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具有协同效应延缓芽殖酵母和裂殖酵母细胞衰老的组合物

阅读：600发布：2021-02-22

IPRDB可以提供具有协同效应延缓芽殖酵母和裂殖酵母细胞衰老的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了具有协同效应延缓芽殖酵母细胞和裂殖酵母细胞衰老的组合物，包括多球壳菌素和雷帕霉素的协同作用下可以延缓芽殖酵母和裂殖酵母的衰老。，下面是具有协同效应延缓芽殖酵母和裂殖酵母细胞衰老的组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有协同效应延缓芽殖酵母和裂殖酵母细胞衰老的组合物，其特征在于，包括多球壳菌素和雷帕霉素。

2.根据权利要求1所述的具有协同效应延缓芽殖酵母细胞和裂殖酵母细胞衰老的组合物，其特征在于，包括45 ng/ml的多球壳菌素和450 pg/ml的雷帕霉素作为延缓芽殖酵母细胞衰老的协同组合。

3.根据权利要求1所述的具有协同效应延缓芽殖酵母细胞和裂殖酵母细胞衰老的组合物，其特征在于,包括60 ng/ml的多球壳菌素和45 ng/ml的雷帕霉素作为延缓裂殖酵母细胞衰老的协同组合。

说明书全文

具有协同效应延缓芽殖酵母和裂殖酵母细胞衰老的组合物

技术领域

[0001] 本发明属于生命科学技术领域，具体涉及利用分子间的协同效应可显著延缓芽殖酵母和裂殖酵母衰老的组合物及其应用方法。

背景技术

[0002] 多球壳菌素（2-氨基-3,4-二羟基-2-羟甲基l-14-氧-6-二十烯酸)，英文名: Myriocin，分子量为401.54，分子式C21H39NO6，易溶于甲醇，乙醇，DMSO，不溶于水和大多数有机溶剂，储存于-20℃，是昆虫病原真菌冬虫夏草的代谢物，又名ISP-1，同时具有免疫抑制和抗真菌两种特性，能潜在的调控哺乳动物免疫体系同时降低真菌感染风险，能预防和治疗多种疾病，包括Ⅱ型糖尿病，心血管疾病，代谢综合症等。多球壳菌素能够特异性抑制鞘脂合成第一步限速反应酶—丝氨酸棕榈转移酶 (SPT)的活性，降低鞘脂前体物鞘氨醇的生物合成，通过多球壳菌素处理降低鞘脂合成，能够影响一些寿命调控相关的信号通路如降低TORC1活性，激活MAPK, PKA等，改变胞内转录组，引起相关基因的上调和下调，进而影响一系列寿命相关的细胞过程包括增强压力抗性、基因组稳定性、线粒体功能、自噬及糖代谢等，最终延长芽殖酵母细胞的寿命。鞘脂作为一个重要的化学治疗药物靶点，在寿命调控中发挥着重要的作用，多球壳菌素能够特异性抑制鞘脂合成，延长芽殖酵母细胞生命，或许能够延长其他哺乳动物寿命，甚至人类寿命，降低衰老及衰老相关疾病的发生。

[0003] 雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，能够特异性抑制Tor的活性，延长酵母、线虫、果蝇及小鼠等的寿命。同时，雷帕霉素作为一种免疫抑制剂，对多种衰老相关疾病的发生发展具有疗效。目前美国FDA已批准Rapamycin及其多个结构类似物进入临床试验阶段，用于治疗衰老相关疾病（特别是一些恶性肿瘤等），是一种极具潜力的衰老相关疾病治疗药物。

[0004] 在过去的十几年里，酵母作为材料在衰老研究中发挥重要作用，其中芽殖酵母作为研究的先驱者对阐明衰老分子机制，理解细胞衰老，以及发现新的长寿基因十分有用，它已经被证明，无论是在研究复制寿命上还是时序寿命上，均是一个非常高效的模式生物，人们已经利用它发现了许多衰老相关机制（包括衰老相关基因及衰老相关的信号通路）。重要的是，这些基因被多次证明在多细胞真核生物中是保守的。裂殖酵母是最近新出现的一个用于衰老研究的十分有用的杆状单细胞真核生物，无论是形态学上还是遗传学上，均与现在普遍使用的芽殖酵母有很大的不同。相较于芽殖酵母，它有许多独特的优势。它与哺乳动物共享着一些在芽殖酵母中没有的细胞过程，包括RNAi干扰机制、核结构蛋白和染色质结合蛋白以及着丝粒结合蛋白、mRNA剪接机制、线粒体基因组对生存的需求。所以，裂殖酵母作为一个独特的模式系统可以用来发现新的长寿调控途径，同时兼具芽殖酵母的优点，如便捷的基因组修改和大批量的生长和分析。此外，在裂殖酵母中Wis4/Wis1/Sty1压力响应通路是依赖于mitogen-activated protein (MAP) kinases，这类似于哺乳动物压力响应激活MAP kinases p38 和 JNK。裂殖酵母与芽殖酵母亲缘关系较远，进化上更接近于人类，拥有许多与人类同源的基因，这为研究人类疾病和衰老的分子机制提供了一些优势。

发明内容

[0005] 本发明令人惊讶的发现多球壳菌素和雷帕霉素，当一起给予芽殖酵母或裂殖酵母时，其低浓度下分子间协同效应可显著延缓芽殖酵母和裂殖酵母的衰老。其使用浓度低，毒副作用小、成本低等优点，具有广阔的应用前景。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：多球壳菌素和雷帕霉素的协同作用下可以延缓芽殖酵母和裂殖酵母的衰老。

[0007] 多球壳菌素45 ng/ml与雷帕霉素450 pg/ml作为延缓芽殖酵母细胞衰老的最佳协同组合。

[0008] 多球壳菌素60 ng/ml与雷帕霉素45 ng/ml的作为延缓裂殖酵母细胞衰老的最佳协同组合。

[0009] 如图1所示，多球壳菌素45 ng/ml与雷帕霉素450 pg/ml作为最佳协同组合对芽殖酵母细胞寿命延长效果示意图。其中，○, 不加药物；△, 只加45 ng/ml 多球壳菌素；*,只加450 pg/ml 雷帕霉素；●, 同时添加45 ng/ml 多球壳菌素和450 pg/ml 雷帕霉素。

[0010] 如图2所示，多球壳菌素60 ng/ml与雷帕霉素45 ng/ml的作为最佳协同组合延缓裂殖酵母细胞细胞寿命延长效果示意图。其中，○, 不加药物；◇, 只加60 ng/ml 多球壳菌素；△,只加45 ng/ml 雷帕霉素；●, 同时添加60 ng/ml 多球壳菌素和45 ng/ml 雷帕霉素。

[0011] 芽殖酵母和裂殖酵母皆与人类拥有许多同源基因，因此以其为模型来作为研究人类疾病和衰老的分子机制具有广阔的应用前景。

[0012] 值得说明的是，多球壳菌素和雷帕霉素最佳协同组合的获得，包括以下过程：（1）多球壳菌素和雷帕霉素储液制备：
将多球壳菌素固体粉末5 mg，加入5 ml 95%的乙醇做溶剂，65℃恒温水浴加热3-5 min，使其充分溶解，得到 1 mg/ml的储液后，将得到的储液存放于-20℃保存，备用；
将雷帕霉素固体粉末5 mg，加入5 ml 95%的乙醇做溶剂，使其充分溶解，得到1 mg/ml的储液后，将得到的储液存放于-20℃保存，备用；
（2）细胞培养液制备：
从-80℃取出芽殖酵母，接种于YPD固体培养基上，30℃培养2-3天；挑取3-4个菌落于装有2.5 ml YPD液体培养基的带棉塞的大试管中培养过夜，得到饱和过夜培养液；
从-80℃取出裂殖酵母，接种于YES固体培养基上，30℃培养2-3天；挑取3-4个菌落于装有2.5 ml YES液体培养基的带棉塞的大试管中培养过夜，得到饱和过夜培养液；
制备用于培养芽殖酵母的一组培养液，包括多个盛有25mlYPD液体培养基的三角瓶，且每个三角瓶内分别加入多壳球菌素储液、雷帕霉素储液、不同组合比例的多壳球菌素储液和雷帕霉素储液混合液；
制备用于培养裂殖酵母细胞的另一组培养液，包括多个盛有25mlYES液体培养基的三角瓶，且每个三角瓶内分别加入多壳球菌素储液、雷帕霉素储液、不同组合比例的多壳球菌素储液和雷帕霉素储液混合液；
将芽殖酵母饱和过夜培养液分别适量加入上述盛有25mlYPD液体培养基的三角瓶中，保证起始浓度为1×105 cells/ml，即OD600=0.01；将裂殖酵母饱和过夜培养液分别适量加入上述盛有25mlYES液体培养基的三角瓶中，保证起始浓度为1×105 cells/ml，即OD600=
0.01；置于恒温振荡培养箱中，30℃，220 rpm培养，72h后开始检测存活率；
其中，OD600测试方法如下，在超净工作台中，取已灭菌EP管加入900 µl无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100 µl细胞培养液于900 µl无菌水中（即将培养液稀释10倍），用分光光度计测定稀释后的菌液OD600，得到的OD600值乘以相应的稀释倍数（即10倍）得到OD600；
（3）存活率检测：
首先，多球壳菌素和雷帕霉素单个药物梯度浓度下处理后能剂量依赖性地延缓芽殖酵母和裂殖酵母细胞衰老，经数据拟合后得出多球壳菌素和雷帕霉素作用于芽殖酵母的EC50分别为314.7 nM（125 ng/ml）和1.1 nM （1 ng/ml）；其作用于裂殖酵母的EC50分别为231.3 nM（93 ng/ml）和221.3 nM （241 ng/ml）。

[0013] 其次，多球壳菌素和雷帕霉素多个组合处理后能不同程度地调控细胞衰老，经数学模型（包括Chou-Talalay模型、Greco模型和Plummer模型）分析显示，多个多球壳菌素和雷帕霉素组合均能通过协同作用延缓两种细胞衰老；最后，通过寿命实验进一步证实多球壳菌素和雷帕霉素协同组合延缓细胞衰老并得出最佳协同效应组合。

[0014] 其中，寿命实验包括以下过程：取已灭菌EP管加入900 µl无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100 µl细胞培养液液于
900 µl无菌水中（即将培养液稀释10倍），用分光光度计测定稀释后的OD600，乘以稀释倍数即得到OD600；取0.5（即细胞数约为5×106）的OD600的菌液5 000 rpm离心3 min，用无菌水洗涤细胞一次后加入1 ml无菌水，加入1 mg/ml的Phloxin B储液，使其终浓度为5 µg/ml；于
30℃摇床避光温育2 h；用 1×PBS (137 mM NaCl；2.7 mM KCl；100 mM Na2HPO4；2 mM KH2PO4；pH 7.4) 洗涤细胞3次，然后将细胞混匀后用移液器吸取7 µl于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下（荧光显微镜型号OLYMPOS IX71）, 于绿色激发光下激发红色荧光，拍照，红色细胞为死细胞。同时在白色光场视野下拍照，白色光场下的细胞为总细胞数，包含死活细胞，统计死活细胞比例，计算出存活率。

[0015] 本发明组合物具备较好抑制芽殖酵母细胞和裂殖酵母细胞衰老的能力，浓度和毒性低，可用于抑制人体衰老有关的活体动物实验或临床实验。

附图说明

[0016] 图1为多球壳菌素45 ng/ml与雷帕霉素450 pg/ml作为最佳协同组合对芽殖酵母细胞寿命延长效果示意图。

[0017] 图2为多球壳菌素60 ng/ml与雷帕霉素45 ng/ml的作为最佳协同组合延缓裂殖酵母细胞细胞寿命延长效果示意图。

具体实施方式

[0018] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供具有协同效应延缓芽殖酵母细胞和裂殖酵母细胞衰老的组合物，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

[0019] 实施例1本实施例通过实验验证多球壳菌素和雷帕霉素协同用药对芽殖酵母细胞寿命的延长效应。

[0020] 本实施例所用的多球菌素为Sigma公司产品，雷帕霉素为LC Labs公司产品。

[0021] 实验过程如下：（a1）在YPD固体培养基上活化芽殖酵母细胞，30℃，培养3天；
（a2）将不同组合配比的多壳球菌素和雷帕霉素分别加入盛装有25 ml YPD液体培养基的多个三角瓶中，121℃，20 min灭菌待用；
（a3）经过3天培养后从YPD固体培养基上挑取芽殖酵母细胞的单克隆装入盛有10ml的YPD液体培养液中，30℃过夜培养制备过夜培养液，测定其OD600，将过夜培养液取一定体积加上述各盛装有25ml YPD液体培养基的三角瓶中，使得加入后起始OD600=0.01；
（a4）在超净工作台中，从上述各三角瓶中取出衰老细胞菌液20 µl于980 µl无菌水中，混匀后再从中取50 µl加入到950 µl无菌水中，涂10 μl菌液于YPD固体培养基上，可预先于平板上加90 μl无菌水，再将10 μl菌液加在里面，便于涂布平板，不同测定的时间点的菌液稀释倍数不同，以保证在平板上长出适量的菌落数（以菌落数100-300个为宜），将菌液稀释涂布平板以后，置于恒温培养箱中30℃，3天，待其长出菌落，统计其数量，将CLS Day 1的菌落数记为100%，将CLS Day 1（72 h）的菌落数记为100%，其它时间点的菌落数相较于CLS Day 1则可以计算出存活率；
（b5）各处理条件下CLS Day 5（168 h）的存活率如下表1所示。可看出，与单个药物处理相比，多球壳菌素和雷帕霉素协同组合处理大大降低了药物使用浓度，同时增强了药物效果。

[0022] 表1.多球壳菌素和雷帕霉素协同效应对芽殖酵母细胞寿命的延长作用由上表可知，雷帕霉素和多壳球菌素对芽殖酵母的寿命延长具有协同作用。

[0023] 在存活率相同的情况下，雷帕霉素和多壳球菌素协同作用下,雷帕霉素的用量和多壳球菌素的用量降低，减少毒副作用。

[0024] 实施例2本实施例通过实验验证多球壳菌素和雷帕霉素协同用药对裂殖酵母细胞寿命的延长效应。

[0025] 本实施例所用的多球菌素为Sigma公司产品，雷帕霉素为LC Labs公司产品。

[0026] 实验过程如下：（b1）在YES固体培养基上活化裂殖酵母细胞，30℃，培养3天；
（b2）将不同组合配比的多壳球菌素和雷帕霉素分别加入盛装有25 ml YPD液体培养基的多个三角瓶中，121℃，20 min灭菌待用；
（b3）经过3天培养后从YES固体培养基上挑取裂殖酵母细胞的单克隆装入盛有10ml的YES液体培养液中，30℃过夜培养制备过夜培养液，测定其OD600，将过夜培养液取一定体积加上述各盛装有25ml YES液体培养基的三角瓶中，使得加入后起始OD600=0.01；
（b4）在超净工作台中，从上述各三角瓶中取出衰老细胞菌液20 µl于980 µl无菌水中，混匀后再从中取50 µl加入到950 µl无菌水中，涂10 μl菌液于YPD固体培养基上，可预先于平板上加90 μl无菌水，再将10 μl菌液加在里面，便于涂布平板，不同测定的时间点的菌液稀释倍数不同，以保证在平板上长出适量的菌落数（以菌落数100-300个为宜），将菌液稀释涂布平板以后，置于恒温培养箱中30℃，3天，待其长出菌落，统计其数量，将CLS Day 1（48 h）的菌落数记为100%，其它时间点的菌落数相较于CLS Day 1则可以计算出存活率；
（b5）各处理条件下CLS Day 2.5（84 h）的存活率如下表2所示。可看出，与单个药物处理相比，多球壳菌素和雷帕霉素协同组合处理大大降低了药物使用浓度，同时增强了药物效果。

[0027] 表2.多球壳菌素和雷帕霉素协同效应对裂殖酵母细胞寿命的延长作用由上表可知，雷帕霉素和多壳球菌素对裂殖酵母的寿命延长具有协同作用。

[0028] 在存活率相同的情况下，雷帕霉素和多壳球菌素协同作用下,雷帕霉素的用量和多壳球菌素的用量降低，减少毒副作用。

[0029] 按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述结构设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。

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