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用于便秘风险预测的微生物群及应用

阅读：752发布：2021-03-01

IPRDB可以提供用于便秘风险预测的微生物群及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了用于便秘风险预测的微生物群及应用，发明人基于测定的总计130个健康对照、84个便秘粪便样本测序数据的分析，鉴别出其中的菌群分类标记物。基于本发明的微生物群，可以有效预测便秘风险。基于本发明微生物群开发的诊断试剂，可以有效预测便秘风险，检测过程无创，安全性高。同时因为菌群样本可以常温运输，大大提高了检测的方便性。，下面是用于便秘风险预测的微生物群及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于便秘风险预测的微生物群，包括健康人富集菌群和便秘病人富集菌群，其特征在于：

健康人富集菌群至少含有f__Prevotellaceae|g__Prevotella|s__stercorea；

2.根据权利要求1所述的微生物群，其特征在于：便秘风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与便秘相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。

3.一种用于便秘风险预测的试剂盒，其含有定量权利要求1所述微生物群的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：便秘风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：

式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与便秘相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：|N|＝2。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：|M|＝16。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：Ij的临界值为：-1.448374411--

0.050777854。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒为PCR试剂盒，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18所示。

9.定量微生物群丰度的试剂在制备便秘风险预测试剂中的应用，其特征在于：微生物群为权利要求1所述的微生物群。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：定量微生物群丰度的试剂为PCR试剂，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18所示。

说明书全文

用于便秘风险预测的微生物群及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及用于便秘风险预测的标志物及相关试剂的应用。

背景技术

[0002] 便秘是常见的肠道功能失调之一，便秘表现为大便干硬、大便次数少、排便困难等症状，便秘同时可能诱发心、脑血管疾病，引起性生活障碍、痛经、尿路感染等问题，严重影响生活质量。

[0003] 人们对肠道菌群与便秘之前的关系进行了一定的研究，如：

[0004] 毕洪玲,张桂兰,何嫱.便秘患者肠菌群的调查[J].临床军医杂志,2003,31(3):82-84.通过活菌定量培养计数法，动态观察了58例便秘患者粪便菌群的变化规律，并与56例健康人比较。结果健康对照组双歧杆菌、类杆菌、乳酸杆菌、梭杆菌、肠杆菌、肠球菌每克粪便里的活菌数分别是：9.88±0.68，9.02±0.52，8.35±1.21，5.52±1.60，7.82±2.12，
7.42±2.42，便秘组上述各活菌数依次为：6.96±0.74，7.03±0.68，7.31±1.32，7.68±
1.42，8.71±1.02，7.29±2.01。两组比较，便秘组粪便中的双歧杆菌、类杆菌均减少非常显著(P＜0.01)；乳酸杆菌减少显著(P＜0.05)；梭杆菌增高非常显著(P＜0.01)；肠杆菌增高显著(P＜0.05)，B/E值减低非常显著(P＜0.01)。结论便秘病人肠道菌群的微生态平衡受到破坏，主要表现在以双歧杆菌为主的益生菌数量显著减少，腐败梭菌等条件致病菌数量显著增高。

[0005] 王林,姜军,丁威威,等.顽固性便秘病人结肠黏膜菌群的变化特征[J].肠外与肠内营养,2014,21(1):12-15.通过结肠镜活检获取乙状结肠黏膜标本，提取DNA，PCR扩增后行变性梯度凝胶电泳，应用分子生物学分析软件对菌群结构的相似性、主成分和多样性进行分析。结果：顽固性便秘病人结肠黏膜菌群有明显改变，与对照组比，顽固性便秘病人结肠黏膜菌群物种丰富度和香农多样性指数均显著降低(P〈0.01)。结论：顽固性便秘病人结肠黏膜菌群紊乱，表现为结肠黏膜菌群多样性减少。

[0006] 赵先平,肖新云,蔡锐,等.便秘相关肠道微生物研究进展[J].中国微生态学杂志,2014,26(10):1236-1240.对便秘相关肠道微生物的研究进展进行了综述，认为便秘造成肠道微生态改变，主要益生菌种类和数目减少，而有害菌或条件致病菌却显著增加。具体表现为需氧菌、真菌、大肠埃希菌等显著增加，厌氧菌、类杆菌和双歧杆菌等显著减少。

[0007] 越来越多的证据表明便秘的发生与微生物的改变存在着密切的关系，便秘发生的病人，微生物发生失调，因此菌群的变化可能作为便秘或者便秘前病变的干预靶点。

[0008] 现有技术并未明确如何通过微生物菌群的情况来预测便秘风险。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组可以高效预测便秘风险的微生物群。

[0010] 本发明的另一个目的在于提供定量微生物群丰度的试剂在制备便秘风险预测试剂中的应用。

[0011] 本发明所采取的技术方案是：

[0013] 作为上述微生物群的进一步改进，便秘风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：

[0014]

[0015] 式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与便秘相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。

[0016] 一种用于便秘风险预测的试剂盒，其含有定量上述微生物群的试剂。

[0017] 作为上述试剂盒的进一步改进，便秘风险通过菌群丰度计算得到，计算公式如下：

[0018]

[0019] 式中，Ij为风险指数，Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，M是与便秘相关富集菌群的子集，|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。

[0020] 作为上述试剂盒的进一步改进，|N|＝2。

[0021] 作为上述试剂盒的进一步改进，|M|＝16。

[0022] 作为上述试剂盒的进一步改进，Ij的临界值为：-1.448374411--0.050777854。

[0023] 作为上述试剂盒的进一步改进，试剂盒为PCR试剂盒，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18所示。

[0024] 定量微生物群丰度的试剂在制备便秘风险预测试剂中的应用，微生物群为上述的微生物群。

[0025] 作为上述应用的进一步改进，试剂为PCR试剂，其扩增的OTU序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18所示。

[0026] 本发明的有益效果是：

[0027] 基于本发明的微生物群，可以有效预测便秘风险。

[0028] 基于本发明微生物群开发的诊断试剂，可以有效预测便秘风险，检测过程无创，安全性高。同时因为菌群样本可以常温运输，大大提高了检测的方便性。

附图说明

[0029] 图1是微生物菌在人群中的分布情况；

[0030] 图2是健康指数的受试者工作特征(ROC)曲线；

[0031] 图3是健康指数在便秘与健康人的分布情况；

[0032] 图4是训练集的ROC曲线；

[0033] 图5是测试集的ROC曲线。

具体实施方式

[0035] 表1为微生物菌各物种在人群中的富集情况：

[0036] 表1、不同微生物在人群中的富集情况

[0037]菌名健康便秘富集人群
g__Bacteroides|s__plebeius 0.043536 0.026512 健康
f__Lachnospiraceae|g__Roseburia 0.001135 0.002371 便秘
o__Clostridiales|f__Mogibacteriaceae 0.000176 0.000591 便秘
g__Gemella|f__Gemellaceae 3.86E-05 0.000257 便秘
f__Lachnospiraceae|g__Blautia 0.003182 0.00616 便秘
f__Coriobacteriaceae|g__Eggerthella|s__lenta 5.87E-05 0.000312 便秘o__Lactobacillales|f__Leuconostocaceae 3.73E-06 7.15E-05 便秘
f__Ruminococcaceae|g__Oscillospira 0.006801 0.009695 便秘
f__Clostridiaceae|g__Clostridium 0.000133 0.000503 便秘
f__Streptococcaceae|g__Streptococcus 0.003982 0.004641 便秘
o__Coriobacteriales|f__Coriobacteriaceae 0.000266 0.001017 便秘
f__Porphyromonadaceae|g__Parabacteroides 0.005154 0.009814 便秘
f__Tissierellaceae|g__Finegoldia 6.63E-06 4.16E-05 便秘
f__Campylobacteraceae|g__Campylobacter 1.87E-05 0.000174 便秘
f__Lachnospiraceae|g__Dorea 0.002403 0.004375 便秘
f__Eubacteriaceae|g__Pseudoramibacter_Eubacterium 7.08E-06 0.000199 便秘f__Tissierellaceae|g__Peptoniphilus 3.29E-05 0.000325 便秘

[0038] 表2、不同微生物对应的OTU序列情况

[0039]

[0040]

[0041]

[0042]

[0043] 健康指数

[0044] 为了开发利用微生物群进行疾病鉴别的潜力，发明人基于确定的基因标志物开发了疾病分类系统。为了利用这些肠道微生物基因标志物对患病风险进行直观地评估，发明人计算了健康指数。

[0045] 健康指数Ij的计算公式为：

[0046]

[0047] 其中Aij是样品j中菌种i的相对丰度，N是所在选择在健康人菌群中富集菌群的子集，而M是与便秘相关富集菌群的子集。|N|与|M|分别是第一子集与第二子集所述菌种的个数。其中|N|为2而|M|为16。

[0048] 健康指数的受试者工作特征(ROC)分析如图2所示。可见在阈值为-1.448374411～-0.050777854时分类较好。

[0049] 表3为具体样本的健康指数。

[0050] 表3、具体样本的健康指数表

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[0055] 健康指数在便秘与健康人的分布如图3所示。从图中可以看出，健康指数在便秘人群与健康人群中的分布显著不同，具备良好的区分能力。

[0056] 为了验证利用微生物菌群进行便秘分类器的潜在能力，基于公共数据库数据开发出基于14个基因标记物的疾病分类系统，该基因标记物被Lasso回归法为最佳基因集。

[0057] 分类器的效果验证：

[0058] 数据来源：数据为前期收集的健康人与便秘者粪便进行16S V3-V4测序获得，通过Usearch进行数据的前处理包括去除引物，去掉低质量reads，OTU聚类等，使用QIIME进行OTU比对。

[0059] 影响微生物分布的因素分析

[0060] 发明人利用置换多元方差分析(PERMANOVA)方法评估不同特征对菌群的影响，这些特征包括年龄，性别，便秘状态。发明人利用R软件(https://www.r-project.org/)中的“vegan”工具包进行分析，经过10000次置换，得到置换P值。发明人还利用R中的“p.adjust”工具包对多重检验进行校正，利用FDR方法得到每个物种的p值。置换多元方差分析结果如表4所示，结果显示疾病年龄性别对菌群整体的分布没有显著影响。

[0061] 表4、置换多元方差分析结果

[0062] 自由度 SumofSqs R2 F Pr(>F) p.adjust
疾病 0.073262 0.003556 0.415824 0.985801 0.985801 0.073262
性别 0.299756 0.01455 0.850684 0.657134 0.985701 0.299756
年龄 8.248356 0.400367 1.040364 0.328967 0.985701 8.248356

[0063] 采用训练队列的丰度谱，对Lasso模型(R glmnt 2.0-16)进行训练，选择物种标志物，并在一个测试集进行测试，并计算预测误差。

[0064] 采用Lasso模型(R glmnt 2.0-16)进行预测，输入为疾病状态、物种丰度，分成训练集和测试集。发明人使用R软件中的glmnt包来来构建分类，并且使用预测函数来预测测试集，输出的是预测结果(疾病概率：默认临界值为0.5，大于0.5则认为该受试者为便秘)。按照7:3的比例来划分训练集与测试集，其中训练集150例，测试集为64例。

[0065] 基于本发明的微生物群，在进行lasso回归计算后，对训练集绘制ROC曲线(图4)，训练集AUC曲线下面积为0.922。测试集的ROC曲线如图5所示，测试集在总体的AUC下面积为0.667。

[0066] 从图中可以知，不管是训练集还是测试集，利用LASSO回归挑选出来的变量建立的模型的区分度均较为良好。

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