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TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用

阅读：496发布：2021-02-27

IPRDB可以提供TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。发明人发现并通过大样本验证TSPAN15在骨性关节炎组织中高表达，进一步在软骨细胞实验结果表明，TSPAN15的抑制剂可用于制备治疗骨性关节炎药物。本发明为临床提供了新的治疗骨性关节炎药物研究方向，具有重要的应用价值。，下面是TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.检测TSPAN15基因和/或基因的表达产物的制剂在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨性关节炎诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨性关节炎组织中TSPAN15基因的表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增TSPAN15基因的引物；所述的基因芯片中包括与TSPAN15基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测TSPAN15基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的骨性关节炎诊断制剂采用免疫方法检测骨性关节炎滑膜组织中TSPAN15基因的表达产物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

7.含有抑制TSPAN15基因的转录或表达的试剂或化合物在制备治疗骨性关节炎的制剂中的应用，其特征在于，抑制TSPAN15基因的转录或表达的试剂或化合物为抑制TSPAN15基因的转录或表达的siRNA。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗骨性关节炎的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

9.含有抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物的化合物在制备促进软骨细胞增殖制剂中的应用，其特征在于，抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物的化合物为抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物的siRNA。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述促进软骨细胞增殖制剂中含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

说明书全文

TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用。

背景技术

[0002] 骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种随着年龄的增长而发生率明显增加的退行性关节炎疾病，也是老年人关节疼痛和致残的主要原因。根据世界卫生组织的统计，膝骨性关节炎在女性患病率中占第四位，随着年龄的增长，其患病率也明显上升，大于65岁的人群中50％以上都有骨性关节炎的临床表现。目前对于骨性关节炎的治疗方法主要是早期采用非手术治疗，止痛、保护和延缓软骨的退化；晚期软骨破坏严重，有剥脱或者游离体，骨赘增生等，此阶段就要采用手术治疗，例如关节清理、截骨术或融合术、人工关节置换术等，而漫长的保守治疗和昂贵的手术费用对于骨性关节炎这种慢性疾病尤不适合。因此，明确OA的发病机制，找寻预防OA、早期干预并延缓软骨退变进程的方法就成为医学上亟待解决的问题。

[0003] 发明人对7例骨性关节炎滑膜组织及4例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中挑选出高表达的候选基因TSPAN15，现有研究中并没有TSPAN15和骨性关节炎相关的报道，进一步，发明人进行了分子细胞生物学方法验证，证实了TSPAN15在骨性关节炎组织中高表达，TSPAN15抑制剂可用于制备治疗骨性关节炎药物。本发明提供了一种新的骨性关节炎的治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种骨性关节炎诊断制剂，所述骨性关节炎诊断制剂检测TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物。

[0005] 进一步，所述骨性关节炎诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨性关节炎组织中TSPAN15基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增TSPAN15基因的引物；所述的基因芯片中包括与TSPAN15基因的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测TSPAN15基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。

[0006] 进一步，所述的骨性关节炎的诊断制剂采用免疫方法检测骨性关节炎滑膜组织中TSPAN15基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

[0007] 进一步，所述检测TSPAN15表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的TSPAN15单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被TSPAN15单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

[0008] 进一步，所述检测TSPAN15蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的TSPAN15单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗TSPAN15单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

[0009] 本发明的目的在于提供上述骨性关节炎诊断制剂在制备骨性关节炎诊断工具中的应用。

[0010] 本发明的目的在于提供一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有抑制TSPAN15基因的转录或表达的试剂或化合物。

[0011] 进一步，所述治疗骨性关节炎的制剂中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制TSPAN15表达的蛋白、导入抑制TSPAN15转录或表达的siRNA、激活促进TSPAN15mRNA降解的microRNA、导入促进TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促进TSPAN15表达的因子及蛋白的表达。

[0012] 优选的，所述治疗骨性关节炎的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。更优选的，所述治疗骨性关节炎的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

[0013] 本发明的目的在于提供上述治疗骨性关节炎的制剂在制备骨性关节炎治疗药物或试剂中的应用。

[0014] 本发明的目的在于提供一种促进软骨细胞增殖制剂，所述促进软骨细胞增殖制剂中含有抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表达产物的化合物。

[0015] 进一步，所述促进软骨细胞增殖制剂中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制TSPAN15表达的蛋白、导入抑制TSPAN15转录或表达的siRNA、激活促进TSPAN15mRNA降解的microRNA、导入促进TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促进TSPAN15表达的因子及蛋白的表达。

[0016] 优选的，所述促进软骨细胞增殖制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。更优选的，所述治疗骨性关节炎的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

[0017] 本发明的目的在于提供上述促进软骨细胞增殖制剂在制备促进软骨细胞增殖工具中的应用。

[0018] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因TSPAN15基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了TSPAN15基因与骨性关节炎的关系：TSPAN15基因在滑膜组织中高表达，与骨性关节炎具有很好的相关性，可用于制备骨性关节炎辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。

[0019] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。

[0020] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

[0021] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

[0022] 基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

[0023] 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

[0024] 常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

[0025] 本发明的目的在于提供一种检测骨性关节炎的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因TSPAN15，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。

[0026] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

[0027] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为GAPDH。

[0028] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

[0029] 本发明目的是提供了一种骨性关节炎蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测TSPAN15蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

[0030] 本发明目的是提供了一种检测骨性关节炎的基因芯片，所述的基因芯片包括与TSPAN15基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

[0031] 图1 siRNA干扰后各组TSPAN15mRNA相对表达量

[0032] 图2 siRNA对软骨细胞增殖的影响

具体实施方式

[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

[0034] 实施例1病例的收集

[0035] 取2012年10月到2014年12月期间在医院骨科就诊骨性关节炎患者，病例组共收集7例，对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，收集共4例。获取所有研究对象的滑膜组织样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。

[0036] 实施例2高通量测序及分析

[0037] 对组织进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

[0038] 测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因TSPAN15。

[0039] 实施例3骨性关节炎患者及对照滑膜组织TSPAN15基因表达情况

[0040] 一、材料和方法

[0041] 1、材料

[0042] 选取39例骨性关节炎患者滑膜组织及8例对照滑膜组织，对其进行分组及编号。病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节人工关节置换术患者；对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。

[0043] 2、方法

[0044] 2.1骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取

[0045] 采用 Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。

[0046] RNA提取后用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、
18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

[0047] 2.2逆转录合成cDNA

[0048] 采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

[0049] 2.3 Real-Time PCR

[0050] 2.3.1仪器及分析方法

[0051] 用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

[0052] 2.3.2引物设计

[0053] 采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_012339.3(TSPAN15)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

[0054] 表1引物序列

[0055]

[0056] 操作过程如下：

[0057] 表2 RealTime反应体系

[0058]组分加入量
2×mix 10μl
上游引物(10uM) 0.5μl
下游引物(10uM) 0.5μl
模板 2μl
加入灭菌蒸馏水至25μl

[0059] (一)反应体系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

[0060] 扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，60℃45sec)×35个循环。

[0061] (二)引物筛选

[0062] 将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

[0063] (三)样品RealTimePCR检测

[0064] 将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

[0065] 二、实验结果

[0066] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较TSPAN15基因在骨性关节炎组织和对照组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中TSPAN15基因在骨性关节炎组织中的表达水平为对照组织的近
3倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析TSPAN15基因在骨性关节炎患者中高表达的结果。

[0067] 实施例4软骨细胞的分离和培养

[0068] 一、实验方法

[0069] (1)将创伤性截肢取下的无菌膝关节软骨标本后立即置于PBS无菌培养皿中，去除关节软骨周围的所有软组织，得膝关节的全层软骨片；

[0070] (2)以无菌手术刀将软骨修剪成约3mm×lmm×lmm大小的组织块，剪碎软骨组织，之后将这些软骨碎块用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS缓冲液冲洗数次后，放入盛有DMEM/F 12培养基的无菌培养皿中；

[0071] (3)将这些修剪的软骨碎块移入离心管中，低温下以1000转/分的速度离心约5分钟；

[0072] (4)将上清液弃去之后加入5ml的0.25％胰蛋白酶，在37℃温搅拌器上消化30-50分钟，然后轻轻吹打弃去上清液，D-Hanks液冲洗3-5次；

[0073] (5)加入5ml的0.15％的II型胶原酶，放入恒温摇箱中，37℃下摇荡消化6小时，每3个小时收一次细胞；

[0074] (6)200目筛网过滤消化后的细胞悬液，低温离心5分钟(约2800转/分)后再次弃去上清液，然后在DMEM/F 12培养液中洗涤3次，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，用吸管轻轻吹打，使细胞悬液分布均匀，从而得到含有软骨细胞的细胞悬液；

[0075] (7)将细胞以1×108/L接种于25CM2培养瓶内(5ml/瓶)，置于37℃恒温，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，更换培养液的频率为每两天1次，利用倒置相差显微镜进行观察和照相，只要软骨细胞汇合成片且贴壁率达到85％-90％后就可以开始传代；

[0076] (8)在传代开始前，先洗净培养液，随后用HANKS液轻洗细胞2-3次；

[0077] (9)在培养瓶内加入0.05％的胰蛋白酶1ml，待其在瓶底均匀分布后将其吸尽，然后再次加入0.05％的胰蛋白酶消化液，以覆盖瓶底为限，之后将其放在37℃恒温培养箱内2-3分钟；

[0078] (10)用倒置显微镜进行观察，当细胞开始回缩，细胞间隙开始增大时，则表明软骨细胞开始游离；

[0079] (11)加入HANKS液终止培养瓶中的消化作用，轻吹瓶底软骨细胞，往往需要反复多次才能使贴壁的软骨细胞完全脱落；

[0080] (12)以1200rpm的速度对细胞悬液进行离心，10分钟后将上清液弃去；

[0081] (13)制成细胞悬液并计数，然后按照1:3的比例进行传代培养。

[0082] 二、实验结果

[0083] 正常软骨细胞一般在24小时左右开始贴壁生长，48小时以后贴壁细胞可以达到90％左右，一般情况下4至7天可长满瓶底，贴壁的软骨细胞具有丰富的胞浆，呈多角形扁平状，可有多个突起，胞体中央为圆形或椭圆形的胞核，可见2至3个核仁，有些区域的软骨细胞呈集落生长。培养至第三代时，软骨细胞开始去分化，并且这种去分化的趋势会随着代数的增加而增强，到第四代时逐渐出现纤维细胞样的变化，具体体现在:形态呈长梭形；边缘突起多且细长；胞浆增多但细胞核偏离中央且核仁肥大。

[0084] 实施例5 RNAi干扰TSPAN15表达及对软骨细胞的影响

[0085] 一、材料

[0086] (一)细胞来源

[0087] 实施例4培养的软骨细胞。

[0088] (二)siRNA设计与合成

[0089] 依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，根据基因序列参照NCBI:NM_012339.3(TSPAN15)，设计相应的siRNA，具体序列见表3。设计后送往合成公司合成。

[0090] 表3 siRNA序列列表

[0091]

[0092] 二、实验方法

[0093] (一)RNA干扰抑制软骨细胞TSPAN15基因的表达

[0094] 细胞分组及转染

[0095] 1.细胞分组

[0096] C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。

[0097] 2.转染

[0098] 按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent提供的步骤进行。

[0099] (1)软骨细胞同步化：转染前一天，取第一代软骨细胞进行试验，将其加入至5％FBS高糖DMEM培养基内，继续在37℃5％CO2内进行培养，从而使所有软骨细胞处于同步状态，减少试验干扰；

[0100] (2)5×104细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；

[0101] (3)准备siRNA-LipofectamineTM 2000复合物:

[0102] a.以250u1Opti-MEM稀释5ul LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。

[0103] b.实验各组分别取7.5u1siRNA加入250u1Opti-MEM I中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；

[0104] c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和LipofectamineTM 2000混合后在室温下孵育20分钟。

[0105] (4)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM 2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；

[0106] (5)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；

[0107] (6)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：

[0108] 转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％

[0109] 3.应用Real-time PCR方法检测转染前后TSPAN15基因表达的变化

[0110] (1)标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的软骨细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入TSPAN15基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到TSPAN15和内参的标准曲线。

[0111] (2)Real-time PCR方法检测转染前后TSPAN15基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进TSPAN15和内参的Real-time PCR反应，实验重复三次。

[0112] (3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

[0113] 三、实验结果

[0114] 分别3条TSPAN15基因的siRNA及对照siRNA转染第一代软骨细胞，结果显示在大量软骨细胞内发现绿色荧光，证明软骨细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察软骨细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到90％以上。Real-time PCR结果显示，转染非特异性的siRNA组对软骨细胞中TSPAN15基因表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的3个TSPAN15基因siRNA组都对软骨细胞中TSPAN15基因表达起到一定抑制作用，其中TSPAN15-siRNA2和TSPAN15-siRNA3抑制效果最明显，抑制率达64％和72％，具体见图1。

[0115] 实施例6 MTT法检测软骨细胞的增殖情况

[0116] 一、MTT法实验步骤

[0117] 1.在96孔板中，按照每孔加入约1×104细胞，然后在37℃5％CO2的条件下培养24小时；

[0118] 2.按照实验分组(空白对照组、软骨细胞加非特异性的siRNA组、软骨细胞加TSPAN15-siRNA3组，每组6个重复)继续培养直至适合检测；

[0119] 3.接着在37℃，5％CO2及100％湿度的条件下继续孵育适当时间；

[0120] 4.同时用Dilution Buffer将5×MTT稀释成1×MTT；

[0121] 5.在每孔中加入50ul 1×MTT，并在37℃条件下孵育4小时；

[0122] 6.吸出上清液后，在每孔中还需加入150u1DMSO，并将其放置在平板摇床上进行摇匀；

[0123] 7.将酶标仪波长设定为570nm，检测每个孔的光密度。

[0124] 8.细胞增殖率的计算：细胞增殖率％＝(受试孔OD值/对照细胞OD值)×100％，其中受试孔OD值＝测试孔的OD值-本底OD值(没有细胞但有MTT的完全培养基)，对照细胞OD值为正常培养细胞孔的OD值。

[0125] 三、实验结果

[0126] 分别在0、12、24、48和72小时节点上取样，相对软骨细胞对照组，软骨细胞加非特异性的siRNA组细胞增殖无显著差异，软骨细胞加TSPAN15-siRNA3组在0-24小时细胞增殖不明显，但是随着时间的增加，在48、72小时节点上软骨细胞增殖率显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见图2和表4所示。

[0127] 表4各组软骨细胞的增殖率(％)

[0128]时间空白对照组非特异性的siRNA组 TSPAN15-siRNA3组
第0h 99.273±0.674 99.273±0.771 99.273±0.528
第12h 99.562±0.985 98.852±1.562 102.011±1.058
第24h 99.681±1.024 99.746±1.974 104.323±0.972
第48h 99.398±1.387 100.023±0.956 129.885±1.103
第72h 99.775±1.916 99.546±0.849 140.011±2.007

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TSPAN15在制备骨性关节炎诊断制剂中的应用

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