皮肤是人身体的最大器官。其可以分为两层：表皮和真皮。这两 层之间通过基底膜连接，基底膜是由不同的大分子(胶原、层粘连蛋 白、蛋白多糖等)形成的基质。
基底膜富含IV型胶原、蛋白多糖和糖蛋白内功素和层粘连蛋白。
这些分子为细胞结合提供了结构网以及生物粘连性质。层粘连蛋 白序列包含数个结合区域：IV型胶原、基底膜蛋白多糖(硫酸类肝素 蛋白多糖)、内功素、和在细胞表面上的受体。
这些基底膜是由下面三层形成的特异性的细胞外基质：
-透明板：该层直接与基底角质化细胞接触，其主要成分是层粘连 蛋白。
-致密板：位于透明板下面，以相似的厚度与透明板平行地延伸。 它是无定型物质，其中胶原IV占优势，其会产生较大的牵引强度和产 生基底膜的柔性。
-网状板：在上述两层下面，但它的位置是较不确定的，其由真皮 的成纤维细胞产生。它是由引入到致密板中的固定纤维和弹性微纤维 形成的，在致密板中它们维持基底膜并为表皮组织提供内聚力。固定 纤维是由胶原VII形成的结构。
在上述板的第一层-透明板中可以发现层粘连蛋白，其是透明板 的主要成分。
层粘连蛋白是约850kDa的糖蛋白，在细胞外基质(ECM)中除胶 原之外它是最丰富的蛋白质。层粘连蛋白仅在基底膜中发现，其由以 交叉形分布并用二硫键桥接的三个长多肽链(α、β、δ)形成。
这三个链存在于不同的层粘连蛋白亚型中，它们的组合产生了很 多不同的层粘连蛋白同种型，其中研究最多的是层粘连蛋白-1。
整联蛋白是涉及层粘连蛋白识别的最重要的受体，它们是第一个 被发现的ECM受体。它们是负责细胞-细胞和细胞-ECM相互作用的一 组跨膜细胞表面受体。
细胞通过受体整联蛋白识别层粘连蛋白中的结合区域，从而将受 体整联蛋白结合到富含层粘连蛋白的基底膜上。该受体整联蛋白通过 特异性配体介导细胞间的结合。
皮肤老化是皮肤所经历的一种皮肤过程，是所有活着的生物体都 具有的一种常见生物学过程。
当发生皮肤老化过程时，一般可以观察到皮肤的功能性能力丧失 和易损性增加，其特征为干燥、皱纹、具有斑点的浅黄色皮肤、浅灰 色头发、以及组织停滞和松弛等。
已经观察到，在30岁后表皮细胞和基底膜的粘连开始降低，这种 表皮和真皮之间接触的减少在皮肤中产生了结构性和功能性的改变， 这构成了老化过程的一部分[J.Investig.Dermatol.Symp.Proc. 1998；3(2)：172-9]。
因此，可以通过增加细胞和基底膜之间的粘连来预防和改善皮肤 的松弛和柔韧性丧失，这样就延缓了皮肤老化。
在这种意义上讲，涉及通式XIKVAV的肽在化妆用组合物中的应 用，以增加皮肤的柔韧性和延缓老化的发明在现有技术中尚没有出现。
US 5,744,515[促进内皮化的方法和可植入物]涉及由聚合物、 陶瓷和金属材料制成的植入物，其具有用粘连分子例如纤连蛋白、层 粘连蛋白、胶原和其某些区域包被的表面。SIKVAV是所述区域中的一 个区域，并作为蛋白质纤连蛋白的一个区域对其进行了具体的描述。 该粘连分子被包括在植入物中以促进移植物的内皮化和它与细胞的粘 连，所述移植物是由多孔的生物材料制成的，这样就允许毛细血管穿 过这些材料生长。
另一方面，US 6,428,579[生物活性分子包被的可植入修复装 置]，涉及用金包被的植入物，在金上粘连了具有不同类型性质的生物 活性肽，这些不同类型的性质是例如细胞调节、趋化性、抗凝、抗血 栓形成、抗肿瘤、抗感染、增强生长、抗炎性质等等。其中，所述的 SIXVAV是在整联蛋白结合肽组中的细胞调节肽的一个例子。这些植入 物的优选应用是在外伤手术后加速骨的生长，并且使用整联蛋白底物 肽例如SIKVAV来改善与骨组织的肽粘连。
US 6,673,108[Transmural concentric multilayer ingrowth matrix within well-defined porosity]涉及具有数个合成的或蛋白 质层的基质。其每一层具有特定的功能。用肽或生长因子将纤维蛋白 层衍生化，具体地说，用来源于层粘连蛋白的肽例如SIKVAV衍生化的 纤维蛋白层即是蛋白质层的一个例子。
这些专利都没提及通式XIKVAV的肽在化妆用组合物中的应用。
因此，本发明的基础是提供一种化妆用组合物，其能增加皮肤柔 韧性，因此延缓皮肤老化。
发明详述
通式XIKVAV的肽形成了层粘连蛋白的趋化性区域，即细胞吸引区 域。这就是这些肽促进细胞粘连、生长和迁移，因此使基底膜再生的 原因。在这些肽中血管发生刺激(形成新的血管)性质会促进内皮细 胞的增殖和分化，也是已知的[Journal of Cellular Physiol.1992 Dec；153(3)：614-25]。
已知XIKVAV型的肽和受体整联蛋白之间的相互作用，在专利号 EP 1 325 739[“包封抗癌药物的脂质体及其在治疗恶性肿瘤中的应用”] 描述了它们的应用，其中将在肿瘤细胞膜中的层粘连蛋白受体过度表 达引导至后者的用含抗肿瘤剂的XIKVAV肽包被的脂质体中。
现在已经确定，XIKVAV肽在皮肤细胞的水平有不同的化妆应用的 功能，如下所示：
-在XIKVAV肽例如IKVAV、SIKVAV或Pal-IKVAV存在下，对角质 化细胞粘连的刺激作用(见附图8)，其中X分别是氢、丝氨酰基、 棕榈酰根。
-在成纤维细胞中对α6整联蛋白表达的刺激作用，如在附图3中 所示的，当α6整联蛋白表达时，在XIKVAV存在下观察到了荧光的产 生，这与在附图2中所示的相反，其中显示了未加入XIKVAV时，对照 样品中发生的情况。
-如附图5所示，在XIKVAV肽存在下，通过荧光的出现观察到在 成纤维细胞中对层粘连蛋白V表达的刺激作用。用不含XIKVAV肽的对 照样品来观察层粘连蛋白V表达的效果(见附图4)。
在本发明中，设计了包含通式XIKVAV的肽的化妆用组合物，其能 增加皮肤的柔韧性，因此延缓老化。
进行分析以定量角质化细胞和成纤维细胞的细胞粘连的增加，以 及整联蛋白、层粘连蛋白等的产生。
简言之，XIKVAV肽能有利于角质化细胞自身的粘连，并通过层粘 连蛋白V和α6整联蛋白(生物粘连肽)的成纤维细胞刺激合成，层 粘连蛋白V和α6整联蛋白都涉及到半桥粒，半桥粒是真皮-表皮接合 的基本结构。
而且，上述的微循环刺激和基底膜的良好情况将有助于适当的氧 和代谢产物转运，以及排泄产物的清除，因此改善表皮细胞的功能性 能力，同时改善它们的抵抗力和柔韧性。
因此，在局部应用的化妆用组合物中掺入的XIKVAV肽的应用，对 于预防皮肤老化，延缓真皮和表皮之间的接触丧失、预防形成部分老 化过程的结构性和功能性改变具有直接作用。
因此，根据本发明的第一个方面，本发明涉及通式XIKVAV(见附 图1)的肽用于通过增加生物粘连肽的表达刺激皮肤细胞的生物粘连， 其中X选自H、氨基酸、直链或支链酰基，Y可以是氨基、羟基或硫醇 基，它们全部被脂肪酸取代或未被取代。
优选地，在通式XIKVAV的肽中，X是氢、丝氨酸、棕榈酰基、或 癸酰基，Y可以是氨基、羟基或硫醇基，它们全部被脂肪酸取代或未 被取代。
优选地，在通式XIKVAV的肽中，X是丝氨酸并且Y是羟基，即是 SIKVAV肽。
优选地，在通式XIKVAV的肽中，X是氢并且Y是羟基，即是IKVAV 肽。
优选地，其中生物粘连被刺激的皮肤细胞是角质化细胞，生物粘 连肽是α6整联蛋白和层粘连蛋白V。
根据本发明的第二个方面，本发明涉及一种化妆用组合物，包含 在化妆可接受的介质中的化妆有效量的通式XIKVAV的肽，用于通过增 加生物粘连肽的表达刺激皮肤细胞的生物粘连。
所述组合物优选是在真皮应用的。
根据一个优选的实施方案，所述组合物增加皮肤的柔韧性，该作 用是通过增加皮肤细胞彼此之间及其与基底膜之间的粘连产生的。
在本发明中，优选在化妆用组合物中掺入的XIKVAV(见附图1) 的浓度高达12％。
在本发明中，优选在化妆用组合物中掺入的XIKVAV(见附图1) 的浓度优选是5％。
优选的赋形剂是在化妆品中常用的那些：水、醇、卵磷脂、天然 或人造聚合物、表面活性剂和活性表面剂、防腐剂等等。
优选的化妆品形式是常用的那些：乳膏、洗剂、乳剂、洗发剂、 浆液、凝胶剂等等。
根据一个优选的实施方案，该组合物包含如下重量百分比的下列 组分：
组分 ％ XIKVAV 0.001-10 凡士林 0-10 三乙醇胺 0-10 BHT 0-10 苯氧乙醇、 尼泊金甲酯、 尼泊金丁酯、尼泊金乙酯 尼泊金丙酯、 尼泊金异丁酯 0-10 硬脂酸 0-10 蜂蜡 0-10 卡波姆 0-10 聚二甲基硅氧烷醇 0-10 环甲硅油 0-1 甘油 0-10 十六烷基硬脂醇 0-10 香料 0-10 水 至100
作为化妆用组合物的一部分使用的其它活性组合可以是维生素、 天然提取物、酵素和用于不同用途的化妆用制剂的其它常用组分：抗 老化、抗蜂窝组织、增湿、再生、促复活组分等等。
根据另一个方面，本发明涉及通式XIKVAV的肽在制备增加皮肤柔 韧性的化妆用组合物中的应用。
由于细胞用整联蛋白识别层粘连蛋白，并且层粘连蛋白通过整联 蛋白与细胞结合，根据本发明的化妆用组合物将会增强细胞粘连和它 们与基底膜的结合，因为XIKVAV肽能增加整联蛋白和层粘连蛋白的产 生，适合作为化妆用组合物的组分使用。
如下面的实施例所示，对由于存在通式XIKVAV的肽而获得的皮肤 细胞的粘连作用进行了分析，并观察到细胞增殖的增加。
因此，由于使用通式XIKVAV的肽而获得的细胞增殖和粘连作用的 增加，其结果就是得到了更紧密的表皮，预防了在皮肤老化中非常特 征性的柔韧性丧失。
老化皮肤的另一个特征是细胞之间的接触丧失，这就有缺乏营养 和发生皮肤改变例如干燥、面色浅黄和丧失功能的危险。
使用根据本发明发展出来的包含通式XIKVAV的肽的化妆用组合 物可以对抗这些老化的迹象。
具体实施方案
下面列出的实施方案是作为对本发明特定方面的支持来进行描 述，而不是限定本发明的范围。
实施例1：
在人成纤维细胞和角质化细胞中进行免疫染色分析，以确定 SIKVAV是否具有增强α6整联蛋白和层粘连蛋白V表达的能力(附图 3，4，5和62，3，4和5)。
由于细胞用整联蛋白识别层粘连蛋白，并且层粘连蛋白通过整联 蛋白将细胞与基底膜结合，能增加整联蛋白和层粘连蛋白产生的肽将 会增加细胞粘连和它们与基底膜的结合。
该分析使用与要探测的蛋白质(整联蛋白或层粘连蛋白)结合的 初级(单克隆)抗体，和与蛋白质和初级抗体的络合物结合的次级(多 克隆)抗体。次级抗体与荧光化合物(FITC-异硫氰酸荧光素)偶联。
用495nm(吸收波长)的滤过光照射FITC，并在528nm处探测到 染料发射的光(发射波长)。
在附图2，3，4和5中观察到了这些方面。
在附图2中，通过免疫荧光发射在未用SIKVAV处理的人成纤维细 胞中可以观察到α6整联蛋白的表达。另一方面，在附图3中，通过 免疫荧光发射在用SIKVAV处理的人成纤维细胞中也可以观察到α6整 联蛋白的表达增加。
在相同的测定中也鉴定出了在SIKVAV存在和不存在时层粘连蛋 白表达的差异。
在附图4和5中可以观察到此表达的差异。在附图4中，通过免 疫荧光在未用SIKVAV处理的人成纤维细胞中可以观察到层粘连蛋白V 的表达，在附图5中，通过免疫荧光发射在用SIKVAV处理的人成纤维 细胞中可以观察到层粘连蛋白V的表达增加。
因此可以得出结论，在用SIKVAV处理的人成纤维细胞而非角质化 细胞中可以观察到层粘连蛋白V和α6整联蛋白的显著增加。而在β1 整联蛋白的产生方面没有探测到变化。
实施例2：
在第二个实施方案的分析中，通过体外成纤维细胞培养的方法已 确定了细胞水平的粘连过程。
该事实如附图6和7所示。
附图6显示的是在未处理的人成纤维细胞中的细胞粘连，附图7 显示的是在用SIKVAV处理的成纤维细胞中的细胞粘连。
附图6和7显示了均匀涂敷的分析微孔和成纤维细胞的生长和分 布，其中与细胞增殖相比，成纤维细胞的生长和分布与细胞粘连更为 相关。
除了促进细胞粘连和迁移，含SIKVAV的化妆用组合物有利于血管 的形成，改善微循环。
实施例3：
本实施方案显示的是角质化细胞和通式XIKVAV的肽的细胞粘连 的体外评价，并在它们之间进行对比性评价。
本实施方案显示了在存在XIKVAV肽时皮肤细胞的粘连如何增加， 并比较了其不同变异体：SIKVAV、IKVAV、Pal-IKVAV、SIKVAV-OH和 SIKVAV-NH2(附图8，9和10)。
在本发明的下面实施例中使用的细胞培养物是在角质化细胞的特 异性生长因子存在下的人表皮角质化细胞(HEKa)。
首先，将96微孔置于平板上，用50μL通式XIKVAV的肽的蒸 馏水涂敷它们(每微孔0.5-250μg/ml)，在室温下干燥过夜。
另一方面，用40μM BSA(牛血清白蛋白)涂敷的微孔进行对照 分析，以评价非特异性的细胞粘连。
所有的微孔已经都用200μL PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤并在37 ℃用在PBS中的1％BSA阻断1小时。
向人皮肤的角质化细胞中加入胰蛋白酶，并且在37℃下在5μM 的钙黄绿素-AM中标记30分钟，最后用Epilife介质洗涤3次。
向先前用XIKVAV肽涂敷的平板上加入标记后的细胞(4.5×104/ 微孔)，在37℃下在用5％CO2增湿的大气中培养2小时。
通过测定洗涤前和后的该黄绿素荧光来评价细胞粘连。
通过粘连细胞的荧光除以加入到每个微孔中细胞的总荧光来确定 细胞粘连的百分比。
用相对于细胞和BSA的非特异性粘连来计算XIKVAV肽促进的细胞 粘连。
结果表明，XIKVAV肽能以剂量依赖的方式促进角质化细胞粘连 (见附图8，9和10)。
相对于所研究的最高浓度下的非特异性粘连，由XIKVAV肽产生的 细胞固定是65％。
这些结果表明，XIKVAV肽是由细胞表面的特异性受体识别的。
这些发现提示，通式XIKVAV的肽是制备用于调整和增加皮肤柔韧 性的化妆用组合物部分的良好候选者。
如果观察附图8，9，和10并比较，就会观察到随着肽剂量的增 加，细胞粘连也增加(剂量依赖性)。
如果比较附图9推导出来的结果，就会观察到在所有情况下角质 化细胞粘连都有很大的增加，但产生更大粘连的肽是SIKVAV肽，即其 中X是丝氨酸的肽。
附图10显示的是SIKVAV-OH和SIKVAV-NH2肽的细胞粘连水平， 其中观察到了如何在低剂量(0.5μg/ml)时SIKVAV-NH2产生的粘连 较大，而在较大剂量时SIKVAV-OH肽产生的粘连较大。