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携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

阅读：895发布：2021-03-02

IPRDB可以提供携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明是一种携带MAGE‑A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，本发明的AAV/MAGE‑A3是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入MAGE‑A3抗原基因得到野生型重组腺相关病毒载体，再通过点突变得到重组腺相关病毒载体。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备细胞药物，治疗肺癌、胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤。，下面是携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于，通过切除腺相关病毒中病毒包装识别位点内全部基因，插入MAGE-A3抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到重组腺相关病毒载体；

其中，突变位点为134位和135位，分别由谷氨酸突变为谷氨酰胺，甲硫氨酸突变为异亮氨酸；

所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的是p5启动子，猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或beta肌动蛋白启动子。

2.一种含有权利要求1所述携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。

3.制备权利要求1所述携带MAGE-A3突变抗原的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；

S2：逆转录PCR后，扩增得到MAGE-A3核心致癌cDNA；

S3：将步骤S2中MAGE-A3 cDNA进行酶切反应，之后和步骤S1产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和MAGE-A3基因的重组腺相关病毒载体；

S4：使用点突变PCR技术，将MAGE-A3基因突变为MAGE-A3E134Q M135I突变抗原基因；

S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中包括以下步骤：

1)从表达MAGE-A3的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；

2)以所述总cDNA为模板，在引物1：ATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAGCACTGC和引物2：CTCTTCCCCCTCTCTCAAAACCCACTCATGCAG的引导下进行PCR扩增，得到MAGE-A3抗原的DNA。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤S4的操作方法为：使用引物

3：GCCGGTCACAAAGGCAGATATACTGGGGAGTGTCGTCG进行点突变PCR，将134位和135位的谷氨酸和甲硫氨酸突变为谷氨酰胺和异亮氨酸突变抗原基因。

6.一种用于癌症的细胞免疫治疗的药物，其特征在于：活性成分为权利要求1所述的携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，或者由权利要求3～5任一项所述的制备方法制得的重组腺相关病毒载体，或权利要求2所述的含有携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品。

7.一种权利要求1所述的携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者权利要求2所述的产品在制备治疗肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤的药物中的应用。

说明书全文

携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建

方法与应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带MAGE-A3突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。【背景技术】

[0002] 黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene，MAGE)首次发现于1991年，其可直接编码黑色素瘤MZ2-MEL细胞系中的MZ2-E抗原，并且只在肿瘤、睾丸和胎盘注重中表达，其他正常组织均不表达。MAGE表达产物是一种肿瘤排斥抗原，可在肿瘤细胞表面与人类白细胞抗原(HLA)分子结合，由细胞毒T淋巴细胞(CTL)特异性识别，产生效应CTL，杀伤肿瘤细胞。

[0003] MAGE家族包括：MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C、MAGE-D和NECDIN 5个亚家族。MAGE-A基因家族分别含有3个外显子，每个成员的最后一个外显子上均有完整的编码区。该基因家族成员的后两个外显子和最后一个内含子的亲水和疏水端具有相当大的保守区，表明所有MAGE基因编码的蛋白可能有非常相似的功能。

[0004] MAGE-A基因家族包含MAGE-A1～MAGE-A12等12个家族成员，其基因序列含有64％-85％的相似度。MAGE-A3是恶性肿瘤最常表达的基因之一，能够与特定的MHC分子结合形成肽段，该肽段分子复合物能够被特定个体的T细胞受体识别，在细胞表面能达到足以激活具有特异性T细胞受体克隆的量，且MAGE-A3可在多种恶性肿瘤中表达，因此，MAGE-A3可作为优选的用于肿瘤免疫治疗的靶抗原。
【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提出一种安全性高、携带黑色素瘤抗原(MAGE-A3)基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体及其构建方法与其在免疫治疗中的应用。

[0006] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

[0007] 本发明提供了一种携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为MAGE-A3突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。

[0008] 本发明通过对MAGE-A3突变抗原基因的135位和136位进行PCR法定点突变，从而降低MAGE-A3二聚化，抑制其诱导E3泛素化激酶诱导AMPK，P53等抑癌蛋白降解，从而降低致癌风险，实现预防和治疗多种癌症的作用。

[0009] 所述的癌症包括，肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤。

[0010] 已知的腺相关病毒载体具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子，为提高目的基因的转录水平，还进一步将MAGE-A3突变抗原基因插入后成功构建的质粒的启动子替换为p5启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的任意一种。

[0011] 本发明还提供一种携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入MAGE-A3突变抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。

[0012] 本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因BCMA与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述启动子中的一种：β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。

[0013] 本发明还提供了一种携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括MAGE-A3重组腺相关病毒的质粒载体、MAGE-A3重组腺相关病毒的病毒载体、被所述MAGE-A3重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述MAGE-A3重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述MAGE-A3重组腺相关病毒的病毒载体由所述MAGE-A3重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。

[0014] 本发明还提供了一种携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品的制备方法，MAGE-A3重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到MAGE-A3重组腺相关病毒的质粒载体；MAGE-A3重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述MAGE-A3重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到MAGE-A3重组腺相关病毒的病毒载体；MAGE-A3重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述MAGE-A3重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系。

[0015] 一种如上所述的携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的产品在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。

[0016] 药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。

[0017] 用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/MAGE-A3的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有MAGE-A3的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。

[0018] 上述药物的用量一般为100μl/5×106个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。

[0019] 为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。

[0020] 本发明与现有技术对比的有益效果是：

[0021] (1)本发明提供了一种安全性高、携带黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)基因的重组腺相关病毒。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/MAGE-A3)载体可将其携带的MAGE-A3突变抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在MAGE-A3突变抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。

[0022] (2)本发明的携带MAGE-A3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于多种恶性肿瘤的细胞免疫治疗。

[0023] 本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。【附图说明】

[0024] 图1：MAGE-A3野生型和突变体MAGE-A3E134Q M135I质粒转染A549细胞电泳测试结果【具体实施方式】

[0025] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

[0026] 实施例1：构建重组腺相关病毒质粒

[0027] S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；

[0028] S2：逆转录PCR后，用引物1：ATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAGCACTGC和引物2：CTCTTCCCCCTCTCTCAAAACCCACTCATGCAG扩增得到MAGE-A3野生型基因；

[0029] S3：将步骤S2中MAGE-A3进行酶切反应，之后和步骤S1产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和MAGE-A3基因的重组腺相关病毒载体；

[0030] S4：使用引物3：GCCGGTCACAAAGGCAGATATACTGGGGAGTGTCGTCG将MAGE-A3中的134位和135位上的谷氨酸Glu和甲硫氨酸Met突变为谷氨酰胺Gln和异亮氨酸Ile，得到MAGE-A3E134Q M135I突变抗原基因；

[0031] S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为SV40早期启动子，得到MAGE-A3E134Q M135I基因的重组腺相关病毒。

[0032] 试验例1细胞杀伤实验

[0033] AAV/MAGE-A3E134Q M135I系统可以在动物细胞培养基中被供体的树突细胞吞噬，进而经由免疫递呈活化供体的T细胞，并诱发对携带有MAGE-A3抗原的癌症细胞系SKBR-3的免疫反应治疗有效性可通过对携带MAGE-A3的SKBR-3细胞的体外杀伤实验证实。

[0034] 具体地，包括以下步骤：

[0035] (1)抽取供体50ml血液，分离其中的单核细胞与T细胞前体细胞

[0036] (2)细胞计数后，以单核细胞∶AAV/MAGE-A3E134Q M135I＝1∶1000的比例加入6孔板一孔中，并加入细胞因子2ml，1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基。单核细胞经过刺激成为识别了MAGE-A3的成熟树突细胞。同时用AAV/GFP诱导产生不识别MAGE-A3的树突细胞做对照。

[0037] (3)T细胞前体细胞，加入细胞因子的2ml，1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基。

[0038] (4)按照1∶1000的比例混合2)和3)的产物细胞。再用加入细胞因子的1640培养基培养7天，得到成熟的CD4+T细胞。

[0039] (5)以40∶1的比例用分别诱导的CD4+T细胞对对携带MAGE-A3的SKBR-3细胞进行杀伤实验。

[0040] MTS试剂作用4小时后，将细胞培养板放入酶标仪，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。

[0041] 细胞杀伤测试结果如表1，

[0042] 表1 SKBR-3细胞杀伤试验测试结果

[0043]

[0044] 细胞杀伤率计算公式为

[0045] 杀伤率＝1-(效应细胞MAGE-A3+靶细胞SKBR-3-混合细胞MAGE-A3和SKBR-3)/(效应细胞MAGE-A3+靶细胞SKBR-3)

[0046] 经换算，MAGE-A3的CTL杀伤实验结果见表2：

[0047] 表2 SKBR-3细胞杀伤试验结果

[0048] 空白组 AAV-GFP组 MAGE-A3组
细胞杀伤率 —— 4.91％ 39.14％

[0049] 根据表2所示，试验结果表明MAGE-A3E134Q M135I突变抗原基因的重组腺相关病毒载体通过树突细胞诱导的杀伤率为39.14％，远高于对照组GFP杀伤SKBR-3的4.91％。

[0050] 试验例2安全性测试

[0051] 重组腺相关病毒(AAV/MAGE-A3)对A549细胞的感染

[0052] 1)体外培养A549；

[0053] 2)以1∶100比例稀释三种腺相关病毒GFP，AAV/MAGE-A3，AAV/MAGE-A3E134Q M135I(病毒滴度每毫升5×1011)加入上述细胞；

[0054] 3)培养2天后加入蛋白合成抑制剂Cycloheximide CHX，再培养1天；

[0055] 4)收集细胞后，立即加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，破碎细胞收集蛋白质；

[0056] 5)Western blot检测P53含量随着不同病毒感染的变化，结果如附图1所示。

[0057] 根据试验结果，与MAGE-A3野生型相比突变体MAGE-A3E134Q M135I的P53含量明显减少。MAGE-A3诱导P53等抑癌蛋白降解，是活化致癌能力的关键，因此突变体的致癌风险更低，可以用于腺相关病毒免疫治疗。如图1所示产物减少了诱导P53升高的致癌能力，但保留了原来的免疫源性。最后将其嵌入腺相关病毒载体中包装成可诱导DC细胞免疫反应且不具致癌性的MAGE-A3疫苗。

[0058] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

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