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一种单宁酶的纯化方法

阅读：892发布：2020-05-13

IPRDB可以提供一种单宁酶的纯化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种单宁酶的纯化方法，纯化过程包括制备单宁酶粗酶液、沉淀和双水相萃取得到纯化单宁酶三个步骤。采用PEG1000/KH2PO4双水相体系萃取单宁酶，酶活回收率达到82.65％，纯化倍数为3.26倍。本发明的纯化方法操作条件温和、工艺简单、易于扩大化，具有良好的工业应用前景。，下面是一种单宁酶的纯化方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备单宁酶粗酶液；

(2)沉淀；

(3)双水相萃取得到纯化的单宁酶。

2.如权利要求1所述一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述制备单宁酶8

粗酶液的具体操作为：将浓度为1.5×10 个/mL无花果曲霉孢子悬液接种于固体发酵培养基，置于恒温下培养3～5天，再向培养基中加入8～10倍体积的乙酸-乙酸钠缓冲液，震荡后得到混合液，过滤，所得滤液即为单宁酶粗酶液。

3.如权利要求2所述一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述无花果曲霉孢子悬液接种量为7.5％(v/m)；所述恒温为25～30℃；所述震荡是置于温度28℃、转速180r/min下震荡90min；所述固体发酵培养基的配方为：在每100g麸皮中加入150mL盐溶液。

4.如权利要求3所述的一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述盐溶液由以下组分构成：单宁酶30g/L，NaNO35g/L，KCl 0.52g/L，MgSO40.52g/L，NaH2PO41.52g/L，蒸馏水补足至100％；所述盐溶液pH5.5。

5.如权利要求1所述一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述沉淀是将步骤(1)所得的单宁酶粗酶液冷冻至温度2～5℃，添加PEG20000的质量浓度为5％～20％，搅拌均匀，于温度2～5℃离心5～25min，取上清液，备用。

6.如权利要求5所述的一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述沉淀是将步骤(1)所得的单宁酶粗酶液于温度4℃冷冻30min后，添加PEG20000的质量浓度为5％～

20％，搅拌均匀，于温度4℃、10000×g下离心15min。

7.如权利要求5或6所述的一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述添加PEG20000质量浓度为10％。

8.如权利要求1所述一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述双水相萃取具体步骤为：向离心管中依次加入质量浓度为50％PEG1000水溶液，50％KH2PO4水溶液，单宁酶粗酶上清液和蒸馏水，构成双水相体系，于混匀器上震荡5min～10min，然后置于4℃、

3000×g下离心10min，收集双水相的上层液体，即得纯化的单宁酶。

9.如权利要求8所述的一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述双水相体系按质量百分比由以下物质所组成：PEG100018％，KH2PO417％，单宁酶粗酶上清液20％，余量为蒸馏水。

10.如权利要求8或9所述的一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述双水相体系的pH值为7.0。

说明书全文

一种单宁酶的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用双水相萃取法从发酵液中分离纯化单宁酶的方法。

背景技术

[0002] 单宁酶(Tannase,EC 3.1.1.20)，或单宁酰基水解酶，是一种能够作用于单宁中的酯键和缩酚羧键生成没食子酸和葡萄糖的水解酶类。该酶可由某些微生物(尤其是丝状真菌类)在诱导物存在的条件下诱导产生。单宁酶应用广泛，在制革、酿酒、医药、饮料等领域均有应用。例如在医药领域用于没食子酸的生产，在速溶茶、啤酒、咖啡饮料的生产加工中作为添加剂以解决产品的“冷后浊”和苦涩味等问题。

[0003] 目前，有关单宁酶的研究已较为完善，主要涉及单宁酶生产菌种的分离筛选、发酵生产条件的优化、酶的催化机理、酶分子结构以及编码单宁酶基因的克隆等方面的研究，然而单宁酶的大规模生产仍然面临很大困难，主要是受制于生产过程的高费用。在实际生产中，分离纯化过程对生物产品生产来说尤为重要，该过程所需费用占到整个产品成本的一半以上，因此，选择一种高效、低成本的纯化方法将能够很大程度上降低生产成本。现有技术中有关单宁酶纯化方法的报道大部分在使用柱层析法，该法可以获得纯度较高的单宁酶，但是也存在回收率低、处理量小、操作繁琐等问题，很难在工业生产中得到推广和应用。为了克服上述问题，本发明提出使用双水相萃取法分离纯化单宁酶，该方法操作简单、设备要求低且易于扩大化，显示出良好的工业应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的内容是提供一种使用双水相萃取法纯化经微生物发酵获得单宁酶的方法。本发明提供的技术方案如下：

[0005] 一种单宁酶的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

[0006] (1)制备单宁酶粗酶液；

[0007] (2)沉淀；

[0008] (3)双水相萃取得到纯化的单宁酶。

[0009] 作为优选，步骤(1)所述制备单宁酶粗酶液的具体操作为：将浓度为1.5×108个/mL无花果曲霉孢子悬液接种于固体发酵培养基，置于恒温下培养3～5天，再向培养基中加入8～10倍体积的乙酸-乙酸钠缓冲液，震荡后得到混合液，过滤，所得滤液即为单宁酶粗酶液。

[0010] 作为优选，所述无花果曲霉孢子悬液接种量为7.5％(v/m)；所述恒温为25～30℃；所述震荡是置于温度28℃、转速180r/min下震荡90min；所述固体发酵培养基的配方为：在每100g麸皮中加入150mL盐溶液。

[0011] 作为优选，所述盐溶液由以下组分构成：单宁酶30g/L，NaNO35g/L，KCl 0.52g/L，MgSO40.52g/L，NaH2PO41.52g/L，蒸馏水补足至100％；所述盐溶液pH5.5。

[0012] 作为优选，步骤(2)所述沉淀是将步骤(1)所得的单宁酶粗酶液冷冻至2～5℃，添加PEG20000的质量浓度为5％～20％，搅拌均匀，离心5～25min，取上清液，备用。

[0013] 作为优选，步骤(2)中所述沉淀是将步骤(1)所得的单宁酶粗酶液于4℃下冷冻30min后，添加PEG20000的质量浓度为5％～20％，搅拌均匀，于4℃、10000×g下离心15min。

[0014] 作为优选，所述添加PEG20000质量浓度为10％。

[0015] 作为优选，步骤(3)中所述双水相萃取具体步骤为：向离心管中依次加入质量浓度为50％PEG1000水溶液，50％KH2PO4水溶液，单宁酶粗酶上清液和蒸馏水，构成双水相体系，于混匀器上震荡5min～10min，然后置于4℃、3000×g下离心10min，收集双水相的上层液体，即得纯化的单宁酶。

[0016] 作为优选，所述双水相体系按质量百分比由以下物质所组成：PEG1000 18％，KH2PO417％，单宁酶粗酶上清液20％，余量为蒸馏水。

[0017] 作为优选，所述双水相体系的pH值为7.0。

[0018] 本发明的有益效果

[0019] 1、本发明提供一种使用双水相萃取法从发酵液中分离纯化单宁酶的方法，该方法操作条件温和、双水相形成时间短，可大幅降低生产成本。

[0020] 2、本发明提供的双水相萃取体系工艺简单，易于扩大化，可以大规模用于单宁酶生产过程中纯化单宁酶。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

[0022] 实施例1：

[0023] 称取10g麸皮于250mL三角瓶中，添加15mL盐溶液(单宁酶30g/L，NaNO35g/L，KCl 0.52g/L，MgSO40.52g/L，NaH2PO41.52g/L，pH5.5)得固体发酵培养基。固体发酵培养基8
在121℃下灭菌20min，冷却后添加7.5％(v/m)无花果曲霉孢子悬液(浓度为1.5×10 个孢子/mL)，置于28℃下培养3天；发酵结束后，向培养基中加入10倍体积的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2mol/L pH5.0)，然后置于28℃、180r/min下震荡90min，混合物经滤纸过滤，滤液得单宁酶粗酶液。

[0024] 粗酶液于4℃下冷冻30min后，添加PEG20000的质量浓度为10％，于磁力搅拌器上慢速搅拌10min后于4℃、10000×g下离心15min，取上清液用于双水相萃取。

[0025] 向10mL离心管中依次加入3.6g质量浓度为50％PEG1000水溶液、3.4g 50％KH2PO4水溶液和2g单宁酶粗酶上清液，添加1g去离子水使总质量为10g，于混匀器上震荡10min，然后在4℃、3000×g下离心10min，加速双水相的形成，最后收集双水相的上层液体。测定上相中的蛋白浓度和单宁酶活力，计算单宁酶的酶活回收率和纯化倍数。结果表明，经过以上纯化操作后，上层溶液单宁酶的酶活回收率达到82.65％，酶比活力为18.13U/mg，纯化倍数达到3.26倍。

[0026] 实施例2

[0027] 称取10g麸皮于250mL三角瓶中，添加15mL盐溶液(单宁酶30g/L，NaNO35g/L，

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