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一组盆腔脱垂诊断标记及其应用

阅读：485发布：2021-02-25

IPRDB可以提供一组盆腔脱垂诊断标记及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一组盆腔脱垂诊断标记及其应用，更具体的涉及CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890基因及其表达产物在盆腔脱垂诊治中的应用。发明人基于高通量测序结果采用生物信息学方法分析进行基因筛选，挑选出6个候选基因，进一步分子细胞生物学方法证实了上述6个候选基因在盆腔脱垂组织中明显高表达，可用于制备盆腔脱垂辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。，下面是一组盆腔脱垂诊断标记及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，其特征在于，所述分子标志物是CPXM1基因和/或CPXM1基因的表达产物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的分子标志物在盆腔脱垂组织中高表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的盆腔脱垂诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒或基因芯片检测盆腔脱垂组织中分子标志物的表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增分子标志物的引物；所述的基因芯片中包括与分子标志物的核酸序列杂交的探针。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的盆腔脱垂诊断制剂采用免疫方法检测盆腔脱垂组织中分子标志物的表达产物。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

7.抑制CPXM1基因转录或表达的试剂在制备盆腔脱垂抑制剂中的应用，其特征在于，抑制CPXM1基因转录或表达的试剂为抑制CPXM1基因的转录或表达的siRNA。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述siRNA序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2。

说明书全文

一组盆腔脱垂诊断标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一组盆腔脱垂诊断标记及其应用，更具体的涉及CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890基因及其表达产物在盆腔脱垂诊治中的应用。

背景技术

[0002] 盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)是由于盆底支持结构的缺陷、损伤或功能障碍造成的，是影响中老年女性生活质量的常见疾病，主要是由盆底支持结构缺陷或者退化、损伤及功能障碍所导致。临床表现为子宫、阴道、膀胱、尿道、结直肠、小肠等器官的脱垂，常伴发尿失禁、排尿排便障碍、性功能障碍等症状。流行病学研究显示高达50％的成年妇女受该疾病困扰，无论是原发性POP还是复发性POP的发病率都在逐年升高，己成为非常值得关注的公共卫生问题。POP严重影响了成年女性的生活与社会活动，有研究指出，POP患者出现抑郁症状的可能性是普通人群的5倍。然而，由于其发病机制尚不明确，目前的治疗大多数只是对其症状进行治疗，而无法从病因上根治疾病。

[0003] 发明人对9例盆腔脱垂病例样本及3例对照进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出6个候选基因：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。进一步，本发明进行了分子细胞生物学方法证实了上述6个候选基因均与盆腔脱垂具有很好的相关性，候选基因在盆腔脱垂患者组织中明显高表达，可用于制备盆腔脱垂辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。

[0005] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。

[0006] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，KIAA1644，PCP4，LINC00890。

[0007] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，LINC00890。

[0008] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4。

[0009] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。

[0010] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，RPRM，PCP4，LINC00890。

[0011] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：SALL1，KIAA1644，RPRM，LINC00890。

[0012] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，KIAA1644，PCP4，LINC00890。

[0013] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，KIAA1644，LINC00890。

[0014] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，KIAA1644，RPRM，LINC00890。

[0015] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，KIAA1644，LINC00890。

[0016] 本发明的目的在于提供分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，KIAA1644。

[0017] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。进而通过分子细胞生物学方法验证了上述6个后续基因与盆腔脱垂的关系：候选基因与盆腔脱垂具有很好的相关性，可用于制备盆腔脱垂辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。

[0018] 进一步的，所述的分子标志物在盆腔脱垂组织中高表达。CPXM1基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多，SALL1基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织6倍多，KIAA1644基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多，RPRM基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织4倍多，PCP4基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多，LINC00890基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多。

[0019] 进一步，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片检测盆腔脱垂组织中上述候选基因任意一个或几个的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增上述候选基因任意一个或几个基因的引物；所述的基因芯片中包括与上述候选基因任意一个或几个基因的核酸序列杂交的探针。更优选的，所述特异性扩增CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890基因的引物见序列表SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.26。

[0020] 进一步，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用免疫方法检测盆腔脱垂组织中上述候选基因任意一个或几个基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/胶体金检测。

[0021] 进一步，所述检测上述候选基因任意一个或几个基因表达的蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的上述候选基因任意一个或几个基因的单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被上述候选基因任意一个或几个基因的单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

[0022] 进一步，所述检测上述候选基因任意一个或几个基因表达的蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的上述候选基因任意一个或几个基因的单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗上述候选基因任意一个或几个基因单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

[0023] 本发明的目的还在于提供一种分子标志物在制备盆腔脱垂治疗制剂中的应用，所述分子标志物选自下述任意一种或多种基因和/或基因的表达产物：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。

[0024] 进一步，所述盆腔脱垂治疗制剂抑制分子标志物的转录和/或表达。

[0025] 抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活上述候选基因任意一个或几个基因的抑制基因、激活抑制上述候选基因任意一个或几个基因表达的蛋白、导入抑制上述候选基因任意一个或几个基因表达的siRNA、激活促进上述候选基因任意一个或几个基因mRNA降解的microRNA、导入促进上述候选基因任意一个或几个基因表达的蛋白降解的分子、抑制促进上述候选基因任意一个或几个基因表达的因子及蛋白的表达。

[0026] 进一步，所述抑制上述候选基因任意一个或几个基因转录或表达的siRNA序列选自序列表中SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.12的任意一种和/或几种。

[0027] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

[0028] 本发明的目的在于提供一种盆腔脱垂抑制剂，所述盆腔脱垂抑制剂抑制上述候选基因任意一个或几个基因的转录或表达，优选的，盆腔脱垂抑制剂中含有抑制上述候选基因任意一个或几个基因的转录或表达的siRNA。更优选的，所述抑制上述候选基因任意一个或几个基因的转录或表达的siRNA选自序列表中SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.12的任意一种和/或几种。

[0029] 本发明的目的在于提供一种盆腔脱垂诊断制剂，所述盆腔脱垂诊断制剂检测上述候选基因任意一个或几个基因的转录或表达，优选的，盆腔脱垂诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测。

[0030] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

[0031] 基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。

[0032] 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

[0033] 常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

[0034] 本发明的目的在于提供一种检测盆腔脱垂的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测上述候选基因任意一个或几个基因，采用特异的上游引物和下游引物。

[0035] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

[0036] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为GAPDH。

[0037] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

[0038] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-102copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。

[0039] 发明目的是提供了一种盆腔脱垂蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测上述候选基因任意一个或几个基因表达的蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

[0040] 本发明目的是提供了一种检测盆腔脱垂的基因芯片，所述的基因芯片包括与上述候选基因任意一个或几个基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

[0041] 图1候选基因在盆腔脱垂患者组及对照组中相对表达量

[0042] 图2RNA干扰后各组候选mRNA表达水平

[0043] 图3宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线1

[0044] 图4宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线2

[0045] 图5宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线3

[0046] 图6宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线4

[0047] 图7宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线5

[0048] 图8宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线6

具体实施方式

[0049] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

[0050] 实施例1病例的收集

[0051] 取2012年9月到2013年12月期间在协和医院妇产科就诊的POP患者，共收集9例，对照来源于同时期妇产科住院的其他妇科疾病(除癌症患者)患者以及体检人群，以年龄、居住地为匹配因素，收集共3例。获取所有研究对象的子宫骶韧带组织样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。

[0052] POP组入选标准：a.经妇科检查后POP-Q评分≥II度；

[0053] b.连续居住北京地区；

[0054] c.至少一次分娩史。

[0055] 排除标准：a.近3个月行激素替代治疗患者；

[0056] b.结缔组织疾病患者(风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、马方综合征、爱唐综合征)；

[0057] c.妊娠患者；

[0058] d.患者拒绝加入；

[0059] e.恶性肿瘤患者。

[0060] 对照组入选标准：a.POP-Q评分≤I度；

[0061] b.至少一次分娩史；

[0062] c.年龄、居住地与病例组匹配

[0063] d.无POP病史。

[0064] 排除标准：同POP组

[0065] 盆腔器官脱垂定量分期法(Pelvic Organ Prolapse Quantitation，POP-Q)：利用阴道顶端、阴道前后壁上的2个解剖指示点与处女膜的关系来界定盆腔器官的脱垂程度，分为0-IV度。检查时所有患者取截石位，并做最大Valsalva动作。

[0066] 0度表示没有脱垂；

[0067] I度表示脱垂最远端在处女膜内，距离处女膜＞1cm处；

[0068] II度表示脱垂最远端在处女膜边缘的1cm内，不论内外；

[0069] III度表示脱垂最远端在处女膜外，距离处女膜边缘＞1cm，但小于(阴道总长度-2cm)；

[0070] IV度表示阴道完全或几乎完全脱垂，脱垂最远端≥(阴道总长度-2cm)。

[0071] 实施例2高通量测序及分析

[0072] 对组织进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

[0073] 测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC

[0074] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了6个差异表达基因：CPXM1，SALL1，KIAA1644，RPRM，PCP4，LINC00890。

[0075] 实施例3盆腔脱垂患者及对照的宫骶韧带组织候选基因表达情况

[0076] 一、材料和方法

[0077] 1、材料

[0078] 选取35例盆腔脱垂患者宫骶韧带组织及5例对照宫骶韧带组织，对其进行分组及编号。对照组为开腹或阴式子宫全切除术的妇科良性疾病患者，经阴道检查排除盆腔器官脱垂，无尿失禁症状。35例盆腔脱垂患者中17例为II度、8例III度、10例为IV度。

[0079] 2、方法

[0080] 2.1盆腔脱垂患者及对照的宫骶韧带组织总RNA的提取

[0081] 采用 Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。

[0082] 2.2逆转录合成cDNA

[0083] 采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。

[0084] 2.3Real-Time PCR

[0085] 2.3.1仪器及分析方法

[0086] 用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

[0087] 2.3.2引物设计

[0088] 采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_019609.4(CPXM1)，NM_002968.2(SALL1)，NM_001099294.1(KIAA1644)，NM_019845.2(RPRM)，NM_006198.2(PCP4)，LINC00890(LINC00890)内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

[0089] 表1 引物序列

[0090]

[0091] 操作过程如下：

[0092] (一)反应体系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，60℃
45sec)×40个循环。

[0093] 表2 RealTime反应体系

[0094]组分加入量

[0095]2×mix 10μl
上游引物(10uM) 0.5μl
下游引物(10uM) 0.5μl
模板 2μl
加入灭菌蒸馏水至25μl

[0096] (二)引物筛选

[0097] 将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

[0098] (三)样品RealTimePCR检测

[0099] 将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

[0100] 二、实验结果

[0101] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较候选基因在盆腔脱垂组织和对照组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，CPXM1基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织近4倍，SALL1基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织6倍多，KIAA1644基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多，RPRM基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织4倍多，PCP4基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多，LINC00890基因在盆腔脱垂组织中的表达水平高于对照组织3倍多(具体见图1)，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析中候选基因在盆腔脱垂患者中高表达的结果。

[0102] 实施例4宫骶韧带成纤维细胞的原代培养、纯化、传代

[0103] 一、细胞的原代培养

[0104] (1)将组织标本放平皿中，PBS冲洗3遍，眼科剪剪碎；

[0105] (2)37℃5％二氧化碳孵箱中，1％I型胶原酶1ml消化剪碎组织2h；

[0106] (3)将含有细胞的消化液转入无菌15m1离心管，离心，40C，1500rpm，5min；

[0107] (4)弃上清液后，将离心管底部含有细胞的悬液用吸管吹匀后转移到25cm2培养瓶，静止0.5h后加入含15％胎牛血清(FBS)的M199培养基5ml，放入37℃5％二氧化碳孵箱中进行原代细胞培养，次日更换培养基；

[0108] (5)每隔3d换液一次：弃旧培养基，PBS冲洗1遍，加入含15％FBS的M199新鲜培养基5ml；

[0109] (6)常规倒置显微镜下观察细胞的形态及生长情况；

[0110] (7)当生长的细胞铺满瓶底70％-80％时，采用差时贴壁法对培养出的宫骶韧带细胞进行纯化。

[0111] 二、细胞的纯化

[0112] (1)在超净台上，将原培养基弃去，用PBS 2m1洗两次，弃去，加入0.25％Trypsin-0.02％EDTAlml，37℃5％二氧化碳孵箱中消化1-2分钟；

[0113] (2)在常规倒置显微镜下观察，出现大部分细胞变圆变悬浮后，加入1ml的含15％FBS的M199培养基，轻轻摇晃以中和0.25％Trypsin-0.02％EDTA；

[0114] (3)将混合液吸至无菌的15m1离心管中，1500rpm，4℃离心5min，弃上清，加入含15％FBS的M199培养基3m1，用吸管轻轻吹打，混匀细胞后，接种于新的25cm2培养瓶中，放入
37℃5％二氧化碳孵箱中0.5h，后弃培养基，贴壁快的细胞(成纤维细胞)留在瓶壁上，贴壁慢的细胞(平滑肌细胞)随着培养基被弃掉，再加入新的培养基放入孵箱中继续培养；

[0115] (4)每隔3d换液一次：弃旧培养基，PBS冲洗1遍，加入含15％FBS的M199新鲜培养基5ml；

[0116] (5)当生长的细胞铺满瓶底70％-80％时，采用差时贴壁法按照上述步骤对培养出的宫骶韧带细胞再次进行纯化；

[0117] (6)第二次纯化后的细胞用含15％FBS的M199培养基进行培养，当纯化后细胞铺满瓶底70％-80％时，进行传代培养。

[0118] 三、细胞传代培养

[0119] (1)在超净台上，将原培养基弃去，用PBS 2m1洗两次，弃去，加入0.25％Trypsin-0.02％EDTAlml，37℃5％二氧化碳孵箱中消化1-2分钟；

[0120] (2)在常规倒置显微镜下观察，出现胞质回缩，细胞间隙增大，大部分细胞变圆变悬浮后，加入1ml的含15％FBS的M199培养基，轻轻摇晃以中和0.25％Trypsin-0.02％EDTA；

[0121] (3)将混合液吸至无菌的15ml离心管中，1500rpm，4℃，离心5min，弃上清，加入含15％FBS的M199培养基2m1，用吸管轻轻吹打，混匀细胞后，按1:2或1:3接种与新的25cm2培养瓶中，放入37℃5％二氧化碳孵箱，次日更换培养基；

[0122] (4)当细胞长满瓶壁后，同法将细胞传入新培养瓶，3-8代的细胞用于本实验。

[0123] 实施例5RNAi干扰候选基因表达及对宫骶韧带成纤维细胞的影响

[0124] 一、材料

[0125] (一)细胞来源

[0126] 实施例4培养的宫骶韧带成纤维细胞。

[0127] (二)siRNA构建与合成

[0128] 依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，候选基因序列参照NCBI:NM_019609.4(CPXM1)，NM_002968.2(SALL1)，NM_001099294.1(KIAA1644)，NM_019845.2(RPRM)，NM_006198.2(PCP4)，LINC00890(LINC00890)，设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成。

[0129] 二、实验方法

[0130] (一)RNA干扰抑制宫骶韧带成纤维细胞候选基因的表达

[0131] 1、siRNA的设计与合成

[0132] siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记，可以实时监测载体在细胞中的转染效率。根据目的mRNA序列，每个候选基因设计3条RNA干扰靶序列经过实验筛选出最佳干扰序列，同时设计阴性对照(见表3)。对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA(shorthairpin RNA)。合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNA PoIyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点，可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间。siRNA空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3:1。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37℃培养过夜。PCR鉴定；测序鉴定。柱抽提阳性克隆载体并定量。

[0133] 表3siRNA转录模板序列

[0134]

[0135] 3、细胞分组及转染

[0136] (1)细胞分组

[0137] C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。

[0138] (2)转染

[0139] 按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent提供的步骤进行。

[0140] ①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1×105/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。

[0141] ②配制转染液体：

[0142] A液：250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；

[0143] B液：250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；

[0144] ③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO2培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。

[0145] 4、转染效率的验证

[0146] (1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况

[0147] 转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧光下观察转染情况。

[0148] (2)应用Real-time PCR方法检测转染前后候选基因表达的变化

[0149] ①标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的宫骶韧带成纤维细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入候选基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到候选和内参的标准曲线。

[0150] ②Real-time PCR方法检测转染前后候选基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行候选和内参的Real-time PCR反应，实验重复三次。

[0151] ③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

[0152] 三、实验结果

[0153] 结果显示本发明构建的候选基因干扰载体都对宫骶韧带成纤维细胞中候选基因表达起到一定抑制作用，其中CPXM1-siRNA对CPXM1基因抑制率达39％，具体见图3；SALL1-siRNA对SALL1基因抑制率达61％，具体见图4；KIAA1644-siRNA对KIAA1644基因抑制率达42％，具体见图5；RPRM-siRNA对RPRM基因抑制率达54％，具体见图6；PCP4-siRNA对PCP4基因抑制率达43％，具体见图7；LINC00890-siRNA对LINC00890基因抑制率达41％，具体见图
8。

[0154] 实施例6MTT法检测宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线:

[0155] 一、实验分组

[0156] 对照组：为开腹或阴式子宫全切除术的妇科良性疾病患者，经阴道检查排除盆腔器官脱垂，无尿失禁症状；宫骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外0.5-1.0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧带细胞培养，传代培养第4-6代；

[0157] POP组：由资深临床医师按照POP-Q法判定脱垂度在POP-QII度的患者；宫骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外0.5-1.0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧带细胞培养，传代培养第4-6代；

[0158] POP干扰组：由资深临床医师按照POP-Q法判定脱垂度在POP-QII度的患者；宫骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外0.5-1.0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧带细胞培养，传代培养第4-6代，按照实施例5所述的方法转染干扰载体；POP干扰组对照：由资深临床医师按照POP-Q法判定脱垂度在POP-QII度的患者；宫骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外0.5-1.0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧带细胞培养，传代培养第4-6代，按照实施例5所述的方法转染非特异性的siRNA；

[0159] 二、MTT法实验步骤

[0160] (1)取上述各组细胞，细胞密度为80％-90％的宫骶韧带成纤维细胞，用0.25％Trysin-0.02％EDTA消化，含10％胎牛血清(FBS)的M199培养基1ml终止消化。离心后，用细胞计数板计数，调整细胞密度为5×104/ml，取吹打均匀的细胞悬液，每孔200u1，种至96孔板，用含10％FBS的M199培养基置于37℃5％二氧化碳温箱中培养；

[0161] (2)种板后第二天，弃培养基，每孔加入20u1MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)继续培养4h；

[0162] (3)MTT加入培养4h后，Formazan结晶可充分形成，将上清轻轻弃掉，避免不要将Formazan结晶移走；

[0163] (4)每孔加入150u1二甲基亚飒(DMSO)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值(A)，并求其各组相应的平均吸光值；

[0164] (5)分别于种板后第二天、第四天、第六天、第八天、第十天、第十二天测相应的A值，并求其平均值；

[0165] (6)以时间为X轴，吸光值为Y轴作图，分别绘制各组宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线。

[0166] 三、实验结果

[0167] 用四唑盐(MTT)比色法测定成纤维细胞的生长曲线，96孔板最佳，接种细胞数为1×104个/孔。酶标仪所测的490nm处的吸光度即A值见表4。结果显示：在相同时间内，POP组和对照组、POP组和POP干扰组、POP干扰组对照和对照组的A值差异显著，有统计学意义(P<0.01)，具体见图3。结果表明POP组细胞的生长增殖活性小于对照组，POP干扰组细胞的生长增殖活性较POP组有了明显提高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

[0168] 表4 宫骶韧带成纤维细胞的吸光度A(X±S)

[0169]

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发明人确认方法和发明人确认系统-专利编号CN110136030A	2020-05-11	485
IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用-专利编号CN109781977A	2020-05-13	335
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一组盆腔脱垂诊断标记及其应用

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