本发明涉及新的巯基烷酰基二肽化合物，中性肽链内切酶 (NEP)和血管紧张素转化酶(ACE)的混合抑制剂，以及它们的制备 方法和含有它们的药物组合物。

本发明新的二肽具有显著抑制中性肽链内切酶(E.C.3.4-24. 11)(它引起耳促尿钠排泄肽失活)和肽基二肽酶A(E.C.3.4-15. 1)(它产生血管紧张素II)的性能。因此，它们表现为中性肽链内 切酶(NEP)和肽基二肽酶A(ACE)的混合抑制剂，具有增强耳促尿 钠排泄肽促进尿钠排泄，利尿和血管舒张效果的能力，并具有阻滞由 血管紧张素II引起高血压的能力。

大量具有一种或多种这些活性的产品是已知的。

专利说明书EP-B-38758描述了那些称之为脑磷脂酶 (encephalinase)的中性肽链内切酶抑制剂的产品，由于该酶使脑磷 脂(encephalins)降解，因此它是吗啡受体的内源性配体。这些抑制 剂常被用作止痛药。

因此，在Nature，228，(1980)，286-288中，B.P.Roques等 人解释了(R，S)-(2-巯基甲基-3-苯基丙酰)甘氨酸 (thiorphan)显示纳摩尔(nanomolar)浓度的抑制性质而且通过增 强脑磷脂和内源性鸦片肽作用而使其象止痛药。

其它具有止痛性能的脑磷脂酶抑制剂构成了例如专利说明书FR- B-2 556 721和EP-B-136 887的主题。

专利说明书US-A-4 053 651和US-A-4 684 660描述了肽基二 肽酶A抑制剂，它被用作抗高血压药物。

Koehn等(J.Biol.Chem.，262，(1987)，11623-11627)和S.L. Stephenson和A.J.Kenny(Biochem.J.，243，(1987)，183-187) 都报道了心脏释放的耳促尿钠排泄肽因周围酶E.C.24.11作用而失 活，特别是在心机能不全情况下，该肽增进促尿钠排泄和利尿并因此 表现出血管舒张效能。因此，中性肽链内切酶抑制剂，thiorphan， 及其衍生物具有增加循环耳促尿钠排泄肽半衰期(half-life)和降 低鼠血压半衰期能力(G.Olins等，Mol.Cell.Endocrinol.，61， (1989)，201-208；A.A Seymour等，Hypertension，14，(1989)，87- 97)。

然而，这些已知的中性肽链内切酶抑制剂中没有一个具有固有的 抗高血压活性并且中性肽链内切酶抑制剂如在临床试验中的 thiorphan引起促尿钠排泄和利尿而没有低血压和降低心脏超负荷效 果。

然而在US-A-4 879 309专利说明书中描述了下式化合物 ，它被用于增加促尿钠排泄和利尿及降低血压。

在FR-B-2 682 952和FR-A-2 679 564专利说明书中描述了 混合NEP和ACE抑制剂。所述化合物具有如下结构式： -专利说明书FR-B-2 682 952： -专利说明书FR-A-2 679 564：

本发明涉及新的二肽类，它在很低的浓度可抑制中性肽链内切酶 和肽基二肽酶A。本发明化合物与现有技术中的化合物不同，特别是 与专利说明书US-A-4 879 309和FR-A-2 679 564中的化合物不 同，即本发明所有化合物在C-端具有亚氨基酸，该亚氨基酸具5或6 元环，该环在5或6位上被取代，特别是分别被苯基和取代苯基取 代。而且，这种庞大的亚氨基酸影响了甘-亚氨基酸链的形成以致对 两种酶获得优良的抑制活性。这种链的形成导致这类化合物对两种酶 显示非常强的抑制活性(KI量级为10-9M)，长效活性和生物利用 度，它们适于阻断从血管的大部分中发现的转化酶，和能降解促尿钠 排泄肽及主要存在于近端肾小管中的中性肽链内切酶。

本发明新的化合物具有抑制中性肽链内切酶和肽基二肽酶A的双 重性质。结果，用这些混合抑制剂获得的低血压效果远大于单独或混 合使用中性肽链内切酶抑制剂和肽基二肽酶A抑制剂获得的低血压效 果。另外，本发明化合物对中性肽链内切酶和肽基二肽酶A显示了平 衡抑制。实际上给定化合物的IC50对于中性肽链内切酶和肽基二肽酶 A大致是相同的。这说明本发明化合物比现有技术中专利说明书US- A-4 879 309和FR-A-2 679 564所述化合物优越。

因此，本发明化合物对于治疗充血性心力衰竭和各种类型的高血 压，和治疗动脉粥样硬化，心脏缺血，慢性肾病，和伴随肺病出现的 心脏意外是非常有效的。它们能减少用环孢霉素治疗引起的副作用。

本发明更具体地涉及通式(I)化合物和其纯立体异构体或其立 体异构体混合物形式及其可能的药物上可接受的加成盐： 其中： -R选自氢，含有1-6个碳原子直链或支链的酰基，苯甲酰基，萘甲 酰基和金刚烷酰基和下式基团： 其中R1，R2，R′，X和n定义如下， -R1和R2相同或不同，每个独立地选自氢，羟基，含有1-6个碳原子 直链或支链的烷基，含有1-6个碳原子直链或支链的烷氧基，选自 氟，氯，溴和碘的卤素，硝基，氨基，羧基，含有1-6个碳原子直 链或支链的烷氧羰基，苄氧羰基，膦酸基，磺酸基，基团SO2-NH2和 基团SO2-NH-烷基，其中术语烷基表示含有1-6个碳原子直链或支 链的饱和的烃基。 -R′选自氢，含有1-20个碳原子直链或支链的烷基，芳烷基和环烷 基烷基， -X选自氧，硫，基团CH2和基团NH， -n选自整数1和2， 可以理解： -“芳烷基”表示与含有1-6个碳原子直链或支链的烷基连接的， 选自苯基和萘基的芳基形成的基团， -“环烷基烷基”表示与含有1-6个碳原子直链或支链的烷基连接 的，含有3-8个碳原子的环烷基形成的基团。

本发明也涉及制备式(I)化合物的方法，其特征在于式(II) 的二肽：

其中R2，R′，X和n如式(I)中的定义， 用式(III)的酸在通常用于肽合成的条件(例如Bosansky等人在＂ Peptide Synthesis＂，J.Wiley和Ssons Edit中所述条件)下酰化， R和R1如式(I)中的定义。 式(II)化合物可由式(IV)的Z-甘氨酸酰氯： 与式(V)的酯： 缩合，其中R2，R′，X和n如上的定义，接着催化氢化得到。

式(III)化合物可从相应的α-氨基酸根据Fisher等人(Ann.， 357，(1907)，1-24)的方法卤化脱氨基，接着卤原子的亲核取代来制 备。

式(I)化合物也可以用例如Castro试剂将式(V)化合物的酸与 式(VI)的类二肽 进行缩合得到，其中R和R1如上定义。

式(VI)的类二肽根据用于二肽合成中的常规方法通过式 (III)的酸与甘氨酸叔丁酯偶合，用三氟乙酸脱去羧基保护基得 到。

例如根据J.N.Barton等人(J.Med.Chem.，30，(1990)，1606- 1615)所述方法得到式(V)化合物。

其中R′代表氢的式(I)化合物与无机或有机碱可形成药物上可 接受的盐。在这些用于形成所述盐的无机或有机碱中可以具体提到的 (但是并不是限定)为氢氧化铵，氢氧化钠和氢氧化钙，N-甲基-D -葡糖胺，赖氨酸，精氨酸和二环己胺。

如果需要，本发明化合物可以纯立体异构体或立体异构体混合物 的形式存在。本领域技术人员从立体异构体混合物用经典分离技术或 起始原料的不对称合成很容易得到纯立体异构体。

在式(I)中标有星号(*)的碳原子为不对称中心。本发明优 选化合物是以下这些，其中： -带有基团 的碳原子具有S构型， -带有基团 的碳原子具有S构 型， -相对于环的平均平面，在一侧的基团 和在另一侧的基团                  为顺式构型。

申请人已经发现本发明化合物具有非常有价值的药理学性质。

当对哺乳动物给药时，本发明化合物用于治疗和预防充血性心力 衰竭，原发性高血压，伴随血量增加出现的高血压，心脏和/或肾机 能不全和肺绞痛(pulmonary angina)，并且对阻止血管壁增厚具有保 护效果。这是由于本发明化合物对中性肽链内切酶和肽基二肽酶A的 双重抑制作用。根据其药理性质，本发明化合物也可用于治疗和预防 动脉粥样硬化和心脏缺血。它们也可用于预防左心室和肺心肥大和纤 维变性。做过心脏和/或肾移植的患者经常长期使用环孢霉素进行治 疗，而环孢霉素具有增加血量和盐滞留的副作用。本发明化合物具有 抵御这种作用的性质，因此用于减少由环孢霉素引起的副作用。

肽基二肽酶抑制剂对于治疗某些高血压是已知产品，它们能阻断 由血管阻力增加引起的血压升高和从血管紧张素I形成血管紧张素II 引起的血量增加。

另一个与动脉压调节有关的重要肽是由心脏释放的耳促尿钠排泄 肽，它具有血管舒张性质并且能控制多尿和促尿钠排泄。耳促尿钠排 泄肽在末梢组织中由中性肽链内切酶降解。中性肽链内切酶抑制剂如 thiorphan诱发人大量多尿和促尿钠排泄而不引起血管紧张素酶量的 增加并且通常用多尿观察的醛甾酮一般与ACE抑制剂一起使用。然 而，当单独使用时，中性肽链内切酶抑制剂对血压的作用是弱的。

中性肽链内切酶和肽基二肽酶A的混合抑制剂可以降低人的各种 起因引起的高血压并且可以在没有同时服用利尿剂和补充钾时使用。

本发明新产品对于预防和治疗充血性心力衰竭和各种类型的高血 压，特别是伴随血量增加出现的高血压，原发性高血压，动脉粥样硬 化，心脏缺血，心脏和/或肾机能不全，肺源性心脏病和肺绞痛非常 有效并且在保护缓激肽和失活的耳促尿钠排泄肽的同时对血管壁增厚 具有保护作用。它们也可以有效地减少用环孢霉素治疗引起的副作 用。

由于本发明化合物抑制中性肽链内切酶和肽基二肽酶A的双重性 质，用这些混合抑制剂获得的低血压效果远大于单独使用或混合使用 中性肽链内切酶抑制剂和肽基二肽酶A抑制剂获得的效果。

本发明还涉及含有式(I)化合物，或它们的纯异构体或其异构 体混合物，以及其碱形式或药物上可接受加成盐和与其结合的一种或 多种，无毒赋形剂或载体的药物组合物。

在本发明药物组合物中，可以更具体提到的是那些适于口服，非 肠道，鼻内，直肠，全舌，眼或呼吸道给药的药物组合物，特别是片 剂或糖衣丸，舌下片剂，香囊，paquets，明胶胶囊，glossettes，锭 剂，栓剂，软膏，软膏，皮肤用胶，可注射或可饮用制剂，气雾剂， 和眼用或鼻用滴剂。

载体和载体中的活性物质的量的选择通常由产品的溶解性和化学 性质，具体的给药方式和药物实际用法决定。例如，可用于片剂中的 赋形剂如乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸二钙，分散剂如淀粉，藻酸 和与润滑剂如硬脂酸镁，月桂基硫酸钠和滑石混合的某些复合硅酸 盐。为了制备胶囊，使用高分子量聚乙烯乙二醇是有利的。当使用水 悬浮剂时，其中可含有乳化剂和有利悬浮的试剂。也可以使用稀释剂 如乙醇，丙二醇，甘油和氯仿或其混合物。

对于非肠道给药，本发明的悬浮剂和溶液产品中可以使用芝麻 油，花生油或橄榄油或丙二醇水溶液以及药物上可接受盐的无菌水溶 液。本发明产品的盐溶液特别适于通过肌内和皮下注射给药。水溶 液，包括纯蒸馏水中的盐溶液可用于静脉给药，条件是适当调整其 pH，用足量的葡萄糖或氯化钠使其成为适当缓冲的和提供等渗的溶 液，并且通过加热或微孔过滤将其灭菌。

在本发明方法中所用剂量为产生最好治疗效果直到获得改进时的 剂量。通常，当治疗高血压时，所用剂量为达到降低血压的治疗效果 时的剂量。一般地，口服给药剂量为0.1-100mg/kg，优选1-10mg/ kg，静脉给药剂量为0.01-10mg/kg，优选0.1-5mg/kg，应该理解，对 于每种特殊情况所用剂量应根据所要治疗的患者的个体因素来确定， 如年龄，体重，健康状况和影响药效的其它特征。

本发明化合物可根据所需获得的治疗效果快慢进行给药。某些患 者对多或少的强剂量可能反映快并对弱的维持剂量满意。对于其它患 者，治疗时作为对每个特殊患者的生理功能需要，每天分为1-4剂 量是必要的。通常，活性成分以口服给药每天1-4次。对其它患 者，开方每天不多于1或2剂量。

本发明化合物对于急性高血压的紧急情况可以注射形式使用。这 种治疗可通过静脉灌注进行以获得和维持所需治疗效果。

在本申请中所用缩写词相应于下列产品：

-PyBrOP：溴氧基-三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸酯

-Cbz：苄酯基(苄氧羰基)

-Z：苄氧羰基

-BOP：苯并三唑-1-基氧-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷 酸酯

-DCC：二环己基碳化二亚胺

下面实施例用于说明本发明，但并不以任何方式限制本发明。起 始原料是公知的，或可用已知的操作方法制备。 制备例A：N-(2-乙酰硫-3-苯丙酰基)甘氨酸叔丁酯

将3.7g甘氨酸叔丁酯盐酸盐3.8ml三乙胺与40ml氯仿组成的溶 液，3g1-羟基苯并三唑与30ml四氢呋喃组成的溶液及6.9克DCC(环己 基碳二亚胺)氯仿溶液依次加入5g2-乙酰硫基-3-苯丙酸与40ml四 氢呋喃组成的溶液中，室温下搅拌一夜，将反应混合物过滤并蒸发至 干，残留物用乙酸乙酯溶出分别用10％柠檬酸溶液，水，10％碳酸氢 钠溶液，水，饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥。过滤，蒸发至 干，得7.5g油状物。 产率：98％ Rf：0.65(正己烷/乙酸乙酯2∶1) 制备例B：N-(2-乙酰硫基-3-苯丙酰基)甘氨酸

将7.5g制备例A得到的化合物溶于10ml二氯甲烷中，0℃下加入 17ml三氟乙酸，0℃保持30分钟，将反应物室温搅拌3小时，蒸发至 干。残留物用50∶50的乙醚-正己烷萃取三次，得到6.2g相应的所需 产物为油状产物。 产率：97％ Rf：0.53(二氯甲烷/甲醇9∶1) 制备例C：N-(2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酸

将硫代乙酸钾溶液(用2.5ml硫代乙酸和2g碳酸钾在水中制备)加 入到10g溶解在1M氢氧化钠中的2-溴-3-(对-苄氧羰基氧苯基) 丙酸(按照K.Koga等Chem.Pharm.Bull.26，178(1978)制备)中。将反 应物室温搅拌2天，用1N盐酸酸化后，水相用乙酸乙酯萃取三次，用 饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥，过滤后，蒸发至干，得黄色油 状物，将其用硅胶色谱纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯/乙酸8∶ 2∶0.5)，得到6.4g油状物。 产率：65％ Rf：0.49(正己烷/乙酸乙酯/乙酸6∶4∶0.5) 制备例D：N-[2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基]甘氨 酸叔丁酯

将1.6g制备例C得到的化合物在制备例A的条件下与0.72g甘氨酸 叔丁酯缩合，得2g淡黄色油状物。 产率：96％ Rf：0.57(己烷/乙酸乙酯1∶1) 制备例E：N-(2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基)甘氨 酸

2g从制备例D得到的化合物在制备例B条件下处理，经过硅胶色 谱己烷/乙酸乙酯/乙酸4∶6∶0.5洗脱后，得到1.35g油状物，将其慢 慢结晶。 产率：76％ Rf：0.49(己烷/乙酸乙酯/乙酸4∶6∶0.5) 制备例F：N-(2-乙酰硫基-3-(对-硝基苯基)丙酸

将2.7g2-溴-3-(对-硝基苯基)丙酸(由(对-硝基苯基)丙 氨酸制备)在0℃氮气下加入硫代乙酸钠(由0.73g氢氧化钠和1.05g 硫代乙酸制备)的二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌48小时后，蒸发 至干，将残留物溶于水，按照制备例C的方法处理上述混合物，得到 2.3g淡黄色油状物。 产率：88％ Rf：0.63(二氯甲烷/甲醇/乙酸9∶1∶0.2) 制备例G：N-甘氨酰-5-(间-羟基苯基)脯氨酸甲酯 步骤a：N-[(N-Cbz)-甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)脯氨酸甲酯

0.6克Z-甘氨酸的二氯甲烷在2.06克PyBrOP和2.6ml二异丙基乙 胺存在下与0.83g5-(间-羟基苯基〕脯氨酸甲酯偶合。室温搅拌4 小时后，洗涤(碳酸氢钠，水，柠檬酸钠，水)有机相，用硫酸钠干 燥，过滤。蒸发至干，油状残留物物通过硅胶色谱(正己烷/乙酸乙 酯4∶6)，得到相应的所需产物为白色固体。 产率：33％ 熔点：173℃ Rf：0.17(正己烷/乙酸乙酯4∶6) 步骤b：N-甘氨酰-5-(间-羟苯基)脯氨酸甲酯

0.39g从步骤a得到的化合物在室温和常压下和10％钯-碳及1当 量1N盐酸的甲醇存在下氢化。室温搅拌3小时后，滤出催化剂，蒸 发溶剂。 产率：100％ 制备例H：N-[N-Cbz-甘氨酰]-5-(对-甲基苯基)脯氨酸甲酯

1当量Z-甘氨酸的丙酮溶液在三乙胺存在下用氰尿酰氯处理。室 温搅拌3小时后，将混合物蒸发至干，将残留物在四氯化碳中溶解， 在三乙胺存在下加入1当量的5-(对-甲基苯基〕脯氨酸甲酯的二 氯甲烷溶液室温搅拌3小时后，将反应混合物蒸发至干，用乙酸乙酯 溶解，洗涤，干燥，蒸发至干。如此得到的油状残留物经色谱以正己 烷/乙酸乙酯1∶1洗脱，得到白色固体。 产率：41％ Rf：0.18(正己烷/乙酸乙酯1∶1) 制备例I：N-[(N-Cbz)-甘氨酰]-5-(邻-甲基苯基)脯氨酸甲酯

该化合物是从Z-甘氨酸和5-(邻甲基苯基)脯氨酸甲酯按照 制备例H所述方法制备的，如此得到的油状物通过色谱纯化，正己烷/ 乙酸乙酯55∶45洗脱，得无色油状物。 产率：42％ Rf：0.21(正己烷/乙酸乙酯1∶1)

实施例1：N-[N-(2-乙酰硫基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-苯基脯 氨酸叔丁酯

将5.4g5-苯基脯氨酸叔丁酯和3.35ml三乙胺的40ml氯仿溶液， 2.96g1-羟基苯并三唑的30ml四氢呋喃溶液，6.76克DCC的30ml氯 仿溶液在0℃下连续地加入6.1g在制备例B中得到的化合物的40ml四氢 呋喃溶液中。将该反应混合物按制备例H所述方法处理，粗品通过硅 胶色谱纯化，洗脱剂为己烷/乙酸乙酯2∶1，得到6.47g油状化合物。 产率：60％ Rf：0.49(乙酸乙酯/己烷1∶1)

实施例2：N-[N-(2-乙酰硫基基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-苯基 脯氨酸

0℃下将5ml三氟乙酸加入到3.2g从实施例1得到的化合物的10ml 二氯甲烷溶液中。该混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温搅拌2.5 小时，蒸发至干，油状残留物在乙醚/己烷混合物(1∶1)中沉淀，得1. 66g白色固体。 产率：58.5％ Rf：0.57(二氯甲烷/甲醇，9∶1)

实施例3：N-[N-(2-巯基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-苯基脯氨酸

0.700g实施例2得到的化合物溶于10ml脱气甲醇中。0℃下加入 5ml脱气1M氢氧化钠溶液，将该混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室 温下搅拌3小时。该混合物用1N盐酸酸化至PH＝1，真空浓缩。将残留 物溶于水中，水层用乙酸乙酯萃取。有机相用水，饱和氯化钠水溶液 洗涤，硫酸钠干燥。过滤，蒸发至干，得到610mg淡黄色油状物，将 其慢慢结晶。 产率：96％ m.p.：75℃ Rf：0.24(二氯甲烷/甲醇，95∶5)

实施例4：N-[N-(2-乙酰硫基基-3-苯丙酰基)甘氨酰]-5-(邻- 羟基苯基)脯氨酸甲酯

将0.500g制备例B得到的化合物与0.400g5-(邻-羟基苯基)脯氨酸 甲酯在实施例1的条件下缩合。通过硅胶色谱用己烷/乙酸乙酯6∶4 洗脱，得0.32g所需油状物。

实施例5：N-[N-(2-巯基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-(邻-羟基苯 基)脯氨酸

0.300g实施例4得到的化合物按照实施例3描述的方法处理，得0. 200g所需化合物。 产率：88％ Rf：0.69(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.5)

实施例6：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基] 甘氨酰]-5-(邻-羟基苯基)脯氨酸甲酯

将0.65g5-(邻-羟基苯基)脯氨酸甲酯，0.7ml二异丙基乙胺和 1.27克BOP在0℃下加入到0.500g制备例E得到的化合物的二氯甲烷溶 液中。室温搅拌48小时。按常规方法处理后，将所得的油状物通过色 谱(己烷/乙酸乙酯，4∶6)纯化后得到0.35g油状物。 产率：47％ Rf：0.53(环己烷/乙酸乙酯/乙酸，3∶7∶0.2)

实施例7：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -(邻-羟基苯基)脯氨酸

2ml脱气的1M氢氧化钠在0℃加入到0.200g实施例6得到的化合物的 1ml脱气甲醇中。0℃搅拌1小时后，室温下搅拌2小时，将反应混合 物按照实施例3所述方法处理，得到0.125g白色固体。 产率：89％ Rf：0.34(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.2)

实施例8：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基]甘 氨酰]-5-苯基脯氨酸叔丁酯

将0.590g制备例C得到的化合物在制备例A的条件下与甘氨酰-(5 -苯基)-脯氨酸二肽叔丁酯缩合，得到1g所需化合物。 产率：98％ Rf：0.46(己烷/乙酸乙酯，1∶2)

实施例9：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-苯基脯氨酸

将1g从实施例8所得到的化合物在0℃氮气下溶于三(三氟乙酸酯) 硼与三氟乙酸的混和物中。在同样的温度下将混合物搅拌20分钟。蒸 发至干后，残留物用甲醇萃取三次，再蒸发至干，将该油状残留物在 乙醚中沉淀，得到710g淡黄色粉末。 产率：75％ Rf：0.71(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.5)

实施例10：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -苯基脯氨酸

将450mg从实施例9得到的化合物溶于5ml脱气甲醇中。0℃下加入 2ml 1M NaOH。按照实施例3所述方法继续进行反应。得到400mg所需 化合物为白色固体。 产率：97％ Rf：0.83(氯仿/甲醇/乙酸，7∶3∶0.5)

实施例11：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-硝基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-苯基脯氨酸叔丁酯

将1g从制备例F得到的化合物和1.15g N-甘氨酰-5-苯基脯氨 酸叔丁酯按实施例1所述条件下反应，得到油状化合物。通过硅胶色 谱分离(环己烷/乙酸乙酯，1∶1)得1.09g淡黄色油状物。 产率：53％

实施例12：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-硝基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-苯基脯氨酸

将2ml三氟乙酸在0℃下加入到0.72g从实施例11得到的化合物溶 于2ml二氯甲烷中。按照实施例2所述条件处理后，得到0.58g白色固 体。 产率：90％ Rf：0.39(二氯甲烷/甲醇，9∶1)

实施例13：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-氨基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-苯基脯氨酸

将300mg实施例12得到的化合物溶于15ml甲醇中并加几滴乙酸，然 后将混合物用钯-碳在常压下氢化。滤出催化剂并蒸发溶剂得到0. 280g白色固体。 产率：100％ Rf：0.391(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.25)

实施例14：N-[N-[2-巯基-3-(对-氨基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -苯基脯氨酸

0.150g从实施例13得到的化合物在实施例3的条件下处理，按常规 处理有机相后得0.103g白色固体。 产率：89％ Rf：0.36(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.3)

实施例15：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基] 甘氨酰]-5-(对-氨基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例E得到的化合物与5-(对-氨基苯基)脯氨酸甲酯按照 实施例6所述的条件偶合，得到油状物，经过色谱分离(二氯甲烷/ 甲醇/乙酸，15∶0.4∶0.1)得白色泡沫状产物。 产率：35％ Rf：0.25(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.25)

实施例16：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -(对-氨基苯基)脯氨酸甲酯

实施例15得到的化合物按照实施例7所述条件处理，得到相应的 所需产物，为白色固体。 产率：60％ Rf：0.37(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.5)

实施例17：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基] 甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)脯氨酸甲酯

将0.35g制备例C得到的化合物与0.3g从制备例G得到的化合物按 照制备例A所述方法偶合，得到油状物，将其通过硅胶色谱分离(己 烷/乙酸乙酯，4∶6)，得0.24g所需产物。 产率：40％ Rf：0.37(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例18：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-(间-羟基苯基)脯氨酸

将0.24g实施例17所得化合物溶解在脱气甲醇中，然后用4当量脱 气1N氢氧化钠溶液处理。在0℃搅拌30分钟及室温搅拌2小时后，将 反应混合物酸化并用乙酸乙酯萃取。蒸发至干后，得到0.12g白色固 体。 产率：71％ Rf：0.34(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.5)

实施例19：N-[N-[2-乙酰硫基-3-苯基丙酰基]甘氨酰]-5-(间- 羟基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例G得到的化合物与2-乙酰硫-3-苯基丙酸按照制备例A 所述方法偶合。得到油状物，通过色谱分离，以正己烷/乙酸乙酯1∶1 洗脱。 产率：50％ Rf：0.28(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例20：N-[N-(2-巯基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-(间-羟基 苯基)脯氨酸

将实施例19得到的化合物按照实施例3的方法处理，得到相应所 需化合物为糊状物。 产率：85％ Rf：0.29(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶0.5∶0.25)

实施例21：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基)丙酰基] 甘氨酰]-5-(对-羟基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例C得到的化合物与N-甘氨酰-5-(对-羟基苯基)甘氨酸 甲酯按照制备例G中步骤a和b所述方法偶合，得到相应的所需产物为 油状物。 产率：50％ Rf：0.26(环己烷/乙酸乙酯/乙酸5.5∶4.5∶0.5)

实施例22：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -(对-羟基苯基)脯氨酸甲酯

将实施例21得到的化合物按照实施例3所述方法处理，得到糊状 物。 产率：77％ Rf：0.24(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.5)

实施例23：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-氯苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -(邻-羟基苯基)脯氨酸甲酯

将2-乙酰硫基-3-(对-氯苯基)丙酸与N-甘氨酰-5-(邻-羟基 苯基)脯氨酸甲酯(按照制备例G所述的方法制备)缩合，经过色谱分 离，以正己烷/乙酸乙酯1∶1洗脱，得到所需产物为油状物。 产率：53％ Rf：0.38(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例24：N-[N-[2-巯基-3-(对-氯苯基)丙酰基]甘氨酰]-5-( 邻-羟基苯基)脯氨酸

将实施例23得到的化合物按照实施例3所述方法处理，得到糊状 物。 产率：88％ Rf：0.26(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶0.5∶0.25)

实施例25：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-甲氧基苯基)丙酰基]甘氨 酰]-5-(邻-羟基苯基)脯氨酸甲酯

将2-乙酰硫基-3-(对-甲氧基苯基)丙酸与N-甘氨酰-5-(邻- 羟基苯基)脯氨酸甲酯(按照制备例G所述的方法制备)缩合，经过色 谱分离，以正己烷/乙酸乙酯4∶6洗脱，得到所需产物为油状物。 产率：50％ Rf：0.28(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例26：N-[N-[2-巯基-3-(对-甲氧基苯基)丙酰基]甘氨酰]- 5-(邻-羟基苯基)脯氨酸

将实施例25得到的化合物按照实施例3所述条件下处理，得白色 固体。 产率：88％ Rf：0.42(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶0.5∶0.25)

实施例27：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-甲氧基苯基)丙酰基]甘氨 酰]-5-(邻-甲氧基基苯基)脯氨酸甲酯

将2-乙酰硫基-3-(对-甲氧基苯基)丙酸与N-甘氨酰-5-(邻- 羟基苯基)脯氨酸甲酯(按照制备例G所述的方法制备)缩合，经过色 谱分离，以正己烷/乙酸乙酯1∶1洗脱，得到所需产物为油状物。 产率：59％ Rf：0.26(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例28：N-[N-[2-巯基-3-(对-甲氧基苯基)丙酰基]甘氨酰]- 5-(邻-甲氧基苯基)脯氨酸

将实施例27得到的化合物按照实施例3所述条件下处理，得白色 固体。 产率：89％ Rf：0.22(环己烷/乙酸乙酯/乙酸5∶5∶0.5)

实施例29：N-[N-(2-乙酰硫基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-(对- 甲基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例H得到的化合物按照制备例G中步骤b所述方法脱保护， 将得到的二肽与2-乙酰硫基-3-苯基丙酸按照制备例A的方法偶 合。所得油状物经色谱分离，以正己烷/乙酸乙酯5.5∶4.5洗脱，得白 色固体。 产率：69％ Rf：0.55(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例30：N-[N-(2-巯基-3-苯丙酰基)甘氨酰]-5-(对-甲基苯 基)脯氨酸

将实施例29得到的化合物按照实施例3所述方法处理，得白色固 体。 产率：89％ Rf：0.59(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶0.5∶0.5)

实施例31：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-(对-甲基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例H得到的化合物按照制备例G中步骤b所述方法脱保护， 将得到的二肽与制备例C所得化合物按照制备例A的方法偶合。所得 油状物经色谱分离，以正己烷/乙酸乙酯1∶1洗脱，得白色固体。 产率：52％ Rf：0.14(正己烷/乙酸乙酯1∶1)

实施例32：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5- (对-甲基苯基)脯氨酸

将实施例31得到的化合物按照实施例3所述方法处理，得白色固 体。 产率：92％ Rf：0.62(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶1∶0.5)

实施例33：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-(邻-甲基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例I得到的化合物按照制备例G中步骤b所述方法脱保护， 将得到的二肽与制备例C所得化合物按照制备例A的方法偶合。经所 得油状物经色谱纯化，以正己烷/乙酸乙酯1∶1洗脱，得油状物。 产率：56％ Rf：0.28(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例34：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5- (邻-甲基苯基)脯氨酸

将实施例33得到的化合物用实施例3所述方法处理，得白色固 体。 产率：87％ 熔点：130℃(分解) Rf：0.24(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例35：N-[N-(2-乙酰硫基-3-苯丙酰基)甘氨酰]-5-(邻-甲 基苯基)脯氨酸甲酯

将制备例I得到的化合物按照制备例G中步骤b所述方法脱保护， 将所得二肽与2-乙酰硫基-3-苯丙酸按照制备例A的方法偶合。经 色谱纯化，以正己烷/乙酸乙酯55∶45洗脱，得白色固体。 产率：58％ 熔点：97℃ Rf：0.40(正己烷/乙酸乙酯4∶6)

实施例36：N-[N-(2-巯基-3-苯丙酰基)甘氨酰]-5-(邻-甲基苯 基)脯氨酸

将实施例35得到的化合物按照实施例3所述方法处理，得白色固 体。 产率：63％ 熔点：110℃(分解) Rf：0.15(二氯甲烷/甲醇/乙酸，9∶0.7∶0.25)

使用相似方法制备下述实施例化合物：

实施例37：N-[N-(2-丙酰硫基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-(邻- 羟基苯基)脯氨酸

实施例38：N-[N-(2-苯甲酰硫基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-5-苯 基脯氨酸

实施例39：N-[N-[2-巯基-3-(对-氨磺酰苯基)丙酰基]甘氨酰]-5 -苯基脯氨酸

实施例40：N-[N-[2-巯基-3-(对-丙氨磺酰苯基)丙酰基]甘氨酰] -5-(间-羟基苯基)脯氨酸

实施例41：N-[N-[2-乙酰硫基-3-(对-氨磺酰苯基)丙酰基]甘氨 酰]-5-(间-羟基苯基)脯氨酸环己烷基甲酯

实施例42：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-5- (邻-羟基苯基)脯氨酸苄酯

实施例43：N-[N-[2-巯基-3-(对-氯苯基)丙酰基]甘氨酰]-2- (邻-羟基苯基)咪唑烷-5-羧酸

实施例44：N-[N-(2-巯基-3-苯基丙酰基)甘氨酰]-2-苯基噁唑 烷-5-羧酸

实施例45：N-[N-(2-巯基-3-苯丙酰基)甘氨酰]-2-(邻-羟基苯 基)噻唑烷-5-羧酸

实施例46：N-[N-[2-巯基-3-(对-羟基苯基)丙酰基]甘氨酰]-2- (间-羟基苯基)六氢嘧啶-5-羧酸

实施例47：N-[N-(5R)-[(2S)-2-巯基-3-(对-2-羟基 苯基)丙酰基]甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸

将(5R)-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸(根据J.Ezquerra 等人(tetrahedron Tetters，34(39)，(1993)，6317-6320)所述制备方 法获得)在制备例G所述条件下处理，并根据制备例A所述方法，与 制备例C得到的(2S)-2-乙酰硫基-3-(对-苄氧羰基氧苯基) -丙酸偶合。将这样得到的酯如实施例18所述方法进行皂化产生标题 化合物。

类似实施例47所述得到方法得到实施例48-53的化合物。

实施例48：N-[N-(5R)-[(2S)-2-巯基-3-苯基丙酰基) 甘氨酰]-5-苯基]-L-脯氨酸

实施例49：N-[N-(5R)-[(2S)-2-巯基-3-苯基丙酰基) 甘氨酰]-5-(邻-羟基苯基)]-L-脯氨酸

实施例50：N-[N-(5R)-[(2S)-2-巯基-3-(对-氯苯 基)丙酰基]甘氨酰]-5-(邻-羟基苯基)-L-脯氨酸

实施例51：N-[N-(5R)-[(2S)-2-巯基-3-(对-氨基苯 基)丙酰基]甘氨酰]-5-苯基]-L-脯氨酸

实施例52：N-[N-(5S)-[(2S)-2-巯基-3-(对-羟基苯 基)丙酰基]甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)-D-脯氨酸

实施例53：N-[N-(5R)-[(2R)-2-巯基-3-(对-羟基苯 基)丙酰基]甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸

实施例54：N-[N-(5S)-[(2S)-2-巯基-3-(对-羟基苯 基)丙酰基]甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸 步骤a：(2S)-5-(间-羟基苯基)-3，4-二氢[2H]吡咯-2 -羧酸

根据Gershon等人(J.Med.Chem.，(1965)，8，877-881)所述方法得 到该化合物。 步骤b：(5S)-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸

将在步骤a中得到的化合物还原(用OH-，H+和NaBH4)以便产 生(2S，5R)和(2S，5S)异构体混合物，然后根据C.G Overberger 等人(Macromolecules，(1972)，5(4)，368-372)所述方法进行分离。 步骤c：N-[N-(5S)-[(2S)-2-巯基-3-(对-羟基苯 基)丙酰基]甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸

根据实施例47所述制备方法从前述步骤得到的化合物得到标题化 合物。

实施例55：N-[N-(5R)-[(2S)-2-巯基-3-(对-羟基 苯基)丙酰基]甘氨酰]-5-(间-羟基苯基)-L-脯氨酸

根据实施例54所述制备方法用(2R)-5-(间-羟基苯基) -3，4-二氢[2H]吡咯-2-羧酸作起始原料得到该化合物。 药理研究 实施例A：对中性肽链内切酶(NEP)和肽基二肽酶A(ACE)体内抑 制作用

本发明化合物抑制作用[3H]-D-丙-亮-脑磷酯作为中性肽链 内切酶的基质按照LIorens等人描述的方法(Biochem.Biophys.Res. commun，96，(1980)，1710sqq)，用Z-苯丙-组-亮氨酸作为肽基二肽 酶A(ACE)的基质按照Biochem.Biophys，206，(1970)，136-42所描述的 方法测定。结果列于表1，同时也给出用N-(2-巯甲基-3-苯基-1 -氧丙基)甘氨酸(thiorphan)所得结果，尽管结构非常相似，但仅仅 对中性肽链内切酶(NEP)显示活性。

                            表1

对中性肽链内切酶(NEP)和血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用     化合物     IC50(nM)NEP     IC50(nM)ACE     实施例3     实施例5     实施例7     实施例10     实施例14     实施例16     实施例18     实施例20     实施例22     实施例24     实施例26     实施例28     实施例30     实施例32     实施例34     实施例36     1.6±0.3     1.1±0.3     4.3±0.3     3.4±0.8     1.8±0.4     26±3     1.6±0.3     2.4±0.8     6±1     1.2±0.4     2.3±0.3     2.5±0.6     10±2     5.0±0.5     3.1±0.3     4.0±0.6     0.55±0.05     0.50±0.10     0.35±0.05     4.2±0.4     3.5±0.5     23±3     0.7±0.2     1.4±0.7     0.45±0.05     0.90±0.06     0.40±0.05     2.20±0.20     8.2±0.5     3.2±0.4     5.2±0.5     3.5±0.6     thiorphan     2.0±0.4     140±13 实施例B：对肾中性肽链内切酶(NEP)和肺肽基二肽酶A(ACE)的体外抑 制作用

这些化合物对小鼠以单一剂量口服给药，两种酶的抑制作用通过 对每一种酶用特定的放射示踪标记物经过竞争实验从1小时到16小时 进行测定。放射示踪的ACE抑制剂([3H]trandolaprilate)或放射示 踪的NEP抑制剂([3H]HACBOGly)经静脉注射给药后，动物被解剖后， 取出肺或肾，器官被匀化。将组织匀桨并如M.C.Fournie-Zaluski 等人(J.Med.chem，37，(1994)，1070-1083)所述方法用液闪测定其放 射性。作为实例，实施例47所述化合物提供了如表II所示的结果：

表II  肾NEP和肺ACE体内抑制作用

(实施例47的化合物：口服给药剂量：2.6×10-6mol/kg 即     1.5mg/kg)     给药后时间              ％抑制率     肾NEF     肺ACE     1h     75±3     90±1     2h     70±5     86±3     4h     74±4     87±3     8h     60±10     73±3     16h     48±4     20±8 实施例C：抗高血压作用

本发明化合物的抗高血压作用是通过给大鼠施用DOCA盐(脱氧皮 质酮)诱发高血压和雄性大鼠(SHR)的自发的高血压的体内试验按照 Traoani等所述方法J.Cardiovasc.Pharmacol.，14.(1989)，419-424.) 进行确定。试验中，本发明化合物显示强的抗高血压活性并且无 毒。

作为实例，将实施例47的化合物用于SHR大鼠，所得结果列于表 III：

表III

               对SHR大鼠的抗高血压作用研究 (给药方式：口服，单剂量为25mg/kg/每天；给药6天，第一天为天1，最后 一天为天6。)   天     收缩压(mmHg)     给药动物     (n＝10)     对照动物     (n＝10)     0     210±5     210±5     1     212±3     195±3*     2     211±1     189±5*     3     210±2     183±4*     4     205±2     184±3*     5     205±1     182±3*     6     213±2     185±5*     7     209±4     189±3     8     212±2     198±5     9     208±2     203±5     10     214±1     210±3 *：p＜0.01 治疗 实施例D：药物组合物：片剂 1000片每片含10mg活性成分的制剂配方 实施例5化合物____________________________________10g 乳糖_____________________________________________50g 硬脂酸镁_________________________________________10g 小麦淀粉_________________________________________20g 玉米淀粉_________________________________________10g 硅胶_____________________________________________5g 羟丙基纤维素_____________________________________5g