的方法。然而，还作为半连续的或连续的过程来进行本发明的方法。

[0066] 术语“发酵产物”和“希望的发酵产物”是指通过使用发酵有机体的发酵生产的产物。根据本发明所涵盖的发酵产物包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸类(例如谷氨酸)；气体类(例如H2和CO2)；抗生素类(例如青霉素和四环素)；酶类；维生素类(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；及激素类。

[0067] 在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，可饮用的酒精；或工业乙醇，或用于可消费醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、奶制品工业(例如发酵的奶制品)、皮革工业及烟草工业中所使用的产品。根据本发明，优选发酵产物是乙醇。根据本发明获得的希望的发酵产物，例如乙醇，优选可以用作燃料，例如用于车辆，例如汽车。燃料乙醇可以与汽油掺合。乙醇它还可以用作可饮用乙醇。

[0068] 在步骤ii)中的发酵之后，可以例如通过蒸馏，或另一分离技术，从发酵培养基分离希望的发酵产物，例如乙醇。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物。

[0069] 在一个实施例中，将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池中。考虑了可以在进料可易于发酵的糖材料之前或期间添加高温球菌属S8A蛋白酶。因此在一个实施例中，将高温球菌属物种S8A蛋白酶与可易于发酵的糖材料的进料流混合。在另一个实施例中，在进料步骤i)之前将高温球菌属物种S8A蛋白酶与可易于发酵的糖材料的进料流混合。

[0070] 本发明方法的具体实施方式：

[0071] 在本发明方法的一个实施例中，希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，所述方法包括在进料前将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加到可易于发酵的糖材料中；将含有蛋白酶的可易于发酵的糖材料添加到包含发酵有机体浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵成所需的发酵产物。

[0072] 在本发明方法的另一个实施例中，乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批、进料分批、半连续或连续发酵方法生产，包括在进料之前向甘油糖蜜中添加蛋白酶；将含有高温球菌属物种S8A蛋白酶的甘蔗糖蜜添加到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；并且将甘蔗糖蜜发酵成乙醇。

[0073] 在本发明方法的另一个实施例中，希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，其中所述方法包括：向包含发酵有机体浆料的发酵池中进料可易于发酵的糖材料；在发酵前将高温球菌属物种S8A蛋白酶进料到包含可易于发酵的糖和发酵有机体的发酵池中；将可易于发酵的糖物质发酵成所需的发酵产物。

[0074] 在本发明方法的另一个实施例中，乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批或进料分批发酵方法生产，其中所述方法包括：将甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；在发酵前将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加到包含酿酒酵母浆料和甘蔗糖蜜的发酵池中；
将甘蔗糖蜜发酵成乙醇。

[0075] 在本发明方法的另一个实施例中，希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，其中所述方法包括：向包含发酵有机体浆料的发酵池中进料可易于发酵的糖材料；在将可易于发酵的糖材料发酵成所需的发酵产物的过程中将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加到发酵池中。

[0076] 在本发明方法的另一个实施例中，乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批、进料分批、半连续或连续发酵方法生产，其中所述方法包括：将甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；在将甘蔗糖蜜发酵成乙醇的过程中向发酵池中添加高温球菌属物种S8A蛋白酶。

[0077] 本发明的一个具体的实施例涉及使用发酵有机体在包含发酵培养基的发酵池中由可易于发酵的糖材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

[0078] i)将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的发酵池中；

[0079] ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

[0080] 其中通过将进料流引入该发酵池来完成该可易于发酵的糖材料的进料；其中[0081] 在步骤i)之前，将高温球菌属物种S8A蛋白酶与该进料流混合；或

[0082] 在进料后，将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加至发酵池中。

[0083] 在本发明的一个最具体的实施例中，高温球菌属物种S8A蛋白酶是S8A嗜热高温球菌蛋白酶，特别是如SEQ ID NO:2披露的蛋白酶，更特别地是SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸。在本发明的另一个具体的实施例中，高温球菌属物种S8A蛋白酶是S8A高温球菌属物种PK蛋白酶，特别是如SEQ ID NO:9披露的蛋白酶，更特别地是SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸。

[0084] 在另一个方面，本发明还涉及当从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时，高温球菌属物种S8A蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。

[0085] 如以上限定，本发明的方法包括添加S8A蛋白酶。在一个实施例中，本披露涉及S8A高温球菌属物种蛋白酶，它是S8A嗜热高温球菌蛋白酶或是S8A高温球菌属PK蛋白酶。根据本发明的一个实施例，可以例如按从0.2至25mg酶蛋白(EP)/L发酵培养基的剂量添加蛋白酶。

[0086] 在一个实施例中，可以按从0.01-100ppm EP(酶蛋白)蛋白酶、例如0.1-50ppm、例如1-25ppm的剂量添加蛋白酶。

[0087] 在一个实施例中，蛋白酶可以是唯一添加的酶(即不添加其他酶)。

[0088] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、或者并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

[0089] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少75％的蛋白酶活性。

[0090] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少80％的蛋白酶活性。

[0091] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少85％的蛋白酶活性。

[0092] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少90％的蛋白酶活性。

[0093] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少95％的蛋白酶活性。

[0094] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少96％的蛋白酶活性。

[0095] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少97％的蛋白酶活性。

[0096] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少98％的蛋白酶活性。

[0097] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
2的成熟多肽的至少99％的蛋白酶活性。

[0098] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的多肽的成熟部分具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

[0099] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少75％的蛋白酶活性。

[0100] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少80％的蛋白酶活性。

[0101] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少85％的蛋白酶活性。

[0102] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少90％的蛋白酶活性。

[0103] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少95％的蛋白酶活性。

[0104] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少96％的蛋白酶活性。

[0105] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少97％的蛋白酶活性。

[0106] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少98％的蛋白酶活性。

[0107] 在一个实施例中，该S8A高温球菌属物种蛋白酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:
9的成熟多肽的至少99％的蛋白酶活性。

[0108] 该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域融合在另一种多肽区域的N-末端或C-末端。

[0109] 该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于一个或多个相同启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

[0110] 融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割而释放所述两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-576；斯维特娜(Svetina)等人，
2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76：245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63：3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13：498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术
9：378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25：505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13：982-987；卡特(Carter)等人，
1989，蛋白质(Proteins)：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6：240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4：35-48。

[0111] 具有蛋白酶活性的多肽的来源

[0112] 可以从高温球菌属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。

[0113] 在另一个方面，该多肽是嗜热高温球菌多肽。在另一个方面，该多肽是高温球菌属物种PK多肽。

[0114] 这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

[0115] 可使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域已知的。然后可通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可通过利用本领域普通技术人员所知的技术(参见，例如Sambrook等人，1989，见上文)分离或克隆多核苷酸。

[0116] 其他酶

[0117] 在一个实施例中，可以与选自下组的一种或多种酶一起(同时地)添加S8A蛋白酶，该组由以下组成：纤维素酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、氧化酶、过氧化酶、过氧化氢酶、漆酶、β-葡糖苷酶、甘露聚糖酶、其他糖酶。

[0118] 在一个实施例中，在其他酶之前和/或之后添加S8A蛋白酶。

[0119] 与不存在蛋白酶或不添加蛋白酶的相应方法相比，根据本发明的方法，添加S8A蛋白酶导致增加的产量，例如乙醇产量。本发明的方法还减少了在发酵培养基中存在的残余糖。然而，最重要地是，与不添加S8A蛋白酶的相应方法相比，发酵池中的发泡得以减少。

[0120] 根据本发明，可以与蛋白酶一起添加α-淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加α-淀粉酶。α-淀粉酶可以是微生物来源的，例如真菌的或细菌的来源的。在一个实施例中，α-淀粉酶是真菌来源的。

[0121] 优选地，酸性真菌α-淀粉酶源自曲霉属，具体是土曲霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、或白曲霉的菌株；或者源自毛霉属，优选地微小根毛霉的菌株；或亚灰树花菌属，优选地大型亚灰树花菌的菌株。

[0122] 在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选的是菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3中的一种，例如具有黑曲霉连接子和淀粉结合域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于在此的SEQ ID NO:6中的一种，或其变体。

[0123] 在一个实施例中，该α-淀粉酶选自下组，该组由以下组成：

[0124] (i)一种α-淀粉酶，包括在此的SEQ ID NO:6的多肽；

[0125] (ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

[0126] 在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是具有至少一个以下取代或取代组合的SEQ ID NO:6中所示的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R+V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:6进行编号)。

[0127] 在一个实施例中，α-淀粉酶衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛酶，优选如本文披露的SEQ ID NO:6，优选具有一个或多个以下取代：G128D、D143N、优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:6进行编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:6的多肽具有至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。

[0128] 在另一实施例中，α-淀粉酶可以是细菌来源的。在一个优选实施例中，细菌α-淀粉酶可以源自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌物种的菌株或其变体。α-淀粉酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，例如在此的SEQ ID NO:5中示出的α-淀粉酶的成熟部分，或成熟α-淀粉酶，或与在此的SEQ ID NO:5具有至少60％、例如70％、例如80％同一性、例如至少90％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少
99％同一性的相应成熟α-淀粉酶。在一个实施例中，成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、或其变体被截短，优选至具有约485-496个氨基酸，例如约491个氨基酸。α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO 99/19467中SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶可为分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

[0129] 芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂合体：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,
576和6,297,038中，并且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，该变体具有在位置R179至G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO 96/23873中的双缺失-参见例如第20页，第1-10行，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。在优选的实施例中，该α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比较)。优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有与在WO 99/
19467中披露的SEQ ID NO:3中所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于位置181和182的缺失的双缺失，并且还包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/
19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239的位置处具有取代。在优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：

[0130] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

[0131] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

[0132] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及[0133] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文披露的SEQ ID NO:5进行编号)。

[0134] 在本发明的另一个实施例中，可以与蛋白酶一起添加葡糖淀粉酶，或在发酵期间存在和/或添加葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以是微生物来源的，例如，葡糖淀粉酶可以是真菌来源的。

[0135] 在一个实施例中，葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或来自木霉属的菌株，优选里氏木霉；或来自篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或来自栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；或来自密孔菌属的菌株；或来自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或来自黑层孔属的菌株。

[0136] 在一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自篮状菌属，如埃默森篮状菌的菌株，例如WO 99/28448中披露的菌株。

[0137] 在一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自密孔菌属的菌株，特别是描述于WO 2011/066576中的血红密孔菌的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，如示为WO 2011/066576中的SEQ ID NO:4的菌株。

[0138] 在一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如在WO 2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。

[0139] 在一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自黑栓菌属的菌株，具体是披露于WO 2006/069289中的瓣环栓菌的菌株。

[0140] 在一个实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。

[0141] 市售的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER，SANTM EXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYMETM ULTRA，SPIRIZYMETM EXCEL和AMGTM E(来自诺维信A/S)；OPTIDEXTM 300，GC480，GC417(来自杜邦)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990ZR(来自杜邦)。

[0142] 在本发明方法的一个实施例中，希望的发酵产物，例如尤其是乙醇，通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，所述方法包括在进料前将蛋白酶添加到可易于发酵的糖材料中；将含有蛋白酶的可易于发酵的糖材料进料到包含发酵有机体浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵成所需的发酵产物。

[0143] 在一个优选的实施例中，乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批、进料分批发酵方法生产，包括在进料之前向甘油糖蜜中添加蛋白酶；将含有蛋白酶的甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；并且将甘蔗糖蜜发酵成乙醇。

[0144] 在另一个实施例中，希望的发酵产物，例如尤其是乙醇，通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，其中所述方法包括：向包含发酵有机体浆料的发酵池中进料可易于发酵的糖材料；在发酵前将蛋白酶进料到包含可易于发酵的糖和发酵有机体浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖物质发酵成所需的发酵产物。

[0145] 在一个优选的实施例中，乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批或进料分批发酵方法生产，其中所述方法包括：将甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；在发酵前将蛋白酶添加到包含酿酒酵母浆料和甘蔗糖蜜的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵成乙醇。

[0146] 在本发明的另一个实施例中，希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，其中所述方法包括：向包含发酵有机体浆料的发酵池中进料可易于发酵的糖材料；在将可易于发酵的糖材料发酵成所需的发酵产物时将蛋白酶添加到发酵池中。

[0147] 在一个优选的实施例中，乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批、或进料分批发酵的方法生产，其中所述方法包括：将甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；在将甘蔗糖蜜发酵成乙醇的过程中向发酵池中添加蛋白酶。

[0148] 在一个优选的特定实施例中，本发明的方法包括：

[0149] i)将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的发酵池中；

[0150] ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

[0151] 其中通过将进料流引入该发酵池来完成该可易于发酵的糖材料的进料；其中，[0152] -在步骤i)之前，将S8A蛋白酶与该进料流混合；或

[0153] -在进料后，将S8A蛋白酶添加至发酵池中。

[0154] 在一个优选的实施例中，S8A蛋白酶是S8A高温球菌属物种蛋白酶，优选地是S8A嗜热高温球菌蛋白酶，或是S8A高温球菌属物种PK蛋白酶。

[0155] 使用发泡发酵有机体，例如发泡酵母，例如酵母属的发泡菌株，例如酿酒酵母的发泡菌株，来进行发酵。

[0156] 蛋白酶用于泡沫减少的用途

[0157] 在这个方面本发明涉及使用S8A蛋白酶，用于减少发酵有机体从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时产生的泡沫。在一个优选实施例中，根据本发明的方法生产希望的发酵产物。

[0158] 本发明通过以下编号的段落来进一步描述：

[0159] 段落[1].使用发酵有机体，在包含发酵培养基的发酵池中，从可易于发酵的糖材料生产发酵产物的一种方法，该方法包括：

[0160] i)将该可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的该发酵池中；

[0161] ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

[0162] 其中在以下时刻添加高温球菌属物种S8A蛋白酶

[0163] a)在步骤i)中的进料之前、期间和/或之后，和/或

[0164] b)在步骤ii)中的发酵期间。

[0165] 段落[2].如段落1所述的方法，其中将可易于发酵的糖材料作为进料流而进料至发酵池中。

[0166] 段落[3].如段落2所述的方法，其中将该高温球菌属物种S8A蛋白酶与可易于发酵的糖材料的进料流混合。

[0167] 段落[4].如段落1-3中任一项所述的方法，其中在进料步骤i)之前，将该高温球菌属物种S8A蛋白酶与该可易于发酵的糖材料的进料流混合。

[0168] 段落[5].如段落1-4中任一项所述的方法，其中该可易于发酵的糖材料选自下组，该组由以下组成：甘蔗汁、甘蔗糖蜜、甜高粱、甜菜、及其混合物。

[0169] 段落[6].如段落1-5中任一项所述的方法，其中该发酵有机体是酵母，如发泡酵母，例如来自酵母属的菌株，如来自酿酒酵母的菌株，尤其是来自当发酵时产生泡沫的酿酒酵母的菌株。

[0170] 段落[7].如段落1-6中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中的发酵之后，将发酵有机体再循环。

[0171] 段落[8].如段落1-7段中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中的发酵之后，收集该发酵有机体，例如发泡酵母，酸洗，并且再循环至该发酵池。

[0172] 段落[9].如段落1-8段中任一项所述的方法，其中该高温球菌属物种S8A蛋白酶是S8A嗜热高温球菌蛋白酶，或是S8A高温球菌属物种PK蛋白酶。

[0173] 段落[10].如段落1-9中任一项所述的方法，其中所述S8A蛋白酶选自下组，该组由以下组成：

[0174] a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

[0175] b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；或[0176] c)(a)、或(b)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

[0177] 段落[11].段落1-10中任一项所述的方法，其中该S8A蛋白酶与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

[0178] 段落[12].如段落1-11中任一项所述的方法，其中该S8A蛋白酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:9的成熟多肽或由其组成。

[0179] 段落[13].如段落1-12中任一项所述的方法，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸或SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸。

[0180] 段落[14].如段落1-13中任一项所述的工艺，其中可易于发酵的糖材料底物并不包含多糖，例如淀粉和/或纤维素/半纤维素。

[0181] 段落[15].根据前述段落中任一项所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。

[0182] 段落[16].如段落1-15中任一项所述的方法，其中希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，所述方法包括在进料前将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加到可易于发酵的糖材料中；将含有蛋白酶的可易于发酵的糖材料进料到包含发酵有机体浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖材料发酵成所需的发酵产物。

[0183] 段落[17].如段落1-15中任一项所述的方法，其中乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批、进料分批、半连续或连续发酵方法生产，包括在进料之前向甘油糖蜜中添加蛋白酶；将含有高温球菌属物种S8A蛋白酶的甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；并且将甘蔗糖蜜发酵成乙醇。

[0184] 段落[18].如段落1-15中任一项所述的方法，其中希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，其中所述方法包括：向包含发酵有机体浆料的发酵池中进料可易于发酵的糖材料；在发酵前将高温球菌属物种S8A蛋白酶进料到包含可易于发酵的糖和发酵有机体的浆料的发酵池中；将可易于发酵的糖物质发酵成所需的发酵产物。

[0185] 段落[19].如段落1-15中任一项所述的方法，其中乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批或进料分批发酵方法生产，其中所述方法包括：将甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；在发酵前将高温球菌属物种S8A蛋白酶进料到包含酿酒酵母浆料和甘蔗糖蜜的发酵池中；将甘蔗糖蜜发酵成乙醇。

[0186] 段落[20].如段落1-15中任一项所述的方法，其中希望的发酵产物通过在发酵池中发酵可易于发酵的糖材料产生，其中所述步骤包括：向包含发酵有机体浆料的发酵池中进料可易于发酵的糖材料；在将可易于发酵的糖材料发酵成所需的发酵产物时将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加到发酵池中。

[0187] 段落[21].如段落1-15中任一项所述的方法，其中乙醇在包含甘蔗糖蜜的发酵池中以分批、进料分批、半连续或连续发酵方法生产，其中所述方法包括：将甘蔗糖蜜进料到包含酿酒酵母浆料的发酵池中；在将甘蔗糖蜜发酵成乙醇的过程中向发酵池中添加高温球菌属物种S8A蛋白酶。

[0188] 段落[22].如段落1-21中任一项所述的方法，该方法包括：

[0189] i)将可易于发酵的糖材料进料至包含发酵有机体浆料的发酵池中；

[0190] ii)将可易于发酵的糖材料发酵为希望的发酵产物，

[0191] 其中通过将进料流引入该发酵池来完成该可易于发酵的糖材料的进料；其中[0192] 在步骤i)之前，将高温球菌属物种S8A蛋白酶与该进料流混合；或

[0193] 在进料后，将高温球菌属物种S8A蛋白酶添加至发酵池中。

[0194] 段落[23].如段落22段中所述的方法，其中S8A蛋白酶是S8A嗜热高温球菌蛋白酶，或是S8A高温球菌属物种PK蛋白酶。

[0195] 段落[24].当从可易于发酵的糖生产希望的发酵产物时，高温球菌属物种S8A蛋白酶用于减少由发酵有机体产生的泡沫的用途。

[0196] 段落[25].如段落24所述的用途，其中所述高温球菌属物种S8A蛋白酶选自下组，该组由以下组成：

[0197] a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

[0198] b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

[0199] c)(a)、或(b)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

[0200] 段落[26].如段落24-25中任一项所述的用途，其中高温球菌属物种S8A蛋白酶与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

[0201] 段落[27].如段落24-26中任一项所述的用途，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸或SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸。

[0202] 段落[28].如段落24段所述的用途，其中该S8A蛋白酶是嗜热高温球菌蛋白酶，或是高温球菌属物种PK蛋白酶。

[0203] 在下面的实例中进一步详细描述本发明，这些实例用于说明本发明。

[0204] 实例

[0205] 菌株

[0206] 高温球菌属2319x1菌株是从位于国后岛(南千岛群岛，俄罗斯远东地区)的Goryachiy海角附近潮汐带的温泉中分离出来的。

[0207] 酶

[0208] 蛋白酶Pfu：源自强烈火球菌的蛋白酶，示于在此的SEQ ID NO:7中。

[0209] 酵母：来自Fermentis，美国的ETHANOL REDTM

[0210] 测定

[0211] 蛋白酶测定

[0212] 1)动力学Suc-AAPF-pNA测定：

[0213] pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。

[0214] 温度：室温(25℃)

[0215] 测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、
8.0、9.0、10.0、和11.0。

[0216] 将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。

[0217] 2)端点Suc-AAPF-pNA AK测定：

[0218] pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。

[0219] 温度：受控的(测定温度)。

[0220] 测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 7.0。

[0221] 将200μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用测定缓冲液稀释45倍)用移液管移至Eppendorf管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将Eppendorf管转移至设定为测定温度的Eppendorf恒温混匀仪中来启动测定。将管在Eppendorf恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过转移管返回至冰浴并添加600μl 500mM琥珀酸/NaOH(pH 3.5)来停止孵育。通过涡旋混合Eppendorf管后，将200μl混合物转移至微量滴定板中。读取OD405作为蛋白酶活性的量度。在测定中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

[0222] 在下面的实例中进一步详细描述本发明，这些实例用于说明本发明。

[0223] 实例1：高温球菌属2319x1的分离

[0224] 该有机体是从位于国后岛(南千岛群岛，俄罗斯远东地区)的Goryachiy海角附近潮汐带的温泉中分离出来的。在含有作为碳源的桦木木聚糖(Sigma)、作为电子受体的无定形Fe(III)氧化物(水铁矿)的Hungate管中获得原位富集，其中填充有来自同一个泉的砂和热水样品，在温度和pH分别在76℃到99℃和5.0到7.0波动范围内孵育6天。通过在含有水铁矿的改良的芬尼格培养基上进行4次随后的转移，从该富集物中分离菌株2319x1(Slobodkin A.I.，Reysenbach A.-L.，Strutz N.，Dreier M.，Wiegel J.1997.Thermoterrabacterium ferrireducens gen.nov.,sp.Nov.，是一种来自大陆温泉的嗜热厌氧异化Fe(III)还原菌，Int.J.Syst.Bacteriol.V.47.P.541-547)，该培养基含有
1g/L桦木木聚糖、0.05g/L酵母提取物、0.12g/L Na2S*9H2O、9g/L NaCl和2g/L MgCl2*6H2O，pH 6.8-7.0，在90℃孵育；在最终的转移中，用元素硫取代水铁矿用作为电子受体。在85℃，pH 6.9-7.0，0.9％(m/v)NaCl和10g/L元素硫中，分离菌株生长最佳。其中，明胶是为了支持该菌株的生长。在明胶上生长期间的细胞产率为1.5x 108个细胞/mL。在明胶培养的全细胞悬液中，在该培养物的无细胞上清液中以及用Tween 80冲洗的细胞表面蛋白部分中，通过酶谱检测对明胶有活性的一种或多种蛋白酶。在所有组分中，检测到分子量>100kDa的活性条带，在全细胞悬浮液和培养上清液中还检测到两种不同的分子量较低的条带，这表明蛋白酶复合物可能具有多聚体结构。根据完整的16S rRNA基因序列，分离菌株2319x1属于嗜热高温球菌物种(与模式菌株DSM 5473T(用除了未培养/环境16S rRNA序列外的标准参数进行NCBI blastn分析)具有99％的16S rRNA基因同一性)。

[0225] 实例2：来自高温球菌属2319x1的S8A蛋白酶的克隆与表达。

[0226] 基因

[0227] 使用高温球菌属S8A蛋白酶(SEQ ID NO:1)的内源基因作为模板，用于PCR扩增对应于高温球菌属S8A蛋白酶的预测肽(SEQ ID NO:2的26至424位氨基酸)的1200bp片段。将高温球菌属S8A蛋白酶的肽与代替天然分泌信号的Savinase蛋白酶分泌信号(具有如SEQ ID NO:4披露的以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)融合。所表达的DNA序列是SEQ ID NO:3。

[0228] 表达克隆

[0229] 编码预测的高温球菌属S8蛋白酶成熟肽的1200bp片段通过PCR进行扩增，并与调节元件和同源区融域合以重组到枯草芽孢杆菌基因组中。线性整合构建体是SOE-PCR融合产物(霍顿(Horton)，R.M.，亨特(Hunt)，H.D.，胡(Ho)，S.N.，皮伦(Pullen)，J.K.以及皮斯(Pease)，L.R.(1989)，不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接的工程化杂种基因(Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes,gene splicing by overlap extension)基因(Gene)77:61-68))，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。SOE PCR方法也描述于专利申请WO 2003095658中。

[0230] 在三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金杆菌cryIIIA启动子组成。用Savinase分泌信号(编码以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)代替天然分泌信号来表达该基因。该SOE-PCR产物被转化进枯草芽孢杆菌中并且在染色体上通过同源重组将其整合到果胶酸裂解酶位点中。随后将包含该整合表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开，并用于在本文披露的SEQ ID NO:2酶的纯化。

[0231] 实例3：从SEQ ID NO:2的嗜热高温球菌纯化S8A蛋白酶

[0232] 将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25Sephadex柱(来自通用电气医疗集团)上的10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中，并将G25转移酶应用于在10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中平衡的Q Sepharose FF柱(来自通用电气医疗集团)。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、1.0M NaCl、pH 9.0之间的线性梯度经五个柱体积洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA动力学测定)，并且将主要活性峰池化。来自Q Sepharose柱的池用去离子水稀释8倍，并用20％CH3COOH将稀释池的pH调节至pH 6.0。将调节池施加至在100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2、pH 6.0中平衡的枯草菌素琼脂糖柱(来自Upfront层析公司)上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将蛋白酶用100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2、1.0M NaCl、pH 6.0+25％(v/v)异丙醇进行洗脱。将洗脱峰转移至G25Sephadex柱(来自通用电气医疗集团)上的10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中，并将缓冲转移酶加至在10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中平衡的SOURCE Q柱(来自通用电气医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、1.0M NaCl、pH 9.0之间的线性梯度经五个柱体积洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA动力学测定法)，并且通过SDS-PAGE对活性级分进行分析。将在考马斯染色的凝胶上仅一条带的部分合并，并且用0.5M HCl将pH调节至pH 7.0。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且用于进一步表征。如SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸所示的多肽显示出如下所示的蛋白酶活性。

[0233] 实例4：来自高温球菌属物种PK的S8A蛋白酶的克隆与表达。

[0234] 基因

[0235] 高温球菌属物种PK S8A蛋白酶在枯草芽孢杆菌中由合成基因表达。合成基因序列是基于如本文中SEQ ID NO:9公开的NCBI参考序列WP_042702525.1的肽序列设计的并且优化用于在枯草芽孢杆菌中表达的密码子。将高温球菌属物种PK S8A蛋白酶的肽用代替天然分泌信号的Savinase蛋白酶分泌信号(具有如SEQ ID NO:4披露的以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)一起表达。所表达的DNA序列是SEQ ID NO:10。

[0236] 表达克隆

[0237] 对应于预测的高温球菌属S8A蛋白酶成熟肽的1200bp片段由含有合成基因的标准克隆载体进行PCR扩增。将PCR引物设计为具有与线性化载体末端互补的15bp延伸(5')。将ClaI限制性酶切位点并入正向引物的5'延伸部分并且将MluI限制性酶切位点并入反向引物的5'延伸部分以便于使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)，将该片段直接克隆到表达载体ExpVec8中。将表达载体Expvec8用相同的限制酶(ClaI和MluI)消化。根据IN-FUSIONTM克隆试剂盒说明进行克隆方案。根据生产商的方案将处理的质粒和插入物转化进One TOP10F'化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州，美国)中。将插入物整合到载体中，并且通过对分离的质粒进行测序来验证插入物的核苷酸序列。
将没有PCR错误的代表性质粒表达克隆转化到枯草芽孢杆菌中。将包含该整合的表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开，并用于在本文披露的SEQ ID NO:9酶的纯化。

[0238] 实例5：纯化来自高温球菌属物种PK的S8A蛋白酶(SEQ ID NO:9)

[0239] 将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25Sephadex柱(来自通用电气医疗集团)上的10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中，并将G25转移酶应用于在10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中平衡的Q Sepharose FF柱(来自通用电气医疗集团)。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、1.0M NaCl、pH 9.0之间的线性梯度经五个柱体积洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA动力学测定)，并且将主要活性峰池化。将来自Q Sepharose柱的池用去离子水稀释8倍，并用20％CH3COOH将稀释池的pH调节至pH 6.0。将调节池施加至在100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2、pH 6.0中平衡的枯草菌素琼脂糖柱(来自Upfront层析公司)上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将蛋白酶用100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2、1.0M NaCl、pH 6.0+25％(v/v)异丙醇进行洗脱。将洗脱峰转移至G25Sephadex柱(来自通用电气医疗集团)上的10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中，并将缓冲转移酶加至在10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 9.0中平衡的SOURCE Q柱(来自通用电气医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM Tris/HCl、1mM CaCl2、1.0M NaCl、pH 9.0之间的线性梯度经五个柱体积洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA动力学测定法)，并且通过SDS-PAGE对活性级分进行分析。将在考马斯染色的凝胶上仅一条带的部分合并，并且用0.5M HCl将pH调节至pH 7.0。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且用于进一步表征。SEQ ID NO:9的成熟多肽用于如下文实例7所示测试蛋白酶活性。

[0240] 实例6：表征来自嗜热高温球菌的S8A蛋白酶(SEQ ID NO:2)

[0241] 使用动力学Suc-AAPF-pNA测定来获得来自高温球菌属物种的S8A蛋白酶的pH活性曲线和pH稳定性曲线。对于pH稳定性曲线，将蛋白酶在不同的测定缓冲液中稀释10倍以达到这些缓冲液的pH值，然后在37℃孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 8.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至pH 8.0，之后对残余活性进行测定。使用端点Suc-AAPF-pNA测定以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。

[0242] 结果示于下表1-3中。对于表1，活性是相对于酶的最佳pH而言。对于表2，活性是相对于样品的残余活性，将这些样品保持在稳定条件(5℃，pH 8.0)下。对于表3，活性相对于酶在pH 7.0下的最佳温度。

[0243] 表1：pH-活性曲线

[0244]

[0245]

[0246] 表2：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)

[0247]

[0248] 表3：在pH 7.0下的温度活性曲线

[0249]

[0250]

[0251] 实例7：成熟多肽的N-末端的确定

[0252] 基于EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据，将成熟序列确定为SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸。

[0253] 来自这一成熟序列的计算的分子量是32966.1Da。

[0254] 如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量约是Mr＝37kDa。

[0255] 通过完整分子量分析所确定的分子量是32965.4Da。

[0256] 实例8：表征来自高温球菌属物种PK的S8A蛋白酶(SEQ ID NO:9)

[0257] 使用Suc-AAPF-pNA动力学测定来获得来自高温球菌属物种PK的S8A蛋白酶的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10倍以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 8.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至pH 8.0，之后对残余活性进行测定。使用端点Suc-AAPF-pNA测定以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。

[0258] 结果示于下表4-6中。对于表4，活性是相对于酶的最佳pH而言。对于表5，活性是相对于样品的残余活性，将这些样品保持在稳定条件(5℃，pH 8.0)下。对于表6，活性相对于酶在pH 7.0下的最佳温度。

[0259] 表4：pH-活性曲线

[0260]

[0261]

[0262] 表5：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)

[0263]

[0264] 表6：在pH 7.0下的温度活性曲线

[0265]

[0266]

[0267] 来自高温球菌属物种PK的S8蛋白酶(SEQ ID NO:9)的其他表征

[0268] 抑制剂：PMSF。

[0269] 如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量约是Mr＝37kDa。

[0270] 通过对PMSF处理的样品的完整分子量分析确定的观察到的分子量为33089.2Da。PMSF为质量增加了154.2Da，因此观察到的蛋白酶部分的质量为32935.0Da。

[0271] 成熟多肽序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸。

[0272] 来自这一成熟序列的计算的分子量是32934.9Da。

[0273] 实例9：S8A嗜热高温球菌蛋白酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)和PfuS蛋白酶(SEQ ID NO:7)在甘蔗糖蜜发酵中的泡沫控制之间的比较

[0274] 酿酒酵母原种培养物在含有YPD培养基(1％酵母提取物，2％细菌蛋白胨，2％右旋糖)的摇瓶中生长。过夜生长后，添加20％(v/v)甘油并将1mL等分试样储存在-80℃。将原种培养物用于制备用于发酵试验实验的预培养物。

[0275] 发酵汁制备

[0276] 通过稀释甘蔗糖蜜(可商购)制备用于发酵实验的汁以获得足以供给每管的量。每天进行，将剩余的稀释糖蜜丢弃。

[0277] 发酵试验

[0278] 将酵母细胞铺在YPD-琼脂培养基上并在30℃孵育48小时。将单细胞分离物转移至5mL液体YPD中，并在30℃孵育过夜。将全部内容物转移至稀释至补充有5g/L酵母提取物的
10％(w/v)总糖(蔗糖、葡萄糖和果糖表示为己糖含量)的无菌糖蜜培养基中，并在30℃孵育
48小时。通过离心(4000rpm，10分钟)收集酵母生物质用于发酵试验。

[0279] 发酵试验在32℃下在50mL离心小瓶(TPP)中进行，尽可能模拟在巴西进行的工业发酵过程。将含20°糖蜜含糖量(Brix)的发酵底物(由稀糖蜜组成)进料至酵母浆料中。酵母浆料代表总发酵体积的30％，类似于工业条件。发酵后，通过离心(4000rpm，10分钟)收集酵母细胞，称重，用发酵汁和水稀释(至酵母湿重的35％w/v)，并用硫酸(pH从2.5开始处理1小时)并在随后的发酵循环中重新使用，包括8个发酵循环。在每一条件下，一式三份运行样品。

[0280] 生物量的测定

[0281] 在样品的离心(4000rpm持续10min)后，通过重量分析法确定湿重生物质。

[0282] 泡沫测量

[0283] S8A蛋白酶(SEQ ID NO:2的107至424位氨基酸)是一种酸性蛋白酶，评估它是否能承受甘蔗糖蜜发酵的条件。将甘蔗糖蜜发酵期间用于泡沫控制的嗜热高温球菌S8A蛋白酶的性能与Pfus蛋白酶进行比较。

[0284] 根据材料和方法部分，在8个发酵循环中进行发酵实验。每个循环代表如下的一次轮换1)酵母浆料制备(35％w/w)，使用发酵汁和水(1:1)；2)经1h、在室温下添加H2SO4至pH 2.5；3)并用稀释的糖蜜(20°糖蜜含糖量)进料以达到10％(w/w)的细胞密度，然后在32℃下孵育7小时到9小时。从第二个循环开始，添加5ppm(mg/L)的酶(在进料糖蜜时)。表7列出了添加的酶的数据。在研究期间，在7个发酵周期过程中添加酶。

[0285] 表7：在甘蔗糖蜜发酵中测试蛋白酶的泡沫控制。

[0286]

[0287] 通过记录管中的泡沫高度和/或通过代表性管的拍照，在每个循环进料后，每小时进行泡沫登记。

[0288] 泡沫高度的计算是通过将管中的总体积(泡沫+液体)除以液体体积来完成的。通常，在巴西进行发酵时，将总池体积的30％作为泡沫形成的顶部空间。只有当泡沫到达容器的顶部时，才添加消泡剂。因此，保持泡沫在这个阈限值下被认为是该行业的泡沫控制。在我们的实验室测定中，100％泡沫体积表明泡沫与发酵液在同一水平或无泡沫形成。为了表明泡沫的形成，如工业中所做的那样，在实验室规模测定中泡沫应该高于143％。

[0289] 从结果看，S8A蛋白酶显示出与PfuS相似的性能。泡沫测量产生以下数据，如表8所示。

[0290] 表8：以泡沫高度(％)测量的泡沫控制。

[0291]

[0292]

[0293] 实例10：比较S8A高温球菌属物种PK蛋白酶(SEQ ID NO:9的成熟多肽)和Mg Prot III(SEQ ID NO:11)在甘蔗糖蜜发酵的发泡控制

[0294] 酿酒酵母原种培养物在含有YPD培养基(1％酵母提取物，2％细菌蛋白胨，2％右旋糖)的摇瓶中生长。过夜生长后，添加20％(v/v)甘油并将1mL等分试样储存在-80℃。将原种培养物用于制备用于发酵试验实验的预培养物。

[0295] 发酵汁制备

[0296] 通过稀释甘蔗糖蜜(可商购)制备用于发酵实验的汁以获得足以供给每管的量。每天进行，将剩余的稀释糖蜜丢弃。

[0297] 发酵试验

[0298] 将酵母细胞铺在YPD-琼脂培养基上并在30℃孵育48小时。将单细胞分离物转移至5mL液体YPD中，并在30℃孵育过夜。将全部内容物转移至稀释至补充有5g/L酵母提取物的
10％(w/v)总糖(蔗糖、葡萄糖和果糖表示为己糖含量)的无菌糖蜜培养基中，并在30℃孵育
48小时。通过离心(4000rpm，10分钟)收集酵母生物质用于发酵试验。

[0299] 发酵试验在32℃下在50mL离心小瓶(TPP)中进行，尽可能模拟在巴西进行的工业发酵过程。将含20°糖蜜含糖量的发酵底物(由稀糖蜜组成)进料至酵母浆料中。酵母浆料代表总发酵体积的30％，类似于工业条件。发酵后，通过离心(4000rpm，10分钟)收集酵母细胞，称重，用发酵汁和水稀释(至酵母湿重的35％w/v)，并用硫酸(pH从2.5开始处理1小时)并在随后的发酵循环中重新使用，包括8个发酵循环。在每一条件下，一式三份运行样品。

[0300] 生物量的测定

[0301] 在样品的离心(4000rpm持续10min)后，通过重量分析法确定湿重生物质。

[0302] 泡沫测量

[0303] S8A蛋白酶(SEQ ID NO:9的107至425位氨基酸)是一种酸性蛋白酶，评估它是否能承受甘蔗糖蜜发酵的条件。将高温球菌属物种PK S8A蛋白酶在甘蔗糖蜜发酵过程中的泡沫控制性能与以前在WO 2014/037438中披露的大型亚灰树花菌丝氨酸蛋白酶(Mg Prot III)进行比较，并且在本文中作为SEQ ID NO:11包含。

[0304] 根据材料和方法部分，在8个发酵循环中进行发酵实验。每个循环代表如下的一次轮换1)酵母浆料制备(35％w/w)，使用发酵汁和水(1:1)；2)经1h、在室温下添加H2SO4至pH 2.5；3)并用稀释的糖蜜(20°糖蜜含糖量)进料以达到10％(w/w)的细胞密度，然后在32℃下孵育7小时到9小时。从第二个循环开始，添加1ppm(mg/L)的酶(在进料糖蜜时)。表9列出了添加的酶的数据。在研究期间，在7个发酵周期过程中添加酶。

[0305] 表9：在甘蔗糖蜜发酵中测试蛋白酶的泡沫控制。

[0306]

[0307] 从第4个循环开始，通过记录管中的泡沫高度和/或通过代表性管的拍照，在每个循环进料后，每小时进行泡沫登记。

[0308] 泡沫高度的计算是通过将管中的总体积(泡沫+液体)除以液体体积来完成的。通常，在巴西进行发酵时，将总池体积的30％作为泡沫形成的顶部空间。只有当泡沫到达容器的顶部时，才添加消泡剂。因此，保持泡沫在这个阈限值下被认为是该行业的泡沫控制。在我们的实验室测定中，100％泡沫体积表明泡沫与发酵液在同一水平或无泡沫形成。为了表明泡沫的形成，如工业中所做的那样，在实验室规模测定中泡沫应该高于143％。

[0309] 从结果看，S8A蛋白酶显示出与Mg Prot III相似的性能。泡沫测量产生以下数据，如表10所示。

[0310] 表10：以泡沫高度(％)测量的泡沫控制。

[0311]

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