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一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒

阅读：403发布：2021-03-03

IPRDB可以提供一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，本发明的发明人偶然发现将大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力，由此发明了提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，解决了目前黑曲霉的发酵生产纤维素酶方面的技术难题。，下面是一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：

该方法包括以下步骤：

步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：

所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；

所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因；

步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；

步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。

2.如权利要求1所述的提高黑曲霉的纤维素酶的酶活的方法，其特征在于：所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述的提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：在所述步骤1)中，clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，所采用的表达载体为pCAMBIA1300载体。

5.如权利要求4所述的提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，所采用的限制性内切酶为Sma I和Xba I。

6.如权利要求5所述的提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：所述步骤3)中，将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体通过PEG介导的原生质体转化到黑曲霉CICC41061菌株中，获得重组黑曲霉菌株。

7.一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒至少包含纤维素酶的表达载体，所述纤维素酶的表达载体含有纤维素酶表达单元，所述纤维素酶表达单元为clp基因启动子序列-clp基因的完整ORF序列-engXCA基因启动子序列-engXCA基因的完整ORF序列；

所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：

所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-

3'，如SEQ ID No.1所示。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：

所述clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

10.一种重组黑曲霉菌株，其特征在于：

所述重组黑曲霉菌株是采用如权利要求1至6中任意一项所述的方法获得的重组黑曲霉菌株。

说明书全文

一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 黑曲霉是曲霉属真菌中的一个常见菌种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，也是重要的发酵工业菌种，可用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等，是制酱、酿酒和制醋的主要菌种。

[0003] 黑曲霉是目前食品工业领域应用广泛的菌种，如何提高黑曲霉的纤维素酶产量和酶活力也是本领域的研究人员一直致力于解决的技术难题。例如，通过基因工程的手段导入纤维素外切酶基因，提高外切酶的酶活力，或者敲除一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。

[0004] 除了黑曲霉以外，黄单胞菌属中不少菌种的基因组中也含有胞外纤维素酶基因，例如，在野油菜黄单胞菌(X.campestris pv.campestris，简称Xcc)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是engXCA；在白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae，简称Xoo)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是clsA(与engXCA基因同源)、eglXoB和cbsA；在柑橘溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri 29-1，简称Xac)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是bglC3；在大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是engXCA基因。

[0005] 然而，上述这些黄单胞菌属菌株的胞外纤维素酶基因是否可以加以利用来提高黑曲霉的纤维素酶的酶活力，本领域技术人员尚未进行这方面的研究。

发明内容

[0006] 鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，

[0007] 该方法包括以下步骤：

[0008] 步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：

[0009] 所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；

[0010] 所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因；

[0011] 步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；

[0012] 步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。

[0013] 优选的，所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQ ID No.1所示。

[0014] 优选的，所述步骤1)中，clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

[0015] 优选的，在所述步骤2)中，所采用的表达载体为pCAMBIA1300载体。

[0016] 优选的，在所述步骤2)中，所采用的限制性内切酶为Sma I和Xba I。

[0017] 优选的，所述步骤3)中是通过PEG介导的原生质体转化将所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中。

[0018] 优选的，所述步骤3)中，将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲酶CICC41061菌株中，获得重组黑曲霉菌株。

[0019] 本发明另一方面提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的试剂盒，其中，所述试剂盒至少包含纤维素酶的表达载体，所述纤维素酶的表达载体含有纤维素酶表达单元，所述纤维素酶表达单元为clp基因启动子序列-clp基因的完整ORF序列-engXCA基因启动子序列-engXCA基因的完整ORF序列；

[0020] 所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因。

[0021] 优选的，所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQ ID No.1所示。

[0022] 优选的，所述clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

[0023] 本发明另一方面提供了一种重组黑曲霉菌株，其中，所述重组黑曲霉菌株是采用如上述的方法获得的重组黑曲霉菌株。

[0024] 本发明的发明人偶然发现将大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力，由此获得了本发明的一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒。

附图说明

[0025] 图1为对比实验中的实施组1和2以及对比组1和2的菌株分泌的胞外纤维素滤液的水解透明圈半径的数据结果。

具体实施方式

[0026] 本发明的发明人在研究的过程中，偶然发现，将大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力。

[0027] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，该方法包括以下步骤：

[0028] 步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：

[0029] 所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；

[0030] 所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因；

[0031] 步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；

[0032] 步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。

[0033] 关于术语“clp基因”，编码clp(Crp-like protein)，又称为全局性调控转录子基因，其表达的蛋白(也称全局性调控子蛋白)通过与启动子区保守的DNA绑定位点结合，从而调控其下游基因(约占全基因组20％的基因)的转录表达。

[0034] 在本申请中，clp基因是指大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因。

[0035] 术语“ORF序列”是指开放性阅读框(open reading frame)，是指结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框，可以编码完整的多肽链，中间不存在使翻译中断的终止密码子。

[0036] 术语“engXCA基因”是指胞外纤维素酶的编码基因。在本发明中具体指大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)中的engXCA基因。clp基因表达后的Clp蛋白可以与engXCA基因的启动子序列结合，从而调控纤维素酶的表达。

[0037] 在本发明的一个优选实施方案中，发明人改造了engXCA基因启动子序列，具体来说，改造了engXCA基因启动子序列中的Clp识别位点的DNA序列，将engXCA基因启动子序列第-148～-163位点的序列从5'-TGTGACCGGTGCGCCA-3’(如SEQ ID No.7所示)改造为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'(如SEQ ID No.1所示)；发明人意外地发现，engXCA基因启动子序列经过改造后，能够显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力。发明人推测，Clp蛋白能更好地与改造后的engXCA基因启动子序列结合，从而提高了黑曲霉菌的纤维素酶活力。

[0038] 在本发明的一个更优选实施方案中，所述步骤1)中，clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

[0039] 在本发明的一个优选实施方案中，在构建纤维素酶的表达载体的步骤2)中，可以将上述构建的clp基因序列和engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到pCAMBIA1300载体上，获得纤维素酶的表达载体。更优选的，所采用的限制性内切酶为Sma I和Xba I。

[0040] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤3)中是通过PEG介导的原生质体转化将所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中。

[0041] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤3)中，将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲酶CICC41061菌株中，获得重组黑曲霉菌株。

[0042] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种改善黑曲霉的纤维素酶活力的表达试剂盒，所述试剂盒至少包含纤维素酶的表达载体，所述纤维素酶的表达载体含有纤维素酶表达单元，所述纤维素酶表达单元为clp基因启动子序列-clp基因的完整ORF序列-engXCA基因启动子序列-engXCA基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因。

[0043] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了采用上述方法获得的重组黑曲霉菌株。

[0044] 以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

[0045] 除非另有描述，本发明的实施将采用细胞生物学等常规技术，这些均是本领域技术人员所熟知的。这些技术在诸如Bruce Alberts《细胞分子生物学》第5版(2002)等工具书中均有完整的描述，或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

[0046] 实施例1

[0047] 一、步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：

[0048] clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；

[0049] engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因；

[0050] clp基因序列与engXCA基因序列的组合即为一个纤维素酶表达单元。

[0051] 在本实施例中，clp基因序列中，clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示；engXCA基因序列中，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

[0052] 关于clp基因序列和engXCA基因序列，可以采用人工合成的方式来制备，也可以利用大豆斑疹病菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增来制备。

[0053] 在本实施例中，是采用PCR扩增的方式来制备纤维素表达单元的核苷酸序列，具体操作如下：

[0054] 1.1引物设计

[0055] clp基因序列的扩增引物对的序列如下：

[0056] 正向序列：5’-ATCCCGGGCACGTCGGTCTGTCCTTATGG-3’(如SEQ ID No.8所示)；

[0057] 反向序列：5’-ATGAGCTCTCAGCGGGTGCCGTACAGCAC-3’(如SEQ ID No.9所示)。

[0058] engXCA基因序列的扩增引物对的序列如下：

[0059] 正向序列：5’-ATGAGCTCCTGCGGATCCACCCCGGCGAC-3’(如SEQ ID No.10所示)；

[0060] 反向序列：5’-ATTCTAGATCAACCTGCTGCGCAGAAGCC-3’(如SEQ ID No.11所示)。

[0061] 1.2 PCR扩增体系如下：

[0062]

[0063]

[0064] 1.3 PCR扩增条件：

[0065] 95℃ 2分钟；

[0066] 循环过程：95℃，20s；58℃，30s；72℃，1分钟；循环37次；

[0067] 72℃ 10分钟；

[0068] 4℃。

[0069] 关于clp基因序列和engXCA基因序列，均采用上面的PCR扩增体系和扩增条件以及各自的引物对。

[0070] 1.4关于PCR扩增后的DNA的纯化，采用Axygen公司的DNA回收试剂盒，具体操作参见该试剂盒的说明书，具体不再赘述。

[0071] 1.5序列鉴定

[0072] 采用PCR扩增(扩增体系及条件均与上述相同)及DNA测序(Tsingke公司)方式验证，具体不再赘述。

[0073] 经鉴定，扩增获得的clp基因序列正确，其包含如SEQ ID No.2所示的clp基因启动子序列，如SEQ ID No.3所示的clp基因的完整ORF序列。

[0074] 经鉴定，扩增获得的engXCA基因序列正确，其包含如SEQ ID No.4所示的engXCA基因启动子序列，如SEQ ID No.6所示的engXCA基因的完整ORF序列。

[0075] 二、步骤2)构建纤维素酶的表达载体

[0076] 2.1提取质粒pCAMBIA1300

[0077] 质粒pCAMBIA1300及其提取试剂盒购买自Axygen公司，按照试剂盒的说明书提取质粒pCAMBIA1300，具体不再赘述。

[0078] 2.2限制性酶切

[0079] 采用Sma I和Xba I对上述步骤1)获得的clp基因序列和engXCA基因序列分别进行限制性酶切，酶切体系如下：

[0080]

[0081] 将上述试剂加入1.5mL PCR管中，充分混匀后于37℃反应3-5h；

[0082] 2.3连接(获得纤维素酶的表达载体)

[0083] 将上述经过酶切的clp基因序列和engXCA基因序列连接到上述获得的质粒pCAMBIA1300中；连接体系如下：

[0084]

[0085] 其中，在上述连接体系中，酶切后的clp基因序列、酶切后的engXCA基因序列与质粒pCAMBIA1300之间的摩尔比大约为1:3:6。

[0086] 将上述试剂加入到0.2mL PCR管中，充分混匀后于4～16℃连接12-16h。

[0087] 2.4纤维素酶表达载体的复制

[0088] 首先，制备大肠杆菌超级感受态细胞；具体操作过程如下：(1)在无抗生素LB平板上划菌，培养单菌落；(2)挑取单菌落接种于10mL LB培养液中，37℃培养6-8h；(3)按3％比例将上述菌液接种于100mL LB中，18-22℃低速振摇过夜；(4)次日，测量OD600，待OD600≈0.5时，将培养瓶置于冰上10min；(5)用50mL预冷离心管4℃、3000rpm离心10min，收集菌体；(6)加35mL预冷的Inoue转化缓冲液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30min；(7)4℃、3000rpm离心10min，收集菌体；(8)加入5mL预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬浮沉淀；(9)按比加入
0.375mL DMSO，轻轻混匀细菌悬液，冰上放置10min；(10)迅速分装成小管，液氮中速冻，贮存-80℃冰箱备用。

[0089] 然后进行热激转化和筛选，具体操作如下：(1)从-80℃冰箱中取出上述获得的1支感受态细胞，放置冰上融化细胞；(2)将10μL上述2.3的连接步骤获得的DNA连接液(纤维素酶的表达载体)加入到感受态细胞中，混均，冰浴30min；(3)将管放入42℃水浴中，热激90S；(4)快速将管移至冰浴中，使细胞冷却2-3min；(5)加入800μL LB液体，37℃摇床温育45min；
(6)将已转化的感受态细胞涂布于含相应抗生素的LB培养基平板上；(7)将平板放置于37℃温箱培养12-16h，可出现筛选菌落。

[0090] 将筛选后的菌落接种于LB液体培养基，37℃、200rpm培养12-16h，提取质粒并进行验证，验证正确的质粒即为“纤维素酶的表达载体”。

[0091] 三、步骤3)转化黑曲霉菌株

[0092] 将所述步骤2)构建获得的纤维素酶的表达载体转化到黑曲酶CICC41061菌株(江南大学惠赠)中。

[0093] 转化体系采用PEG介导的原生质体转化方法。

[0094] 首先，制备原生质体，具体操作如下：(1)接种菌丝块于CM平板上生长3-4天，菌落直径约3cm；(2)切取直径约3cm的菌落，置于100mL CM液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养2天；(3)用Miracloth过滤收集菌丝，无菌水冲洗两遍，用吸水纸将水吸干；(4)将菌丝置于盛有10-20mL酶液的50mL离心管中酶解。离心管平躺，30℃、60rpm振荡1.5-2h酶解；(酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体释放情况)；(下面的步骤于4℃下完成，0.7M NaCl溶液，1×STC先放于4℃预冷)(5)取出酶解液，加少量0.7M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，用0.7M NaCl溶液轻轻冲洗1-2次，去残渣，收集滤液于50mL离心管中；(6)离心，3000rpm、4℃离心10min；(7)小心弃上清，加10-20mL 1×STC悬浮，用剪去尖头的枪头轻轻吹打，然后3000rpm、4℃离心10min；(8)重复步骤7两次；(9)加适量(约300μL)1×STC悬浮，计数，使原生质体终浓度为108个/mL，分装为150μL/管；可以立即转化，或另加7％DMSO保存于-70℃。

[0095] 然后进行转化，具体步骤如下：(1)将2μg(5μL)上述步骤2)获得的质粒(纤维素酶的表达载体)加到150μL原生质体中，轻轻混匀，静置25min；(2)分2-3次加1mL PTC，轻轻混匀，室温静置25min；(3)把原生质体加到约10mL左右熔化后冷却至45-50℃的TB3固体培养基中，轻轻混匀后倒入培养皿中，置于28℃、黑暗培养24h；(4)往培养皿中再倒入10mL含300μg/mL潮霉素B(Hygromycin B)/争光霉素(Bleomycin)的TB3固体培养基；(5)28℃下黑暗培养7-10天，一般5天后即可看出转化是否成功；(6)待上述转化子菌落直径约5mm时，从菌落上挑取小块菌丝块移置含150μg/mL Hygromycin B/Bleomycin的CM固体培养基中进行筛选转化子(进一步采用PCR验证筛选出来的转化子)，筛选出来的转化子即为获得的重组黑曲霉菌株。

[0096] 实施例2

[0097] 实施例2与实施例1的区别在于：engXCA基因序列以及PCR扩增采用的引物与条件不同。

[0098] 所述engXCA基因序列中，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

[0099] 发明人改造了engXCA基因启动子序列，具体来说，改造了野生型engXCA基因启动子序列中的Clp识别位点的DNA序列，将野生型engXCA基因启动子序列第-148～-163位点的序列从5'-TGTGACCGGTGCGCCA-3’(如SEQ ID No.7所示)改造为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'(如SEQ ID No.1所示)；

[0100] 在本实施例中，先分别扩增engXCA基因的启动子序列和完整ORF序列，之后再以扩增后的engXCA基因的启动子序列的片段和完整ORF序列的片段为模板来扩增整段engXCA基因序列。

[0101] 具体来说，首先，扩增engXCA基因的启动子序列的引物对序列如下：

[0102] 正向序列：5’-ATGAGCTCCTGCGGATCCACCCCGGCGAC-3’(如SEQ ID No.12所示)；

[0103] 反向序列：5’-CGCTGCCGCAGAAGAGCGCAGTGTGACACCGGTCACATGCAA-3’(如SEQ ID No.13所示)；

[0104] 扩增engXCA基因的完整ORF序列的引物对序列如下：

[0105] 正向序列：5’-TTGCATGTGACCGGTGTCACACTGCGCTCTTCTGCGGCAGCG-3’(如SEQ ID No.14所示)；

[0106] 反向序列：5’-ATTCTAGATCAACCTGCTGCGCAGAAGCC-3’(如SEQ ID No.15所示)。

[0107] 关于engXCA基因的启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列的PCR扩增，PCR扩增体系和条件均可以参照实施例1中engXCA基因序列的PCR扩增体系和条件，具体不再赘述。

[0108] 在获得了engXCA基因的启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列的片段后，再以扩增后的两个片段为模板来扩增整段engXCA基因序列；具体的PCR扩增体系和扩增条件如下：

[0109] PCR扩增体系：

[0110]

[0111]

[0112] PCR扩增条件：

[0113] 95℃ 2分钟；

[0114] 循环过程：95℃，30秒；62℃，2分钟；72℃，1.5分钟；循环5次；

[0115] 循环过程：95℃，20秒；55℃，2分钟；72℃，1.5分钟；循环35次；

[0116] 72℃ 10分钟；

[0117] 4℃。

[0118] 实施例2的步骤2)构建纤维素酶的表达载体和步骤3)转化黑曲霉菌株均与实施例1的操作全部相同，具体不再赘述。

[0119] 对比实验：

[0120] 对照组1：野生型的黑曲霉菌株CICC41061。

[0121] 对照组2：空白载体pCAMBIA1300质粒(没有构入上述的纤维素酶表达单元的质粒)转化黑曲霉菌株CICC41061，获得的重组黑曲霉菌株；

[0122] 实验组1：实施例1获得的重组黑曲霉菌株；

[0123] 实验组2：实施例2获得的重组黑曲霉菌株；

[0124] 将上述的对照组1和2，实验组1和2的菌株(每组5个重复试验)分别接种到PDA培养5
基斜面上，置于30℃温箱培养3天，得到斜面孢子。将斜面孢子按1×10/mL接种到PDA液体培养基中，30℃、160rpm/min震荡培养48h。离心收集上清液，并用滤器过滤，获得各组的滤液(含有胞外纤维素酶的滤液)。

[0125] 然后，测定上述获得的各组含胞外纤维素酶的滤液的酶活力，具体测定方法如下：制备含0.5％羧甲基纤维素(CMC)的PDA平板，并用打孔器在上面打孔。将40uL每组滤液接种于PDA平板上的小孔中，30℃放置48h后，在平板上加入约20mL 0.1％的刚果红(Congo Red)染色30min，20mL1M的NaCI洗涤脱色两次(20min/次)。如果滤液中含有纤维素酶，那么在红色背景下其小孔周围会形成水解透明圈，并且透明圈的大小与滤液中含有的纤维素酶活力成正比。

[0126] 根据酶活力测定结果显示，参见图1，

[0127] 实施组1(实施例1获得的重组黑曲霉菌株)中，其菌株分泌的胞外纤维素滤液的水解透明圈半径为2.84±0.38cm；

[0128] 实施组2(实施例2获得的重组黑曲霉菌株)中，其菌株分泌的胞外纤维素滤液的水解透明圈半径为3.72±0.44cm；

[0129] 对照组1(野生型的黑曲霉菌株CICC41061)中，其菌株分泌的胞外纤维素滤液的水解透明圈半径仅为1.62±0.23cm；

[0130] 对照组2(导入了pCAMBIA1300空载体的重组黑曲霉菌株)中，其菌株分泌的胞外纤维素滤液的水解透明圈半径仅为1.53±0.21cm。

[0131] 通过对比对照组1和2的结果可以看出，导入pCAMBIA1300空载体对提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力几乎没有作用。

[0132] 通过将实验组1和2与对照组1和2的结果可以看出，导入纤维素酶表达单元(clp基因序列和engXCA基因序列)可以显著提高重组黑曲霉菌株的分泌的胞外纤维素酶活力。

[0133] 通过对比实验组1和实验组2的结果可以看出，将野生型的engXCA基因启动子序列经过改造后，能够显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力。发明人推测，Clp蛋白能更好地与改造后的engXCA基因启动子序列结合，从而提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力。

[0134] 应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

[0135] 上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

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IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用-专利编号CN109781977A	2020-05-13	335
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一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒

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